DE3824110A1

DE3824110A1 - Verfahren zur herstellung und reinigung von an ihrem 5'-ende phosphorylierten oligo- und jpolynukleotidsequenzen und reagenz zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3824110A1
Application number: DE3824110A
Authority: DE
Inventors: Juergen Dipl Chem Wippler; Hans Joachim Dr Fritz; Matthias Dipl Chem Cramer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-07-15
Filing date: 1988-07-15
Publication date: 1990-01-18

Description

Die Erfindung betrifft ein Phosphorylierungsreagenz, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von an ihrem 5′-Ende phosphorylierten Oligo- und Polynukleotidsequenzen unter Verwendung des Phosphorylierungsreagenzes.

Oligo- und Polynukleotide finden als Träger von Erbin formation in der Gentechnologie eine weite Verwendung. Ihre chemische Synthese erlangt daher mit dem Fortschreiten der Biotechnologie immer mehr an Bedeutung. So sind bisher schon die Gene für pharmakologisch wirksame Sub stanzen wie Insulin, Interferron oder Somatostatin hergestellt worden.

Die Synthese von Polynukleotiden erfolgt entweder auf enzymatischem oder chemischem Wege. Bei der chemischen Synthese wird im allgemeinen so vorgegangen, daß man die 3′- bzw. 5′-Hydroxygruppen und gegebenenfalls weitere Hydroxy- oder Aminogruppen der Nukleoside in üblicher Weise schützt und mittels reaktiven Phosphorver bindungen zwei Nukleoside durch eine 3′,5′-Internukleotid phosphodiesterbindung verknüpft. Im allgemeinen wird die gezielte Synthese von Biopolymersequenzen wie z.B. Polynukleotiden an Festphasen bevorzugt. Dabei wird an einer festen Phase ein erstes Nukleosid bzw. Nukleotid gebunden und anschließend mittels bekannten chemischen oder enzymatischen Verfahren durch stufenweises Aneinander knüpfen der jeweiligen Nukleotide das gewünschte Polynuk leotid aufgebaut. Eine solche Festphasensynthese zeigt eine Reihe von Vorteilen gegenüber einer Synthese in Lösung, da die wachsende Polynukleotidkette auf einfache Weise von anderen Komponenten des Reaktionsgemisches abgetrennt werden kann. So ist es z.B. möglich, chromato graphische Trennmethoden durch einfache Wasch- und Filtrationsverfahren zu ersetzen und die Reaktionen beliebig oft zu wiederholen, um auf diese Weise die Ausbeuten zu erhöhen. Auch die Löslichkeit der einzel nen Polynukleotidderivate ist bei dieser Vorgehensweise nicht mehr von Bedeutung, da die einzelnen Reaktionen in heterogener Phase ablaufen. Aufgrund der einfachen Wasch- und Filtrationsmethoden an einer Festphase wird es möglich, die Polynukleotidsynthese automatisch durchzuführen.

Als besonders geeignet für die Synthese an festen Phasen hat sich die phosphoramitidmethode von Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H. J. Am. Chem. Soc. (1981) 103, 3185-3191 erwiesen.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß alle üblichen Synthese verfahren den Nachteil haben, daß sie nach dem Entschützen Polynukleotide mit einem freien 5′-Hydroxyende ergeben. Solche nicht phosphorylierten Polynukleotide sind jedoch für biologische Prozesse normalerweise nicht brauchbar, weil in der Regel dafür Nukleotidketten benötigt werden, die an ihrem 5′-Ende einen Monophosphat rest aufweisen.

Obwohl es wünschenswert ist, bei der Synthese auch die 5′-Endphosphorylierung auf chemischem Wege durchzuführen, um auch diesen Syntheseschritt automatisch durchführen zu können, werden aufgrund mangelnder Praktikabilität der bekannten chemischen Reagenzien weiterhin enzymatische Phosphorylierungsmethoden bevorzugt. Solche enzymatischen Phosphorylierungen mit z.B. Polynukleotidkinase und ATP weisen jedoch den Nachteil auf, daß aufgrund von inaktivem Enzym, ungenau eingestelltem Puffer oder dem Auftreten von inhibierenden Stoffen die Kinasereaktion nicht oder nur unvollständig abläuft.

Längere Polynukleotide sind ab einer Größe von etwa 40 Basen aufwärts in der Polyacrylamidgelelektrophorese analytisch schlecht von sequenzgleichen, nicht 5′-phos phorylierten zu unterscheiden, so daß es schwierig ist, die Reinheit des Produktes zu überprüfen. Eine hohe Reinheit an 5′-phosphoryliertem Material ist jedoch z.B. bei der Klonierung von Genen unbedingt erforder lich, da auch die nichtphosphorylierten Polynukleotide mit dem entsprechenden Gegenstück der DNA beim Klo nieren hybridisieren, ohne jedoch ligiert zu werden. Die Anwesenheit solcher 5′-Hydroxypolynukleotide führt somit zu geringen Ausbeuten an kloniertem Material.

Dies hat zu einer Reihe von Versuchen geführt, die End phosphorylierung von Oligonukleotiden auf rein chemischem Wege durchzuführen.

E. Ullmann und J. Engels, Tetrahedron Letters, (1986) 27, 1023-1026 beschreiben ein Verfahren zur Phosphory lierung des 5′-Endes eines Oligonukleotides durch chemische Umsetzung mit einem monovalenten Phosphory lierungsmittel. Dabei wird das Nukleotid mit einem Phosphorylierungsmittel auf Phosphoramiditbasis umge setzt und mittels Standardverfahren zum Phosphat oxi diert. Wird dabei ein Phosphorylierungsagens verwendet, das eine Nitrophenylethylgruppe enthält, dann kann der damit erhaltene 5′-Phosphodiester an einer Reversed Phase HPLC vom nicht umgesetzten Material abgetrennt werden. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß eine schonende Entschützung und gleichzeitige Reinigung an einer festen Phase nicht möglich ist. Außerdem besitzt die Nitrophenylethylgruppe nur eine geringe Hydrophobizität, so daß entsprechende Oligonukleotide mit Basenlängen größer als 15 schlecht mittels Reversed Phase HPLC zu reinigen sind.

EP-A 8 51 10 454 beschreibt die Abtrennung und Reinigung von durch Tritylierung an ihrem 5′-Ende lipophil ge schützten Oligonukleotiden von nicht umgesetztem Material mittels hydrophober Wechselwirkung an einer Reversed Phase Matrix. Auf diese Weise werden jedoch keine 5′-Phosphatoligonukleotide erhalten.

T. Horn und M.S. Urdea, DNA (1986) 5, 421-426 beschrei ben eine chemische Phosphorylierung des 5′-Endes nach der Phosphoramiditmethode, die zur Anwendung bei der automatischen Oligonukleotidsynthese geeignet ist. Dabei wird ein an eine feste Phase gebundenes Oligo nukleotid mit Bis-(β-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylamino phosphin umgesetzt. Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß die Schutzgruppen schon beim Lösen der Oligonukleotidkette von der Festphase abgespalten werden. Damit besteht keine Möglichkeit, die Phosphat schutzgruppe zur Reinigung auszunutzen. Aus diesem Grunde müssen die Schutzgruppen von dem fertigen phos phorylierten Oligonukleotidprodukt mittels zeitauf wendigen und verlustreichen chromatographischen Verfah ren abgetrennt werden.

