DE2751570A1

DE2751570A1 - Carboxymethylierte beta-1,3-glucane, verfahren zu deren herstellung und antitumormittel

Info

Publication number: DE2751570A1
Application number: DE19772751570
Authority: DE
Inventors: Takuma Sasaki; Yukio Sugino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-11-18
Filing date: 1977-11-18
Publication date: 1978-05-24
Also published as: CA1100951A; BE860885A; US4454315A; JPS6152125B2; CH634855A5; SE7713016L; JPS5366442A; GB1595596A; NL7712764A; SU1024011A3; SE432939B; FR2421617B1; FR2438056A1; DK510177A; FR2438056B1; FR2421617A1

Description

PROF. DR. DR. J. KEITSTÖTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH* 2751 57Q

BAUERSTRASSE 22. D-(OOO MÜNCHEN 4O ■ FERNRUF OBB 37 65 S3 ■ TELEX 8213206 ISAR O POSTANSCHRIFT: POSTFACH 76O. O-COOO MÜNCHEN «3

-3

München, 18. November 1977 M/18 285

TAKEDA CHEMICAL INDUSTRIES, LTD, 27, Doshomachi 2-chome Higashi-ku

Osaka / Japan

Carboxymethyiierte ß-1,3-Glucane, Verfahren zu deren Herstellung und Antitumormittel

fl O 9 8 ? 1 / O 9 2

Die Erfindung betrifft carboxynethylierte Derivate von ß-1,3-Glucan, ein Verfahren zu deren Herstellung und Mittel zur vorbeugenden und therapeutischen Behandlung von Tumoren, in denen diese Derivate verwendbar sind.

Seit Jahren vird nach Substanzen geforscht, die bei der parenteralen oder oralen Applikation da3 Tumorwachstum hemmen und eine Verlängerung der Überiebenszeit tumorkranker Warmblüter ohne ernsthafte Nebenwirkungen ermöglichen.

Es wurde nun gefunden, daß ein wasserunlösliches wärmegelierbares ß-1,3-Glucan, das von Mikroorganismen aus den Genus Alcal.igenes und Agrobactertum erzeugt wird, dessen teilv/eise hydrolysierte Tliederpolymere und carboxymethylierte Derivate dieses Glucans bzw. dieser ITiederpolyneren eine starke Antitunorwirkung gegen das './achstun von Tumoren, v;ie Sarcona, Carcinoma oder Leukämie, in "..'arr.blütern ohne unerv/ünschte Nebenwirkungen entfalten.

Aufgabe der Erfindung ist es, Antitumornittel zur vorbeugenden oder therapeutischen Behandlung von Ileoplasma-befallenen '.vamblüterii bereitzustellen, die das ß-1,3-Glucan, dessen Niederpolymere und/oder dessen carboxymethylierte Derivate als "..'irksteffe enthalten. Fsraer ist es Aufgabe der Erfindung, neue carboxynothylierte Derivate des ß-1,3-Glucans und der durch partielle Hydrolyse des ß-1,3-Glucans herstellbaren Niederpolymeren bereitzustellen.

Aus den JA-A3 7000/1963, 32 673/1973, 32 674/1973 und GB-PS 1 352 938 ist bekannt, daß bestimmte I-Iikroorganismenstamme aus den Genus Alcaligenes und Agrobacterium ein wasser unlösliches wärmegelierbares ß-1,3-Glucan (im folgenden: TAK-N) produzieren. Bisher war Jedoch keine pharmazeutische Verwendbarkeit dieses Glucans bekannt.

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^I:/1S2

?75157O

Intensive Untersuchungen an TAIC-II, dessen durch partielle Hydrolyse herstellbaren IJiederpolyrneren (im folgenden: TAPI-D) und carboxyinethylierten Derivaten von TAK-N bzw. den genannten Niederpolyneren (im folgenden: CITAIC) haben nun gezeigt, daß diese Substanzen starke Antitunorv/irkung besitzen und eine ausgeprägte Tumorhensmng bis zur vollständigen Rückbildung der Tumoren entfalten.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von wasserunlöslichem ß-1,3-Glucan, das in Gegenwart von Wasser bei einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 170 wämegelierbar ist, von IJiederpolyneren, die durch partielle Hydrolyse dieses Glucans herstellbar sind, und/oder von carboxymethylierten Derivaten dieses Glucans bzw. dieser I.lederpolymeren zur Bekämpfung dus Tunioivachstums in 'warrublütern.

Das in Rahmen der Erfindung verwendbare TAlC-IJ entsteht - vie in den genannten Patentschriften beschrieben - bei der Züchtung bestimmter IÜkroorganisneu, wie Agrobacteriun radiobacter (I?0 13127, ATCC β466), Agrobacteriun radiobacter U-19(IFO 13126, ATCC 21679, FERII P-1165) und Alcaligenes faecalis var. myxogenes lITK-u (IFO-13140, ATCC 21630, FERM-P 1168). Das ß-1,3-Glucan enthält ß-1,3-Bindungen als hauptsächliche glycosidlache Bindungen und ist wasserunlöslich, wobei die meisten Verbindungen einen durchschnittlichen Polymerisationsgrad (im folgenden; DP) von nicht weniger als etwa 70 und die charakteristische Eigenschaft aufweisen, daß sie beim Erwärmen, z.B. auf etwa 6O⁰C, in Gegenwart von Wasser bei einem DP von I70 gelierbar sind.

Der 3» von TAK-H hängt vom Herstellungsverfahren ab. Gemessen nach dtr Methode von Manners «t al, Carbohydrate Research, Bd. 17, 3. 109 (1971) beträgt er etwa 70 bis 1000 und in vie len Fällen 100 bie 600. Während diese verschiedenen Glucanver- bindungen üblicherweise in Gegenwart von Wasser wärmegelierbar aind, verlieren sie ihr· Oelierfähigkeit bei niedrigeren DP-

totiai/oii)

Vierten. rcispicisvcice ist das Glucan nit einen DP von 113 nicht eelierfähig, während es 'cei einen Viert von 170 gelierf.^;ihis ist. Übsrraschenderv/'eise besitzen sov;ohl TAK-N als auch TAI'-D und CIITAIC starl:e Antitunon/irkung. Besonders überraschend ist, dafl selbst einige Arten von TAiC-D, die wegen ihres niedrigen Polynericationsgradss nicht als Polysaccharide bezeichnet v/erden können, dies β Antitunorwirlcung beibehalten und entfalten.

TAIC-D v/ird durch partielle Hydrolyse von TAK-IT hergestellt. Die Hydrolyse kann auf bol:a-:alo './eise erfolgen, z.B. durch saure Hydrolyse, alkalische Hydrolyse oder enzynatisclie Hydrolyse nit ß-1,3-Gluca:aase.

TAIC-D kann aus dea Reaktionsgenisch nach verschiedenen Methoden, wie sie üblichen/eise zur Reinigung oder Fraktionierung von Polysacchariden und Oligosaccharide» angev;andt werden, abgetrennt werden, z.B. durch Ausfaller, unter sauren Bedingungen, Ausfällen durch Zugabc von ethanol oder Gelfiltration. Mach diesen Verfahren kann can die verschiedenen iliederpolyraeren mit den jev/eils gevrtinschten DF-'./ert getrennt voneinander erhalten.

Unter "TAIC-D" werden sämtliche Arten von Niederpolymeren verstanden, die bei der partiellen Hydrolyse von TAIC-II entstehen können.

Der DP-'./ert des aus Kulturen der genannten Mikroorganismen isolierten TAK-N ist breit gestreut. Da der Polymerisationsgrad des bsi der Fermentation entstehenden ß-1,3-Glucans nit zunehmender Feraentationszeit abnimmt, kann auch TAK-N mit einem DP-'./ert unterhalb des oben genannten Bereichs hergestellt werden.

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Da andererseits TAIC-D durch Hydrolyse vor. TAK-Ii hergestellt wird, ist sein DP zwangsläufig niedriger als der des eingesetzten TAIC-N. Im allgemeinen kann jedoch TAK-H mit Polymerisationsgraden, die der Mehrzahl der TAK-D-Arten entsprechen, durch Züchtung der genannten Mikroorganismen hergestellt werden. Solange TAK-N und TAK-D dieselben DP-Werte haben, ist kein nennenswerter Unterschied in der Antitumorwirkung und der Wärmegelierfähigkeit feststellbar.

