DE69227793T2

DE69227793T2 - Verfahren und Verbindungen für die Festphase-Synthese von Oligonukleotiden und Analogen

Info

Publication number: DE69227793T2
Application number: DE69227793T
Authority: DE
Inventors: Andrzej Grajkowski; Wojciech Stec; Bogdan Uznanski
Original assignee: Polska Akademia Nauk Instytut
Current assignee: Polska Akademia Nauk Instytut
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-06
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2012-03-07
Also published as: JPH06220083A; JP3207915B2; EP0506242A1; EP0506242B1; US5512668A; ATE174341T1; DE69227793D1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Festphasensynthese von Oligonucleotiden und insbesondere Verfahren und Verbindungen zur Synthese von P-chiralen Oligonucleotidanalogen.
Die Entwicklung von zuverlässigen und zweckmäßigen Verfahren für die Festphasensynthese von Polynucleotiden hat zu zahlreichen Fortschritten auf dem Gebiet der Molekularbiologie und verwandten Gebieten geführt; vergl. z. B. Itakura, Science, Bd. 209 (1980), S. 1401-1405; Caruthers, Science, Bd. 230 (1985), S. 281-285; und Eckstein, Hrsg., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991)). Insbesondere hat die Verfügbarkeit von synthetischen Oligonucleotiden und einer Vielzahl von nucleaseresistenten Analogen davon, wie Thiophosphaten, Methylphosphonaten und dergl., Untersuchungen bezüglich ihrer Verwendung als therapeutische Verbindungen zur Behandlung einer Vielzahl von Zuständen, die mit einer ungeeigneten Expression von angeborenen und/oder exogenen Genen verbunden sind, begünstigt; vgl. z. B. Cohen, Hrsg., Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, New York, 1989; Van der Krol et al., Biotechniques, Bd. 6 (1988), S. 958- 976; Matsukara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 86 (1989), S. 4244- 4248; Lyer et al., Nucleic Acids Research, Bd. 18 (1990), S. 2855-2859; Leiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 87 (1990), S. 3430-3434; McManaway et al., Lancet, Bd. 335 (1990), S. 808-811; Manson et al., Lymphokine Research, Bd. 9 (1990), S. 35-42; Sankar et al., Eur. J. Biochem., Bd. 184 (1989), S. 39-45; Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 86 (1989), S. 7790-7794; Miller, Biotechnology, Bd. 9 (1991), S. 358-362; Chiang et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 18162-18171; Calabretta, Cancer Research, Bd. 51 (1991), S. 4505-4510; und dergl.). Üblicherweise werden diese Verbindungen als "antisense"-Verbindungen verwendet. Dies bedeutet, daß es sich bei diesen Verbindungen um Oligonucleotide oder Analoge davon handelt, die Basensequenzen aufweisen, die komplementär zu Segmenten von Zielnucleinsäuren, üblicherweise RNAs, sind, so daß Duplexe oder Triplexe entstehen, die die jeweiligen Ziele gegenüber einem enzymatischen Abbau empfindlicher machen, die Translation oder Prozessierung blockieren oder anderweitig die Expression blockieren oder hemmen; vgl. z. B. Cohen (a. a. O.); Moser et al., Science, Bd. 238 (1987), S. 645-650.
Zahlreiche der phosphatanalogen Verknüpfungen dieser antisense-Verbindungen sowie solche von verwandten nicht-nucleosidischen Polymeren sind am Phosphor chiral, z. B. Thiophosphate, Phosphorselenoate, Methylphosphonate und dergl.; vergl. Zon, Pharmaceutical Research, Bd. 5 (1988), S. 539-549; und Ohlmann und Peyman, Chemical Reviews, Bd. 90 (1990), S. 543-584. Derzeit gibt es keine Möglichkeit, die Chiralität dieser Phosphorreste während der Festphasensynthese zu steuern. Infolgedessen führt die Synthese von derartigen Polymeren zu Gemischen von Diastereoisomeren, bei denen die einzelnen Polymeren der Gemische willkürliche Sequenzen von Rp- und Sp-chiralen Phosphorverknüpfungen entlang ihrer Gerüste aufweisen. Derartige Gemische, die durch die derzeit verfügbare Technologie hergestellt worden sind, bestehen aus 2n Diastereoisomeren, wobei n die Anzahl der P-chiralen Verknüpfungen im Polymeren bedeutet. Beispielsweise weist ein Trimeres mit zwei P-chiralen Verknüpfungen 2² = 4 mögliche Diastereoisomere auf, die durch die folgenden 5'→ 3'-Sequenzen von Verknüpfungen angegeben werden: Rp-Rp, Rp-Sp, Sp-Rp und Sp-Sp. Zusätzlich zu dem Mangel an Verfahren zur Synthese von Polymeren mit einer vorbestimmten Chiralität besteht ein Mangel an verfügbaren analytischen Werkzeugen zur direkten Messung der Reproduzierbarkeit der Herstellung einer diastereoisomeren Population von Polymeren mit P-chiralen Verknüpfungen bei mehr als 4-meren Produkten; vergl. Zon, in Hancock, Hrsg., High-Performance Liquid Chromatography in Biotechnology (John Wiley, New York, 1990, S. 301-349). Diese fehlende Möglichkeit zur Herstellung von Oligonucleotidanalogen und verwandten nicht-nucleosidischen Polymeren mit vorbestimmter Sequenz, Länge und Chiralität ist problematisch, da es starke Anzeichen dafür gibt, daß die Chiralität einen wichtigen Faktor der Duplexstabilität und Nucleasebeständigkeit darstellt; vergl. z. B. Lesnikowski et al., Nucleic Acids Research, Bd. 18 (1990), S. 2109-2115; Burgers et al., J. Biol., Chem., Bd. 254 (1979), S. 7476-7478; Miller et al., Biochem., Bd. 18 (1979), S. 5134-5143; Zon, Pharmaceutical Research (a.a.O.); Eckstein, Ann. Rev. Biochem., Bd. 54 (1985), S. 367-402; und dergl. Diese Hinweise legen es nahe, daß die stereokontrollierte Synthese von antisense- und verwandten Verbindungen mit vorbestimmter Chiralität an jedem P-stereogenem Zentrum es ermöglichen könnte, spezielle therapeutische Diastereoisomere zu konzipieren, die Duplexe mit maximaler Stabilität bilden und die eine maximale Resistenz gegenüber nucleolytischen Enzymen aufweisen, wodurch ihre Lebensdauer wirksam verlängert wird und auf diese Weise die erforderliche Menge eines xenobiotischen Materials zur Erzielung einer bestimmten therapeutischen Wirkung verringert wird.
Die Erfindung ist auf ein neues Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden und verwandten Polymeren, deren Monomereinheiten durch Phosphatgruppen verknüpft sind, oder auf Analoge davon abgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren die Synthese von derartigen Verbindungen mit einer vorbestimmten Chiralität, sofern die Phosphorverknüpfungen chiral sind. Die Erfindung umfaßt Synthons und Synthonvorstufen zur Herstellung derartiger Polymerer sowie die Polymeren selbst, sofern die Phosphorverknüpfungen chiral sind und die Sequenz ihrer Chiralität vorbestimmt ist. Bei den erfindungsgemäßen Synthons handelt es sich um hydroxylgeschützte monomere O-(1,3,2-Dichalcogen-subst.-phospholane), die gegebenenfalls in ihre Rp- und Sp-chiralen Formen aufgetrennt werden können, um eine Festphasensynthese eines Polymeren mit einer vorbestimmten Sequenz von Rp- oder Sp-Verknüpfungen zu ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: (a) Bereitstellen eines ersten Monomeren, das an einen Festphasenträger gebunden ist, wobei das erste Monomere eine geschützte Hydroxylgruppe aufweist; (b) Entfernen der Schutzgruppe von der geschützten Hydroxylgruppe unter Bildung einer freien Hydroxylgruppe; (c) Umsetzen eines aus der nachstehenden Formel (I) ausgewählten Synthons mit der freien Hydroxylgruppe in Gegenwart einer katalytischen Base; und (d) Wiederholen der Stufen (b) und (c), bis ein Polymeres der gewünschten Länge erhalten worden ist. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren ferner die Stufe des Verkappens von nicht umgesetzten Hydroxylgruppen nach der Stufe der Umsetzung. Ein wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, das erste Monomere an einen Festphasenträger über eine verknüpfende Gruppe zu binden, die in Gegenwart der katalytischen Base nicht gespalten wird.
Sofern eine P-chirale Verknüpfung zwischen Monomeren gebildet wird, umfaßt die Stufe (d) vorzugsweise die Wiederholung der Stufen (b) und (c) bis ein Polymeres mit einer vorbestimmten Länge und Chiralität erhalten worden ist. Sofern eine P-chirale Verknüpfung zwischen Monomeren gebildet wird und es sich bei den Monomeren um Nucleoside oder Analoge davon handelt, umfaßt die Stufe (c) insbesondere die Auswahl der gewünschten P- chiralen Form des Synthons der Formel (I) und die Stufe (d) die Wiederho lung der Stufen (b) und (c) bis ein P-chirales Oligonucleotid von vorbestimmter Länge erhalten worden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue chemische Möglichkeit zur Synthese von Oligonucleotiden und verwandten Polymeren mit Phosphatverknüpfungen oder phosphatanalogen Verknüpfungen bereit. Insbesondere wenn die phosphatanalogen Verknüpfungen P-chiral sind, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von Polymeren mit einer vorbestimmten Sequenz der P-Chiralität entlang des Polymergerüstes bereit. Erfindungsgemäße P-chirale Oligonucleotide lassen sich als antivirale Mittel, therapeutische antisense-Verbindungen, Hybridisierungssonden und dergl. verwenden.
