DE3887018T2

DE3887018T2 - Metall-chelatierende 2,6-disubstituierte Pyridine und ihre Anwendung.

Info

Publication number: DE3887018T2
Application number: DE3887018T
Authority: DE
Inventors: Ilkka Hemmilae; Marek Kwiatkowski; Veli-Matti Mukkala; Christian Sund; Jyrki Ylikoski
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 1987-07-10
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2008-06-21
Also published as: EP0298939B1; SE8702824D0; DE3887018D1; ATE100084T1; SE8702824L; EP0298939A1; JPS6434961A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft bifunktionelle, chelatbildende, 2,6-disubstituierte Pyridinverbindungen. Die Verbindungen sind in dem Sinne bifunktionell, daß eine chelatbildende Fähigkeit auf ihre Stammpyridingruppierung begrenzt ist, an die durch kovalente Bindung (Konjugation) von anderen organischen Verbindungen weitere Funktionen angefügt worden sind.
Das gesteigerte Interesse an der Verwendung von verschiedenen Metallen als Marker in verschiedenen biologischen Systemen erzeugt ein Bedürfnis nach einem Liganden, der Metalle stärker bindet als die meisten der derzeit vorliegenden Liganden. Die Erfindung stellt stabile Metallchelate bereit, die als biologische Markierungsmittel bei solchen Bedingungen, denen andere Chelate nicht widerstehen würden, z.B. erhöhten Temperaturen, elektrophoretischen Bedingungen, Anwesenheit von weiteren komplexierenden Reagentien oder in vivo Experimenten, verwendet werden können. Die Erfindung stellt auch ein einfaches Verfahren zur Anheftung solcher Chelate an biologische Proben mittels kovalenter Bindungen bereit, die bei den obigen Bedingungen stabil sind und die die Komplexierungseigenschaften des Liganden nicht verändern.

Beschreibung des Stands der Technik und der Strategie die zur Erfindung geführt hat