Im folgenden v/ird die Herstellung von TAK-D aus TAK-N näher erläutert.

Versuch 1 (Hydrolyse mit Schwefelsäure)

60 g TAK-N(DP « 5401 gemessen nach der Methode von Manners et al; im folgenden beziehen sich alle DP-V.^Terte auf diese Methode, falls nichts anderes angegeben ist) werden in 6 Liter 4 η Schwefelsaure suspendiert. Die Hydrolyse wird bei 60⁰C durchgeführt, wobei man nach 30 Minuten und 1 Stunde Jeweils 2 Liter des Reaktionsgemische entnimmt. Diese Proben werden mit S₁ bzw. Sp bezeichnet. Das restliche Reaktionsgemisch wird eine weitere Stunde bei 60°C inkubiert, so daß eine weitere Probe S* erhalten v/ird. Aus S₁, S₂ und S* stellt man Kydrolyseprodulcte nach dem folgenden Verfahren her: Zunächst zentrifugiert man die einzelnen Proben und sammelt den Niederschlag. Der jeweilige niederschlag wird dann nit 1,6 Liter destilliertem Wasser gewaschen und zentrifugiert. Nach nochmaliger Wiederholung dieses Verfahrens suspendiert man den Niederschlag in 1,2 Liter destilliertem Wasser, neutralisiert die Suspension mit 8 η Natronlauge und unterwirft sie der Gefriertrocknung. Hierbei erhält man 22 g S₁, 20 g S₂ und 19 g Sj. Jeweils 7 g dieser Pulver werden in 700 ml destilliertem Wasser suspendiert, worauf man den pH mit 8 η Natronlauge auf 12,5 einstellt und so Proben S₁', S₂* bzw. S₃* erhält.

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-r-

- ¹^¹⁸1751570

Jede dieser Lösungen wird mit Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 60 Si versetzt und durch Zentrifugieren von dem entstehenden Niederschlag befreit. Der Überstand wird mit Ethanol bis zu einer Konzentration von 70 -A versetzt. Schließlich neutralisiert man die Lösung mit verdünnter Salzsäure, zentrifugiert den entstehenden niederschlag ab und wäscht ihn viermal mit je 250 ml destillierten Vasser.

Durch Gefriertrocknung erhält nan 1,6g S-I und 1,5g S-II als weiße Pulver aus S₁ ¹ bzw. Sg'· S₇* wird uit Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 70 ;S versetzt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag v.-ird in etwa 500 ml destilliertem Uasssr resucpendiert, mit Ethanol bis zu'einer Konzentration von 70 '.j versetzt und schließlich Kit einer geringen Menge Salzsäure neutralisiert. Der entstehende niederschlag v.-ird abzentrifugiert, vierv.io.1 n:Lt je Z^C ral destillierten: V.'asser gewaschen und gefrier^2"crocl:uet, vobei 5,5 g eines v.^rei.3en Pulvers (5-III) ci'-ialtc-i vcrdon.

Die physikaliach-chciischcn Si _wcr.cc::af ten von S-I, S-II und S-III sind in Tabelle I

Tab-	DP*	lie I	C_T i™. J-	S-II	S-III
	Elemer.taranalyse Ci)	125	82	68
	C 40,13	40,65	40,9*
r-:einhoit (>j) **	H 6,74	6,77	6,76
Glucosegehalt (/O) ***	93,1	91,1	93,8
Ia)Jp in 0,1 N KaOH	< 0,1	< 0,1	< o.¹
25.6 (0=1,16)	(C=I',1O)	18,8 (C-0J82)

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♦ Gemessen nach der Methode von Manners et al
** errechnet aus den nach der Schwefelsäuremethode bestimmten Glucosegehalt
*** gaschromatographisch bestimmt.

Versuch 2 (Hydrolyse mit Ameisensäure)

(I) 6 g TAK-H (DP = 540) werden in 150 ml 35prozentiger Ameisensäure suspendiert, worauf man die Hydrolyse 20 Minuten bei 83°C durchführt. Nach dem Abkühlen engt man das Reaktior.sgemisch zur Trockene ein und suspendiert das Konzentrat in *./asser. Die Suspension wird mit 5 η Katronlauge auf pH 12,5 eingestellt, wobei eine klare Lösung entsteht, die ma:: mit

5 η Salzsäure auf pH 7,0 einstellt. Der entstehende niederschlag wird abzentrifugiert, mit destilliertem Wasser gründlich gewaschen und gefriergetrocknet. Hierbei erhält nan
5,4 g eines weißen Pulvers (S-I).

(II) 12 g des in (I) verwendeten ΤΛΚ-!" v/erden 20 !!!nuten bei 95 C in 300 ml nCprozenti^er Ansise—c'iure hydrolysiert. Durch v/eitere Verarbeitung des Reaktionsgcnischs gemäß (I) erhalt
man 10,3 g eines weißen Pulvers (S-II).

(III) 12 g des in (I) verwendeten TAK-IT werden 40 Minuten bei 95⁰C in 300 ml 90prozentiger Ameisensäure hydrolysiert. Durch weitere Verarbeitung des Reaktionsgemische gemäß (I) erhält
man 5,4 g eines weißen Pulvers, das nan in 0,05 η Natronlauge bis zur Reinkonzentration von 1,0 Jj auflöst und mit Ethanol
bis zu einer Konzentration von 57,5 Ϊ* versetzt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert, in destilliertem Wasser suspendiert und mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Durch Zentrifugleren der Suspension, gründliches Auswaschen des Niederschlags mit 70prozentigem wäßrigem Ethanol und Gefriertrocknen erhält man 2,2 g eines weißen Pulvers (F-V).

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M/ 18 285

AO

Der vorstehend beim Abtrennen des ethanol!sehen Niederschlags zurückbleibende Überstand wird mit Ethanol bis zu einer Konzentration von 70 \'i versetzt und mit Salzsäure neutralisiert. Der entstehende I'ic-derschla^ virc. abzentrifugiert, nit 70prozcnti^em v.'Ußri^cn Zthar.ol go'.:asehen und Gefriergetrocknet. Hierbei erhült :.:-r. 2,3 g eines weißen Palvers (7-III). Der nach dem Abtrennen des ersten Niederschlags (5,4 g) aus dem Hydrolysatgemisch verbleibende Überstand enthalt nennenswerte Hennen von Teilhydrolysaten in löslich gemachtem Zustand. Dor Überstand -.-.'ird daher ein;_-eo.i£t und zenti'ifugiert, wobei sich der entstandene Niederschlag abscheidet. Durch Gefriertrocknen des Niederschlags erhalt man 2,9 g eines weißen Pulvers (F-VII). Der erhaltene Überstand wird durch Gelfiltrationschromatographie an einer Sephadex G-25-Säule (Lösungsmittel: 0,1 π Annoniunbicarbonat) '.reiter fraktioniert, worauf man die vereinigten ?ral:tionen gafriertrocknet. Auf diese './eiss erhalt nan 0,7 g eines veißen Pulvers (F-VIII).

(IV) 18 g des in (I) verwendeten TAIC-N v.^ferden 40 Minuten bei 95°C in 450 ml 90prozentir;er Ameisensäure hydrolysiert, worauf man das Reaktionsgemisch demselben Fraktionierungsverfahren wie in (III) unterwirft, d.h. einer Konzentration, Ausfällung mit Ethanol, Gelfiltration etc. Auf diese Weise erhält man vier Fraktionen von weißen Pulvers (2,5 g F-IV; 2,8 g F-YI etc.).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Pulver (F-I, F-II, F-III, F-IV, F-V, F-VI, F-VII und F-VIII) sind in Tabelle II wiedergegeben. Löst man 6 Proben nit niedrigerem DP (F-III, IV, V, VI, VII, VIII) Jeweils in 0,02 η Natronlauge und chroraatographiert sie an derselben Sephadex G-200-Säule, die mit derselben Lösung v/ie oben in Gleichgewicht steht, so werden sie in der Reihenfolge des abnehmenden DP (von F-III bis F-VIII) eluiert, wobei Jede Probe eine symmetrische Band· ergibt. Dies weist darauf hin, daß Jede der Proben in Bezug auf den Polymerisationsgrad eine Normalverteilung aufweist.