Die Erfindung eröffnet eine neue Möglichkeit zur Festphasensynthese von Oligonucleotiden und verwandten Polymeren unter Verwendung von hydroxylgeschützten monomeren O-(1,3,2-Dichalcogen-subst.-phospholan)- Synthons. Insbesondere umfaßt die Erfindung 2-N-subst.-1,3,2-Dichalcogensubst.-phospholan-Vorstufen der vorstehenden Synthons, die hydroxylgeschützten monomeren O-(1,3,2-Dichalcogen-subst.-phospholan)-Synthons selbst und P-chirale Oligonucleotide und verwandte P-chirale Polymere mit einer Länge im Bereich von 4 bis mehrere hundert Monomere und vorzugsweise im Bereich von 12 bis 60 Monomere.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierte Polymere weisen im allgemeinen die folgende Formel auf: Formel I
worin:
Q Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; Alkoxy oder Alkylthio mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Sauerstoff- oder Schwefelheteroatomen bedeutet; oder zusammen mit zwei benachbarten Sauerstoffatomen ein Nucleosid oder Nucleosidanaloges bedeutet. Vorzugsweise bedeutet Q Alkyl oder Alkenyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom oder zusammen mit zwei benachbarten Sauerstoffatomen ein Nucleosid oder Nucleosidanaloges. Insbesondere bedeutet Q Alkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder cyclisches Alkoxy mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom oder zusammen mit 2 benachbarten Sauerstoffatomen ein Nucleosid oder Nucleosidanaloges.
R¹ bedeutet Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe, wie Triphenylmethyl (d. h. Trityl), p-Anisyldiphenymethyl (d. h. Monomethoxytrityl oder MMT), Di-p-anisylphenylmethyl (d. h. Dimethoxytrityl oder DMT), Pivaloyl, Acetyl, 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl, Tetrahydropyranyl, Phenoxyacetyl, Isobutyloxycarbonyl, Pixyl, Benzyl, Trialkylsilyl mit 3 bis 9 Kohlenstoffatomen, 9-Fluorenylmethylcarbamat (Fmoc) oder dergl. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflg., John Wiley, New York, 1991, liefern eine umfassende Übersicht über die Auswahl von Schutzgruppen für die verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
X bedeutet ein Chalcogen, vorzugsweise S, O oder Se oder einen substituierten Iminorest der Formel =NR², worin R² Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Aryl, alkylsubstituiertes Aryl oder alkenylsubstituiertes Aryl mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Y bedeutet ein Chalcogen, vorzugsweise S, O oder Se.
n bedeutet einen Bereich von 1 bis mehrere hundert. Vorzugsweise liegt n im Bereich von 5-200, insbesondere von 12-60 und ganz besonders von 15-30.
Bei den erfindungsgemäßen Synthons handelt es sich um hydroxylgeschützte monomere O-(1,3,2-Dichalcogen-subst.-phospholane), die vorzugsweise durch die folgende Formel definiert sind: Formel II
Darin haben Q, R¹, X und Y die vorstehend definierten Bedeutungen. Z bedeutet S oder Se und insbesondere S. R³, R&sup4; R&sup5; und R&sup6; bedeuten unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine elektronenziehende Gruppe. Vor zugsweise bedeuten R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder unabhängig voneinander oder zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, Aryl oder alkylsubstituiertes Aryl mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen. Sofern eine spezielle Auswahl von R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; zu einer chiralen Beschaffenheit führt, versteht es sich, daß das Synthon der Formel II mit einer gegebenen stereochemischen Anordnung dieser Ringsubstituenten eingesetzt wird. Das Synthon der Formel II wird durch Umsetzung des nachstehenden cyclischen Phosphits mit einer freien Hydroxylgruppe eines geeigneten Monomeren hergestellt: Formel III
worin Y, Z und R³ bis R&sup6; die vorstehend definierten Bedeutungen haben und W eine austretende Gruppe bedeutet, die einem nucleophilen Angriff durch eine freie Hydroxylgruppe eines Monomeren zugänglich ist. Vorzugsweise bedeutet W Halogen, Dialkylamino mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, Morpholinyl, Piperidinyl oder Pyrrolidinyl. Insbesondere ist W aus der Gruppe Cl, Morpholino und Diisopropylamino ausgewählt.
P-chirale Polymere der Erfindung sind allgemein durch die Formel I definiert, mit den Maßgaben, daß X und Y in zumindest einer Verknüpfung nicht gleich sind und daß nicht sämtliche Verknüpfungen im gleichen Polymeren identisch sein müssen. Insbesondere sind die P-chiralen Oligonucleotide der Erfindung durch die folgende Formel definiert: Formel IV
worin X, Y und R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen haben, wieder mit der Maßgabe, daß X und Y zumindest in einer Verknüpfung nicht gleich sind und daß nicht sämtliche Verknüpfungen im gleichen Oligonucleotid identisch sein müssen. B bedeutet eine natürliche oder synthetisch modifizierte Purin- oder Pyrimidinbase. D' bedeutet eine 3'- Hydroxylschutzgruppe. D bedeutet Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl oder -OR', worin R' Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine 2'-Hydroxylschutzgruppe, z. B. eine Alkylsilylgruppe, wie tert.-Butyldimethylsilyl, oder dergl., bedeutet. Vorzugsweise liegt n im Bereich von 5-200 und insbesondere im Bereich von 12-60. Aus der Formel IV ergibt sich, daß die P- chiralen Oligonucleotide der Erfindung 5'-3'-, 5'-2'-, 5'-5'-, 3'-3'-, 2'-2'- und 3'-2'-Verknüpfungen zwischen Nucleosiden durch die entsprechende Auswahl von Synthons der Formel II umfassen können.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" umfaßt lineare Oligomere von natürlichen oder modifizierten Nucleosiden, einschließlich Desoxyribonucleoside, Ribonucleoside, α-anomere Formen davon und dergl., die üblicherweise durch Phosphodiesterbindungen oder Analoge davon verknüpft sind und in einer Größe von einigen Monomereinheiten, z. B. 3-4, bis einige hundert Monomereinheiten vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden um Oligomere der natürlichen Nucleoside mit einer Länge im Bereich von 12 bis 60 Monomereinheiten und insbesondere mit einer Länge im Bereich von 15 bis 30 Monomereinheiten. Sofern ein Oligonucleotid durch eine Buchstabensequenz wiedergegeben wird, z. B. "ATGCCTG", so ist darunter zu verstehen, daß die Nucleotide von links nach rechts in der 5'→3'-Reihenfolge vorliegen.
Zu Phosphorverknüpfungen zwischen nucleosidischen Monomeren gehören Phosphodiesterbindungen und Analoge von Phosphodiesterbindungen, wie Thiophosphat, Dithiophosphat, Selenophosphat, Diselenophosphat, Thiophosphoranilid, Phosphoranilidat und dergl. Vorzugsweise sind die Monomeren der erfindungsgemäßen Oligonucleotide durch Phosphodiester-, Thiophosphat- oder Dithiophosphat-Verknüpfungen verbunden.
Der hier verwendete Ausdruck "Nucleosid" umfaßt die natürlichen Nucleoside, unter Einschluß der 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen, wie sie beispielsweise in Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflg., Freeman, San Francisco, 1992, beschrieben sind. Zu "Analogen" in bezug auf Nucleoside gehören synthetische Nucleoside mit modifizierten Basenresten und/oder modifizierten Zuckerresten, wie sie beispielsweise von Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980, beschrieben sind. Derartige Analoge umfassen die natürlichen und synthetischen Nucleoside mit oder ohne entsprechende Schutzgruppen für die erfindungsgemäße Synthese. Eine beispielhafte Aufzählung von Nucleosidanalogen umfaßt 2-Aminopurin, Desoxyinosin, N&sup4;-Methoxydesoxycytidin, N&sup4;-Aminodesoxycytidin, 5-Fluordesoxyuridin und dergl.
Der Ausdruck "elektronenziehend" bedeutet die Tendenz eines Substituenten, Valenzelektronen des Moleküls, dessen Bestandteil es ist, anzuziehen, d. h. es ist elektronegativ; vergl. z. B. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley, New York, 1985, S. 16-18.