Die Entdeckung von EDTA hat eine Reihe von Untersuchungen ausgelöst, die zur Synthese von Liganden mit variierenden Metallchelatierungseigenschaften geführt hat. In den vergangenen wenigen Jahren sind diese Untersuchungen auf die Entwicklung von mehreren bifunktionellen, chelatbildenden Mitteln ausgedehnt worden, die sowohl eine chelatbildende Gruppe als auch eine reaktive, funktionelle Gruppe, die sich mit bestimmten biologischen Molekülen umsetzen kann, besitzen.
Markierungsmittel dieses Typs werden bereits auf mehreren Gebieten der Nuklearmedizin verwendet. Bestimmte Klassen von funktionalisierten Chelaten, insbesondere solche, die Europium oder Terbium enthalten, sind in ausgedehntem Maße als Markierungsmittel bei Immunoassays oder bei der Hybridisierungserfassung von viraler DNA eingesetzt worden. Einige Chelate können nützliche Reagentien bei der Nucleinsäuresequenzierung, beim DNA- oder Protein-Fingerprinting und auch in der Fluoreszenzmikroskopie sein. Dies bedeutet naturgemäß, daß das Markierungsmittel einen hohen Grad an physikalisch chemischer Stabilität haben muß, da es nicht nur in verdünnten physiologischen Systemen, sondern auch bei ziemlich ausgeprägten Bedingungen von Hitze und elektrischem Strom stabil bleiben muß. Weiterhin sollen Markierungsmittel selbst in Gegenwart eines großen Überschusses eines anderen Komplexierungsmittels, z.B. EDTA, stabil sein. Viele der derzeit existierenden Liganden erfüllen diese Kriterien nicht. Im allgemeinen ist man davon ausgegangen, daß Derivate von Ethylendiaminotetraessigsäure - EDTA - zu dieser Kategorie gehören. Solche Derivate verlieren Metall (Eu³&spplus;) nach fünfminütigem Sieden bei 100ºC - typischen Denaturierungsbedingungen für DNA-Hybridisierungssonden - und sie sind bei elektrophoretischen Bedingungen nicht genügend stabil. Andererseits verlieren viele wirksam chelatbildende, homobifunktionelle Liganden, z.B. DTPA (in Form von DTPA-Dianhydrid eingeführt) einen Teil ihrer Metallbindungskapazität, wenn eine der Carboxylgruppen eine Kupplungsreaktion eingeht. Dazu kommt noch, daß dieser Ligand, wenn er zur Markierung in seiner aktiven Form des Dianhydrids verwendet wird, immer erhebliche Mengen von vernetzten Produkten erzeugt, die zusammen mit den darauffolgenden Schwierigkeiten der Einführung eines Metallions in einen solchen Polyliganden, ohne daß ausgedehnte Ausfällungserscheinungen bewirkt werden, diesen Ligand für die meisten der Zubereitungen nutzlos macht.
Wir haben uns daher vorgenommen, einen chemisch modifizierten Liganden aufzufinden, der sich rasch und wirksam mit einem Substrat umsetzen würde und trotzdem das Metall bei den obigen drastischen Bedingungen beibehalten würde. Bei unserer Suche nach einem geeigneten stabilen, bifunktionellen Liganden haben wir unsere Aufmerksamkeit auf Liganden der Formel fokussiert. Lanthanidchelate dieser Liganden sind bekannt, und man ist davon ausgegangen, daß sie in verdünnten wäßrigen Lösungen sehr stabil sind. Es ist auch bekannt, daß der Substituent R die chelatbildenden Eigenschaften eines solchen Liganden beeinträchtigen kann. Insbesondere können Substituenten vom elektronenabgebenden Typ die Stabilität des Chelats stark vermindern [Chem. Ber. 117, 948-954 (1984)]. Das gleiche ist möglicherweise selbst dann wahr, wenn ein solcher Substituent Elektronen auf dem Wege über ein konjugiertes System abgibt. Diese Schlußfolgerung baut sich auf Spektralwerten und der Tatsache auf, daß einige funktionelle Gruppen die an einen Pyridinring konjugiert sind, sich hinsichtlich der Reaktivität z.B. Amino oder Isothiocyano im Vergleich zu ihrer normalen Reaktivität ausgeprägt unterscheiden. Trotzdem sind Verbindungen mit starken elektronenabgebenden Substituenten, die an einen Phenylring gebunden sind, welcher an den Pyridinkern konjugiert ist, in der EP-A-195 413 und EP-A-203 047 als nützlich beschrieben und beansprucht worden, um biologisch aktiven Molekülen chelatbildenden Eigenschaften zu verleihen.
Unser Ziel ist dadurch erreicht worden, daß erkannt wurde, daß eine funktionelle Gruppe des Typs, der eine kovalente Bindungsfähigkeit anderen organischen Verbindungen verleiht, an den Pyridinring auf dem Wege über eine inerte Brücke mit einem allphatischen Kohlenstoffatom nächst dem Ring und nicht wie beim Stand der Technik auf dem Wege über Pi-Elektronensysteme oder stark elektronenabgebende Gruppen, die direkt an den Ring konjugiert sind, angeknüpft werden sollte. Synthetisch wurde diese Einführung einer die funktionelle Gruppe enthaltenden Struktur durch Derivatisierung auf zwei verschiedene Weisen - i) in Position 4 des Pyridinrings oder ii) in den Substituenten in 2- und/oder 6-Positionen erreicht.
Nach unserem Gefühl waren alle aus der Literatur verfügbaren Synthesewege und die resultierenden Verbindungen der Formel I zu kompliziert. Wir haben daher Alternativwege untersucht.
Wir haben gefunden, daß 2,4,6-Trimethylpyridin (Collidin) (1) in 4- Methylposition mit einem breiten Bereich von Alkylierungsmitteln selektiv alkyliert werden kann, wodurch Produkte erhalten werden, die ein Spektrum von weiteren synthetischen Alternativen anbieten. Vergleiche Schema 1.
Wir haben ein wirksames Verfahren zur Einführung von chelatbildenden Gruppen, z.B. Iminobiscarbethoxymethylgruppen, in das jeweilige Pyridinderivat speziellerweise in 2- und 6-Positionen, ohne Einfluß auf die Methylengruppe in 4-Position, gefunden. Die Anwendung von bekannten Verfahren gestattet die Einführung von anderen Gruppen als Carboxylgruppen in das chelatbildende Zentrum. Phosphonate können gemäß J. Org. Chem. 31, 1603 (1966) eingeführt werden und Phosphate können nach dem allgemeinen Verfahren eingeführt werden, das beispielsweise in Helv. Chim. Acta 70, 175 (1987) beschrieben wird. Ein ganzer Bereich von Metallelementen kann mit solchen Liganden in einen Komplex überführt werden. Nucl. Med. Biol. 13, 311 (1986) und die darin genannten Druckschriften geben eine Obersicht über die Metalle und die Herstellungstechnik für die Chelatbildung. Wir haben auch ein unabhängiges Verfahren gefunden, bei dem bestimmte Aminosäuren zur Einführung von reaktiven Gruppen in das Chelat verwendet werden. Dieses Verfahren ist in Schema 2 dargestellt.
Während die Verwendung von α-Aminosäuren als Ausgangsmaterial für die Synthese von Chelaten keine neue Idee darstellt (GB-P 723 316), sind nach unserer Kenntnis Lysin oder andere α,ω-Diaminosäuren bislang niemals für solche Zwecke eingesetzt worden und zwar möglicherweise wegen Syntheseschwierigkeiten bei der selektiven Handhabung dieser Moleküle.

Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die in Formel II angegebene,allgemeine Struktur, und sie umfassen auch übliche Analoge davon, wie die Säure-, Ester-, Salz- und Chelatformen mit einem oder mehreren der chelatbildenden Heteroatomen. Das charakterische Merkmal der Verbindungen besteht darin, daß die Gruppe X-Y an den Pyridinring der Formel II auf dem Wege über ein an den genannten Ring angefügtes aliphatisches Kohlenstoffatom angeknüpft ist. Stammpyridinverbindung Substituent
In der Formel II ist n die ganze Zahl 1 oder 2 und - - - - - bedeutet, daß die Gruppe X-Y ein Substituent ist, der R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; oder ein Wasserstoffatom in Z und/oder Z' ersetzt.
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind Gruppen, die kein Elektronenpaar haben, das zu einer signifikanten Delokalisierung und Resonanz mit dem Pyridinring im stande ist. Sie werden aus Wasserstoff, Alkyl und Aralkyl mit einem aliphatischen Kohlenstoffatom nächst dem Pyridinring ausgewählt. Mindestens zwei von R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind Wasserstoffatome. Die Gruppen enthalten 0 bis 12 Kohlenstoffatome, und sie können durch Strukturen, wie geradkettige, verzweigte oder cyclische, aliphatische Kohlenwasserstoffketten und Gruppen, die Niedrigalkyl (C&sub1; - C&sub5;) enthalten und aromatische Strukturen, wie Phenyl-, Naphthyl, Chinolyl, Pyridyl oder Bipyridyl, beispielhaft beschrieben werden.
Z und Z' stellen gleiche oder verschiedene chelatbildende Strukturen dar, von denen jede mindestens ein, vorzugsweise mehr als zwei oder drei Heteroatome mit einem freien Elektronenpaar umfassen und die so angeordnet sind, daß die Heteroatome zusammen mit dem Stickstoffatom des Pyridinrings dazu imstande sind, ein Metallion zu chelatieren. Eine wirksame Chelatierung erlegt auch der Brücke, die die zwei chelatierenden Heteroatome miteinander verbindet, bestimmte sterische Erfordernisse auf, so daß sie im Abstand von zwei Atomen voneinander angeordnet sein sollten, wobei jedoch auch ein Abstand von drei Atomen annehmbar sein kann. In den meisten Fällen enthält die Brücke 1, 2 oder 3 aliphatische Kohlenstoffatome. Z und Z' sind N-Biscarboxymethylamino- und N- Biscarboxyethylaminogruppen oder das analoge Phosphat (-N(-CH&sub2;-O-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;) und die Phosphonate (-N(-CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;). Die chelatierenden Keteroatome (N und O) können als entsprechende protonierte Formen und im Falle von O auch als Esterformen, wie Niedrigalkyl (C&sub1;-C&sub6;)- oder Benzylester vorhanden sein.
X-Y stellt eine inerte organische Gruppe dar, bei der X eine inerte und stabile Brücke ist und Y (a) eine funktionelle Gruppe oder (b) ein Rest einer organischen Verbindung (Y') ist, die Eigenschaften hat, die in der Verbindung der Formel II nach der kovalenten Kupplung von X-Y an die chelatlerende Stammpyridinverbindung beibehalten worden sind. Die obige Bezeichnung "inert" bedeutet, daß die Gruppe oder Brücke, die durch dieses Adjektiv charakterisiert wird, keinerlei wirksames, chelatierendes Heteroatom hat, das enger als im Abstand von vier Atomen von den an der Chelatierung eines Metallions teilnehmenden Heteroatomen angeordnet ist. In der Praxis bedeutet dies, daß die vier Atome normalerweise durch eine Kette mit vier Kohlenstoffatomen dargestellt werden. Unter "stabil" ist zu verstehen, daß die Brücke X sich nicht zersetzt, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Einsatz kommen. So erleidet z.B. die Brücke nicht leicht eine Hydrolyse. In der Formel II liegt X-Y vorzugsweise als Substituent, der ein Wasserstoff in den Z- und/oder Z'-Gruppen ersetzt, oder der R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3;, vorzugsweise R&sub2;, ersetzt, vor.
Ausgenommen das Erfordernis, daß die Brücke X ein aliphatisches Kohlenstoffatom, vorzugsweise eine Methylengruppe (-CH&sub2;-) an ihrem linken Ende haben muß, wenn sie direkt an den Pyridinring angeheftet ist, kann X auch mindestens ein Strukturelement, ausgewählt aus den folgenden enthalten: -NR- (sekundäres und tertiäres Amin), -CONR- und -NRCO- (substituiertes Amid), -S-S- (aliphatisches Disulfid), -S- (aliphatischer Thioether), -O- (Ether), -COO- und -OOC- (Ester), -N=N- (Diaza) und eine reine Kohlenwasserstoffkette, die geradkettig, verzweigt oder cyclisch ist und 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält. Die Kohlenstoffkette ist rein aliphatisch oder rein aromatisch (mit Einschluß von Phenyl, Naphthyl, Chinolyl, Pyridyl und Bipyridyl), kann aber auch beide Typen von Strukturen, wie in Alkylaryl und anderen inerten funktionellen Gruppen zeigen, die an der oben beschriebenen Chelatierung nicht teilnehmen. Das Symbol R in dem obigen substituierten Amid kann vorzugsweise Wasserstoff bedeuten, kann aber auch Alkyl, z.B. Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen, bedeuten.
Y kann aus zwei Hauptkategorien (A und B wie untenstehend) ausgewählt werden:
A) Y kann der Rest einer organischen, biologisch aktiven Verbindung (Y') sein, die die Fähigkeit hat, an biospezifischen Affinitätsreaktionen, z.B. zwischen Antigenen (Haptenen) und den homologen aktiven Antikörperkomponenten, komplementären Nucleinsäuren, Lectinen und Kohlenhydratstrukturen, Protein A und IgG etc., teilzunehmen. Die Fähigkeit von Y' wird in Y im wesentlichen beibehalten, wenn in einer Verbindung der Formel II vorhanden. Dieser Typ von biologisch aktiven Molekülen wird oftmals als Zielsubstanzen (Zielmoleküle) bezeichnet.