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	W	Tabelle II	6,46	Rein heit- r*'5	Vi/ 13	2751570 285
	299	Elencntar- analyse (Ji) C H	6,91	92,3	Glucose- ZO haltte	in 0.1 N iiaOH
F-I	113	40,73	6,77	98,4	< 0,05	30,6(0=0,35)
F-II	50	41,71	6,50	93,5	< 0,03	22,3(C=O,57)
F-III	44	• 41,98	6,71	90,8	< 0,03	12,l(C=l,06)
F-IV	39	42,35	6,99	93,3	< 0,03	10,9(0-2,24)
F-V	24	41,44	6,99	92,5	< 0,03	4,0(0=1,62)
F-VI	16	42,62	6,37	91,8	< 0,03	-1,5(C=I,07)
F-VII	7	42,46	94,1	< 0,03	0,4(0=1,06)
F-VIII	und	39,84	***: siehe Fußnote von	< 0,03	0,0(C=O,57)
		Tabelle I.

Ferner v/urde gefunden, daß bei der Caroozyaethylierong von TAIC-N iind TAK-D neue Derivate (CITAK) entstehen, bei denen die Hydroxylgruppen dea Glucans mehr oder weniger carboxymethyliert sind.

Gegenstand der Erfindung sind daher ß-1,3-Glucanderivate der allgemeinen Formel I

CH₂OR

(D

H OR

in der mindestens einer der Rest R die Gruppe: -CH₂COOH ist und die übrigen Reste R gegebenenfalls Vaaaeratoffatome darstellen und η eine Zahl iron 0 bis 1000 einschließlich ist, -sowie daran Salsa.

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- 1/ - K/ 18 285

CHTAK kann durch übliche Caboxymethylierung von TAIC-H oder TAIi-D hergestellt werden, z.B. durch Unisetzen von TAK-N oder TAK-D mit Honochloressigsäure in Gegenwart einer Alkalibase. Neben diesen Verfahren können aber auch andere übliche Verfahren zur Carboxymethylierur.g von Kohlenhydraten angewandt werden.

Die Abtrennung von QITAK aus dem Reaktionsgemisch kann auf übliche V/eise erfolgen, wie sie üblicherweise zur Reinigung von Kohlenhydraten angewandt wird, z.B. durch Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel. Daneben können jedoch Je nach dem Gehalt an Carboxynethylgruppen oder der Löslichkeit von CIlTAIC in 'Jasser andere Verfahren angewandt werden, z.B. die Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration.

Das erhaltene CIITAIC enthält stets Carboxynethylgruppen im Molekül, jedoch richtet sich der Gehalt an Carboxyraethylgruppen weitgehend nach den Bedingungen der Carboxymethylierungsreaktion. Bei der Titration zeigt sich, daß der Gehalt an Ca rboxym ethyl gruppen im CIiTAK nach der normalen Carboxymethylierungsreaktion üblichen/eise weniger als drei Carboxymethylgruppen pro Glucoserest im CMTAK-Molekül beträgt. Als CIITAK sind für die Zwecke der Erfindung sämtliche Substanzen geeignet, die bei der Carboxynethylierung von TAK-N oder TAIC-D entstehen und deren Moleküle nachweisbar Carboxymethylgruppen enthalten, unabhängig vom Carboxymethyliorungsgrad.

Wie aus der Formel (I) der freien Säure hervorgeht, kann ClTAIC mit verschiedenen Basen zu entsprechenden Salzen reagieren, z.B. zu den natrium-, Kalium-, Calcium-, Aluminium-, Magnesium- oder Aminsalzen. Unter "CIITAIC" wird daher nicht nur die freie Säure, sondern auch deren Salze verstanden, insbesondere Salze mit niedriger Toxizität.

In Tabelle III sind die physikalischen Eigenschaften einiger typischer Arten von CIITAIC genannt, die nach dem vorstehenden

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Verfahren aus TAK-N und TAK-D hergestellt worden sind. Die physikalischen Eigenschaften vmrden hierbei bestimmt, nachdem die einzelnen Proben 10 Stunden unter verhindertem Druck über Phosphorpentoxid bei 60⁰C getrocknet worden sind.

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	Eeiepi	Ausganss-	-CH₂COOH	Tabelle III	Ka	•	Viskosität	r ^25
	Nr/	_ω1 material	«relialt		2,7		(Centipoise)
COMTAK	13		0,54	Elenentar-	5,7	2,57	in 0.1 K NeOH
Nr.	14	Art ^*	0,75	analyse	10,0	2,71	6,0(C-O,77)
1	15	TAK-N 540	1,07	C II	2,7	2,60	10, KC=C, 76)
2	16	^w 540	0,30	40,97 5,57	5,9	2,10	5,7(C=O,79)
3	17	• 540	0,36	58,51 5,45	4,8	2,27	15, KC=O, 80)
4	18	" 255	0,59	37,89 4,77	9,0	2,25	10,0(0=0,74)
5	18	- 255	1,15	40,82 6,05	4,7	2,29	14,6(C=O,82)
6	19	TAE-D 299	0,51	39,82 6,06	9,9	1,96	1,5(C=O,81)
7	20	" 299	1,22	38,84 5_f7i	5,5	1^49	12,2(C=O,71)
θ	19	¹¹ 11$ .	0,36	37,93 4,86	4,6	1,68	3,1(C»O,78)
9	20	• 113	0,45	40,?2 5,74	1,83	10,0(0=0,7'0
10		• 68	37,03 4,78		9,5(C=O,78)
11	« 68	40,46 5,96
		39,41 5,95

Kmmer des Beispiels, in dea das CITTAK hergestellt wird. Bestimmt nach der Methode von Manners et el. Anzahl der Carboxynothylgruppsn pro Glucoserest.

Bestissat nit einea koaxialen Rot-itionsvlskosimeter unter den folgenden Bdi

Bedingunren:

Lösungsmittel; 0,1 η Natronlausaj Konzentration 0,2

Scbergcßchwindigkeit 1046,7 sec-'.

Temperatur 30 C;

VL/ 13

'AS

In den Fig. 1 und 2 sind die IR-Spektren von CIITAIC Hr. 2 und Nr. 11 aus Tabelle III in Kaliumbromid gezeigt. Die Zahlen an der Oberkante, der linken Seite und der Unterkante geben die Wellenlänge (um), die Durchlass!gkeit (JS) bzw. die Wellenzahl (cm" ) an. Die charakteristischen Absorptionen treten bei 1440 bis 1400 und bei S9I cm"¹ auf.

Das vorstehend erhaltene TAK-N, TAK-D und CMTAK mit DP-Werten von 2 bis etwa 1000, vorzugsweise 15 bis 800 und insbesondere 40 bis 600, besitzen signifikante Hemmwirkung gegenüber verschiedenen Tumorarten in Warmblütern, z.B. Kaustieren, Geflügel, Hunden, Katzen, Kaninchen, Ratten und Mäusen. Die Wirkung entfaltet sich insbesondere gegen feste Tumoren, die bekanntlich gegenüber der Behandlung mit herkömmlichen cytotoxischen Arititumormitteln weniger empfindlich sind.

Beispielsweise wird das Wachstum von Sarcona 160, Ehrlich-Carcinoma, Leukämie-Zellen SN-36, CQ-I-Adenocarcinoma oder IITF-Reticulumzell en-Sarcoma, die jeweils subcutan in H'äuse transplant!ert sind, merklich gehemmt, wenn man TAK-N, TAK-D oder CMTAK vor, nach oder gleichzeitig mit der Transplantation ein- oder mehrmals in einer Dosierung vor. etwa 1 bis 1000 mg/kg pro Applikation und Tag intraperitoneal, intravenös oder subcutan verabfolgt.

Die Toxizität von TAIC-N, TAIC-D und CMTAK ist außerordentlich¹ niedrig. Beispielsweise werden bei Mäusen und Ratten mit intraperltonealen Dosen von 3000 mg/kg oder oralen Dosen von 10 000 mg/kg keine toxischen Effekte beobachtet. Die Polysaccharide können daher Warmblütern gefahrenlos mehraals verabreicht werden.