G.R. Gough et al., Proceedings of the International Symposium on Chemical Synthesis of Nucleic Acids, Egestorf, Deutschland 1980, (ISBN 0 904147 26 6) Seite 99 bis 102 beschreiben ein Verfahren zum Einführen von 3′- bzw. 5′-Phosphatabkömmlingen in Oligodesoxyribo nukleotiden. Dabei wird in einem Lösungsmittel ein an seinem 3′-Ende mit einem Ribonukleotid versehenes ge schütztes Trinukleotid mit einem 2′,3′-tritylierten Uridin durch eine 5′-5′-Phosphodiesterbindung zu einem Tetranukleotid verknüpft, welches anschließend mittels einer ersten Perjodatoxidation, der eine Detritylierung mit anschließender enzymatischer Behandlung durch eine Phosphatase folgt und mittels einer zweiten Perjodat oxidation zum 5′-phosphorylierten Dinukleotid umgesetzt wird. Dieses Verfahren zeigt jedoch eine für die Syn these von Polynukleotiden viel zu geringe Ausbeute und ist zudem nicht an einer festen Phase durchführbar. Um reine Oligonukleotide zu erhalten sind deshalb zeitauf wendige und an Substanz verlustreiche Chromatographiever fahren notwendig. Die Herstellung von Polynukleotiden ist bei den angegebenen Ausbeuten von maximal 70% für einen einzigen Verfahrensschritt nicht möglich.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die zu vor geschilderten Nachteile zu überwinden und ein che misches Verfahren zur Herstellung von an ihrem 5′-Ende phosphorylierten Oligo- und Polynukleotidsequenzen bereitzustellen, das an einer festen Phase durchgeführt werden kann und durch das auf einfache Weise und mit hoher Ausbeute insbesondere auf automatischem Wege die jeweils gewünschten Polynukleotidsequenzen erhalten werden.

Diese Aufgabe wird durch das in den Ansprüchen defi nierte Verfahren gelöst.

Erfindungsgemäß werden die Polynukleotide in der jeweils gewünschten Sequenz nach an sich bekannten Verfahren gewonnen. Dabei wird im allgemeinen so vorgegangen, daß man die 3′- und 5′-Hydroxygruppen und gegebenenfalls noch weitere Amino- oder Hydroxygruppen der Nukleoside in üblicher Weise schützt und mittels reaktiven Phosphor verbindungen zwei Nukleoside durch eine 3′-5′-lnternukleo tidphosphordiesterbindung verknüpft. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. zusammenfassend in E.L. Winnacker, Gene und Klone VHC 1985, Seiten 44 bis 61, die hiermit ausdrücklich zum Teil der Beschreibung gemacht wird, beschrieben.

Im erfindungsgemäßen Verfahren finden sowohl Polydes oxyribonukleotide als auch Polyribonukleotide Verwen dung, jedoch müssen bei letzterem die 2′- und 3′-Hydroxy gruppen in geschützter Form vorliegen.

Die so auf herkömmliche Art gewonnenen 5′-Hydroxy polynukleotide werden erfindungsgemäß an ihrem unge schützten 5′-Ende mit einem Phosphorylierungsreagenz umgesetzt, welches in gamma- und delta-Stellung zum Phosphorester einen gegebenenfalls geschützten Diol und in beta-Stellung eine positive Austrittsgruppe, vorzugs weise ein H-Atom aufweist und das einen an einer Reversed Phase Matrix haftenden hydrophoben Rest enthält oder ein an einen Antikörper bindendes Hapten aufweist. Anschließend werden die zum Phosphor gamma- und delta ständigen Hydroxyde zu Aldehyden oxidiert und die kationische Austrittsgruppe, die vorzugsweise ein Proton darstellt und mittels einer Base abstrahiert wird, abgespalten. Durch diese β-Eliminierung wird die Phosphordiesterbindung gelöst und die 5′-phosphorylierte Polynukleotidkette freigesetzt.

Vorzugsweise wird ein Phosphorylierungsreagenz der allgemeinen Formel I

verwendet, wobei
P eine mit einer OH-Gruppe reaktive Phosphat- oder Phosphitgruppe und
R eine abspaltbare OH-Schutzgruppe darstellt,
X=E, OH, Halogen, Alkyl oder Alkoxy ist oder eine O-, N-, Alkylen- oder Oxyalkylenoxy-Brücke zu B, B₁ oder B₃ darstellt,
einer der Substituenten B bis B₃ eine hydrophobe Veranke rungsgruppe oder ein an einen Antikörper bindendes Hapten darstellt, die anderen Substituenten B bis B₃ H oder niedrig Alkyl, B₂ auch eine Einfachbindung, bedeu ten.

Stellt X eine Brücke zu B, B₁ oder B₃ dar, so ist es ein Sauerstoffatom, welches über eine Etherbindung die Brücke herstellt, ein N-Atom oder eine Alkylen- oder Oxyalkoxygruppe und vorzugsweise eine Methylengruppe. Ist P eine Phosphitgruppe, so wird diese vorzugsweise mit Jod zum Phosphat oxidiert.

Besonders bevorzugt sind solche Reagenzien, bei denen die beiden benachbarten Hydroxylgruppen des Diols in cis-Stellung zueinander stehen.

In der obigen Formel sind unter einer hydrophoben Verankerungsgruppe solche Gruppen zu verstehen, die an einer Reversed Phase Matrix haften. Im erfindungsgemäs sen Verfahren werden dafür zweckmäßigerweise Alkylgrup pen mit 6 bis 20, insbesondere mit 8 bis 18 C-Atomen, eine Arylgruppe, eine substituierte Aryl- oder hetero cyclische Arylgruppe oder substituierte Alkylgruppe verwendet. Vorzugsweise stellt B eine Naphthyl-, eine Mono-, Di- oder Trinitrobenzyl- oder eine Dinitrobenzyl oxyethylgruppe dar.

Zweckmäßigerweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren solche Reagenzien verwendet, bei denen X eine Brücke zu B derart ausbildet, daß ein Ring entsteht, der die bei den benachbarten Hydroxyle enthält. Vorzugsweise ist dabei X ein Sauerstoffatom und als Ringsystem wird zweckmäßigerweise ein Zucker verwendet.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Reste sind N³-sub stituierte Uracile, im besonderen N³-(3,5-Dinitrobenzyl oxyethyl)-2′,3′-o-dibenzoyluracil und N³-Octyl-2′,3′- dibenzoyluracil. Es hat sich gezeigt, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut mit N³-Octyl- 2′,3′-o-dibenzoyluridin-5′-o-(2-cyanoethyldiisopropyl amido-phosphit) oder mit N³-(3,5-dinitrobenzyloxyethyl)- 2′,3′-o-dibenzoyluridin-5′-o-(2-cyanoethyl)-diisopropyl amidophosphit als phosphorylierungsreagenz durchführen läßt.

Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich solche Rea genzien zu verwenden, bei denen B ein Hapten darstellt. Dabei werden zuerst in an sich bekannter Weise Antikör per, vorzugsweise monoklonale Antikörper, die gegen das gewünschte Hapten gerichtet sind, erzeugt und isoliert und mittels üblichen Verfahren an einer Matrix immobili siert. Bevorzugt wird als Hapten eine Dinitrophenylben zyloxyethylgruppe oder Dinitrophenyl-ε-aminohexansäure.

Das Phosphorylierungsreagenz der allgemeinen Formel I wird durch dem Fachmann bekannte Kupplungsreaktionen an das 5′-Ende der Nukleotidkette ansynthetisiert. Dabei wird das freie 5′-Hydroxyende der Kette mit der Phos phat- bzw. Phosphitgruppe umgesetzt. Zweckmäßigerweise wird hierbei nach dem gleichen Verfahren vorgegangen, das auch zur Synthese der Polynukleotidkette angewendet wird, wobei man vorzugsweise nach dem sogenannten Phosphoramiditverfahren vorgeht. In diesem Fall wird erfindungsgemäß ein Reagenz der allgemeinen Formel I verwendet, bei dem der Rest P ein Amidophosphitrest ist. Dabei wird das Reagenz üblicherweise in Gegenwart von Tetrazol mit dem Polynukleotid umgesetzt.

Das Abspalten der Schutzgruppen wird mittels üblichen bekannten Verfahren durchgeführt. Wird das erfindungs gemäß bevorzugte Reagenz mit Benzoyl geschützten Hydroxy len und mit Cyanoethylphosphitestern verwendet, so ist es möglich, beide Schutzgruppen gleichzeitig abzuspalten. Dafür wird vorzugsweise eine wäßrige Ammoniaklösung verwendet. Das Entschützen kann jedoch auch in zwei getrennten Stufen durchgeführt werden, wobei zuerst die Cyanoethylgruppen in nicht wäßriger Lösung mit einer starken organischen Base abgespalten werden. Als starke Base wird vorzugsweise Diisopropylethylamin und insbe sondere 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en und als Lösungsmittel Pyridin verwendet. Anschließend werden die O-Benzoylgruppen und die Schutzgruppen der Nukleo basen mit konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung abge spalten. Dieses zweistufige Verfahren hat zum Vorteil, daß dabei keine Aminolyse der Phosphortriestergruppe auftreten kann.

Nach dem Entschützen wird die phosphorylierte Polynuk leotidkette an eine Matrix gebunden und von den Reagen zien und vom nicht umgesetzten Material abgetrennt. Als Matrix wird erfindungsgemäß eine Reversed Phase Matrix oder eine Affinitätsmatrix verwendet.

Als Reversed Phase Matrix wird vorzugsweise ein käuf liches Präparat verwendet, wie es von verschiedenen Firmen, wie z.B. Kieselgel 60 RP-18 der Firma Merck, Darmstadt, vertrieben wird. Üblicherweise handelt es sich dabei um mit längerkettigen Kohlenwasserstoffen beschichtetes Kieselgelmaterial, wobei erfindungsgemäß Materialien Verwendung finden, die mit einer Kohlenwas serstoffkette von C₈ bis C₁₈ beschichtet sind. Je nach Art des aufzutrennenden Materials ist es jedoch möglich, auch andere Reversed Phase Materialien zu verwenden.

Als Affinitätsmatrix wird erfindungsgemäß eine Matrix verwendet, die immobilisierte, vorzugsweise monoklonale, Antikörper enthält, die gegen das Phosphorylierungsagens und zwar im besonderen gegen den Rest B als Hapten gerichtet sind. Die Herstellung und Isolierung von gegen ein bestimmtes Hapten gerichteter Antikörper ist dem Fachmann bekannt. Die Antikörper werden in an sich bekannter Weise auf ein Trägermaterial immobilisiert. Zweckmäßigerweise werden solche Trägermaterialien verwendet, die mit dem Antikörper kuppelnde Gruppen enthalten, wie z.B. reaktive Polystyrole, insbesondere Chlormethylpolystyrol oder Oxirane enthaltende Polyacryl amidkugeln, die unter dem Namen Eupergit C von der Firma Röhm Pharma GmbH, Weiterstadt, erhältlich sind.

Obwohl es auch möglich ist, das erfindungsgemäße Ver fahren im sogenannten Batch-Verfahren durchzuführen, wird das Matrixmaterial vorzugsweise in eine Säule ge füllt verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl mit einfachen, mit dem Matrixmaterial gefüllten Säulen als auch mit entsprechend gefüllten HPLC-Säulen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungs form werden einfache Kartuschen, wie z.B. eine RP-C18- Kartusche der Firma Baker, Phillipsburg, New Jersey, USA, verwendet.

Die Oxidation der Diole wird zweckmäßigerweise an den festphasengebundenen Polynukleotiden durchgeführt. Dabei wird das mit Substanz beladene Matrixmaterial mit einer Lösung eines Oxidationsmittels behandelt. Als Oxidationsmittel finden alle Substanzen Verwendung, die Hydroxygruppen schonend zu Aldehyden oxidieren. Vorzugs weise werden jedoch Perjodate und Bleitetraacetate verwendet.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Darstellung des Phosphorylierungsreagenzes. Dabei wird ein Diol der allgemeinen Formel II

in der Y bis Y₃ gleich B bis B₃ sind oder eine mit B bis B₃ verknüpfbare Gruppe darstellen und X und B bis B₃ die in Anspruch 1 definierte Bedeutung aufweisen, zuerst mit einem die benachbarten Diolhydroxyle schützen den Reagenz und dann die endständige Hydroxygruppe mit einer Phosphorverbindung der allgemeinen Formel (R₁R₂R₃)P (R₁R₂R₃)PO oder P(R_1-5)₅ umsetzt, wobei die Reste R₁-R₅ gleich oder verschieden sind und gut hydrolysierbare Austrittsgruppen darstellen.

Die Herstellungsweisen solcher Diole der allgemeinen Formel II sind vielfältig und dem Fachmann bestens bekannt. So ist es z.B. möglich, ausgehend von einer β, γ-ungesättigten Fettsäure durch Reduktion der Car bonsäurefunktion mit LiBH₄ einen γ, δ-ungesättigten Alkohol darzustellen, der wiederum durch Umsetzen der Doppelbindung mit HOCl oder vorzugsweise mit OsO₄ oder MnO^- ₄ in den gewünschten Diol überführt wird. Eine weitere Möglichkeit, Verbindungen der Formel II darzu stellen besteht in der Umsetzung von Glycerinaldehyd mit Acetaldehyd mittels einer Aldoladdition und an schließender Verknüpfung des Restes B mit der Aldehyd funktion sowie Oxidation der gebildeten Doppelbindung zum Diol.

Bevorzugt wird als Diol der allgemeinen Formel II ein Kohlenhydrat, insbesondere ein Zucker wie ein Penta- oder Hexasaccharid verwendet. Zweckmäßigerweise werden dazu erfindungsgemäß Ribosen, Glucosen, Mannosen, Allosen und andere geeignete Zucker verwendet, die leicht mit einem Rest B auf an sich bekannte Weise ver knüpft werden. Besonders bevorzugt werden erfindungsge mäß Ribonukleoside wie z.B. Adenosin, Uridin, Guanosin, Cytidin, Inosin und Thymidin oder andere mit Ribose verknüpfte Naturstoffe wie z.B. Riboflavine als Diole der allgemeinen Formel Il verwendet.