Gewöhnlich sind sie derivatisiert worden oder sie können leicht derivatisiert werden, um funktionelle Gruppen zu enthalten, die die Konjugierung an diversifizierte Typen von Verbindungen gestatten.
B) Y ist aus Isothiocyanato-, Bromacetamido-, Iodacetamido-, Bernsteinsäureamido-, Pyridyldithio-, Mercapto-, Carboxyl- und seinen aktiven Estern (z.B. N-Hydroxybernsteinsäureimido- oder p-Nitrophenyl-), Hydroxyl-, Aldehyd-, Amino-, Diazonium-, Tosyl-, Mesytylyl-, Trexyl-, Phosphodiester oder Phosphotriester ausgewählt. Andere funktionelle Gruppen können diejenigen sein, die dem Fachmann bekannt sind.
Die reaktive Gruppe Y muß nicht notwendigerweise mit dem Rest des Moleküls in der Form eines bereits vorliegenden Chelats gemeinsam vorliegen. Für manche Zwecke kann der chelatierende Teil des Moleküls zeitweise geschützt werden, z.B. in Form eines Esters, so daß der geschützte Ligand an das Zielmolekül gekoppelt wird. Nach der Entblockierung kann er am Schluß das gewünschte, markierte Produkt bilden. Die Schutzgruppe wird gemäß bekannten Prinzipien ausgewählt [vgl. z.B. Protective Groups in Organic Synthesis; Green TN; John Wiley & Sons Inc.; USA (1981)]. Faktoren, die bei der Auswahl der Gruppe in Betracht zu ziehen sind, sind u.a. die Stabilität der Verbindung, mit der Y umgesetzt werden soll, die Reaktivität von Y und der Typ der Struktur, die durch Reaktion von Y und der vorgesehenen Verbindung gebildet wird.
Ein Aspekt der Erfindung umfaßt die Verwendung einer Verbindung der Formel II zur kovalenten Bindung eines chelatierenden 2,6-disubstituierten Pyridins an eine organische Verbindung (Y'), die mindestens eine gegenüber Y reaktive, funktionelle Gruppe A enthält. Dieser Aspekt der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel II oder eine Säure-, Ester-, Salz- oder Chelatform davon, wie vorstehend angegeben, mit der genannten Verbindung Y so kontaktiert wird, daß A und Y miteinander reagieren, um die Verbindung Y' und das genannte 2,6-disubstituierte Pyridin miteinander kovalent zu verbinden. Nach der Reaktion werden die genannten Säure-, Ester- oder Salzformen ggf. in an sich bekannter Weise in die erforderliche Chelatform umgewandelt. Die für die Bindung erforderlichen Reaktionsbedlngungen hängen von dem Paar der funktionellen Gruppen (Y und A), Y' und der angewendeten Verbindung der Formel II etc. ab, und sie sind als solche bekannt. Bei diesem Aspekt der Erfindung haben bei den Säure-, Ester-, Salz und Chelatformen n, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, Z, Z', Y, Z und - - - - - die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben, mit der Ausnahme, daß Y nur eine funktionelle Gruppe ist.
An sich bekannte Schutzgruppen sind manchmal erforderlich, um die Bindung durchzuführen. Vergleiche das oben genannte Lehrbuch.
Die bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind in Formel III Stammpyridinverbindung Substituent
zusammengefaßt.
In der Formel III haben R&sub2;, X und Y die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben. - - - - bedeutet, daß X-Y ein Substituent ist, der entweder R&sub2; oder H' ersetzt. n ist die ganze Zahl 1 oder 2 mit der Maßgabe, daß n immer den Wert 1 hat, wenn X-Y ein Substituent ist, der R&sub2; ersetzt. Ch ist eine aus -COD-, -OPO&sub3;²&supmin; und -PO&sub3;²&supmin; ausgewählte chelatierende Gruppe. Der bevorzugte Aspekt der Erfindung umfaßt auch die Säure-, Ester-, Salz und Chelatformen wie oben definiert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In allen Beispielen wurden handelsübliche Chemikalien mit höchster, vorzugsweise analytischer, Reinheit verwendet. Die restlichen Reagentien wurden nach herkömmlichen Verfahrensweisen hergestellt. Die meisten Lösungsmittel wurden routinemäßig destilliert. Pyridin, Acetonitril und Tetrahydrofuran wurden aus Rückfluß Kochen mit Calclumhydrid vor der Destillation getrocknet. Der Träger für die Kurzsäulenchromatografie (Flash-Chromatografie) Kieselgel G60 und die TLC-Platten Kieselgel 60F-254 wurden von Merck erhalten. Die NMR-Spektren wurden entweder unter Verwendung eines Jeol JNM GX400 oder eines Hitachi-Perkin-Elmer R600-Spektrometers und unter Verwendung von TMS als innerem Standard aufgezeichnet. Die UV-Spektren wurden auf einem Beckman-DU-8-Spektrofotometer aufgezeichnet. Die IR- Spektren wurden unter Verwendung eines Beckman-IR-8-Spektrofotometers aufgezeichnet. Die Spektren der einzelnen synthetisierten Verbindungen wurden aufgezeichnet, und sie standen im Einklang mit den gegebenen Strukturen.
Die analytischen TLC-Platten wurden in mehreren Systemen entwickelt, die hier aufgeführt werden:
System A MeOH/CHCl&sub3; 1:9
System B MeOH/CHCl&sub3; 1:4
System C MeOH/CHCl&sub3; 1:19
System D MeOH/CHCl&sub3; 3:7
System F 1 M NH&sub4;Ac/EtOH 2:8
Beispiele 1 bis 12 vgl. Reaktionsschema 3. Beispiele 13 bis 23 vgl. Reaktionsschema 4. Beispiele 24 bis 33 vgl. Reaktionsschema 5. Beispiele 34 bis 42 vgl. Reaktionsschema 6. Beispiele 43 bis 45 vgl. Reaktionsschema 7, Beispiele 46 bis 49 vgl. Reaktionsschema 8.
Alle numerierten Strukturen in den Schemen entsprechen den synthetisierten Verbindungen. Die Abkürzungen werden in den Beispielen erläutert. Alle synthetisierten Verbindungen werden durch die chemische Formel und den Namen angegeben. Im Falle irgendeiner Unstimmigkeit zwischen der Formel und dem Namen ist immer die erstgenannte richtig.