Die Applikation kann auf die bei der Krebsbehandlung übliche Weise erfolgen, z.B. durch Intratumor-, subcutane , intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder gegebenenfalls durch orale oder rektale Verabfolgung oder durch äußere An-

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Wendung, Auftragen, Inlialioren oder andere Applikationsformen.

TAK-H, TAK-D oder QITAK werden 'Warmblütern in einer ausreichenden Menge verabfolgt, um das Tunorwachstum zu hemmen.

Die Dosierung und die Applikatior.sart von TAK-II, TAIC-D oder QITAIC bei 'Warmblütern, die von Neoplasm en befallen sind, können von der Art des Mittels (TAIC-N, TAIC-D, QITAK), dem Tier bzw. Patienten, den Tunorsymptomen, der Applikationsform und anderen Faktoren abhängen. In allgemeinen beträgt die Dosierungsmenge pro Verabreichung etwa 0,02 bis 2000 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,2 bis 2CC0 ng/kg Körpergewicht, wobei die bevorzugte Obergrenze etwa 500 ng/kg Körpergewicht beträgt. In vielen Fällen betrügt eine besonders bevorzugte Obergrenze etwa 200 ng/kg. Die Verabreichung kann z.B. 1 bis 6 mal täglich an aufeinanderfolgenden Tagen oder in größeren Abständen durchgeführt werden.

Die Iiifektionsform ist von Fall zu Fall unterschiedlich, jedoch in herkömmlichen Rahnen, d.h. TAIC-IT, TAIC-D oder CMTAK werden entweder direkt oder mit Hilfe eines üblichen Lösungsvermittlers, z.3. eines Alkohols, wie Ethanol oder Propylenglykol, eines nicht-ionogenen. grenzflächenaktiven Mittels, physiologischer Kochsalzlösung oder isotonischen Lösungen, in einem wäßrigen flüssigen Medium gelöst oder suspendiert. Im Falle von QITiJC kann die Probe leicht in destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst werden.

Für die orale Verabreichung können beliebige phannazeutische Formen angewandt werden, z.B. Sirupe, Elixiere oder Suspensionen, oder aber die Verbindung kann z.B. in Waffeln, Pillen, Tabletten, Suppositorien oder Gele eingearbeitet werden. Eine bevorzugte orale Dosierungscinheit besteht aus einer Tablette, die etwa 10 bis 1000 ng des 'Wirkstoffs pro Tablette enthält. Derartige Tabletten können auf übliche Weise beschichtet

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werden, vorzugsweise mit einen leicht löslichen Beschiclitungsmatcrial, wie Zucker. Die ger-annte IIer^ge ::ann auch Gelatinekapseln einverleibt werden, die sich bein Einführen in den Magen sofort auflösen. Gegebenenfalls können auch übliche Geschmackskorrigentien und Färbenittel verwendet werden.

Tabletten dieser Art werden auf übliche Weise durch Vermischen des Wirkstoffs mit einem Bindemittel, z.3. Stärke oder Zucker, Granulieren des Gemischs, Zugabe erforderlicher Füllstoffe, Geschmackskorrigentien, Gleitmittel etc., Vermengen des Gemischs und Passieren durch ein 30 laesk-Sieb hergestellt. Die gründlich gemischte !lasse wird dann mit einer üblichen Presse zu Tabletten der gev.~Unschxen Härte gepreßt, vorzugsweise zu zwei-geteilten Tabletten für die leichtere Verabreichung.

TAK-N, TAiI-D und CITAK können in Kombination mit anderen Antitumonaitteln verabreicht werden. Kombinationen nit anderen Antitumormitteln, die zu einer verbesserten inmunologischen Aktivität der Tumor-befallenen Tiere führen, sind ebenfalls bevorzugt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Einige Beispiele erläutern die Herstellung von TAIv-D aus TAIC-II, das Verfahren zur Herstellung von CMTAK, die physikalischen Eigenschaften von TAK-Ii, TAIC-D und CKTAK und einige injizierbare Forasn dieser I-Iittel. Andere Beispiele erläutern die Antitumorwirkung von TAK-N, TAK-D und Q-ITAK gegen Käusetuaoren in Modellversuchen.

Bei der Behandlung tumorbefallener Tiere mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kann eine drastische Rückbildung verschiedener Tumorarten erzielt werden, z.B. von Sarcoma, Carcinoma, Reticulumzellen-Sarcoaa und LeukUmiezellen. Alle diese Tumcrarten bei Nagetieren sind als verläßliche Tumormodelle für andere Warmblüter bekannt.

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AS

Die meisten der folgenden Experimente über die Antitumorwirkung von TAIi-N, TAK-D und CS-ITAIZ werden in Anlehnung an die I-Ietliode zur Bestimmung der Antitumoraktivität von Lentinan, einem verzweigten Glucan aus einen eßbaren Pilz, durchgeführt; vgl. G. Chihara et al. IJature Bd. 222, S. 687 Ms (igC9)und Cancer Research Bd. ZQ, 3. 2775 bis 27S1 (1970).

Die in den B:cperincnten verwendeten I'äusetunoren, v/ie Sarcona 180 (3160), Ehrlich-Carcinoma (Ehrlich), IJTF-Reticulumzellen-Sarcoma (NTF), CCM-Adenocarcinona (CCI!) und Leukämiezellen 3Π-36 (.¹II-I-36) werden jeweils in der Ascitesfora in 5 bis 7 'fachen alten ICR-JCL-Hausen kultiviert. Eine geeignete Anzahl dieser Tunorzellen wird subkutan in die ICR-JCJL-Käuse transplant!ert. An 35. Tag nach der Tunortransplantation schneidet man die gewachsenen Tunorknoten sun ^-'ägen aus.

TAIv-II oder TAIC-D werden in geeigneter Konzentration bei einem pK-'./ert um den Neutralpunkt in destillierten V/asser oder physiologischer Kochsalzlösung suspendiert oder gelöst, während CIiIYJZ in destillierten './accer oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst wird. Die einzelnen Präparate werden I-I'iuscn in einer Dosis von C, 2 r.l/20 g Körpergewicht täglich 10 Tage lang, beginnend 24 Stunden nach der Tunortransplantation, tu glich 5 Tage lang vor der Tur.ortransplaivtation bzw. nur einmal während des 7. Tages vor und des 21. Tages nach der Tunortransplantation intraperitoneal, subcutan oder intravenös verabfolgt.

eispiel 1 Tuuorhaimnif von ΤΛΚ--Ι (DF= ^AO): einr.i?.I.i^c;o I:i.jr;l:t:'.on

Vier Ilillionen 3 1cO-Zellen werden subcutan in die lirike Leistengegend von 4 bis 5 'fachen alten weiblichen ICR-JCL-liüusen transplantiert. Ära 35. Tag nach der Transplantation werden die Tumorknoten ausgeschnitten und gewogen. Das durchschnittliche Tumorgewicht bei einer aus 5 Mäusen bestehenden

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II/ 1ο 285

/Ι9

behandelten Gruppe (T) wird mit dem bei einer aus 10 Mäusen bestehenden Kontrollgruppe (C) verglichen, woraus sich die

Tumorhetimung folgendermaßen errechnet:

Tumorhenmung (J$) « C-T/C χ 100. Die Anzahl an tumorfreien Tieren (vollständige Rückbildung) am 35. Tag wird ebenfalls

bestimmt.

Eine Suspension von 10 mg/ml TAK-U (DP - 540) in physiologischer Kochsalzlösung wird intraperitoneal (0,2 nl/20 g Körpergewicht) jedem Tier einmal in einer Dosierung von 100 rag/kg am 7., 3. oder 1. Tag vor bzw. den 1., 2., 3., 5., 7. 10., 14. oder 21. Tag nach der Tumortransplantation bzw. an Tag der Tumortransplantation verabfolgt.

