DE4010368C2

DE4010368C2 -

Info

Publication number: DE4010368C2
Application number: DE19904010368
Authority: DE
Inventors: Makoto Tokorozawa Saitama Jp Machida; Makoto Yashiro; Eiko Tokio/Tokyo Jp Takezawa; Sachiko Yokohama Kanagawa Jp Nanbara; Tetsuya Hiroshima Jp Yoshida
Original assignee: Sanyo Kokusaku Pulp Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1992-07-02
Also published as: CA1335259C; GB2229919B; DE4010368A1; FR2645024A1; FR2645024B1; GB2229919A; GB8922752D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lignin-Derivaten aus der Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen und/oder davon abgeleitete Lignin-Derivate als Hauptbestandteil zur Bekämpfung von AIDS.

Die Anzahl an Patienten mit AIDS ist in jüngster Zeit besonders in den USA und in Afrika enorm angestiegen und umfaßt augenblicklich bis zu etwa 50 000 Personen, wobei die Anzahl der Virusträger in der ganzen Welt etwa das 100fache beträgt. Es wird gesagt, daß fast alle Virusträger innerhalb von fünf Jahren von der Krankheit befallen werden und die Todesrate etwa 100% erreicht. AIDS läßt das Immunsystem von lebenden Körpern in der Weise kollabieren, daß der AIDS-Virus die Helfer-T-Zellen, die das Immun system steuern, infiziert und diese zerstört. Als Ergebnis werden die Per sonen von jeder Infektion, von malignen Tumoren und dergleichen befal len und sterben dann an diesen Krankheiten.

Bis zum heutigen Tage hat man das auf Nucleinsäuren basierende AZT (Azi dothymidin) allein als therapeutisches Mittel gegen AIDS verwendet. Auf grund erheblicher Nebenwirkungen (wie beispielsweise Anämie) kann das AZT aber nicht während langer Zeitdauern verabreicht werden.

Auf der anderen Seite ist Lignin in der Natur nach Cellulose reichlich vor handen, es ist in fast allen Pflanzen enthalten und wird durch den Men schen als Teil der Nahrungsmittel zu sich genommen. Erst kürzlich haben die physiologischen Wirkungen (wie beispielsweise eine Wirkung bei Darmstörungen usw.) von pflanzlichen Fasern Interesse gefunden. Dar über hinaus fallen Lignin-Derivate hauptsächlich in Ablaugen auf dem Ge biet der Zellstoff- und Papierindustrie an. Deren Einsatzmöglichkeit als Arzneimittel ist jedoch noch kaum untersucht worden, wobei allerdings ihre Antitumoreigenschaften bekannt sind.

Die US-PS 41 85 097 beschreibt ein Verfahren zur Bekämpfung von Herpes simplex Viren durch Auftragen eines antiviral wirksamen Lignosulfonats auf das befallene Tiergewebe.

Gegenstand der europäischen Patentanmeldung 03 15 182 ist ein Arznei mittel mit einem Gehalt an einer Polysaccharide enthaltenen Komponente aus Thujapflanzen als aktivem Wirkstoff, welches zur Bekämpfung von HIV-Infektionen eingesetzt werden kann.

JP-OS-57-1 30 919 beschreibt ein Lignin, insbesondere Nadelholz-Lignin enthaltendes virucides Mittel zur Bekämpfung von IBR-Viren.

Es ist nun die physiologische Wirkung von Ligninsulfonsäure und anderen Lignin-Derivaten, insbesondere deren antivirale Wirkung gegenüber dem NDV-Virus (Newcastle Disease Virus), welcher zu der Paramyxovirus-Fa milie gehört und dem RSV-Virus (Rous Sarcoma Virus) und dem HIV-Virus (Human Immunodeficiency Virus), welcher zu der Familie der Retroviren gehört, der auch der AIDS-Virus angehört, untersucht worden, was schließlich zur Vollendung der Erfindung geführt hat.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lignin-Derivaten aus der Ab lauge von Zellstoff-Aufschlüssen und/oder davon abgeleitete Lignin-Deri vate als Hauptbestandteil zur Bekämpfung von AIDS.

Zunächst ist die Antivirusaktivität und Sulfit-Ablauge bestimmt worden, wobei sich gezeigt hat, daß die Wirkung gegen NDV-Virus bei etwa 1,5 mg/ml und gegen RSV-Virus bei etwa 100 µg/ml auftritt. Als nächstes wurde die Sulfit-Ablauge durch Ultrafilter (vom UK-Typ) in Fraktionen mit Molekulargewichten von 10 000 und 1000 fraktioniert. Die Menge an Zuckern, Asche und Ligninsulfonsäure wurde in jeder Fraktion bestimmt und die Antivirusaktivität getestet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Es hat sich nun herausgestellt, daß die Substanz, die Antivirusaktivität aufweist, in der Ligninsulfonsäure vorliegt, und daß insbesondere die Fraktion, die eine hohe Aktivität zeigt, auf der Seite der hohen Molekulargewichte liegt. Diese Fraktion weist ebenfalls eine starke Antivirusaktivität gegenüber dem HIV-Virus auf. Diese Tatsache täuscht jedoch nicht darüber hinweg, daß es noch aktive antivirale Substanzen außer der Ligninsulfonsäure in der Sulfit-Ablauge gibt. Die in der Erfindung angewendeten Verfahren zur Untersuchung bzw. Austestung der Antivirusaktivität werden nun nachfolgend aufgezeigt.