Beispiel 1

2,6-Dimethyl-4-(2-phenylethyl)pyridin (2)

Flüssiger Ammoniak (150 ml) wurde in einen 250 ml Dreihalsrundkolben eingeführt, der mit einem mechanischen Rührer, einem Tropftrichter und einem Auslaßrohr versehen war und der in ein Trockeneis/Ethanol-Bad eingetaucht war. Natriumamid wurde durch Zugabe von 20 mg Eisennitrat (Fe³&spplus;) gefolgt von metallischem Natrium (2,09 g, 0,09 Mol) erzeugt. Die tiefblaue Lösung wurde 1 h lang gerührt, und eine lösung von Collidin (1) (10,06 g, 0,083 Mol) in 20 ml trockenem Diethylether wurde in das Reaktionsgemisch im Verlauf von 15 min eingeführt. Die resultierende gelbe Suspension wurde weitere 45 min lang gerührt, und danach wurde Benzylchlorid (6,33 g, 0,05 Mol), gelöst in 10 ml trockenem Diethylether, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 45 min lang gerührt, und überschüssiges Natriumamid wurde durch Zugabe von Ammoniumchlorid (4,82 g, 0,09 Mol), gelöst in 20 ml H&sub2;O, neutralisiert. Ammoniak wurde abgedampft und der Rückstand wurde zwischen Wasser und Diethylether aufgeteilt. Die gesammelte ätherische Phase wurde auf Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das zurückbleibende braune Öl wurde fraktioniert, und die bei 130 ºC/0,1 mmHg überdestillierende Fraktion wurde gesammelt.
Ausbeute = 6,17 g (55 %), Öl, Rf = 0,57 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30-7,05 (m, 7H), 2,90-2,70 (m, 4H), 2,46 (s, 6H)

Beispiel 2

2,6-Dimethyl-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin (3)

Die Verbindung (2) (20 g, 88,9 Mol) wurde in THF (150 ml) aufgelöst und mit Salpetersäure (6,7 ml, 60%ige wäßrige Lösung, 1 Äq) versetzt.Zu der klaren Lösung wurde Diethylether zugesetzt bis sie trübe blieb, und das Gemisch wurde in einem Kühlschrank zur Kristallisation stehengelassen. Die weißen Nitratkristalle (quantitative Ausbeute) wurden in kleinen Portionen zu gut gekühlter Schwefelsäure (150 ml) gegeben, wobei niemals gestattet wurde, daß die Temperatur 10ºC erreichte. Danach wurde das Gemisch 10 min lang auf 50 ºC erwärmt. Die resultierende braune Lösung wurde auf Eis gegossen und mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Das organische Material wurde mit Chloroform (3x200 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen auf Natriumsulfat wurde der Chloroformextrakt unter Verwendung von 4 % Ethanol/Chloform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die richtigen Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft, wodurch ein reiner gelber Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 22,82 g (95 %), Rf = 0,62 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,14 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,30 (d, 2H, J=8,7 Hz), 6,75 (s, 2H), 3,05-2,98 (m, 2H), 2,90-2,84 (m, 2H), 2,48 (s, 6H).

Beispiel 3

2,6-Dimethyl-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin-N-oxid (4)

Die Verbindung (3) (22,82 g, 84,5 mMol) wurde in Chloroform (100 ml) aufgelöst und in kleinen Portionen bei Raumtemperatur im Verlauf von 30 min mit 16 g (94 mMol) m-Chlorperbenzoesäure (mCPBA) versetzt. Das Gemisch wurde weitere 2 h lang gerührt. Nach einem negativen TLC-Test auf das Ausgangsmaterial wurde es durch Aufteilung zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgearbeitet. Die kombinierten Chloroformextrakte (3x200 ml) wurden eingedampft, wodurch ein hellgelbes, festes Material erhalten wurde, das TLC-rein war.
Ausbeute: 24,55 g (100 %), Rf = 0,40 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,14 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,29 (d, 2H, J=8,7 Hz) 6,93 (s, 2H), 3,06-3,00 (m, 2H), 2,92-2,86 (m, 2H), 2,50 (s, 6H).

Beispiel 4

2-Acetoxymethyl-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-6-methylpyridin (5)

Die Verbindung (4) (24,0 g) wurde in 100 ml Essigsäureanhydrid suspendiert. Das Gemisch wurde 20 min lang am Rückfluß gekocht, was zu einer homogenen dunklen Lösung führte. Essigsäureanhydrid wurde auf einem Rotavapor eingedampft, und der ölige Rückstand wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert. Anschließend wurde mit Chloroform (3x200 ml) extrahiert. Die Chloroformphase wurde eingedampft, und das Rohmaterial wurde unter Verwendung von 2 % Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die reinen Fraktionen wurden eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wurde, das TLC- und NMR-rein war.
Ausbeute: 19,55 g (69 %), Rf = 0,71 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,14 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,31 (d, 2H, J=3,7 Hz) 6,95 (s, 1H), 691 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,08- 3,92 (m, 2H), 2,97-2,91 (m, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,14 (s, 3H)

Beispiel 5

2-Acetoxymethyl-4-(2-(4-nitrophenyl)ethyl]-6-methylpyridin-N-oxid (6)

Die Verbindung (5) (19 g, 60,5 mMol) wurde wie in Beispiel 3 oxidiert. Der rohe einzige Flecken auf dem TLC-Produkt wurde nach Stardardaufarbeitung isoliert.
Ausbeute: 18,97 g (95 %), Öl, Rf = 0,45 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,17 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,32 (d, 2H, J=8,8 Hz) 7,03 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 5,38 (s, 2H), 3,10- 3,03 (m, 2H), 3,00-2,93 (m, 2H), 2,52 (s, 3H), 2,20 (s, 3H)

Beispiel 6

2,6-Bisacetoxymethyl-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin (7)