Solche leicht zugänglichen Diole werden gegebenenfalls nach dem Schützen weiterer reaktiver Gruppen mit einem Hapten oder einer hydrophoben Verankerungsgruppe wie z.B. einer langkettigen Fettsäure, einem Alkohol oder einem aromatischen Ringsystem wie Naphthalin bzw. deren substituierten Derivate umgesetzt.

Diese hydrophoben Reste bzw. das Hapten wird, sofern es nicht schon von vorneherein im Diolmolekül vorhanden ist, wie z.B. bei langkettigen Alkoholen, mittels dem Fachmann bekannten Verfahren mit dem Diolrest verknüpft. Hierfür haben sich insbesonders Reaktionen mit einer Aldehydgruppe oder auch einfache nukleophile Substitut ionen z.B. mittels Jod oder Paratolulsulfonat als Aus trittsgruppen bewährt.

Als Schutzgruppen für die benachbarten Diole sind insbesondere Benzoesäure oder Aceton geeignet, die zu den entsprechenden Benzoesäureestern bzw. zur Isopropyliden verbindung unter Wasserabspaltung umgesetzt werden, und als Schutzgruppe für die endständige üblicherweise 5′-Hydroxygruppe wird vorzugsweise ein Dimethoxytrityl chlorid oder ein Anisoylderivat verwendet.

Als Phosphorverbindungen, die erfindungsgemäß mit dem freien Hydroxylende des Diols umgesetzt wird, haben sich sowohl drei- als auch fünfwertige Verbindungen des Phosphors als geeignet erwiesen. Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren jedoch dreiwertige Phosphor verbindungen wie Phosphoramidite verwendet, die nach Verknüpfung mit dem freien Hydroxyende des Diols der allgemeinen Formel II mittels Jod zum fünfwertigen Phosphat oxidiert werden. Insbesondere wird diese Oxi dation nach dem Umsetzen des erfindungsgemäßen Phos phorylierungsreagenzes der allgemeinen Formel I mit dem Polynukleotid durchgeführt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, an ihrem 5′-Ende phosphorylierte Polynukleotide auf einfache Weise und mit hoher Ausbeute herzustellen, ohne daß das Produkt die in biologischen Experimenten störenden, nicht phosphorylierten Polynukleotide enthält.

Auf diese Weise können Polynukleotide mit Längen von über 50 Monomeren hergestellt werden, die auch in einer Polyacrylamid Gelelektrophorese ein reines Produkt zeigen. Werden die erfindungsgemäß bevorzugten Phosphor amiditderivate als Phosphorylierungsreagenz der allge meinen Formel I verwendet, so ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in der gebräuchlichen DNA-Syn thesestrategie anzuwenden. Die erfindungsgemäßen Phos phorylierungsreagenzien sind leicht zugänglich und die Reinigung und Abspaltung der jeweiligen Reagenzien werden mit einfachen käuflichen Substanzen durchgeführt. Durch das Anlagern der Polynukleotide an eine feste Phase ist das zeitraubende und verlustreiche Abtrennen der Reagenzien mittels chromatographischen Methoden unnötig geworden, da diese einfach mit einem Lösungsmit tel abgespült werden. Die Gewinnung des gereinigten 5′-phosphorylierten Polynukleotids wird mit üblichen Reversed-Phase-HPLC-Puffern durchgeführt. Diese sind dampfflüchtig und entweichen daher bei der Gefrier trocknung. Auf diese Weise wird ein Polynukleotid erhalten, das sich völlig gleich verhält wie ein her kömmlich durch eine enzymatische Kinasereaktion gewonne nes 5′-phosphoryliertes Polynukleotid. Da sämtliche Verfahrensmaßnahmen an fester Phase und durch Zupipet tieren der gelösten Reagenzien durchgeführt werden ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zu automati sieren. Dadurch kann die Reinigung und anschließende Klonierung dieser Oligonukleotide an einem einzigen Tag durchgeführt werden.

Beispiel 1 Synthese der Dinitrobenzyloxyethyl-Monomere 1. 3,5-Dinitrobenzyloxyethanol

In 100 ml Tetrahydrofuran werden zuerst 70 ml Glykol und dann 0,67 g Natrium (28,0 mMol) gelöst und nach Abkühlen auf 0°C 5,0 g 3,5-Dinitrobenzyl chlorid (26,0 mMol, gelöst in 40 ml Tetrahydrofuran) innerhalb 2 Stunden unter Rühren bei 0°C zugetropft. Man läßt die Lösung sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt, bis die Reaktion vollständig abgelaufen ist. Das Reaktionsende wird mittels einem Dünnschicht chromatogramm bestimmt, Eluens: Essigsäureethylester; rF=0,58. Anschließend wird der gesamte Ansatz mit 700 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase schüttelt man zweimal mit je 100 ml Dichlormethan und wäscht anschließend zweimal mit je 300 ml Wasser. Nach dem Trocknen der Dichlormethan-Phase wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Toluol kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 4,2 g (66,7%). Im ¹H-NMR sind die ¹H-Resonanzen qualita tiv und quantitativ dem Produktmolekül zuortbar. Das Massenspektrum zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 242 (berechnete relative Molekular masse (C₉H₁₀N₂O₆):242).

2. p-Toluolsulfonsäure-(3,5-dinitrobenzyloxy)-ethyl ester

4,0 g 3,5-Dinitrobenzyloxyethanol (16,3 mMol) und 6,0 g p-Toluolsulfonsäurechlorid (28,0 mMol) werden in 80 ml Pyridin gelöst und bei Raumtempera tur gerührt. Das Reaktionsende ist nach ca. 3 Stun den erreicht. Das Reaktionsende wird mittels einem Dünnschichtchromatogramm bestimmt. (Eluens: Essig säureethylester, n-Hexan 7 : 3; rF=0,82). Nach Abdampfen des Pyridins unter Vakuum wird der Rückstand mit 700 ml 5%iger Na₂CO₃-Lösung ausge schüttelt. Die organische Phase schüttelt man zuerst zweimal mit je 100 ml Dichlormethan aus und wäscht anschließend zweimal mit je 300 ml Wasser. Nach dem Trocknen der Dichlormethan-Phase über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel unter Vakuum abge dampft und der Rückstand aus Toluol kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 5,9 g (91,4%). Im ¹H-NMR sind die ¹H-Resonanzen qualitativ und quantitativ dem Produktmolekül zuortbar. Elementaranalyse, berechnet (%)/ gefunden (%), (C₁₆H₁₆N₂O₈S₁): C, 48, 48 / 49, 47; H, 4,07 / 4,14; N, 7,07 / 7,30. Das MS zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 396 (berechnete relative Molekularmasse: 396).