Einigen erfindungsgemäßen Aspekten liegen auch andere Wege zur Festphasensynthese von Oligonucleotiden zugrunde, z. B. die Auswahl von Schutzgruppen, die Auswahl von Festphasenträgern und dergl. Infolgedessen lassen sich umfangreiche Richtlinien für die Auswahlmöglichkeiten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in der Literatur finden; vergl. z. B. Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984; Amarnath und Broom, Chemical Reviews, Bd. 77 (1977), S. 183-217; Pon et al., Biotechniques, Bd. 6 (1988), S. 768-775; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, Bd. 10 (1982), S. 6553-6570; Eckstein, Hrsg., (a. a. O.); Greene und Wuts (a. a. O.); Narang Hrsg., Synthesis and Applications of DNA and RNA, Academic Press, New York, 1987; und dergl.
Die erfindungsgemäßen Synthonvorläufer werden im allgemeinen gemäß dem nachstehenden Reaktionsschema synthetisiert: Schema I
Im allgemeinen werden die Synthonvorläufer durch Umsetzung eines entsprechend 1,2-substituierten Ethanderivats mit Phosphortrichlorid in einem aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise Hexan, Diethylether oder Methylenchlorid, bei einer Temperatur im Bereich von -10º-30ºC in Gegenwart einer Base, wie Trialkylamin oder Pyridin, hergestellt. Vorzugsweise wird Pyridin als Base verwendet. Das erhaltene 2-Chlor-1,3,2-dichalcophospholan wird sodann mit sekundären Aminen, wie N,N-Diisopropylamin oder Morpholin, unter Bildung der bevorzugten Synthonvorläufer umgesetzt.
Erfindungsgemäße Synthons werden im allgemeinen gemäß dem nachstehenden Reaktionsschema synthetisiert: Schema II
worin R¹, R³ bis R&sup6;, W, X, Q, Y und Z die vorstehend definierten Bedeutungen haben. [X] bedeutet ein Mittel zur Übertragung des X-Restes auf den Phosphor. Wenn X die Bedeutung S hat, bedeutet [X] elementaren Schwefel, 1,1-Dioxo-3H-1,2-benzodithiol-3-on oder ein Acyldisulfid oder ein entsprechendes Diphosphorthioyldisulfid; vergl. z. B. Stec et al., PCT/US91/01010. Wenn X die Bedeutung Se hat, handelt es sich bei [X] um elementares Selen oder eine gesättigte Lösung von Kaliumselenocyanat, beispielsweise in 95% Pyridin/5% Triethylamin, gemäß der Lehre von Stec et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 106 (1984), S. 6077-6079. Wenn X die Bedeutung NR² hat, bedeutet [X]ein Acid der Formel N&sub3;R², worin R² Aryl mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet. Vorzugsweise hat R² die Bedeutung Phenyl. Vorzugsweise wird die Umsetzung in einem aprotischen organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder dergl., durchgeführt. Wenn W kein Halogenatom bedeutet, wird die Umsetzung mit einer schwachen Säure, wie Tetrazol oder substituiertem Tetrazol durchgeführt; vergl. z. B. Dahl et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15 (1987), S. 1729-1743. Wenn W ein Halogenatom bedeutet, wird die Umsetzung vorzugsweise durch eine schwache Base, wie Pyridin, substituiertes Pyridin oder Trialkylamin, katalysiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der schwachen Base um Triethylamin oder Diisopropylethylamin.
Wenn Q, X, Y und Z so gewählt sind, daß das Synthon P-chiral ist, so müssen die Rp- und Sp-Formen des Synthons vor der Synthese von Polymeren von vorbestimmter Chiralität in den P-stereogenen Zentren getrennt werden. Die hier verwendeten Ausdrücke "Rp" und "Sp" beziehen sich auf die alternativen Stereokonfigurationen der chiralen Phosphoratome in den Synthons oder in den Phosphorverknüpfungen der Polymeren. Beispiele für Rp- und Sp-Dimere sind nachstehend aufgeführt:
In bezug auf P-chirale Polymere wird die Sequenz der chiralen Phosphoratome mit den tiefgestellten Indices "ps" oder "pr" zwischen den Monomeren bezeichnet. Beispielsweise stehen QpsQpsQpsQpsQ für ein Pentameres mit vier Sp-Phosphorverknüpfungen oder
ApsTprGpsAprCpsTprTpsGprGpsAprC für ein 11-meres Oligonucleotid mit abwechselnden Rs- und Rp-Phosphorverknüpfungen (worin A, C, G und T die natürlichen 2'-Desoxynucleoside Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin bzw. Desoxythymidin bedeuten, sofern nichts anderes angegeben ist). Wenn die Phosphorverknüpfung achiral ist, erfolgt keine Bezeichnung zwischen den Monomeren. Somit bedeutet QpsQQQQ ein Pentameres mit einer einzigen P-chiralen Verknüpfung des Sp-Typs, während der Rest der Verknüpfungen entweder achiral oder gemischt Rp- und Sp-chiral ist.
In bezug auf Nucleosidmonomere kann der Phospholanrest der Synthons entweder an die 3'- oder an die 5'-Hydroxylgruppe gebunden sein, was die Synthese von 3'→5' oder 5'→3'-Oligonucleotiden ermöglicht. Vorzugsweise wird der Phospholanrest über die 3'-Hydroxylgruppe gebunden.
Die Auftrennung der Rp- und Sp-chiralen Formen der Synthons wird unter Anwendung standardmäßiger Techniken durchgeführt, wobei man sich üblicherweise der Kieselgelchromatographie oder der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) bedient; vergl. z. B. Mislow, Introduction to Stereochemistry, W. A. Benjamin, New York, 1966. In bezug auf Nucleosid- Synthons können in einigen Fällen die Rp- und Sp-Formen durch ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber einer Verdauung ihrer Oligomeren durch bekannte Nucleasen identifiziert werden, wobei aber üblicherweise die Rp-Form das Diastereoisomere darstellt, das unter den nachstehend beschriebenen HPLC-Bedingungen langsamer eluiert wird. Eine herkömmliche Röntgenstrahlenkristallographie und 2-D-NMR-Verfahren können ebenfalls zur Zuordnung der absoluten Stereochemie am Phosphoratom in Fällen herangezogen werden, wo die Chiralität des Monomeren bekannt ist. Der hier verwendete Ausdruck "diastereoisomer rein" in bezug auf die Rp- und Sp- Formen der erfindungsgemäßen Synthons oder in bezug auf Oligomere mit einer bestimmten Sequenz der Rp- und Sp-Chiralität bedeutet, daß die angegebene stereochemische Konfiguration im wesentlichen frei von sämtlichen anderen Phosphorkonfigurationen ist. Vorzugsweise bedeutet dies eine Verbindung, die auf molarer Basis zu mehr als 95% für jede Verknüpfung die angegebene stereochemische Konfiguration und zu weniger als 5% für jede Verknüpfung andere Phosphorkonfigurationen aufweist. Insbesondere bedeutet dieser Ausdruck eine Verbindung, die auf molarer Basis zu mehr als 99% für jede Verknüpfung die angegebene stereochemische Konfiguration und zu weniger als 1% andere Phosphorkonfigurationen für jede Verknüpfung aufweist.
Die erfindungsgemäßen Polymeren werden im allgemeinen gemäß dem nachstehenden Schema synthetisiert: Schema III
worin Q, X, Y und Z die vorstehend definierten Bedeutungen haben und worin SS einen Festphasenträger und R&sup7; ein Verkappungsmittel, wie Acyl, Isopropylphosphonat oder dergl., bedeuten. Ein wichtiges Merkmal der Kupplungsreaktion besteht in der Anwesenheit einer katalytischen Base, die vorzugsweise nicht nucleophil ist, z. B. Kalium-tert.-butanolat, 1- Methylimidazol, N-Methylimidazol, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder dergl. Vorzugsweise wird DBU als katalytische Base verwendet, und zwar in einem großen molaren Überschuß (z. B. 100-300x) der Reaktanten. Die Kupplungsreaktion kann in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, Methylenchlorid, N,N-Dimethylformamid oder dergl., durchgeführt werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß SS einen Festphasenträger umfassen kann, an den Oligonucleotide gebunden sind, die unter Anwendung einer anderen chemischen Vorgehensweise synthetisiert worden sind, beispielsweise unter Verwendung von Phosphoramidit-Synthons.
Eine Vielzahl von Festphasenträgern kann erfindungsgemäß verwendet werden, wobei aber Glas oder Polystyrol mit kontrollierten Poren bevorzugt werden. Vorzugsweise wird der Festphasenträger einer solchen Derivatbildung mit dem ersten Monomeren der zu synthetisierenden Polymerkette unterzogen, daß die verknüpfende Gruppe,. die das Monomere mit dem Träger verbindet, in Gegenwart der katalytischen Base und von anderen Reagenzien, die im Synthesezyklus verwendet werden, stabil ist. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polymeren an Festphasenträger, z. B. Glas mit kontrollierten Poren (CPG), durch einen Sarcosinyllinker gebunden; vergl. Brown et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., (1989), S. 891-893; und Pfleiderer et al., Tetrahedron Letters, Bd. 31 (1990), S. 2549. Kurz zusammengefaßt, wird der Festphasenträger auf folgende Weise funktionalisiert: 9-Fluorenylmethoxycarbonylsarcosin (FMOC-Sarcosin) (10 Äquivalente) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (15 Äquivalente) werden zu einem langkettigen Alkylamino-CPG in einem Gemisch aus N,N-Dimethylformamid (DMF) und Dichlormethan gegeben. An die Entfernung der FMOC-Gruppe mit Piperidin in Pyridin schließt sich die Kupplung der Sarcosinmethylaminogruppe an ein hydroxylgeschütztes, monomeres O-Succinat (10 Äquivalente) in Gegenwart von DCC (15 Äquivalente) an. Für 5'-O-DMT-geschützte Nucleoside führt dies zu einer Beladung mit etwa 20 Mikroäquivalenten pro Gramm des trockenen Trägers.