Die Verbindung (6) (18,5 g, 56 mMol) wurde in einer der Synthese in Beispiel 4 analogen Synthese in das Produkt (7) umgewandelt. Das neutralisierte End-extrahierte Produkt wurde eingedampft und unter Verwendung von 2 % Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die das Produkt enthaltenden reinen Fraktionen wurden kombiniert und eingedampft.
Ausbeute: 12,04 g (61 %), Öl, Rf = 0,72 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,14 (d, 2H, J=8,8 Mz), 7,31 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,07 (s, 2H), 5,18 (s, 4H), 3,10-2,80 (m, 4H), 2,15 (s, 6H)

Beispiel 7

2,6-Bishydroxymethyl-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin (8)

Diacetat (7) (12,0 g, 34,1 mMol) wurde in 50 ml Ethanol aufgelöst. Zu dieser bei Raumtemperatur gerührten Lösung wurde auf einmal Natriumhydroxid 5 M, 20 ml gegeben. Nach 10 min, als der TLC-Test auf das Substrat negativ war, wurde das Gemisch mit Citronensäure neutralisiert und zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Ethanol/Chloroform 1:1 aufgeteilt. Die Extraktion wurde dreimal wiederholt, wobei für jede Extraktion 100 ml organisches Lösungsmittel verwendet wurden. Die kombinierten Extrakte wurden eingedampft, und das zurückbleibende Gemisch wurde flash-chromatografiert, wobei am Schluß 8 % Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel verwendet wurden. Die richtigen reinen Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft.
Ausbeute: 4,75 g (52 %), gelber Feststoff, Rf = 0,35 (System B)
H¹NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 8,15 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,55 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,22 (s, 2H), 5,33 (t, 2H, austauschbar, J=5,5 Hz), 4,48 (d, 4H, J=5,5 Hz) 3,10- 3,02 (m, 2H), 3,00-2,94 (m, 2H)

Beispiel 8

2,6-Bisbrommethyl-4-(2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin (9)

Zu der Dihydroxyverbindung (8) (2,7 g, 9,44 mMol) in 35 ml trockenein Dichlormethan wurde Phosphortribromid (3,63 g, 1,26 ml, 13,41 mMol) gegeben, und das Gemisch wurde 15 min lang am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und mit Chloroform (3x50 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden eingeengt und aus Ethylacetat kristallisiert.
Ausbeute: 3,91 g (84 %), weiße Kristalle, Rf=0,73 (System C)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,15 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,28 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,14 (s, 2H), 4,49 (s, 4H), 3,05-3,02 (m, 2H), 3,01-2,37 (m, 2H)

Beispiel 9

2,6-Bis[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]-4-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]pyridin (10)

Die Verbindung (9) (3,27 g, 7,9 mMol) und Iminodiessigsäurediethylester (5,78 g, 30,5 mMol) wurden zusammen mit Toluol gemeinsam eingedampft und in trockenem Acetonitril (50 ml) wieder aufgelöst. Festes Natriumcarbonat (10 g) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 h lang am Rückfluß gekocht. Danach wurden die Salze herausgefiltert, und das Filtrat wurde eingedampft. Der Rückstand wurde flash-chromatografiert, und die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft. Um Material zu erhalten, das von irgendwelchem cochromatografierten Iminodiessigsäurediethylester frei war, wurde das ölige Produkt mit Petrolether (3x20 ml) verrührt, was ein Material ergab, das von irgendwelchen Verunreinigungen frei war.
Ausbeute: 5,09 g (80 %), Öl, Rf = 0,27 (System C)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):8,08 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,29 (s, 2H), 7,27 (d, 2H, J=8,8 Hz), 4,13 (q, 8H), 3,95 (s, 4H), 3,53 (s, 8H), 3,04-2,90 (m, 4H), 1,23 (t, 12H)

Beispiel 10

2,6-Bis[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]-4-[2-(4-aminophenyl)ethyl]pyridin (11)

Zu der Lösung der Verbindung (10) (4,8 g, 7,5 mMol) in 50 ml Ethanol wurden 10 % Palladium auf Kohle (100 mg) und anschließend Natriumborhydrid (378 mg, 10 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt und zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die Chloroformextrakte (3x50 ml) wurden eingeengt und flash-chromatografiert, wodurch die Verbindung (11) als Öl nach dem Eindampfen erhalten wurde.
Ausbeute: 3,89 g (85 %), Rf = 0,37 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):7,28 (s, 2H), 6,93 (d, 2H, J=7,3 Hz), 6,60 (d, 2H, J=7,3 Hz), 4,17 (q, 8H), 4,00 (s, 4H), 3,59 (s, 8H), 2,87-2,79 (m, 4H), 1,27 (t, 12H)

Beispiel 11

2,6-Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4-[2-(4-aminophenyl)ethyl]pyridin und sein Europiumchelat (12)

Die Verbindung (11) (250 mg) in 20 ml Ethanol wurde mit 1 M Natriumhydroxid (10 ml) bei Raumtemperatur 3 h lang behandelt. Das reine TLC-Produkt (Lösungsmittelsystem Acetonitril/Wasser 4:1) wurde mit 1 M Salzsäure neutralisiert und eingeengt. Zu dem in Wasser (25 ml) aufgelösten Rückstand wurde Europiumchloridhexahydrat (60 mg), gelöst in 5 ml Wasser, zugegeben, und das Gemisch wurde 30 min lang gerührt. Der Überschuß des Europiumsalzes wurde in der Weise entfernt, daß der pH-Wert mit gesättigter Natriumcarbonatlösung auf 8,5 erhöht wurde und daß der Niederschlag abfiltriert wurde. Die klare Lösung wurde fast zur Trockene eingedampft und (12) wurde durch Zugabe von 100 ml Aceton ausgefällt. Das Produkt wurde auf dem Filter mit Aceton gewaschen und getrocknet.