Wie aus Tabelle IV hervorgeht, hennt TAIC-M bei einer Dosis von 100 mg/kg das Wachstum von S 130 signifikant, wenn man es nur einmal während des 7. Tages vor und des 21. Tages nach der Tumortransplantation verabfolgt. Außerdem ist bei einer einzigen Verabfolgung von TAK-N (DP » 540) am 7. Tag nach der Tumortransplantation in einer Dosis von 20 mg/kg, 60 mg/kg bzw. 100 mg/kg eine signifikante Verringerung des Tumorv/achstums bei den beiden höheren Dosen von 60 bzw. 100 mg/kg zu beobachten.

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M/ 18 2

£751570

	TAK-N	Dosis	1	Tabell	♦»·	2	e IV	Tumor- hemnung CO	Anzahl mit vollständiger Rückbildung / Anzahl der behandelten
	(DF54O)		1		3			0/10
Probe		100 χ	1	Tag der Injek tion		durch schnitt 1. λ rieht (ö)	67,8	3/5
		100 χ	1		7	7 06	76,8	3/5
TAK-N ,	100 χ		_/			100	5/5
(W540))	ΊΟΟ χ	1	-3	7	1,64	92,1	3/5
		1	-1	10	O		O/IC
	ΊΟΟ χ	1	0	14	0,56	82_f9	4/5
	ICO χ	1		21		91,5	4/5
TAK-N ,	100 χ	1		1,19	100	5/5
	100 χ		7	0,59	82,0	3/5
J	,100 χ	1	7	O	100	5/5
		1	7	1,25	——_—	0/10
	ΊΟΟ χ	1	O	100	5/5
	100 χ	1	5,08	99,8	4/5
TAK-N ι	100 χ		O	99,8	4/5
(DP540)	ΊΟΟ χ	1	0,01	66,3	1/5
		1	0,01	____	0/5
\	ί 20 χ 60 χ	1	1,71	30,6	1/5
	100 χ	5,36	97,8	3/5
	3.72	99,4	4/5

	0,03

* TAIC-N v/ird am 7. Tag vor der Tumortransplantation verabfolgt.

** TAIC-II v/ird am 1. Tag nach der Tumortransplantation verabfolgt.

*** TAIC-N wird am Tag der Tumortransplantation verabfolgt.

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. 27S1570

- 20 - Π/ 18 285

Die Ergebnisse zeigen, daß TAK-H (DP = 540) aas Tunorwachstum in allen Stadien der Tumor entwicklung in Warmblütern
selbst bei einer einzigen Verabreichung wirksam henrrfc.

Beispiel 2

Tumorhorununrr von TiMC-If (D? - 540) und Autoklaven-"erormenem TAIC-M (DP = 540)

Sechs Millionen S ISO-Zellen werden subcutan in die rechte
Leistengegend von ICR-JCL-Käusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Am 35. Tag nach der Transplantation werden die Tumorknoten ausgeschnitten und gewogen. Die Tunorhemmung der behandelten Gruppe errechnet sich wie in Beispiel 1.

Es werden TAK-N (DP = 540) und Autoklaven-geronnenes TAIC-N
(DP = 540) verwendet, v;obei letzteres durch 27mir.ü'ciges Erhitzen einer 2pro^entigen Suspension von TAK-IT (D? = 540) auf 12O°C und anschließendes Trocknen und Pulverisieren des entstehenden Gels erhalten wird. Die Proben v/erden in destilliertem v/asser in der gevtflnschten Konzentration suspendiert,
worauf man die einzelnen Suspensionen einer Gruppe νρη 5 Mäusen täglich 10 Tage lang, beginnend 24 Stunden nach der Tuuortransplantation intraperitoneal verabfolgt.

"Wie aus Tabelle V hervorgeht, zeigt TAK-II (DP = 54C) in einer Dosis von 1 bis 50 a^/l:g eine ausgepiüöts '.«'irkunt; auf das
Tumorwachstum, v/obei der Effekt bei einer Dosis von 5 bis
25 mg/kg besonders signifikant ist. Das Autoklaven-beiiandelte TAK-N (DP = 540) hemmt in einer Dosis von 10 mg/kg ebenfalls da3 Tumorwachstun. Es ist keine Toxizität feststellbar.

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	Dosis mg/kg (ip)	10	as"	II/	18 235
		10	Tabelle V
		10		. Tumor- heoiiung CO
Probe	1 χ	10	durchschnittl Tunorgewicht *(si*		Anzahl mit voll ständiger Rück bildung/ Anzahl der behandelten I-Iäuse
		10	6 CO		0/6
	5 χ	10	4 80	20^0	0/6
	7 χ	10	3.58	40,3	1/6
	10 χ	10	0_}02	99,7	5/6
	1 ^ χ	10	0,73	87,8	5/6
	20 χ	10	O Ol	99,8	5/6
TAK-N <	25 x	O_t 10	98,3	V5
(LP 540)	50 χ	O	100	5/5
		0,42	93,0	3/6
	10 χ	1,19	80,2	1/6
		3,67 0^29		0/6 5/6
TAK-N (EP 540) OeI*		92,1

* Autoklavenbehandelt.

Die Ergebnisse zeilen, daß TAK-I¹T in relativ niedrigen Dosen das Tunorwachstuia hemmt und daß die Probe ohne Aktivitätsverlust im Autoklaven sterilisiert werden kann.

Beispiel 3 Tumorhcnrier.de "Jirkun-T verschiedener Arten von TAIv-IT und TAIC-D

24 Stunden nach der gemäß Beispiel 2 durchgeführten Transplantation von S 180 werden verschiedene Arten von TAK-N und

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- Z2 -

M/ 18 285

TAK-D, die in destilliertem Wasser suspendiert sind, einer Gruppe von 5 Mäusen täglich 10 Tage lang in einer Dosis von 10 ms/kg intraperitoneal verabfolgt. Am 35. Tag nach der Tumortransplantation werden die Tumorknoten ausgeschnitten und gewogen. Die Tumorheimnung errechnet sich wie in Be-icpiel 1.

Wie aus Tabelle VI hervorgeht, bevrirken alle Proben eine Hemmung des Tumorwachstums. Insbesondere Proben mit einem DP über 50 zeigen eine starke Antitumorwirkung mit zahlreichen vollständigen Rückbildungen.

	Tabelle VI	durch- schnittl. TuDorge- wicht (g)	Tumor hemmung (Sä)	Anzahl mit voll ständiger Rück bildung/ Anzahl der behandelten Mäuse
Probe	Dosis mg/kg (ip)	5,46	_—_	0/6
		0,07	98,7	5/6
(W 565)	10x10	0,20 0,46	96,3 91,6	3/5 4/6
(W 540) ^TAK-^H (OT 380)	η H	0	100	6/6
(W 125)	Il	5,46		0/6
	......	0	100	6/6
S-II (W 82)	10x10	0,03	99,5	5/6
S-III (W 68)	It	0	100	6/6
TAK-D F-III (W 50)	Il	2,03	62,8	1/6
F-V (W 39)	«1	3,60	34,1	0/6
F-VI CW 24)	ti	1,54	71,8	1/6
F-VII (W 16)	Il

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- «5 - K/18 285

21*

Die Ergebnisse zeilen, daß sov;ohl TAII-II als auch TAII-D unabhängig von ihren D?-Verten das Tumorwachstum heramen.

Beispiel 4

Tunorheramcndc Wirkung von CIITAIC und Autoklaven-behandeltem CTITAIC

Die Antitunorwirkung dreier Arten von CIiTAK, das aus TAK-N (DP = 540) (CHTAK ITr. 1, 4, 5) hergestellt worden ist, und von Autoklaven-behandeltem CMTAK, wird gemäß Beispiel 2 untersucht. Man löst die Proben in destilliertem Wasser für die Injektion und stellt den pH auf etwa 7,0 ein. In einigen Experimenten wird eine der Proben (CIITAK Nr. 1) vor der Verabfolgung 25 Minuten in einem Autoklaven bei 120⁰C sterilisiert.

Wie aus Tabelle VII hervorgeht, inhibieren sämtliche CMTAK-Proben in einer Dosis von 10 me/kg das Tunorvaclistum signifikant. Diese Wachstum shernnung durch CIITAK wird bei Dosen von 1 bis 40 mg/kg beobachtet.