Vorzugsweise wird zusätzlich zu den allgemeinen Stufen des vorstehend dargestellten Synthesezyklus nach jeder Kupplungsstufe eine Verkappungsstufe hinzugefügt, bei der nicht-umgesetzte freie Hydroxylgruppen mit einer Gruppe umgesetzt werden, die eine weitere Monomeraddition verhindert. Vorzugsweise werden die nicht umgesetzten freien Hydroxylgruppen mit einer Verkappungslösung umgesetzt, die aus 1 Teil Essigsäureanhydrid/Lutidin in Tetrahydrofuran (THF) (10 : 10 : 80 Vol./Vol./Vol.) und 1 Teil N-Methylimidazol in THF (16 : 84 Vol./Vol.) besteht. Insbesondere wird der Festphasenträger nach jeder Stufe der Schutzgruppenentfernung, Kupp lung und Verkappung mit einem geeigneten Lösungsmittel, üblicherweise Acetonitril, gewaschen.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert. Die Vorrichtung zum Automatisieren kann verschiedenartig ausgestaltet sein. Im allgemeinen umfaßt die Vorrichtung eine Reihe von Reagenzbehältern, eine den Festphasenträger enthaltende Synthesekammer und eine rechnergesteuerte Einrichtung, um in vorbestimmter Weise Reagenzien aus den Reagenzbehältern in die Synthesekammer und die Reinigungskammer zu transportieren und aus diesen zu entfernen sowie sie aus der Synthesekammer in die Reinigungskammer zu transportieren. Die rechnergesteuerte Einrichtung zur Übertragung von Reagenzien kann mit einem Laboratoriumsroboter für allgemeine Zwecke (vergl. z. B. Wilson et al., Bio Techniques, Bd. 6 (1988), S. 779), oder mit einem dafür vorgesehenen Schlauchsystem und elektronisch gesteuerten Ventilen realisiert werden. Vorzugsweise wird die rechnergesteuerte Einrichtung durch ein dafür vorgesehenes System aus Ventilen und Schläuchen, die die verschiedenen Behälter und Kammern verbinden, realisiert. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Reagenzien durch Aufrechterhaltung eines positiven Drucks in den Reagenzienbehältern unter Einwirkung eines unter Druck stehenden Inertgases, wie Argon gedrückt, was der Vorgehensweise in zahlreichen, weit verbreiteten automatisierten Synthesegeräten, z. B. den DNA-Synthesegeräten der Fa. Applied Biosystems. Inc., Modelle 380B oder 381A, entspricht.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können als Hybridisierungssonden gemäß der Lehre von Hames et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polymeren können auch als Bestandteile von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Im Fall der erfindungsgemäßen Poly-(alkyl- oder -alkenylphosphate) enthalten derartige Zusammensetzungen eine antivirale therapeutische Menge von mindestens einem Poly-(alkyl- oder -alkenylphosphat) und/oder mindestens einem der Thiophosphatanalogen davon in einem pharmazeutisch wirksamen Träger. Die Poly-(alkyl- oder -alkenylphosphate) und ihre Thioanalogen können entweder mit einer einzigen Kettenlänge (d. h. einem einzigen Wert von n) oder in Form eines definierten Gemisches mit einem Gehalt an Polymeren mit mehr als einer Kettenlänge verabreicht werden. Insbesondere wird eine einzige Kettenlänge im Bereich von 15 bis 30 Monomeren verwendet.
Eine Vielzahl von Krankheiten und Störungen kann durch Verabreichung einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an den erfindungsgemäßen anti sense-Oligonucleotiden behandelt werden. Zu viralen Erkrankungen, die durch die antisense-Hemmung der Nucleinsäureexpression behandelt werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) durch Hepatitis B-Virus, Cytomegalovirus, Herpes-simplex-Virus I oder II, HIV-Virus Typ I oder II, Influenzavirus, Rs-Virus und humaner Papillomavirus verursachte Erkrankungen. Zu malignen Zuständen, die durch Verabreichung der erfindungsgemäßen antisense-Verbindungen behandelt werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Lungenkrebs (z. B. kleinzelliges Lungenkarzinom), kolorektaler Krebs, Prostatakrebs, Brustkrebs sowie Leukämien und Lymphome. Bei derartigen Krankheiten werden die antisense-Verbindungen auf in aberranter Weise exprimierte Oncogene, die mit diesen Krankheiten zusammenhängen, oder auf andere Gene, die als Bestandteil des Krankheitszustands in unpassender Weise exprimiert werden, gerichtet; vergl. z. B. Aaronson, Science, Bd. 254 (1991), S. 1146-1153. Akute Entzündungs- und Immunreaktionen, wie septischer Schock, Eosinophilie und dergl., können ebenfalls mit den erfindungsgemäßen antisense-Verbindungen behandelt werden, wobei in unpassender und/oder aberranter Weise exprimierte Cytokin- Gene gehemmt werden; vergl. z. B. Tracey et al., Nature, Bd. 330 (1987), S. 662-664; US-5 055 447; und Waage et al., J. Exp. Med., Bd. 169 (1989), S. 333-338) (antisense-TNF-α und/oder -TNF-β); Starnes et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 4185-4191; und Fong et al., J. Immunol., Bd. 142, S. 2321-2324 (antisense-IL-6); Coffman et al., Science, Bd. 245, S. 308-310 (antisense-IL-5); Finkelman et al., J. Immunol., Bd. 141 (1988), S. 2335-2341 (antisense-IL-4); Young et al., Blood, Bd. 68 (1986), S. 1178-1181 (antisense-GM-CSF); und dergl.
Bei einem pharmazeutischen Träger kann es sich um eine beliebige verträgliche, nicht-toxische Substanz handeln, die zur Abgabe der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen an einen Patienten geeignet ist. Ein Träger kann steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse, neutrale Lipide, kationische Lipide und inerte Feststoffe enthalten. Pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie Pufferungsmittel, Dispergiermittel und dergl., können ebenfalls der pharmazeutischen Zusammensetzung einverleibt werden. Für eine topische Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Salben, Gele oder Cremes zubereitet, wie es allgemein aus dem Stand der Technik bekannt ist. Im allgemeinen sind Zusammensetzungen, die sich für eine parenterale Verabreichung von Arzneistoffen eignen, bekannt; vergl. z. B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflg., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Die erfindungsgemäßen Zusammenset zungen können auch mittels eines implantierbaren oder injizierbaren Arzneistoffabgabesystems verabreicht werden; vergl. beispielsweise Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Bd. 24 (1984), S. 199-236; Lewis, Hrsg., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York, 1981; US-3 773 919; US-3 270 960; oder dergl. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zum Transport von Resten zur Unterstützung beim Erreichen von Geweben oder beim Eindringen in Zellmembranen und dergl. konjugiert werden, wie es beispielsweise von Latham et al. in WO-91/14696 beschrieben wird.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen parenteral und insbesondere intravenös verabreicht. In derartigen Fällen umfassen die pharmazeutischen Träger Kochsalzlösungen, Dextroselösungen, Kombinationen dieser beiden Lösungen, nicht-wäßrige Lösungen, wie Ethyloleat, und dergl.
Die Wahl des Verabreichungsschemas für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung hängt von mehreren Faktoren ab, wozu die Abbaugeschwindigkeit der speziellen Verbindungen im Serum, die Zugänglichkeit der Zielgewebe und -zellen, pharmakokinetische Parameter, die Toxizität und dergl. gehören. Vorzugsweise wird bei einem Verabreichungsschema die Menge der einem Patienten zu verabreichenden Verbindung entsprechend einem hinnehmbaren Ausmaß an Nebenwirkungen auf ein Maximum eingestellt. Demgemäß kann die Menge einer abzugebenden Verbindung von der speziellen Verbindung und der Schwere der viralen Infektion oder anderen zu behandelnden Zuständen abhängen. Vorzugsweise liegt eine Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen im Bereich von etwa 1-2 ug/kg bis etwa 10-20 mg/kg.