Beispiel 12

Europiumchelat von 2,6-Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(2- (4-isothiocyanatphenyl)ethyl]pyridin (13)

Zu dem Aminochelat (12) (100 mg), gelöst in 5 ml Wasser, das heftig gerührt wurde, wurde Thiophosgen (80 ul), gelöst in 3 ml Chloroform, auf einmal zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Wasserphase wurde abgetrennt, mit Chloroform (3x3 ml) extrahiert und auf ein Volumen von 0,5 ml eingeengt. Die Zugabe von Ethanol (10 ml) brachte (13) quantitativ als weißen Feststoff zur Ausfällung. TLC (System Acetonitril/H&sub2;O 4:1) und Fluoreszenzentwicklung mit Acetonylaceton/EtOH (1:20) zeigten nur ein einziges Produkt, das gegenüber einem Fluorescamintest auf freie Amine negativ war.
IR (in KBr): 2100 cm&supmin;¹

Beispiel 13

4-(7-Bromheptyl)-2,6-dimethylpyridin (14)

Natriumamid wurde aus Natrium (1,0 g, 43,5 mMol) in flüssigem Ammoniak (100 ml) entsprechend Beispiel 1 gebildet. Collidin (1) (5,0 g, 41,3 mMol), gelöst in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde tropfenweise zugesetzt. Nach 45 min wurde rasch eine gut gekühlte Lösung von Dibromhexan (51,2 g, 210 mMol) in THF (100 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei -40ºC gerührt und sodann über Nacht unter Rühren stehengelassen. Während dieser Zeit verdampfte das Ammoniak.
Die zurückgebliebene THF-Lösung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen Wasser und Diethylether aufgeteilt. Die etherische Phase wurde mit Salzsäurelösung (2,0 M, 200 ml) behandelt, und die in die wäßrige Phase extrahierten Pyridiniumsalze wurden durch Zugabe von Natriumhydroxid (5 M) freigesetzt, wodurch eine leicht alkalische Lösung erhalten wurde. Die gebildeten öligen Produkte wurden wieder extrahiert und durch Silicagelsäulenchromatografie getrennt.
Ausbeute: 3,54 g (30 %), Öl Rf=0,48 (System C)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 6,73 (s, 2H), 3,37 (t, 2H, J=8,5 Hz), 2,44 (s, 6H), 1,70 (t, 2H), 1,30-1,60 (m, 10H)
Als ein Nebenprodukt wurde 1,7-Bis-[4-(2,6-dimethylpyridyl)]heptan (15) aus dem gleichen Reaktionsgemisch mit einer Ausbeute von 35 % isoliert.
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):6,77 (s, 4H), 2,48 (s, 12H), 1,58 (t, 4H, J=7,0 Hz), 1,30 (s, 12H).

Beispiel 14

4-(7-Phthalimidoheptyl)-2,6-dimethylpyridin (16)

Ein Gemisch aus Verbindung (14) (3,54 g, 12,5 mMol), Kaliumphthalimid (2,54 g, 13,7 mMol) und Dimethylformamid (25 ml) wurde 6 h auf 125ºC erhitzt. Das DMF wurde abgedampft, und der Rückstand wurde zweimal mit n- Butanol und zweimal mit Toluol gemeinsam abgedampft. Das trockene Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute: 3,54 g (81 %), viskoses Öl, Rf=0,46 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,60-7,95 (m, 4H), 6,76 (s, 2H), 3,68 (t, 2H, J=7 Hz), 2,48 (s, 6H), 2,36-2,60 (m, 2H), 1,23-1,77 (m, 10H)

Beispiele 15 bis 21

Von 4-(7-Phthalimidoheptyl)-2,6-dimethylpyridin-N-oxid (17) zu 4- (7-Phthalimidoheptyl)-2,6-bis-N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]pyridin (23), Verbundungen 17 bis 23 in Schema 4
Diese Verbindungen wurden nach den Bedingungen der Beispiele 3, 4, 5, 6, 7, 8 bzw. 9 hergestellt. Nachstehend werden daher nur die Endergebnisse angegeben.

Beispiel 15

4-(7-Phthalimidoheptyl)-2,6-dimethylpyridin-N-oxid (17)

Ausbeute: 95 %, Öl, Rf=0,38 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,60-7,95 (m, 4H), 6,97 (s, 2H), 3,68 (t, 2H, J=7 Hz), 2,54 (s, 6H), 2,36-2,60 (m, 2H), 1,23-1,77 (m, 10H).

Beispiel 16

2-Acetoxymethyl-4-(7-phthalimidoheptyl)-6-methylpyridin (18)

Ausbeute: 89 %, Öl, Rf=0,70 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,60, 7,95 (m, 4H), 6,96 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,69 (t, 2H, J=7 Hz), 2,51 (s, 3H), 2,40-2,65 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,23-1,83 (m, 10H).