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Tabelle VII

K/ 18 235

Probe

Dosis durch- Tunor- Anzahl mit vollstän-

me/k°- schnittl- hennung di^er Rückbildung/ An-

CiC^⁰* Tuniorse- CO zahl der behandelten

^v ^yj wicht (-) Mäuse

	____	2,87	—_—_	0/7
CMTAK Ν_Γ.1·	10x9	0	100	7/7
	10x9	0,28	90 2	V7
Nr.5	10x9	O₁Ol	99,7	6/7
Autoklaven		3 65		0/6
behandelt		^J\ '
	flxlO	0,77	78,9	1/6
CMTAK Nr.l	J 3x10	0,03	99,2	5/6
	^5*10	0,23	93,7	4/6
Autoklaven		2.17		0/6
behandelt		ι '
	f 5^χΐθ	0	100	6/6
	10x10	0,07	9&_;8	5/6
CMTAK Nr₁I¹	15x10	0,08	96,3	5/6
	20x10	0,21	90,3	3/6
	^0x10	0,18	91,7	1/6

Die Ergebnisse zeilen, daß CHTAK ohne Verlust seiner Antitumor*.7irkun2 sterilisiert v;erden kann und sich in in^iziorbarer Form zur Krebsbehandlung eignet.

Beispiel 5

Timorh-smnende Wirkung von TAIC-IT. TAIC-D und QlTAK bei verschiedenen Applikationsarten

TAIC-II (DP= 540), TAIC-D (F-III; DP= 50); TAIC-D (F-VII; DP=16) und CI-ITAIC Ur. 1 werden in einer Dosis von 5 ag/k£ an 10 aufeinanderfolgenden Tagen an I CR-JCL-I lau se intravenös, subcutan bzw. intraperitoneal verabfolgt, denen 24 Stunden vor der

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K/ 18 285

ersten Injektion 4 χ 10 Zellen transplant!ert worden sind. Die Tumorhemmung errechnet sich vie in Beispiel 1.

Vie aus Tabelle VIII hervorgeht, ist in jedea Fall eine signifikante Hemmung des Tunorvachstuns zu beobachten. Bei intravenöser Verabfolgung inhibieren ΤΑΚ-Π, Q-I¹Z¹AK und selbst F-VII (DP = 16) das Tumorvachstum praktisch vollständig, wobei die Tumorhemmung mehr als 85 '/·> beträgt ur.d boi 4 oder 5 von 5 behandelten Mäusen eine vollständige Tumorrückbildung zu beobachten ist.

Tabelle VIII

Probe Dosis Applika- durch- Timor- Anzahl Lüt_voll-

t ,, ν tion schnittl. hemmung ständiger Kückbil-(mg/kg) _v /:'\ dung/Anzahl der be-

CiT

	^5 xlO	iv	0,84	87_;5	O/IG
CMTAK /	¹ 5 χ 10	SC	3,77	48 4	4/5
Kr.l \	( 5 x 10	iP	0,91		0/5
			7.30 ό		2/5
	f5 χ ίο	iv	2,72	iod«	0/10
TAK-N	I 5 χ ίο	SC	0 17	63	W/ XU 5/5
(LP 540)	(5 χ 10	ip	3 02	98	3/5
	[5 χ ίο	iv	0,91	59	V5
TAK-E	5 χ ίο	SC	2,30	88	2/5
F-III (LP 50) ^s	^5 χ ίο	iP	1 C6	68	3/5
	p χ 10	iv	2^67	85	3/5
TAK-D	J5X10	SC	2,34	63	4/5
F-VII (EP 16)	(5 χ 10	ip		68	3/5
			2/5

Die.Ergebnisse zeigen, daß TAK-N, CTlTAK und TAK-D bei Jeder Applikationsart tumorhemmend wirken.

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- -. K/ 18 285

a*

Beispiel 6

Tumorheinmende ^:.Iirlaing von TAK-IT. TAK-D und CITiUI bei der Verabfolguno: vor der Tunort ransraiantation: Vorbehandlung

TAK-II und TAIv-D mit verschiedenen durchschnittlichen Polyraerisationsgraden sowie C-ITAIv ITr. 1 werden ICR-JCL-Ilausen mit einen Körpergewicht von etwa 23 g in Dosen von 3 bis 80 mg/kg täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal verabfolgt. T>AK-H und TAIi-D sind hierbei in destilliertem Wasser suspendiert, während CMTAK gelbst ist. Im Falle von σίΤΑΚ wird der pH schließlich auf etwa 7,0 eingestellt. Am 1. bzw. 3. Tag nach der letzten Verabfolgung v/erden 6 χ 10 S 180-Zellen subcutan in die rechte Leistengegend der Tiere transplantiert. Am 35. Tag nach der Transplantation schneidet man die Tunorknoten aus und wiegt sie. Die Tumorhemmung errechnet sich wie in Beispiel 1.

V/ie aus Tabelle IX hervorgeht, ist bei jeder Probe eine ausgeprägte Hemmung des Tumorwachstums zu beobachten. Insbesondere TAK-N (DP =» 5^0), CMTAK und TAIC-D mit DP-'Jerten oberhalb 50 zeigen eine starke Henmwirlcung. QiTAK entfaltet eine tumorhemmende Wirkung selbst bei einer Dosis von 3 mg/kg.

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Taballc IX

„ . Ddgio Tag der durch- Tu-ior- A;-*.ahl mit voll-^Probe «E/kg ^T—
(i

ig/kg Injek- scVmittl. hc:^iui.g ständiger Rückbil-'ip) tion " 'Γ-ΛποΓΓς- {λ) dung/Ansahl dor be

5,CG 0/5

-5 tis-1 0_f?7 92,7 V6

-5^bi3-l 0,98 80,6 2/6

10,10 0/6

-I 0,20 98,0 V5

(IfGS) -1 0,35 96,5 5/6

T TTT

(I? 50) ^2Ox5 -5 Ws-I 1,50 67,1 3/5

(fe^V39) ^2Ox5 -5We-I 5,52 45,3 0/6

(fe^V2'0 ^2OX' -5Ws-1 ^,18 58,6 0/6

^2Cx5 -5Ws-1 5,64 42,2 ■ 0/6

6,4-5 0/6

/3*5 -5bic-l 1,44 77,6 3/5 ^?X5 -5Ws-I 3,55 44,8 1/6

\2Ox5 -5bis-l 0,05 99,2 4/6

5_tO3 0/5

(40x5 -5Ms-I 0,11 97,8 4/6

7^5 0/5

) -7bis-3 0,18 97,6 3/5

TAK-L

S^III 20x5 -7bis-3 0,75 89,9 4/5

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M/ 18 285

Die Ergebnisse zeigen, daß sich die genannten Polysaccharide zur prophylaktischen Krebsbehandlung eignen.

Beispiel 7

Tumorhenraende Wirkung von TAK-IT und CMTAK bei verschiedenen Tumorarten

Ehrlich-Carcinoma, CCTl-Adenocarcinoma, HTF-Reticulum-Zellen-Sarcoma und SlI-36 Leukäiaiezellen werden verwendet, um die Eignung von TAK-N und CIITAK zur Bekänpfung verschiedener Tumorarten zu untersuchen.

3,1 x 1O⁶ Ehrlich-Zellen, 1,1 x1O⁷ CCH-Zellen 4,5 x 1O⁶ 1!TP-Zellen bzw. 7,2 χ 10 SIT-35-Zellen v:erden ICR-JCL-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 23 g subcutan transplantiert, worauf man TAIC-N (DP = 540), das in destilliertem Wasser suspendiert ist, bzv. CmTAK Nr. 1, das in destilliertem Wasser gelöst ist (pH 7,0) und Autoklaven-behandelt worden ist, in Dosen von 10 bis 50 mg/kg täglich 10 Tage lang, beginnend 24 Stunden nach der Transplantation, intraperitoneal verabfolgt. Am 35. Tag nach der Transplantation werden die Tumoren ausgeschnitten und gewogen. Die Tumorhommung bei den behandelten Gruppen errechnet sich wie in Beispiel 1.

Wie aus Tabelle VII hervorgeht, ist in jeden Fall eine signifikante Hemmung des Tumorwachstuns zu beobachten.