3. 5′-O-4,4′-Dimethoxytrityl-2′,3′-O-dibenzoyluridin

Zu einer Lösung von 6,0 g Uridin (24,6 mMol) in 90 ml Pyridin werden bei 0°C 9,15 g 4,4′-Dimethoxy tritylchlorid (27,1 mMol) gegeben. Nach einer Stunde Reaktion bei 0°C und weiteren drei Stunden bei Raumtemperatur, wobei die Reaktion durch Dünn schichtchromatographie kontrolliert wird (Eluens: Dichlormethan, Ethanol, Pyridin 94,5 : 5 : 0,5, rF=0,23) werden 6,6 ml Benzoylchlorid zugegeben und weitere 30 Minuten gerührt (rF=0,70). Hiernach hydrolysiert man mit 20 ml H₂O für 15 Minuten und dampft im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit 600 ml 5%iger Na₂CO₃-Lösung ausgeschüttelt und dreimal mit 70 ml Dichlormethan extrahiert. Nach Trocknen der Dichlor methanphase über Na₂SO₄ dampft man das Lösungsmittel ab. Durch mehrmaliges Auflösen und Abdampfen des Rückstandes mit Toluol wird das rohe Produkt pyridinfrei gemacht. Die Reinigung erfolgt mittels einer Kieselgel-Säulenchromatographie (Säule 5 cm Querschnitt, 160 g Si6OH, Eluens: Essigsäureethyl ester/Hexan/Pyridin 49, 75 / 49, 75 / 0,5). Reine Frak tionen werden nach Eindampfen und Aufnehmen in 10 ml Toluol aus Essigester, n-Pentan (50 ml : 950 ml) präzipitiert. Ausbeute: 12,7 g (68,4%); ¹H-NMR: die ¹H-Resonanzen sind qualitativ und quantitativ dem Produktmolekül zuortbar. Elementaranalyse, berechnet (%)/ gefunden (%), (C₄₄H₃₈N₂₀O₁₀): C, 70,01 / 70,05; H, 5,07 / 5,07; N, 3,71 / 3,53. Das FAB-MS (Xe) zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 754 (berechnete relative Molekularmasse: 754).

4. N³-(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl)-3′,2′-O-dibenzoyluridin

8,3 g 5′-O-4,4′-Dimethoxytrityl-2′,3′-O-dibenzoyl uridin (10,9 mMol) und 4,8 g p-Toluolsulfonsäure (3,5-dinitrobenzyloxy)-ethylester (12,2 mMol) werden in 70 ml trockenem Dimethylsulfoxid gelöst. Nach Zugabe von 4,0 g trockenem kristallinen K₂CO₃ wird ca. 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert; (Eluens: Essigsäureethylester, n-Hexan 7 : 3; rF=0,56). Der Reaktionsansatz wird in 800 ml konzentrierte NaHCO₃-Lösung ausgeschüt telt. Die organische Phase schüttelt man zweimal mit je 100 ml Dichlormethan und wäscht anschließend zweimal mit je 300 ml Wasser. Nach Trocknen der Dichlormethan-Phase wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft und der Rückstand mit zweimal 100 ml Toluol unter Vakuum coevaporiert. Hiernach werden zum Rückstand 250 ml 3%ige Trichloressig säure (in Dichlormethan, W/V) gegeben und zwei Mi nuten bei Raumtemperatur gerührt (rF=0,22). Die Reaktion wird durch Zugabe von 30 ml Pyridin ge stoppt. Den Reaktionsansatz schüttelt man zweimal mit je 400 ml Wasser aus und engt unter Vakuum zum Öl ein. Der Rückstand wird in 15 ml Toluol aufge nommen und aus Essigsäureethylester, n-Hexan (50 ml : 1000 ml) präzipitiert. Das Präzipitat wird aus Methanol:Toluol (9 : 1) umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt 5,6 g (75,9%). Im ¹H-NMR sind die ¹H-Resonanzen qualitativ und quantitativ dem Produktmolekül zuortbar. Elementaranalyse, berech net (%)/ gefunden (%), (C₃₂H₂₈N₄O₁₃): C, 56,80/57,81; H, 4,17/4,32; N, 8,28/8,40. Das MS zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 677 (berechnete relative Molekularmasse: 677).

5. N³-(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl)-2′,3′-O-dibenzoyl uridin-5′-O-(2-cyanoethyl)-diisopropylamido-phos phit

Alle Arbeiten werden unter Argon ausgeführt. 0,5 g N³-(Dinitrobenzyloxyethyl)-3′,2′-O-dibenzoyl uridin (0,69 mMol) werden in 10 ml trockenem Toluol gelöst und unter Vakuum eingedampft, um Spuren von Wasser azeotrop zu entfernen. Der Rückstand wird in 25 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, 0,63 ml Diisopropylethylamin (3,61 mMol) zugegeben und auf 0°C abgekühlt. Durch ein Gummi septum werden 0,31 ml Diisopropylamin-2-cyanoethoxy chlorophosphin (1,62 mMol) mit einer Spritze innerhalb 3 Minuten bei 0°C unter Rühren der Tetrahydrofuranlösung zugegeben. Die Lösung wird noch weitere 30 Minuten bei 0°C und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion verfolgt man mittels Dünnschichtchromatographie (Essigsäureethyl ester, n-Hexan, Pyridin 59,5 : 40 : 0,5; Edukt rF=0,69, Produkt rF=0,80). Der Reaktionsansatz wird mit 250 ml 5%iger wäßriger eiskalter Natriumcarbonatlö sung (Argon-gesättigt) ausgeschüttelt und das Ge misch mit 50 ml Dichlormethan (Argon-gesättigt) extrahiert. Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und engt zum Öl im Vakuum bei Raum temperatur ein. Die Reinigung erfolgt durch eine Säulenchromatographie: (Säulenquerschnitt 3 cm, 50 g Al₂O₃, neutral, Eluens: Dichlormethan, n-Hexan, Pyridin - 89 : 10 : 1). Reine Fraktionen werden gesam melt und nach dem Einengen am Rotationsverdampfer unter Vakuum zum Öl noch zweimal mit je 100 ml Toluol evaporiert. Das Produkt lyophilisiert man über Nacht aus 20 ml Benzol. Die Ausbeute beträgt 0,2 g (33,1%). Das MS zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 877 (berechnete relative Molekular masse (C₄₁H₄₅N₆O₁₄P₁) : 877).

Beispiel 2 Synthese der Oktyl-Monomere 4. N³-Oktyl-2′,3′-O-dibenzoyluridin

Die Darstellung erfolgt analog derjenigen des N³-(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl) -3′,2′-O-dibenzoyl uridin, jedoch mit 0,75fachem Ansatz: 5,0 g 5′-O- 4,4′-Dimethoxytrityl-2′,3′-O-dibenzoyluridin (6,6 mMol), 1,8 g Oktyljodid (7,5 mMol), restliche Chemikalien 3/4 der Menge von Beispiel 1.4. Das Oktyljodid ist nach 3 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt (Reaktionskontrolle durch Dünnschicht chromatographie; Essigsäureethylester, n-Hexan, 1 : 1; Edukt rF=0,29, Produkt rF=0,53). Nach der Detritylierung und Ausschütteln erfolgt die Reini gung durch eine Säulenchromatographie (Säulenquer schnitt 5 cm, 80 g Silicagel Si60H, Eluens: Petrol ether, Essigester 7 : 3). Reine Fraktionen werden gesammelt und nach dem Einengen am Rotationsver dampfer unter Vakuum als Öl bei -20°C gelagert. Die Ausbeute beträgt 2 g (50%). Im ¹H-NMR sind die ¹H-Resonanzen qualitativ und quantitativ dem Pro duktmolekül zuortbar. Elementaranalyse: berechnet (%)/gemessen (%), (C₃₁H₃₆N₂₀O₁₈) : C, 65,96/67,29; H, 6,38/6,68; N, 4,96/4,55. Das FAB-MS (Xe⁺) zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 565 (berech nete relative Molekularmasse: 565) .