Beispiel 1

2-Chlor-1,3,2-oxathiaphospholan

Ein Gemisch aus Pyridin (79,1 g, 1,0 Mol) und Benzol (400 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Rühren mit 2-Mercaptoethanol (39,1 g, 0,5 Mol) und Phosphortrichlorid (68,7 g, 0,5 Mol) versetzt. Der Rührvorgang wurde 0,5 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Pyridiniumchlorid abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Das rohe Produkt wurde durch Destillation unter vermindertem Druck gereinigt. Die bei 70- 72ºC/20 mmHg siedende Fraktion wurde gewonnen. ³¹P-NMR: δ 205,0 ppm (Benzol). Ausbeute: 72%.

Beispiel 2

N,N-Diisopropylamino-1,3,2-oxathiaphospholan

Eine Lösung von 2-Chlor-1,3,2-oxathiaphospholan von Beispiel 1 (28,5 g, 0,2 Mol) in n-Pentan (300 ml) wurde tropfenweise bei Raumtemperatur unter Rühren mit N,N-Diisopropylamin (40,5 g, 0,4 Mol) versetzt. Nach 0,5 h wurde Diisopropylaminhydrochlorid durch Filtration entfernt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Das Produkt wurde destilliert. Die bei 70ºC/0,1 mmHg gewonnene Fraktion erwies sich bei ³¹P-NMR als homogen. Ausbeute 70%. ³¹P-NMR: δ 147,8 ppm (Benzol). MS: m/z 207 (M&supmin;, E. I., 15 eV).

Beispiel 3

2-N,N-Diisopropylamino-4,4-dimethyl-1,3,2-oxathiaphospholan

Eine Lösung von 20 mMol wasserfreiem Pyridin in Benzol (25 ml) wurde bei 0-5ºC tropfenweise unter Rühren mit einem Gemisch aus 10 mMol 2-Methyl-2-mercaptopropanol-1 und 10 mMol Phosphortrichlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann 1 h bei Umgebungstemperatur belassen. Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Durch Destillation erhielt man 2-Chlor-4,4-dimethyl- 1,3,2-oxathiaphospholan vom Kp. 48-52ºC/0,1 mmHg. 10 mMol dieser Verbindung wurden in 25 ml n-Hexan gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur mit 20 mMol N,N-Diisopropylamin versetzt. Nach 1 h wurde Diisopropylaminhydrochlorid durch Filtration entfernt. Das Produkt, 2- N,N-Diisopropylamino-4,4-dimethyl-1,3,2-oxathiaphospholan, wurde unter vermindertem Druck destilliert. Die bei 86-90ºC/0,1 mmHg anfallende Fraktion wurde gewonnen. ³¹P-NMR (C&sub6;D&sub6;): δ 154,3 ppm.

Beispiel 4

2-N,N-Diisopropylamino-1,3,2-dithiaphospholan

A. Eine Lösung von 20 mMol wasserfreiem Pyridin in Benzol (25 ml) wurde bei 0-5ºC tropfenweise unter Rühren gleichzeitig mit 10 mMol 1,2- Ethandithiol und 10 mMol Phosphortrichlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde bei 14 mmHg abdestilliert. Man erhielt 1,15 g (73%) 2-Chlor-1,3,2-Dithiaphospholan als farblose Flüssigkeit vom Kp. 110ºC. ³¹P-NMR: δ 170,7 ppm (C&sub6;D&sub6;).
B. Eine Lösung von 2-Chlor-1,3,2-Dithiaphospholan (10 mNol) in Benzol (25 ml) wurde bei 0-5ºC unter Rühren mit N,N-Diisopropylamin (20 mMol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur ge rührt. Diisopropylaminhydrochlorid wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde bei 0,6 mmHg destilliert. Man erhielt 1,4 g (63%) 2-N,N-D üsopropylamino-1,3,2-dithiaphospholan in Form einer farblosen Flüssigkeit vom Kp. 110ºC. ³¹P-NMR: δ 93,9 ppm (CD&sub3;CN).

Beispiel 5

N&sup6;-Isopropoxyacetyl-5'-O-(4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl)-2-desoxyadenosin-3'-O-[1,3,2-oxathiaphospholan-2-sulfid]

1 mMol N&sup6;-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin und 1 mMol 1- H-Tetrazol wurden unter Vakuum bei 50ºC getrocknet. Nach Lösen in wasserfreiem Methylenchlorid (3 ml) wurde unter Rühren 2-Diisopropylamino- 1,3,2-oxathiaphospholan (1,1 mMol) zugegeben. Der Rührvorgang wurde 1 h bei Umgebungstemperatur fortgesetzt. Sodann wurden 10 mMol elementarer Schwefel zugegeben. Nach Rühren über Nacht wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und an einer Kieselgelsäule gereinigt. Ausbeute 90%. ³¹P-NMR: δ 103,63; 8 103,58 ppm (C&sub6;D&sub6;). 85% H&sub3;PO&sub4; als externer Standard.

Beispiel 6

N&sup4;-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxycytidin-3'-O-[1,3,2-oxathiaphospholan-2-sulfid]

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß N&sup4;-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxycytidin als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Ausbeute 87-88%. ³¹P-NMR: δ 104,38; δ 104,36 ppm (C&sub6;D&sub6;). 85% H&sub3;PO&sub4; als externer Standard.

Beispiel 7

N²-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxyguanosin-3'-O-[1,3,2-oxathiaphospholan-2-sulfid]

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß N²-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxyguanosin als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Ausbeute 72%. ³¹P-NMR: δ 103,66; δ 103,58 ppm (C&sub6;D&sub6;). 85% H&sub3;PO&sub4; als externer Standard.

Beispiel 8

5'-O-DMT-2'-desoxythymidin-3'-O-[1,3,2-oxathiaphospholan-2-sulfid]

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß 5'-O-DMT-2'-Desoxythymidin als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Ausbeute 92%. ³¹P-NMR: δ 104,14; δ 104,12 ppm (C&sub6;D&sub6;). 85% H&sub3;PO&sub4; als externer Standard.

Beispiel 9

Trennung der Stereoisomeren der Synthons der Beispiele 5-8

Diastereoisomere Gemische der Synthons (Aipa, Cipa, Cipa und T bedeuten die Produkte der Beispiele 5-8) wurden an Kieselgel (Kieselgel 60H)-Säulen (200 · 60 mm) gemäß den Angaben in der nachstehenden Tabelle aufgetrennt. Es wurde jeweils 1 g des Produkts aufgesetzt.