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II/13 235

— el L _ ' "

	Probe	CMTAK IJr_#l	Dosis mg/kg (ip)	durch- schnittl.	'ίχαζοτ-	Anzahl nit voll ständiger Rückbil dung/ Anzahl der be-
Tumor	TAK-N (DP 540)	TAK-N (LP 540)	,' 10x10 <20x10 ^40x10	3,54 2,37 0,50	53,1 85,9 . _ Z3.7	0/5 0/5 2/6 0/5
Ehrlich- CarcinoLi	CMTAK Nr. 1	^i' . TAK-N KGticulum- zoll en- (DP 540)	(20x10 \40xl0	1,93 0,80 0,60	58,5 68,9	1/6 3/6 2/6
	TAK-N CCM-jtfeno-CEF 540)		20x10	3,42 0,79	76,9	0/6 2/6
	carcinom	20x10	3,42 1,03	69,9	1/6 1/6
Leukämie SN-3 6	f 10x10 ) 25x10 \ 50x10	0,91 0,18 0,19 0,23	80,2 79_tl 74,7	2/6 4/5 3/5 2/6
(10x10 \30x10	7,64 0,38 2,21	95,0 71,1	0/6 2/6 0/6

Die Ergebnisse zeisen, daß T/JC-II und CIIT.IIC gegen verschiedene Tumorarten, wie Sarkoma, Carcinoma, Adenocarcinoraa und Leukämie, eine Antitunorwirkung entfalten.

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Λ.

IV 18 285

Beispiel 8

Die vier CMTAK-Präparate (G-ITAII Hr. 2, 6, 9 und 11) v/erden jeweils nach dem Verfahren von Beispiel 4 in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und auf ihre V.'irkung gegenüber S-1CO-TumorzGllen geprüft. Alle Proben zeilen bei einer Ta^csdosis von 5 nij/kg pro Applikation nach 10 Tajon, besinnend 24 Stunden nach der Tumortransplantation, eine signifikante Unterdrückung des Tumorwachstums.

Beispiel 9

TAK-N (ersetzbar durch TAK-D oder QlTAK) I50 mg

Lactose 48 mg

Magnesiumstearat 2

insgesamt 200 mg Die genannten Mengen beziehen sich auf eine Kapsel.

TAK-N (TAIC-D oder QITAIC) und Lactose werden in den genannten Mengenverhältnissen vermischt, tablettiert und pulverisiert. Hierauf gibt man Magnesiumstearat zu und füllt das Gemisch in Kapseln ein.

Beispiel 10

TAK-N (ersetzbar durch TAK-D oder QITAK) 400 mg Lactose 95 ng

HPC-L (Hydroxypropylcellulose) 5 mg

insgesamt 500 mg Die genannten Mengen beziehen sich auf eine Dosierungseinheit.

Die drei Bestandteile werden in den genannten Mengenverhältnis sen vermischt, worauf man eine geringe Wassermenge zugibt, das Gemisch in einem Kneter knetet, granuliert, trocknet, nochmals granuliert, kassiert und zu Dosierungseinheiten verpackt.

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ι:/ 13 285

Beispiel 11

(a) 1 g TAK-D (DP =16) wird in 1COO ml destilliertem Wasser für die Injektion gelöst, v.^roraui nan filtriert und das Filtrat in 500 ral-Anteilen in Ampullen füllt. Nach dem Verschließen werden die Ampullen auf übliche "Weise hitzesterilisiert.

(b) 2 g CTITAK aus Beispiel 34 werden in 100 ml destilliertem Wasser für die Injektion (oder physiologischer Kochsalzlösung) gelöst und filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml-Anteilen in Ampullen gefüllt, die nach dem Abschmelzen auf übliche Weise hitzesterilisiert werden.

Beispiel 12

TAIv-II (ersetzbar durch TAJC-D oder CMTAK) Sorbit

llatriuracarboxynothylcellulose ToIysorbate o0

p-Hydroxybenzoesäureaethylester
p-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,4 mg

Die Bestandteile werden in destilliertem Wasser für die Injektion bis zu einem Gesamtvolumen von 4 ml gemischt. Bei Verwendung von CMTAK wird die Lösung gegebenenfalls mit 1/10 η Natronlauge neutralisiert.

__ Beispiel 13

3 g TAK-N (DP = 540) werden in 30 ml Isopropanol suspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf gibt man langsam unter Rühren innerhalb etwa 60 Minuten β ml einer 30prozentigen Matriurahydroxidlösung zu. Das Gemisch wird etwa 90 Minuten bei Raumtemperatur weiter kräftig gerührt, um eine Gelbildung zu vermeiden. Hierauf gibt man 3,6 g t'onochloresslgsäure zu und rührt das Gemisch 5 Stunden bei 60 bis 70⁰C, um die Carboxymethylierung durchzuführen. Das erhaltene Produkt wird abfiltriert und mit Methanol/Essigsäure (7 ι 3; V/V)

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160	mg
2CO	ms
10	mg
3,2	mg
4	mg

M/13 285

gründlich gewaschen. Der niederschlag wird abfiltriert, nacheinander nit cOprozentigen wäßrigem Methanol, Methanol und Aceton gründlich gewaschen und unter vemir.derten Druck getrocknet. Hierbei v/erden 2,9 g CIITAIC erhalten, dessen Carboccymethylgehalt (Anzahl der Carboxynethylgruppen pro Glucoserest) 0,54 beträgt.

Beispiel 14

1,5g TAK-N (DP = 540) werden in 40 ml Isopropanol suspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerUhrt. Hierauf gibt nan unter Rühren 2 ml einer 30prozentigen Natriunhydroxidlcsung in 4 Anteilen zu, d.h. jeweils 0,5 al in Zeitabständen von 15 Minuten. Das Genisch wird dann weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, worauf man 0,9 g Konochloressigsüure in 3 Anteilen zugibt, d.h. jeweils 0,3 g in Zeitabständen von 10 Minuten. Die Carboxynethylierung erfolgt 150 Minuten unter Rühren bei 50⁰C. Das erhaltene Produkt vird abzentrifirmiert, in 50 ml './asser gelöst und nit Essigsäure neutralisiert. Die neutrale Lösung wird mit 120 nl Methanol versetzt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugicrt, mit einem Gemisch aus 300 ml cOprozentigem wäßrigem Methanoi und 100 nl ethanol und dann mit einem Gemisch aus 300 ml oCprozentigem wäßrigen Methanol und 200 ml Ether gewaschen. Durch schließliche Gefriertrocknung des Produkts erhält man 1,7 g CMTAK mit einen Carboxymethylgehalt von 0,75.

Beispiel 15

1,5 g TAK-N (DP a 540) werden in 40 nl Isopropanol suspendiert und 30 Minuten bei Rauntenperatür gerührt. Hierauf gibt nan 4 ml einer 30prozentigen Natriumhydroxidlösung in 4 Anteilen zu; d.h. je 1 ml in Abständen von 15 Minuten, worauf man 90 Minuten bei Raumtemperatur rührt. Anschließend gibt man 1,8g Monochloressigsäure in 3 Anteilen zu, d.h. je 0,6 g in Abständen von 10 Minuten. Das Gemisch wird 150 Minuten bei 50⁰C gerUhrt, um die Carboxymethylierung durchzuführen. Das erhaltene

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3fr

M/ 18 285

Produkt wird abzentrifugiert, in 40 ml Wasser gelöst und mit Essigsäure neutralisiert. Die neutrale Lösung wird mit 90 ml Methanol versetzt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert, mit einen Gemisch aus 200 ml SOprozentigem wäßrigem Methanol und 100 nl Ethanol und dznn mit einem Gemisch aus 200 ml GCprozentigem wäßrigen Ethanol und 200 ral Ether gründlich geva3chen. Durch schließliche Gefriertrocknung erhält man 2,0 g σITAK mit einem Carboxymethylgehalt von 1,07.