2. N³-Oktyl-2′,3′-O-dibenzoyluridin-5′-O-(2-cyano ethyl)-diisopropylamido-phosphit

Alle Arbeiten werden unter reinem Argon durchge führt. 0,65 g N³-Oktyl-2′,3′-O-dibenzoyluridin (1,15 mMol) werden in 10 ml trockenem Toluol ge löst. Spuren von Wasser entfernt man durch azeo tropes Destillieren im Vakuum. Der Rückstand wird in 35 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und 1,0 ml Diisopropylethylamin (5,73 mMol) zugegeben. Durch ein Gummiseptum werden 0,44 ml Diisopropyl amino-2-cyanoethoxy-chlorophosphin (2,30 mMol) mit einer Spritze innerhalb 3 Minuten bei Raumtempera tur unter Rühren der Tetrahydrofuranlösung zuge geben. Die Lösung wird noch weitere 15 Minuten ge rührt. Die Reaktion verfolgt man mittels Dünn schichtchromatographie (Essigsäureethylester, n-Hexan, Pyridin 59,5 : 40 : 0,5; Edukt rF=0,68, Produkt rF=0,90). Der Reaktionsansatz wird mit 250 ml 5%iger wäßriger eiskalter Natriumcarbonat lösung (Argon-gesättigt) ausgeschüttelt und das Gemisch mit 50 ml Dichlormethan (Argon-gesättigt) extrahiert. Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und engt zum Öl im Vakuum bei Raum temperatur ein. Verbliebene flüchtige Substanzen werden durch mehrmaliges Abdampfen mit trockenem Toluol entfernt. Der ölige Rückstand wird bei -20°C aufbewahrt. Ausbeute: 0,7 g (80%). FAB-MS (Xe⁺) zeigt einen Massenpeak beim Verhältnis m/e 765 (berechnete relative Molekularmasse (C₄₀H₅₃N₄O₉P₁) : 765.

Beispiel 3 Oligodesoxyribonukleotidsynthese mit den modifizierten Uridinen am 5′-Terminus

Die Synthese wird an einem Applied Biosystems DNA-Synthe sizer Modell 380 A (Applied Biosystems lnc, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Es werden die original Cyclen abbc 11 (für 1µMol Synthesen) und ssbc102 (für 0,2µMo1 Synthesen) verwendet (Applied Biosystems User Bulletin DNA Synthesizer Issue No. 36, Juli 1, 1986 (Revised)). Das N³-Oktyl-2′,3′-O-dibenzoyluridin-5′- O-(2-cyanoethyl)-diisopropylamido-phosphit setzt man als Lösung in trockenem Acetonitril (70 mg/ml, analog zu Thymidin) zur automatisierten Synthese ein. Das N -(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl)-2′,3′-O-dibenzoyluridin- 5′-O-(2-cyanoethyl)-diisopropylamido-phosphit löst sich schlecht in Acetonitril. Hier werden ca. 20 mg/ml in trockenem Acetonitril gelöst. Wegen der langen Standzei ten dieser Lösungen in den Teflonschläuchen des DNA-Syn thesizers wird der Kopplungsschritt zweimal durchgeführt (wenn die Kopplung nur einmal pro Oligodesoxynukleotid synthese durchgeführt wird, können während der langen Standzeiten Sauerstoff und Wasserdampf durch die Teflon schläuche diffundieren, wodurch die Ausbeute sinkt). Die Kopplungsschritte, für 1µMol Synthesen waren wie folgt: 2s Tetrazol zum Abfall, 10s Base und Tetrazol zur Säule (Flußrate: 1,5 ml/min), 120s warten; die Schritte werden wiederholt. 0,2µMol Synthesen wurden folgendermaßen durchgeführt: 2 s Tetrazol zum Abfall, 5 s Base und Tetrazol zur Säule, 10 s warten, 4 s # 18 (Aceto nitril) zur Säule, 20 s warten; die Schritte werden wiederholt. Für die Entschützung und Abspaltung der synthetisierten Oligodesoxynukleotide wird ebenfalls ein Standardterminationscyclus benutzt. Jedoch wird dabei anstelle der Thiophenollösung #8, welche die Standard-Reaktion vorsieht, wird eine 5%ige Lösung von 1,8-Diazabicyclo-(5.4.0)-undec-7-en in trockenem Pyridin verwendet. Die Syntheseschritte für 1,0 sowie 0,2µMol Synthesen waren wie folgt: 30 s #8 zur Säule (Flußrate ca. 1,5 m1/min), 600 s warten, 15 s #8 zur Säule, 600 s warten.

Beispiel 4 Reinigung von Dinitrobenzyloxyethyl-U-oligodesoxynuk leotiden 1. Reinigung und Immobilisierung von Ig 22/20

Die Reinigung erfolgt nach Dissertation Rudolf Mieran, 1983, S. 18-19, Univ. Köln.

lmmobilisierung: Der gereinigte Antikörper Ig 22/20 wird in einen Phosphatpuffer (0,1 M KH₂PO₄-pH=8,0) umdialysiert. Auf 1 g Eupergit C, (Kugeln aus Polyacrylamid, mit Oxiranringen als kupplungsfähige Gruppen) werden 10,0 mg Ig 22/20 in 9,0 ml Phosphatpuf fer (der 0,1% p-Hydroxybenzoesäureethylester enthält) 48 Stunden bei Raumtemperatur geschüt telt. Durch mehrmaliges Dekantieren und Zugeben wird der beladene Antikörper auf Capp-Puffer eingestellt (10% Ethanolamin, 0,2% Natriumacid auf pH=9,0 mit HCl einge stellt). Das gecappte Eupergit C wird abge nutscht, erst mit 50 ml Wasser und dann zwei mal mit je 50 ml PBS gewaschen (PBS=Phosphate Buffered Saline, 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄). Das Material füllt man in eine Säule. Die Antikörpersäule ist in PBS (mit 0,3% Natriumacid W : V) monatelang bei 4°C lagerbar.

2. Affinitätschromatographie von Dinitrobenzyloxy ethyl-U-oligodesoxynukleotiden

Die Antikörpersäule wird mit ca. 12 ml PBS gewaschen. 1/3 bis 1/5 des rohen Syntheseproduktes wird nach dem Entschützen, wie in Beispiel 5 beschrieben, und Lyophylisieren in 1 ml PBS gelöst und auf die Antikörpersäule bei Raumtemperatur aufgetragen. Mit weiteren 8 ml PBS wäscht man diejenigen Oligo desoxyribonukleotide aus, die kein Dinitrobenzyloxy ethyl-U enthalten aus. Das Produkt wird mit 3 ml einer 80 mM Lösung von N-(2,4-Diniotrophenyl)-capron säure in PBS von der Säule eluiert. Die dritte ml-Fraktion enthält das Produkt. Diese Fraktion wird gefriergetrocknet und danach einer Flüssig phasenabspaltung unterworfen, wie in Beispiel 5 unter 2. beschrieben.