Bei der Untersuchung der Anti-NDV-Aktivität vermehrt man primäre CEF-Kulturzellen (Chick Embryo Fibroblast) auf einer Platte mit 96 Vertiefungen und infiziert mit dem NDV-Virus. Nach 30 Minuten fügt man dann nach und nach verdünnte Proben hinzu und beurteilt 24 Stunden später unter dem Mikroskop die Konzentration, bei der die durch den Virus verursachte Zellfusion inhibiert wird.

Bei der Untersuchung der anti-RSV-Aktivität infiziert man nach der Vermehrung der CEF-Zellen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen mit dem RSV-Virus. Nach 1 Stunde fügt man nach und nach verdünnte Proben hinzu und beurteilt 5 Tage später die Konzentration, bei der die durch den Virus verursachte Transformation inhibiert wird.

Für die anti-HIV-Untersuchung verwendet man als Zellen und Virus MT-4-Zellen (mit HTLV-1-Zellen infizierte humane T-Zellen) bzw. HTLV-III_b-Virus. Man stellt das Virusmedium aus dem Überstand von Molt 4/HIV_HTLV-IIIb-Zellkulturen, die HIV-produzierende Zellen sind, her. Der Virustiter beträgt 1 × 10⁶ TCID₅₀/ml. Daneben verwendet man als Medium RPMI 1640-Zellen (welche Antibiotika enthalten). Man fügt für die Kultur gleiche Mengen an MT-4-Zellen mit 1 × 10⁶ Zellen/ml und HTLV-III_b-Zellen mit 2 × 10⁴ TCID₅₀/ml in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen, die man während 1 Stunde zur Absorbierung des Virus unter Kulturbedingungen hält. Danach fügt man Probenlösungen, die auf verschiedene Konzentrationen verdünnt sind, hinzu und gibt schließlich Medium bis auf ein Volumen von 1 ml hinzu und hält dann während 4 Tagen in einem CO₂-Inkubator mit einer Temperatur von 37°C unter Kulturbedingungen. Für Vergleichszwecke stellt man Kulturen mit Zellen, die nicht mit HTLV-III_b-Virus infiziert sind und ohne die Zugabe der Probenlösungen her. Man beurteilt die Antiviruswirkung nach zwei Verfahren, nämlich nach der Inhibierung der durch den HIV-Virus verursachten Zelldegeneration und nach der Inhibierung der Entwicklung von spezifischem HIV-Antigen auf der Oberfläche der Zellen. Zunächst beurteilt man die Wirkung der Zelldegeneration aus der Inhibierung der letalen Wirkung auf Zellen durch Zugabe der Probe, indem man die Anzahl der lebenden Zellen nach der Trypanblau-Methode für das 4-Tage-Kulturmedium, welches sowohl durch den HIV-Virus infiziert und nicht infiziert ist, zählt. Des weiteren fügt man für die Bestimmung des spezifischen HIV-Antigens, nachdem man die mit Methanol fixierten Zellen zunächst mit anti-HIV-Humanserum während 40 Minuten bei 37°C umgesetzt hat, FITC-markiertes anti-human IgG hinzu und läßt während 40 Minuten bei 37°C reagieren und zählt dann die Anzahl der mit Fluoreszenz markierten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops aus.

Als nächstes bestimmt man die Antivirusaktivität verschiedener Lignin-Derivate.

Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Die Verfahren zur Herstellung der in dieser Tabelle gezeigten Proben sind die folgenden.

○ Natrium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Behandlung von Calcium-Ligninsulfonat mit Natriumsulfat, wobei die Base ausgetauscht wird.

○ Calcium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Calciumsulfit-Kochflüssigkeit (CaSO₃).

○ Magnesium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Magnesiumsulfit-Kochflüssigkeit (MgSO₃).

○ Kraft-Lignin
Die Herstellung erfolgt durch Kraft-Aufschluß von Rotkiefer und man erhält gebleichten Kraft-Zellstoff (mit einem Rest-Ligningehalt in der Pulpe von 2,0%).

Die Zusammensetzung der Kraft-Ablauge beträgt 6,2% anorganische Stoffe, 2,8% Zucker und 6,0% Lignin.