Beispiel 10

Weitere Synthese von Nucleosid-3'-O-[2-thiono-1,3,2-oxathiaphospholan]-Synthons

Nucleosid-Synthons wurden mit den exocyclischen Aminen der folgendermaßen geschützten Basenreste hergestellt: N&sup6;-Benzoyladenin, N&sup4;-Benzoylcytosin und N²-Isobutyrylguanin (die entsprechenden Synthons werden durch Abz, Cbz und Gibu wiedergegeben, das Thymidin-Synthon durch T). Die einzelnen vier Synthons wurden auf folgende Weise hergestellt. Das Gemisch aus den entsprechenden geschützten 5'-DMT-O-(2'-Desoxyribonucleosid) (10 mMol) und 1 H Tetrazol (0,77 g, 11 mMol) wurde 5 h unter Hochvakuum getrocknet und sodann in Dichlormethan (25 ml) gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise innerhalb von 10 min mit dem Produkt von Beispiel 2 (2,28 g, 11 mMol) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 2 h unter Rühren bei Raumtemperatur belassen. Elementarer Schwefel (0,48 g, 15 mMol), der vorher mehrere Stunden an einer Vakuumleitung getrocknet worden war, wurde in einer Portion zu dem Reaktionsgemisch gegeben, das sodann über Nacht gerührt wurde. Nicht-umgesetzter Schwefel wurde abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer abgedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (3 ml) gelöst und auf eine Kieselgelsäule (30 cm · 6 cm, 170 g eines 230-400 mesh-Kieselgels) aufgesetzt. Die Elution wurde mit CHCl&sub3; (200 ml) und sodann mit CHCl&sub3; : CH&sub3;OH (97 : 3, Vol./Vol.) durchgeführt. Die Isolation wurde durch HPTLC der gewonnenen Fraktionen überwacht. Die gewonnenen Fraktionen, die die entsprechenden Produkte enthielten, wurden vereinigt und eingedampft. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wurden sämtliche Produkte als weiße, schaumartige Feststoffe erhalten. Sie bestanden aus Gemischen der entsprechenden Sp- und Rp-Diastereoisomeren in Ausbeuten von 90, 89, 85 bzw. 92% für Abz, Cbz, Gibu bzw. T.
Die reinen Diastereoisomeren wurden in sämtlichen Fällen auf ähnliche Weise, wie es nachstehend für Cbz angegeben wird, erhalten. 1 g des Cbz-Produkts wurde in Ethylacetat (4 ml) gelöst und auf eine Kieselgelsäule (30 cm · 6 cm) (Kieselgel 60 H, 200 g Merck, Art. Nr. 7736) aufgesetzt. Die Diastereoisomeren wurden mit Ethylacetat eluiert. Fraktionen von 15 ml wurden gewonnen. Die Elution der Produkte wurde durch HPTLC (dreifache Entwicklung in Ethylacetat; Nachweis: HCl-Spray) verfolgt. Fraktionen, die die aufgetrennten Diastereoisomeren (schnell: Fraktionen 61-73 und langsam: Fraktionen 87-98) enthielten, wurden jeweils vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch ³¹P-NMR und HPLC unter Verwendung von Lichrospher Si100, 5 um (30 cm · 7,8 mm) unter Verwendung von Ethylacetat als Elutionsmittel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min) charakterisiert. Für das rasche Diastereoisomere: 250 mg Ausbeute, 25%; ³¹P-NMR (in C&sub6;D&sub6;, H&sub3;PO&sub4; als externer Standard): δ 104,31 ppm (Benzol). 100% diastereoisomere Reinheit. Für das langsame Diastereoisomere: 180 mg Ausbeute, 18%; ³¹P- NMR: δ 104,26 ppm (Benzol), 100% diastereoisomere Reinheit. Die Fraktionen 74-86 wurden für wiederholte Isolationen der Isomeren zurückgeführt. Die Daten der isolierten Synthons sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt:

Beispiel 11

5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-(2-thiono-4,4-dimethyl-1,3,2-oxathiaphospholan

1 mMol 5'-O-DMT-thymidin und 1 mMol 1H-Tetrazol wurden unter Vakuum 3 h getrocknet. 4 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde mit 1 mMol 2-N,N-Diisopropylamino-4,4-dimethyl-1,3,2-oxathiaphospholan vermischt. Die Phosphitylierung wurde mittels TLC (CHCl&sub3; : MeOH, 9 : 1) verfolgt. Nach Verschwinden des Phosphitylierungsmittels wurde das Reaktionsgemisch mit 1 mMol elementarem Schwefel versetzt. Sodann wurde das Gemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Produkte wurden an einer Kieselgelsäule unter Verwendung von CHCl&sub3; gereinigt. Ausbeute: 68%, Rf (TLC): 0,74 (CHCl&sub3; : MeOH, 9 : 1). ³¹P-NMR: 108,08; 107,80 ppm (CD&sub3;CN).

Beispiel 12

Nucleosid-5'-O-DMT-3'-O-[2-thiono-1,3,2-dithiaphospholan]-Synthons

Das Produkt von Beispiel 4 wurde gemäß den Angaben von Beispiel 11 mit 5'-DMT-geschützten Nucleosiden (die exocyclischen Amine sind wie in Beispiel 10 geschützt) umgesetzt. Man erhielt die 2-Thiono-1,3,2-dithiaphospholan-Synthons. Es wurde festgestellt, daß die Wirksamkeit der Sulfurierung durch Anwesenheit von Spurenmengen an Pyridin verstärkt wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt:

Beispiel 13

5'-O-DMT-thymidin-3'-O-(2-seleno-1,3,2-oxathiaphospholan]

5'-O-DMT-thymidin wurde mit 2-N,N-Diisopropylamino-1,3,2-oxathiaphospholan und elementarem Selen unter analogen Bedingungen wie in Beispiel 11 umgesetzt. Ausbeute: 80%, ³¹P-NMR: 99,05; 98,90 ppm, (CHCl&sub3;, JPSe 952,16 Hz. Rf: 0,77 (CHCl&sub3; : MeOH, 9 : 1).

Beispiel 14

Synthese von 5'-O-DMT-Nucleosiden, die über Sarcosinyllinker an einen Festphasenträger gebunden sind

A. Das langkettige Alkylamin CPG (LCA-CPG, Sigma, Kat. Nr. L-8638, 500 A, 80-130 mesh, 2 g) und N-Fmoc-Sarcosin (Bachem Bioscience, Inc., Prod. Nr. B-1720, 0,5 g, 1,6 mMol) wurden miteinander vermischt und 3 h unter Hochvakuum getrocknet. Trockenes Dimethylformamid (5 ml), Pyridin (0,5 ml) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,5 g, 2,4 mMol) wurden zugegeben. Das gesamte Gemisch wurde in dicht verschlossene Fläschchen (7,4 ml) gegeben und 12 h mäßig geschüttelt. Eine Suspension des Festphasenträgers wurde auf Glasfritten übertragen. Sodann wurde das Lösungsmittel abgesaugt. Der Träger wurde 3 mal mit Methanol/Acetonitril/Pyridin (1 : 1 : 1, Vol./Vol./Vol., 3 · 20 ml) gewaschen. Restliche Lösungsmittel wurden unter Hochvakuum entfernt. Das N-Fmoc-sarcosinylierte LCA-CPG wurde in einer 10%igen Lösung von Piperidin in Pyridin (Vol./Vol., 10 ml) für 0,5 h suspendiert, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Das N-sarcosinylierte LCA-CPG wurde abfiltriert und mit Methanol/Acetonitril/Pyridin (1 : 1 : 1, Vol./Vol./Vol., 3 · 20 ml) gewaschen und anschließend 5 h unter Hochvakuum getrocknet.
B. Das gemäß A erhaltene Produkt (0,5 g) wurde getrennt mit den jeweiligen 3'-O-succinylierten Produkten 5'-O-DMT-dAbz, -dGibu, dCbz und -dT vermischt. Die Gemische wurden 2 h unter Hochvakuum getrocknet, wonach DMF (2 ml), Pyridin (0,2 ml) und DCC (50 mg) zugegeben wurden. Die erhaltenen Gemische wurden mäßig bei Raumtemperatur in dicht geschlossenen Fläschchen für 12 h geschüttelt. Eine Suspension des festen Trägers von jedem Gemisch wurde getrennt auf Glasfritten übertragen und 3 mal mit Methanol/Acetonitril/Pyridin (1 : 1 : 1, Vol./Vol./Vol., 3 · 20 ml) und schließlich mit Acetonitril (3 · 10 ml) gewaschen. Nach Trocknen mit einem Strom von trockenem Stickstoff wurden die Träger mit einem Acylierungsmittel (N-Methylimidazol/THF, 1 ml, Applied Biosystems, Inc., Kat. Nr. 400785, und Essigsäureanhydrid/Lutidin/THF, 1 ml, Applied Biosystems, Inc., Kat. Nr. 400607) für 15 min behandelt. Nach gründlichem Waschen mit Methanol/Acetonitril/Pyridin (1 : 1 : 1, Vol./Vol./Vol., 3 · 10 ml) und Acetonitril (3 · 10 ml) wurden die erhaltenen Festphasenträger unter Hochvakuum getrocknet. Das Beladen der Träger mit den jeweiligen Nucleosiden, die durch Trityltest bestimmt worden waren, erfolgte auf folgende Weise: CPG-Sarcosinyl-dAbz: 42,7 uMol/g; CPG-Sarcosinyl-dGibu: 46,7 uMol/g; CPG- Sarcosinyl-dCbz: 31,6 uMol/g; und CPG-Sarcosinyl-dT: 35,0 uMol/g.

Beispiel 15

2'-Desoxyadenylyl-(3',5')-2'-desoxyadenosin-thiophosphat (Rp-Isomeres)

A. Über eine Säule (Volumen 110 ul), die an jedem Ende mit einem Filter gesichert war und 1 uMol N&sub6;-Isopropoxyacetyl-5'-O-DMT-2'-desoxy adenosin (Uznanski et al., Nucleic Acids Research, Bd. 17 (1989), S. 4863-4868), das an einen festen Träger gebunden war, enthielt, wurden 5 ml 2% Dichloressigsäure in Methylenchlorid innerhalb von 1 Minute gegeben. Anschließend wurde der Träger mit 15 ml Acetonitril gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet.
B. In die auf die vorstehend beschriebene Weise vorbereitete Säule wurden 110 ul Lösung mit einem Gehalt an 30 uMol N&sub6;-Isopropoxyacetyl-5'- O-DMT-2'-desoxyadenosin-3'-O-1,3,2-oxathiaphospholan-2-sulfid (langsamer eluierendes Diastereoisomeres) und 300 uMol 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec- 7-en (DBU) eingeführt. Die Umsetzung wurde 20 Minuten bei 18-24ºC fortgesetzt. Die Säule wurde mit 10 ml Acetonitril gewaschen. Anschließend wurden 5 ml 2% Dichloressigsäure in Methylenchlorid über die Säule gegeben, um die 5'-Hydroxylschutzgruppe zu entfernen.
C. Nach gründlichem Waschen mit Acetonitril wurde 1 ml 25% Ammoniaklösung langsam für 1 h über die Säule gegeben, um das Dimere vom festen Träger abzuspalten und um die Schutzgruppen der exocyclischen Aminfunktionen zu entfernen. Das Produkt wurde durch HPLC gereinigt (PRP1- Hamilton-Säule, 30 · 7 mm), wobei ein Gradient von 5-20% Acetonitril/Wasser, 0,1 M Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) verwendet wurde und die Strömungsgeschwindigkeit 3 ml/min betrug.