Beispiel 5 Reinigung von Oktyl-U-oligodesoxyribonukleotiden 1. Reinigung mittels Reversed Phase Kartusche:

Dabei entschützt man das Oligonukleotid über Nacht bei 55°C in 25%igem Ammoniak, wie bei üblichen Synthesen. Hiernach wird der entschützte Ansatz mit 80%iger Essigsäure (mit ca. 1/3 an Volumen der NH₃-Lösung) neutralisiert. Zeitlich parallel spannt man eine Kartusche (Firma Baker, RP C₁₈) senkrecht ein und wäscht 10 Minuten mit zweimal 500µl 50% MeOH. Dabei läßt man die Lösung langsam durchlaufen und erzeugt gegebenenfalls mit einer Gilsonpipette etwas Gas-Druck. Die Kartusche wird nun dreimal mit 500µl 0,1 M Triethylammoniumacetat Puffer (TEAA), pH 7,0 equilibriert und anschließend trägt man je nach Synthese-Qualität und -Menge (0,2 oder 1,0µMol-Synthese) 1/3 bis 1/5 der Gesamtsynthese an neutralisierter Oligonukleotid-Lö sung langsam auf die Kartusche auf. Dann wird dreimal mit 300µl 15% Acetonitril (in 0,1 M TEAA, pH 7) gewaschen, um die Oktyl-freien Oligonukleotide zu entfernen. Bei Oligonukleotiden größer 20mere benutzt man 12% Acetonitril. Nun wird, wie zuvor, nochmals mit 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, pH 7,0 equillibriert.

Zur Oxidation der Cis-Diole am Uridin wäscht man mindestens 15 Minuten lang die Kartusche dreimal mit 300µl 50 mM NaJO₄-Lösung. Dabei muß die Zeit gut eingehalten und nur hydrostatischer Druck ver wendet werden. Die Kartusche wird durch zweimali ges Waschen mit 300µl H₂O von Salzen befreit.

Die oxidierte Ribose wird durch 30minütiges Waschen der Kartusche mit viermal 300µl 5%igem wäßrigem Triethylamin einer β-Eliminierung unterzogen. Auch hier muß die Zeit gut eingehalten und nur hydro statischer Druck angewendet werden. Schließlich wird die Kartusche von Triethylamin durch vierma liges Waschen mit 300µl 0,1 M TEAA, pH 7 befreit und das 5′-phosphorylierte Oligonukleotid mit zweimal 200µl 15% Acetonitril (in 0,1 M TEAA, pH 7,0) von der Kartusche eluiert. Danach wird mit der gleichen Menge an 30%igem Acetonitril die Elution wiederholt und das Eluat in einem Eppen dorf-Gefäß aufgefangen.

Die Lösung lyophilisiert man im Hochvakuum. Nach Aufnahme des Rückstandes in 20µl H₂O wird erneut im Hochvakuum lyophilisiert, um Reste von Triethyl ammoniumacetat zu entfernen. Das fertige 5′-phospho rylierte Oligonukleotid wird anschließend in einem Lagerpuffer (10 mmolar Tris/HCl, 0,1 mmolar EDTA, pH 8,0) aufgenommen.

2.Reinigung mittels HPLC:

Die Probe wird, wie zuvor beschrieben, entsalzt. Hiernach wird 1/3 bis 1/5 der neutralisierten Lö sung auf einer C₁₈-Reversed-Phase-HPLC chromatogra phiert, wobei sich das erfindungsgemäß gewonnene Oligonukleotid analog den 5′-Dimethoxytrityloligo desoxynukleotiden verhält. Reine Fraktionen können nach Verdünnen mit Wasser auf 12% Acetonitril mittels einer C₁₈-RP-Kartusche wie zuvor beschrie ben, weiter behandelt werden. Bei Oligodesoxy nukleotiden die länger als 40 Basen sind, sollte eine Flüssigphasenabspaltung durchgeführt werden. Die gesammelten HPLC-Fraktionen werden vereinigt und im Hochvakuum eingedampft. Für die anschlies sende Flüssigphasenabspaltung wird der Rückstand in 50µl 25 mM NaJO₄ gelöst und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Hiernach werden 50µl 25 mM Rhamnose zugegeben und ebenfalls 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt werden 100µl 5%ige Triethylamin-Lösung zugegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionslösung dampft man dann im Hochvakuum ein und entsalzt durch eine DEAE 52-Säulenchromatogra phie. Dafür werden ca. 50 mg DEAE 52 Ionenaustau scher in 1 ml 2 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (pH 7,5 bis 8) auf Eis 30 Minuten lang gequollen und etwa 20 mm³ gequollenes DEAE 52-Material wird in eine kleine Säule gefüllt und mit dreimal 300µl 0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (pH 7,5-8) gewaschen. Die Oligonukleotid-haltige Lösung wird nach Verdünnen auf 10 mM an Salzen langsam durch die Säule passiert. Die Säule wäscht man danach mit zweimal 200µl 0,1 M Triethylammonium hydrogencarbonat (pH 7,5 bis 8) und danach wird das Oligonukleotid mit zweimal 200µl 2 M Triethyl ammoniumhydrogencarbonat (pH 7,5 bis 8) von der Säule eluiert und in einem Eppendorfgefäß aufgefan gen. Die Probe lyophilisiert man im Hochvakuum und nimmt die DNA in TE-Lagerpuffer auf. Wenn Salzreste nicht unbedingt stören ist es auch möglich, eine Ethanolfällung durchzuführen. Die Lösung wird nach der Abspaltungs-/Eliminierungsreaktion lyophilisiert, in 40µl Wasser aufgenommen und mit 120µl Ethanol versetzt. Nach 2 Stunden bei 0°C zentrifugiert man 5 Minuten in einer Eppendorfzentrifuge, 1400 rpm. Der Überstand wird abgehoben und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.

Beispiel 6

Wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, wurden folgende Dinitrobenzyloxyethyl- (DNB) und Oktyl (OKT) Uridin- (U) Oligonukleotide hergestellt:

1. DNB-U-16C, Okt-U-16C, 16/17mere
DNB/OKT-U-5′-GGT.TTT.CCC.AGT.CAC.G-3′
2. OKT-U-16T, 16/17mer
OKT-U-5′-GGT.TTT.CCT.AGT.CAC.G-3′
3. PIEROTCR, Mutageneseoligonukleotid
Okt-U-5′-CAG.ATC.ATC.TAA.CCT.CA-3′
4. TN5TM, Mutageneseoligonukleotid
Okt-U-5′-GTT.CAA.TCA.TGA.TAT.CCG.ATC.CTC.ATC-3′
5. REIREP81, Mutageneseoligonukleotid
Okt-U-5′-CTA.TCA.GCT.CAC.TGC.AAC.CGG.AAG.ACA.TCG.CGA-3′
6. SALFXA, Mutageneseoligonukleotid
Okt-U-5′-CAT.CCT.TTA.TGG.TCG.CCC.TAC.CCT.CGA.TGT. CGA.CGG.TCG.AAA.TTC.ACC.TC-3′

Die Oligonukleotide wurden gereinigt und einer analyti schen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer analytischen Polyacroylamid-Gelelek trophorese von rohen und gereinigten Okt/DNB-U-Oligo nukleotiden.