○ Dioxan-Lignin
Die Herstellung erfolgt durch Extraktion von mit einem Alkohol-Benzol-Gemisch behandeltem Holzmehl (von der Fichte), indem man während 2 Stunden bei 175°C in einer Dioxan/Wasser-Flüssigkeit (1 : 1) nach dem Verfahren von Sakakibara et al. erhitzt. Die Ausbeute beträgt etwa 45%.

○ Thioglykolsäure-Lignin
Die Herstellung erfolgt nach den Verfahren nach Brauns et al. in der Weise, daß man zu einer flüssigen Mischung aus Thioglykolsäure mit 2n Chlorwasserstoffsäure entfettetes Holzmehl (von der Birke) hinzufügt und während 7 Stunden erhitzt. Man filtriert dann die Masse und extrahiert den Rest mit 2% Natriumhydroxid nach dem Waschen mit Wasser und Ethanol. Man gewinnt das Lignin nach der Chlorwasserstoffällung.

○ Sulfomethyliertes Produkt des Kraft-Lignins
Die Herstellung erfolgt in der Weise, daß man zu einer etwa 25%igen Aufschlämmung von Kraft-Lignin Na₂SO₃ (10 bis 20%, bezogen auf Kraft-Lignin) und dann HCHO (äquimolar zu Na₂SO₃) hinzufügt und während 1bis 2 Stunden bei 60 bis 80°C reagieren läßt und dann weiterhin 2 bis 3 Stunden bei 130 bis 150°C weiter reagieren läßt und anschließend abkühlt und trocknet.

Tabelle 2

Wie aus Tabelle 2 zu ersehen ist, erkennt man Antivirusaktivitäten bei allen in der Tabelle aufgeführten Lignin-Derivaten, wobei die Ligninsulfonsäuren die stärkste Antiviruswirkung aufweisen. Außerdem sind die Lignin-Derivate nicht auf die in der Tabelle gezeigten beschränkt und man kann jedes bekannte Derivat verwenden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Pro Ansatz dialysiert man unter Verwendung einer Dialysemembran 100 ml der in Tabelle 1 gezeigten Sulfit-Ablauge gegen Leitungswasser während 4 Tage und während 3 Tagen gegen destilliertes Wasser. Nach der Dialyse konzentriert man mit einem Rotationsverdampfer die Flüssigkeit auf etwa 30 ml, führt dann eine Gefriertrocknung durch und erhält etwa 3,5 g einer Fraktion, die reich an Ligninsulfonsäure ist. In dieser Fraktion vermindert man sowohl den reduzierenden Zucker als auch die Asche auf etwa 1/10 im Vergleich zu den Gehalten in der ursprünglichen Sulfit-Ablauge. Bei der Bestimmung der anti-NDV- und anti-RSV-Aktivitäten weist diese Fraktion Wirkungen bei 0,5 mg/ml bzw. 0,04 mg/ml auf.

Beispiel 2

Nachdem man 100 ml der in Tabelle 2 aufgeführten Kraft-Ablauge auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt hat und somit das Kraft-Lignin gefällt hat, zentrifugiert man dieses (bei 10 000 min^-1) und sammelt die gefällte Fraktion. Diese überführt man dann durch Trocknen unter vermindertem Druck in ein Pulver und erhält etwa 4,0 g einer Fraktion, die reich an Kraft-Lignin ist. Nach Suspendierung in destilliertem Wasser fügt man zur vollständigen Lösung 1n NaOH hinzu und stellt eine Lösung mit einer Endkonzentration von 1% her. Bei der Bestimmung der anti-NDV- und anti-RSV-Aktivitäten unter Verwendung dieser Kraft-Lignin-Lösung erkennt man Wirkungen bei 0,8 mg/ml in Form von Feststoffen.

Beispiel 3

Unter Verwendung eines Teils der in Tabelle 1 aufgeführten Sulfit-Ablauge mit einer Fraktion von Molekulargewichten von über 10 000 bestimmt man die anti-HIV-Aktivität. Die Ergebnisse sind der Tabelle 3 zu entnehmen.

Tabelle 3

Wie aus den obigen Ergebnissen zu ersehen ist, inhibiert die anti-HIV-Aktivität der Fraktion der Sulfit-Ablauge mit einem Molekulargewicht von mehr als 10 000 vollständig die durch den Virus hervorgerufene Zelldegeneration und die Bildung von HIV-spezifischen Antigen bei einer sehr niedrigen Konzentration von 8 µg/ml. Die Toxizität gegenüber Zellen tritt nur in geringem Maße bei einer Konzentration von 500 µg/ml auf, was ein Beweis dafür ist, daß diese Fraktion ein Antivirusmittel mit sehr hohem SI-Index (Selektiver Index) ist.

Claims

Verwendung von Lignin-Derivaten aus der Ablauge von Zellstoff-Auf schlüssen und/oder davon abgeleitete Lignin-Derivate als Hauptbestand teil zur Bekämpfung von AIDS.