Beispiel 16

(RpRpRpRpRpRpRp)-Octathymidylthiophosphorsäure

Die Synthese wurde gemäß Beispiel 14 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-1,3,2-oxathiaphospholan-Synthons (langsamer eluierende Diastereoisomere) in 7 Kupplungszyklen eingesetzt wurden. Das Produkt wurde gemäß den Angaben von Beispiel 14 gewaschen, gespalten, von Schutzgruppen befreit und gereinigt.
Das Produkt wurde durch Schlangengift-Phosphodiesterase (svPDE) (Crotalus adamenteus), von dem bekannt ist, daß es Rp-Isomere von Thiophosphaten hydrolysiert, und durch Nuclease P1 (Penicillium citrinum), von dem bekannt ist, daß es Sp-Isomere von Thiophosphaten hydrolysiert, getestet. Puffer I für svPDE: 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5 und 15 mH MgCl&sub2;. Puffer II für Nuclease P1: 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, 1 mM ZnCl&sub2;. Für den svPDE-Test wurde 1 optische Dichteeinheit des Octathymidylthiophosphorsäure-Produkts zu 20 ug svPDE in 500 ul Puffer I gegeben und 24 h bei 37ºC inkubiert. Die HPLC-Analyse gemäß Beispiel 14 ergab, daß das Produkt vollständig zu Thymidin-5'-thiophosphat hydrolysiert wurde. Für den Nuclease P1-Test wurde 1 optische Dichteeinheit des Octathymidylthiophosphorsäure-Produkts zu 10 ug svPDE in 500 ul Puffer II gegeben und 24 h bei 37ºC inkubiert. Die HPLC-Analyse gemäß Beispiel 14 ergab, daß das Produkt gegenüber der Hydrolyse durch das Enzym vollkommen beständig war.

Beispiel 17

(SpSpSpSpSpSpSp)-Octathymidylthiophosphorsäure

Die vollständig Sp-chirale Octathymidylthiophosphorsäure wurde gemäß Beispiel 15 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das rascher eluierende (Sp) Diastereoisomere von 5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-1,3,2-oxathiaphospholan- 2-sulfid als Synthon verwendet wurde. Das Produkt wurde mit svPDE und Nuclease Pl gemäß Beispiel 15 getestet. Es wurde festgestellt, daß es gegen svPDE vollkommen beständig ist und durch Nuclease P1 vollständig hydrolysiert wird.

Beispiel 18

Dithymidyl-(3',5')-dithiophosphat

A. In Lösung

Das Gemisch aus 5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-[2-thiono-1,3,2-dithiaphospholan] (0,3 mMol) und 3'-O-Acetylthymidin (0,3 mMol) wurde 3 h unter Vakuum getrocknet und anschließend in 3 ml wasserfreiem CH&sub3;CN gelöst. Diese Lösung wurde mit 0,33 mMol DBU versetzt. Das Gemisch wurde 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Die ³¹P-NMR-Untersuchung ergab das Vorliegen von 70% 3'-O-5'-O-geschütztem Dithymidyl-(3',5')-dithiophosphat (δ 116,7 ppm), 2% nicht-umgesetztes Synthon und 28% Nebenprodukte (δ 71,8 und δ 72,2 ppm). Nach Abdampfen des Lösungsmittels verblieb ein Feststoff, der in 3 ml 80% CH&sub3;COOH gelöst wurde. Anschließend wurden 2 g Essigsäure unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde erneut in 5 ml 25% NH&sub4;OH gelöst. Diese Lösung wurde 15 h bei 55ºC inkubiert. Nach Einengen und Lösen in 5 ml Wasser wurden feste Teilchen abfiltriert. Das Filtrat wurde auf eine mit DEAE-Sephadex A-25 gepackte Säule aufgesetzt. Das Produkt wurde mit einem 0,05-1 M Gradienten von TEAB eluiert. Die UV-absorbierende Fraktion wurde gewonnen und eingeengt. Die ³¹P-NMR-Untersuchung (D&sub2;O) ergab die Anwesenheit des Produkts. δ 113,8 ppm, Reinheit > 95%. Ausbeute aus dem UV-Absorptionsprofil: 46,6%. Eine weitere Analyse durch FAB-MS bestätigte das Vorliegen von Dithymidyl-(3',5')-dithiophosphat als Produkt.

B. Am festen Träger

1 uMol CPG-T in einer Säule (Applied Biosystems, Inc.) wurde detrityliert. 10 uMol 5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-[2-thiono-1,3,2-dithiaphospholan] (unter Vakuum getrocknet), das mit 140 ul CH&sub3;CN verdünnt war, wurde auf die Säule zusammen mit 10 uMol DBU in 15 ul CH&sub3;CN aufgesetzt. Nach 10 Minuten (unter gelegentlichem Schütteln) wurde die Säule mit CH&sub3;CN gewaschen, detrityliert und von Schutzgruppen befreit sowie gespalten, wobei standardmäßge Verfahren angewandt wurden. Eine HPLC-Analyse (ODS Hypersil, linearer Gradient 5 → 20% CH&sub3;CN in 0,1 M TEAB, 20 min. Retentionszeit 12,3 min) ergab, daß das Produkt aus Dithymidyldithiophosphorsäure mit 8% Thymidin verunreinigt war.

Beispiel 19

Dithymidyl-(3',5')-selenophosphat

A. In Lösung

0,1 mMol des Produkts von Beispiel 13 in 0,5 ml CH&sub3;CN wurde zu einem Gemisch aus 0,1 mMol 3'-O-Methoxyacetylthymidin und 0,15 mMol DBU gegeben. Nach 10 min ergab eine ³¹P-NMR-Prüfung die Anwesenheit von etwa 80% 3',5'-geschütztem Dithymidyl-(3',5'-selenophosphat (δ 49,7 und δ 49,5 ppm) und 20% nicht-identifizierten Nebenprodukten (δ 59,7 und δ 59,6 ppm)

B. An einem festen Träger

1 uMol CPG-T in einer Säule (Applied Biosystems, Inc.) wurde detrityliert. 10 uMol 5'-O-DMT-Thymidin-3'-O-[2-seleno-1,3,2-oxathiaphospholan], das mit 50 ul CH&sub3;CN verdünnt war, wurde auf die Säule zusammen mit 20 uMol DBU in 100 ul Pyridin aufgesetzt. Nach 10 min wurde die Säule mit Acetonitril gewaschen und detrityliert. Das Produkt wurde vom Träger abgespalten. HPLC-Analyse (ODS-Hypersil), linearer Gradient 5 → 20% CH&sub3;CN in 0,1 M TEAB innerhalb von 20 Minuten: Retentionszeit 8,87 und 9,54. Ausbeute: 85% (durch HPLC).

Beispiel 20

Kontrolle der Stereospezifität unter Bedingungen einer automatisierten Festphasensynthese