Beispiel 16

3,2 g TjUC-N (DP = 255) v/erden in 33 ml Wasser suspendiert, v/o rauf man unter Rühren bei Rauntemperatur 1 g Natriumhydroxid und dann 2,4 g Natrium-monochloracetat zugibt. Die Carboxymeth]/lierung wird unter Rühren 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Hierauf versetzt man nochmals mit 1 g Natriumhydroxid und 2,4 g Natriun-monochloracetat und führt die Reaktion v/eitere 3 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur durch. Schließlich gibt man nochmals 1 g Natriumhydroxid und 2,4 g Natrium-monochloracetat zu ur.d setzt die Reaktion weitere 2 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur fort. Das Realctionsgemisch wird dann mit 1 Liter Ethanol versetzt, vorauf man den entstehenden Niederschlag gründlich auf einem Glasfilter mit Ethanol wäscht, bis das Filtrat keine Rotfärbung nit Phenolphthalein mehr ergibt. Durch Trocknen unter vermindertem Druck bei 5O⁰C erhält man 3,7 g eines Pulvers, das in 90 ml Wasser gelöst, mit Essigsäure neutralisiert und mit 210 ml 3thanol versetzt v.'ird. Der entstehende Niederschlag v;ird abzentrifugiert, nit CCprozentigem wäßriger. Ethanol gewaschen und gefriergetrocknet. Hierbei erhält man 2,5 g CIITAK mit einem Carboxynethylgehalt von 0,3C

Beispiel 17

6,4 g ΤΛΚ-Ν (DP = 255) v/erden in 66 ml Wasser suspendiert und unter Eiskühlung und Rühren mit 4 g Natriumhydroxid sowie 9,6 g Natrium-monochloracetat versetzt. Die Carboxymethylierung erfolgt unter Eiskühlung und 2stündigen Rühren. Hierauf gibt man

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^ M/ 18 285

nochmals 4 g Natriumhydroxid und 9,6 g Natriua-monochloracetat zu und rührt das Gemisch 3 Stunden unter Eiskühlung. Schließlich werden v/eitere 4 g Katriumhydroxid und 9»6 g "atriunmonochloracetat zugegeben, worauf man die Reaktion unter Eiskühlung und Rühren weitere 3 Stunden fortführt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 1 Liter Ethanol versetzt. Der entstehende Niederschlag wird auf einem Glasfilter gründlich mit Ethanol gewaschen, bis das Filtrat keine Rotfärbung mit Phenolphthalein mehr ergibt. Durch Trocknen unter vermindertem Druck bei 5O⁰C erhält man 8,6 g eines Pulvers, das in 172 ml Wasser gelöst und mit Essigsäure neutralisiert wird. Bei Zugabe von 480 ml Ethanol erhält man einen niederschlag, der abzentrifugiert, mit SOprozentigem wäßrigen Ethanol gewaschen und gefriergetrocknet wird. Hierbei erhält nan 5,6 g CMTAK mit einem Carboxymethylgehalt von 0,36.

Beispiel 18

1,5g TAK-D (F-I, DP » 299) werden in 40 ml Isopropanol suspendiert und gemäß Beispiel 14 carboxymethyliert. Durch Auswaschen des Produkte gemäß Beispiel 14 erhält man 1,9 g CMTAK mit einem Carboxymethylgehalt von 0,59·

Dasselbe TAK-D wird in 40 ml Isopropanol suspendiert und wie in Beispiel 15 carboxymethyliert. Durch Auswaschen des Reaktionsprodukts gemäß Beispiel 15 werden 2,2 g CIlTAK mit einem Carboxymethylgehalt von 1,15 erhalten.

Beispiel 19

1,5 g TAK-D(F-II, DP« 113) bzw. TAK-D(S-III, DP » 68) werden in 40 ml Isopropanol suspendiert und wie in Beispiel 14 carboxymethyliert. Die jeweiligen Reaktionsprodukte werden abzentrifuglert, in 40 ml Wasser gelöst und mit Essigsäure neutralisiert. Jede der beiden neutralen Lösungen wird mit 90 ml Methanol versrttt, worauf man den entstehenden Niederschlag abrentrifugiert, zunächst mit 200 ml eOprozentigem wäßrigem Methanol und dann mit 200 ml wäßrigem Ethanol gründlich wäscht und

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schließlich gefriertrocknet. Hierbei v;erden die folgenden zwei Arten von CMTAIC erhalten:

Ausbeute Carboxymethylgehalt

CHTAK (erhalten aus F-II) 1,4 g 0,51 CMTAX (erhalten aus S-III) 1,4 g 0,36

Beispiel 20

1,5g TAK-D(F-II; DP « 113) bzv. TAK-D(S-III, DP « 68) werden in 40 ml Isopropanol suspendiert und gemäß Beispiel 15 carboxymethyliert. Die Reaktionsprodukte werden wie in Beispiel 19 gewaschen. Hierbei erhält can die folgenden beiden Arten von CMTAK:

Ausbeute Carboxymethylgehalt

CHTAK (erhalten aus F-II) 2,3 1,22

CMTAK (erhalten aus S-III) 1,4 0,45

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ι 3>· .. Leerseite

Claims

Patentansprüche

( 1. ' Carboxyniethylierte 3-1,3-Gluca:ie dsr allgemeinen For mel I

CH₂OE

i\ OR H OHS| I/ H

II GE

CH

H CE

CH₂OR

(D

in der mindestens einer der :-i3st9 R die Gruppe: -CIi₀CCCI-I ist und die übrigen P.este R ö*e.i:ebensnfalls »'asserstoffator.ie sind und η eine Zahl von 0 "bis et'.vc 1CCO ist, sov:ie deren SaIs:-.
2. Verfahren zur "crst;llur:j der V;rcinuur^-:.n r_f.c.".. Anspruch 1, dadurch ^ckGi::--«io]r-Uct, via.'; ι:.ζχι ein \-Ξ.ζαer-u;:löalichr?s ß-1, J—C-lv.can, üc.z in Coi;c.:v..^rc.r-: ve:, \..\sozr box cii.'.-·.. durchschnittIichen Poljcierisctioi'-c^rac von 170 vän-ie^elisrOa ist, oder ein iiiederpolj'rr.erss dieses Glr.c?.r.s cs.T^oy.y.izt'r.-jliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g-^si^ der durchschnittliche Polynerisations^rad dos Glue ans bzv;. des liiederpol^eren 5 bis 1COC beträgt, gemessen nach der Hethode von Kanners et al., Carbohydrate Researched. 17,

3. 109 (1971).
4. Antitunormittel, enthaltend ein vasserunlösliches

ß-1,3-Clucan, das in Gec"er.-.:art von ",.'asser bei einer, durchschnittlichen Polynerisationsijrad von 170 würme^elieroar ist, ein durch teilweise Hydrolyse dieses Glueans herstellbares I>iiedeipolyr.ieres und/oder ein carcoxyraethyliertes Derivat dieses Glucans oder iliederpolyneren.

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5. Antitur.iomittel nach Anspruch 4, dadurch £el:ennzeichnet, daß der durchschnittliche Polynerisationsrrad des ß-1,3-Glucans bzv/. des iliederpolyneren 5 bis 10C0 ceträgt, gemessen nach der Methode von lianners et al, Carbohydrate Research 3d. 17, S. 109 (1971), und daß das carboxyl.-ethylierte Derivat aus diesen Glucan bzw. Niederpolymeren herstellbar ist.
6. Antxturaonaittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der durchschnittliche Polynerisationsgrad des 3-1,3-Glucans bzv/. des Uiederpolyneren 15 bis 300 betragt, gemessen nach der Methode vor, !!armors et al, Carbohydrate Research 3d. 17, S. 109 (1971), und daß das carboxyrnethylierte Derivat aus diesem Glucan bzv/. Iliederpolyneren herstellbar ist.
7. Antitunorrnittel nach Anspruch 4, dadurch gel:ennzoichnet, daß der durchschnittliche Polyuerisatior.sgrad des ß-1,3-Glucans bzw. d-?s Uiederpolyneren 40 bis GCC beträft, Gemessen nach der Methode von liaiu-crs et al, Carbohydrate ?.ecc-ax*ch 2d. 17, C. 1C3 (1971), u::d Ci?. das carooxy:.;c;hyli2rte Derivat aus diesow Glucan bzv;. ITiedDrpolyxeron herstellbar ist.

ρ η q R ? 1 / η π ? 3

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