1: Okt-U-16C roh; 2: Okt-U-16C Kartuschen-gereinigt; 3: 16C kinasiert und Gel-gereinigt; 4: DNB-U-16C Affi nitätsgereinigt; 5: Pierotor roh; 6: Pierotor Kartuschen gereinigt; 7: Tn5tm roh; 8: Tn5tm Kartuschen-gereinigt,; 9: REIrep81 roh; 10: REIrep81 Kartuschen-gereinigt; 11: REIrep8l RP-HPLC-gereinigt, anschließend auf der Kartusche abgespalten; 12: SalFXa RP-HPLC-gereinigt; 13: SalFXa RP-HPLC-gereinigt mit anschließender Flüssigphasenabspal tung.

Die Zahlen über den Balken geben Länge oder Oligonukleo tide nach Abspaltung des Uridin-Restes an. Das Gel enthält 14% Polyacrylamid und die Oligonukleotide wurden mit "Stains All" (Applied Biossystems Inc, User Bulletin) angefärbt. Daraus ist ersichtlich, daß es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, phosphory lierte Oligo- und Polynukleotide in reiner Form darzu stellen.

Beispiel 7

Die biologische Aktivität der erfindungsgemäß phospho rylierten Nukleotidsequenz Nr. 1 des Beispiels 6 wurde mittels der Markerausbeuten von Mutagenesen im Vergleich mit einem sequenzgleichen kinasierten Oligonukleotid verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Mutagenesemethode 3.3.L5 (Nucl.Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)).

Y: durchschnittliche Markerausbeute. Anzahl der Primärtransfektanten mindestens 1300, mindestens 500 Sekundärtransfektanten gezählt.

Diese Ergebnisse belegen die hohe Ausbeute an biologisch aktivem Material, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wurde im Vergleich zu herkömmlichen enzymatischen Phosphorylierungsverfahren.

Claims

1. Phosphorylierungsreagenz, insbesondere zur Phos phorylierung des 5′-Hydroxyendes von Oligo- und Polynukleotiden, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel I wobei
P eine mit einer OH-Gruppe reaktive Phosphat- oder Phosphitgruppe und
R eine abspaltbare OH-Schutzgruppe darstellt, X=H, OH, Halogen, Alkyl oder Alkoxy ist oder eine O-, N-, Alkylen- oder Oxyalkylenoxy-Brücke zu B, B₁ oder B₃ darstellt,
einer der Substituenten B bis B₃ eine hydrophobe Verankerungsgruppe oder ein an einen Antikörper bindendes Hapten darstellt, die anderen Substi tuenten B bis B₃ H oder niedrig Alkyl, B₂ auch eine Einfachbindung, bedeuten.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß P einen -P(R₁R₂) Rest darstellt, wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und eine C₁- bis C₄-Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-, Halogen-, 2-(p-Nitrophenyl) ethyl-, 2-Cyanoethyl-, Diisopropylamidogruppe dar stellen.

3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die abspaltbare OH-Schutzgruppe Ether- oder Estergruppe, insbesondere eine Benzoyl-, Silyl ether-, Dimethoxytrityl- oder Isopropylidengruppe ist.

4. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß B eine Alkylgruppe mit 6 bis 20 C-Atomen, eine Arylgruppe, eine substituierte Arylgruppe oder heterocyclische Arylgruppe oder substituierte Alkylgruppe darstellt.

5. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylgruppen 8 bis 18 C-Atome aufweisen.

6. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß X mit B, B₁ oder B₃ über eine Acetalbrücke verbunden ist.

7. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß X zusammen mit B einen Zucker ausbildet.

8. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagenz verwendet wird, bei dem B eine Naphthylgruppe, eine Mono-, Di- oder Trinitrobenzyl-, eine Dinitrobenzyloxyethylgruppe darstellt.

9. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß B ein N³-(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl)-2′,3′-o-di benzoyluracilrest ist.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß B ein N³-Octyl-2′,3′-o-dibenzoyluracilrest ist.

11. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es N³-Octyl-2′,3′-o-dibenzoyluridin-5′-o-(2- cyanoethyldiisopropylamido-phosphit)- oder N³-(3,5-Dinitrobenzyloxyethyl)-2′,3′-o-dibenzoyl uridin-5′-o-(2-cyanoethyl)-diisopropylamidophos phit ist.

12. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es das benachbarte Diol in Cis-Stellung enthält.

13. Verfahren zur Herstellung eines Phosphorylierungs reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Diol der allgemeinen Formel II in der Y bis Y₃ gleich B bis B₃ sind oder eine mit B bis B₃ verknüpfbare Gruppe darstellen und X und B bis B₃ die in Anspruch 1 definierte Bedeutung aufweisen, zuerst mit einem die benachbarten Diolhydroxyle schützenden Reagenz und dann die endständige Hydroxygruppe mit einer Phosphorverbindung der allgemeinen Formel (R₁R₂R₃)P (R₁R₂R₃)PO oder P(R_1-5)₅ umsetzt, wobei die Reste R₁-R₅ gleich oder verschieden sind und gut hydrolysierbare Austrittsgruppen darstellen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß R ₁-R ₅ ein p-Nitrophenylethanoyl, Dimethylamin, Oxazin, Tetrazolrest oder ein Halogenatom ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine dreiwertige Phosphorverbindung verwendet wird.

16. Verfahren zur Herstellung von an ihrem 5′-Ende phosphorylierten Oligo- und Polynukleotidsequenzen durch Synthese der Nukleotidkette in an sich be kannter Weise, insbesondere durch automatisierte Synthese an einer festen Phase, mit anschließender chemischer Phosphorylierung der endständigen 5′-OH-Gruppe und Abtrennen der nicht phosphorylier ten Nukleotidkette an einer Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß nach Fertigstellung der gewünschten Nukleotid sequenz das 5′-OH-Ende der Kette mit einem Phosphory lierungsreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umgesetzt, anschließend die phosphorylierte Nukleo tidkette von nicht umgesetzten Reagenzien gereinigt wird, die zum Phosphorester γ- und δ-ständigen Diolhydroxyle zum Aldehyd oxidiert werden und die Nukleotidkette mit einer Proton abstrahierenden Base behandelt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der phosphorylierten Nukleotid kette an einer Reversed-phase-Matrix erfolgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reversed-phase-Matrix mit C₈ bis C₁₈ substituiertem Material verwendet wird.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der phosphorylierten Nukleotid kette durch Affinitätschromatographie erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation der Diole mit Perjodat oder Bleitetraacetat durchführt.

21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagenz mit Benzoyl, geschützten Diolen und mit Cyanoethylphosphitestern verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schutzgruppen nach der Reinigung in einem Verfahrensschritt gleichzeitig abspaltet.

23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß für die Affinitätschromatographie der immobili sierte Antikörper Ig22/20 verwendet wird.