Ein automatisiertes DNA-Synthesegerät der Fa. Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA), Modell 380B, wurde unter Verwendung von Säulen des Herstellers eingesetzt (1 uMol-Maßstab). Das Routineprogramm des Herstellers für die Synthese von Oligonucleotiden nach dem 2-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren wurde gemäß den Angaben in der nachstehenden Tabelle modifiziert: Chemische Stufen für einen Synthesezyklus
*Für den 1 uMol-Synthesemaßstab wurden 2 M DBU in Pyridin (150 ul) und 0,1 M 5'-O-DMT-Desoxynucleosid-3'-O-[2-thiono-1,3,2-oxathiaphospholan] (von Beispiel 10) (50 ul) in Acetonitril verwendet.
Die Behälter 1-4 des DNA-Synthesegeräts wurden mit Lösungen von reinen Diastereoisomeren (Beispiel 10) in Acetonitril (0,1 M) gefüllt. Der Behälter 9 (der üblicherweise den 1H-Tetrazol-Aktivator enthielt) wurde mit 2 M DBU in Pyridin gefüllt. In jedem Fall folgte bei beendeter Synthese nach saurer Detritylierung eine Ammoniakspaltung und Basen-Schutzgruppenentfernung. Die Produkte (Dimere) wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer ODS Hypersil (5 um)-Säule (30 cm · 4,6 mm) analysiert und gereinigt, wobei die Elution mit einem linearen Gradienten von Acetonitril 5 → 20% CH&sub3;CN/0,1 Mol TEAB, 0,75%/min. Strömungsgeschwindigkeit 1,5 ml/min. erfolgte. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Die HPLC-Profile sind in Stec et al., Nucleic Acids Research, Bd. 19 (1991), S. 5883-5888 zusammengestellt. Stereospezifitäten der Bildung der Dinucleotid-(3',5')-dithiophosphate
(a) Gleiche Nomenklatur wie in Beispiel 10
(b) Sämtliche diastereoisomeren Synthons wurden durch HPLC unter gleichzeitigem Einspritzen von gemäß Stec et al., J. Amer. Chem. Soc. Bd. 106 (1984), S. 6077-6079, hergestellten authentischen Proben identifiziert.
(c) Durch HPLC
(d) Hergestellt durch Vermischen von getrennten Diastereoisomeren.
Wie aus den vorstehenden Daten ersichtlich ist, ergeben die langsam eluierten Diastereoisomeren immer ein Dinucleotidprodukt in der Rp-Konfiguration, während die rasch eluierten Diastereoisomeren immer ein Dinucleotidprodukt in der Sp-Konfiguration ergeben.

Beispiel 21

Kontrolle der Stereospezifität unter Bedingungen einer automatisierten Festphasensynthese bei Anwendung von Nucleosiden, die über Sarcosinyl-Linker an einen Festphasenträger gebunden sind

Die Verfahren von Beispiel 20 wurden mit der Ausnahme wiederholt, daß anstelle der Säulen des Herstellers Säulen bereitgestellt wurden, die mit 5'-DMT-Nucleosiden, die über einen Sarcosinyl-Linker gemäß Beispiel 14 an eine feste Phase gebunden waren, gepackt waren.

Beispiel 22

(RpRpRp)-Penta-(2'-O-desoxycytidin-thiophosphat)

Ein (RpRpRp)-Penta-(2'-O-desoxycytidin-thiophosphat) wurde mit einem automatischen DNA-Synthesegerät gemäß Beispiel 19 unter Verwendung des CPG-Sarcosinyl-dCbz-Festphasenträger gemäß Beispiel 20 synthetisiert.
Eine Lösung des langsam eluierten Synthons von Beispiel 10 (100 mg) in Acetonitril (1,2 ml) wurde verwendet. Tritylierte und detrytilierte Produkte wurden durch zweistufige Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die Analyse der tritylierten und detritylierten Produkte durch HPLC (gleiche Säule wie in Beispiel 19) ergab zwei einzelne Peaks (Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min). Für das tritylierte Produkt: Retentionszeit 20,40 min (5-30% CH&sub3;CN/0,1 M TEAB, t=20 min. Exponent 0,25). Für das detritylierte Produkt: Retentionszeit 11,80, (5-20% CH&sub3;CN/0,1 M TEAB, 0,75%/min). Präparative Ausbeute: 14%. Die enzymatische Analyse gemäß den vorstehenden Angaben ergab, daß das Produkt vollständig in der Rp-Form vorlag.

Beispiel 23

(SpSpSp)-Penta-(2'-O-desoxycytidin-thiophosphat)

(SpSpSpSp)-Penta-(2'-O-desoxycytidin-thiophosphat) wurde gemäß Beispiel 21 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das rasch eluierte Synthon verwendet wurde. Bei der gleichen Analyse wie in Beispiel 21 wies die tritylierte Verbindung eine Retentionszeit von 20,7 min und das detritylierte Produkt eine Retentionszeit von 12,00 min auf. Die präparative Ausbeute betrug 15%. Die enzymatische Analyse gemäß den vorstehenden Angaben ergab, daß das Produkt in der all-Sp-Form vorlag.

Beispiel 24

Synthese von P-chiraler antisense-Verbindung

All-Rp- und all-Sp-Formen des 28-meren antisense-Oligonucleotidthiophosphats 5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA wurde mit einem automatisierten DNA-Synthesegerät gemäß den Beispielen 19 und 20 unter Verwendung der langsam und rasch eluierten Synthons von Beispiel 10 hergestellt.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel

worin

Q für C&sub1;-C&sub8;-Alkylen, C&sub2;-C&sub8;-Alkenylen oder C&sub1;-C&sub8;- Oxaalkylen oder -Thiaalkylen steht, die jeweils 1 oder 2 Heteroatome enthalten, oder -O-Q-O- ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon bedeutet,

R¹ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe bedeutet,

X für O, S, Se oder =NR² steht, worin R² C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder C&sub6;-C&sub1;&sub2;-Aryl, Alkylaryl oder Alkenylaryl bedeutet,

Y für O, S oder Se steht,

Z für S oder Se steht und jedes von R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub4;- Alkyl bedeutet oder alle Gruppen R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; und die Kohlenstoffatome, an die sie gebunden sind, zusammen C&sub6;-C&sub1;&sub2;-Aryl, -Alkylaryl oder -Alkenylaryl darstellen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin Q C&sub3;-C&sub6;-Alkylen, -Alkenylen oder -Oxaalkylen bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in der R¹-O-Q-O- eine Gruppe der Formel

darstellt, worin

B eine Purin- oder Pyrimidinbase bedeutet,

D Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl oder OR' ist, wobei R' C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder eine Schutzgruppe für die 2'- Hydroxygruppe darstellt, und

R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.

4. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R¹-O-Q-O- eine Gruppe der Formel

darstellt, worin

D' Wasserstoff, Hydroxyl oder OR" bedeutet, wobei R" eine Schutzgruppe für die 3'-Hydroxygruppe darstellt und

B und D die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung haben.

5. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R¹-O-Q-O- eine Gruppe der Formel

bedeutet, worin R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, B die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung hat und D' die in Anspruch 4 angegebene Bedeutung hat.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis S. die in der Form des reinen Rp-Diastereoisomeren vorliegt.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis S. die in der Form des reinen Sp-Diastereoisomeren vorliegt.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Gegenwart eines Reagenzes [X], worin

(i) X für O steht und [X] elementarer Sauerstoff oder ein Peroxid ist,

(ii) X für S steht und [X] elementarer Schwefel, ein Acyldisulfid oder ein Diphosphorothioyldisulfid ist,

(iii) X für Se steht und [X] elementares Selen oder Kaliumselenocyanat ist oder

(iv) X für =NR² steht und [X] N&sub3;R² ist, worin R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.

9. Polymere Verbindung, die eine Sequenz von Monomereinheiten und von Phosphorverknüpfungen mit spezifischer Chiralität aufweist, wobei die polymere Verbindung die allgemeine Formel

hat, in der

Q' für C&sub1;-C&sub8;-Alkyl, C&sub2;-C&sub8;-Alkenyl oder C&sub1;-C&sub8;-Oxaalkyl oder -Thiaalkyl steht, die jeweils 1 oder 2 Heteroatome enthalten, oder -O-Q' ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon bedeutet,

n einen Wert von 5 bis 200 hat und

Q, R¹, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

10. Polymere Verbindung nach Anspruch 9 der allgemeinen Formel

worin

R¹, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und

B und D die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung haben.

11. Polymere Verbindung nach Anspruch 9 der allgemeinen Formel

worin

R¹, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und

B und D die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung haben.

12. Polymere Verbindung nach Anspruch 11, worin

X für O oder S steht und

Y für O oder S steht.

13. Polymere Verbindung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin n einen Wert von 12 bis 60 hat.

14. Polymere Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei alle Phosphorverknüpfungen Rp-chiral sind.

15. Polymere Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin alle Phosphorverknüpfungen Sp-chiral sind.

16. Polymere Verbindung nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 in Form eines 21-meren bis 28-meren Oligonukleotids der Sequenz

5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA.

17. Verfahren zur Herstellung einer polymeren Verbindung, die eine Sequenz von Monomereinheiten und von Phosphorverknüpfungen umfaßt und die in Anspruch 9 angegebene allgemeine Formel aufweist, welches folgende Stufen umfaßt:

(a) Binden eines ersten Monomeren, das eine geschützte Hydroxylgruppe aufweist, an einen Festphasenträger,

(b) Entfernen der Schutzgruppe von der geschützten Hydroxylgruppe unter Bildung einer freien Hydroxylgruppe,

(c) Umsetzen der freien Hydroxylgruppe mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und

(d) Wiederholen der Stufen (b) und (c) bis ein Produkt der gewünschten Länge erhalten worden ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17 zur Herstellung einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Stufe (c) eine spezifische Chiralität aufweist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, welches die weitere Stufe des Verkappens von nicht umgesetzten freien Hydroxylgruppen nach Stufe (c) umfaßt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei Stufe (c) in Gegenwart einer katalytischen Base durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die katalytische Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en ist.