Beispiel 17

2-Acetoxymethyl-4-(7-phthalimidoheptyl)-6-methylpyridin-N-oxid (19)

Ausbeute: 96 %, Öl, Rf=0,57 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,61-7,96 (m, 4H), 7,06 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 3,67 (t, 2H, J=7 Hz), 2,51 (s, 3H), 2,42-2,67 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 1,23-1,83 (m, 10H)

Beispiel 18

2,6-Bisacetoxymethyl-4-(7-phthalimidoheptyl)pyridin (20)

Ausbeute: 80 %, Öl, Rf=0,71 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,61-7,96 (m, 4H), 7,10 (s, 2H), 5,18 (s, 4H), 3,67 (t, 2H, J=7 Hz), 2,45-2,67 (m, 2H), 2,14 (s, 6H), 1,23-1,77 (m, 10H)

Beispiel 19

2,6-Bishydroxymethyl-4-(7-phthalimidoheptyl)pyridin (21)

Die alkalische Hydrolyse des Phthalimidodiesters (20) lieferte, wie erwartet, sowohl das Produkt, bei dem nur die Esterfunktionen hydrolysiert waren (21), und das Nebenprodukt mit einem offenen Phthalimidoringsystem. Beide Produkte wurden nach Reinigung über eine kurze Kolonneg gesammelt, da sich das letztgenannte bei den in der nächsten Stufe angewendeten Bedingungen zurückcyclisiert.
Gesamtausbeute: 55 %, weiße Kristalle, Rf=0,31 (System B)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;) für reines (21): 7,61-7,96 (m, 4H), 7,20 (s, 2H), 5,35 (s, breit, 2H), 4,50 (s, 4H), 3,67 (t, 2H, J=7 Hz), 2,45-2,67 (m, 2H), 2,14 (s, 6H), 1,23-1,77 (m, 10H).

Beispiel 20

2,6-Bisbrommethyl-4-(7-phthalimidoheptyl)pyridin (22)

Ausbeute: 78 %, weiße Kristalle, Rf=0,73 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,61-7,96 (m, 4H), 7,28 (s, 2H), 4,52 (s, 4H), 3,67 (t, 2H, J=7 Hz), 2,45-2,67 (m, 2H), 2,14 (s, 6H), 1,23-1,77 (m, 10H).

Beispiel 21

4-(7-Phtalimidoheptyl)-2,6-bis[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)-aminomethyl]pyridin (23)

Ausbeute: 93 %, Öl, Rf=0,62 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,06-8,08 (m, 2H), 7,93-7,95 (m, 2H), 7,51 (s, 2H), 4,40 (q, 8H, J=7,1 Hz), 4,23 (s, 4H), 3,90 (t, 2H, J=7,0 Hz), 3,83 (s, 8H), 2,81 (t, J=7,6 Hz), 1,95-1,55 (m, 10H), 1,49 (t, 12H, J=7,1 Hz).

Beispiel 22

4-(7-Aminoheptyl)-2,6-bis-[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]- pyridin (24)

Die Verbindung (23) (400 mg, 0,55 mMol) wurde in Dioxan (5 ml) aufgelöst und mit Natriumhydroxid (2 M, 5 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 1,5 h lang bei Raumtemperatur gerührt, mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert und fast zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hydrazinhydrat (2,0 ml), gelöst in Ethanol (10 ml), behandelt und 6 h am Rückfluß gekocht. Flüchtige Stoffe wurde abgedampft und mit trockenem Acetonitril gemeinsam verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in trockenein Ethanol (50 ml), das zuvor mit Thionylchlorid (4 ml) behandelt worden war, suspendiert. Das Gemisch wurde 2 h am Rückfluß gekocht, filtriert, eingedampft und zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die kombinierten Chloroformextrakte wurden auf Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und schließlich durch Kurzsäulenchromatografie gereinigt.
Ausbeute: 232 mg (71 %), Öl, Rf=0,15 (System B)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 7,29 (s, 2H), 4,17 (q, 8H, J=7 Hz), 4,00 (s, 4H), 3,60 (s, 8H), 2,72 (t, 2H, 7,0 Hz), 2,58 (t, 2H, J=7,3 Hz), 1,33-1,61 (m, 10H), 1,26 (t, 12H, J=7,0 Hz).

Beispiel 23

Hydrolyse der Verbindung (24) und Synthese des Aminochelats (25)

Die Hydrolyse der Verbindung (24) wurde analog zu Beispiel 11 durchgeführt. Das erhaltene Produkt wurde durch Standard-Acetonausfällung ausgefällt.

Beispiel 24

4-(3-Benzyloxypropyl)-2,6-dimethylpyridin (26)

Eine Natriumamidlösung in flüssigem Ammoniak wurde aus Natrium (1,03 g, 44,6 mMol) in 100 ml flüssigem Ammoniak gemäß Beispiel 1 hergestellt.
Collidin (1) (5 g, 41,3 mMol) in trockenem Tetrahydrofuran wurde tropfenweise zugegeben, und das Gemisch wurde 60 min lang bei -40ºC gerührt. Zu diesem gerührten Gemisch wurde tropfenweise im Verlauf von 30 min 1-Benzoxy-2-bromethan (Tetrahedron Lett. 28, 2639-42, 1979) (8,24 g, 39,2 mMol), gelöst in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml), gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt.
Nach dem Abdampfen aller flüchtigen Stoffe wurde der Rückstand zwischen Natriumhydrogencarbonat und Chloroform aufgeteilt. Das Eindampfen der Chloroformphase lieferte einen öligen Rückstand, der bei vermindertem Druck destilllert wurde - Kp. 145-150/12 mmHg.
Ausbeute: 5,12 g (52 %), Öl, Rf=0,58 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 6,73 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,43 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,42 (s, 6H), 1,84 (m, 2H).

Beispiele 25 bis 31

Von 4-(3-Benzyloxypropyl)-2,6-dimethylpyridin-N-oxid (27) zu 4-(3- Benzyloxypropyl)-2,6-bis-N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]pyridin (33), Verbindungen 27 bis 33 in Schema 5.

Diese Verbindungen wurden bei den Bedingungen der Beispiele 3, 4, 5, 6, 7, 8 bzw. 9 hergestellt. Daher werden hier nur die Endergebnisse angegeben.

Beispiel 25

4-(3-Benzyloxypropyl)-2,6-dimethylpyridin-N-oxid (27)

Ausbeute: 90 %, Öl, Rf=0,42 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 6,91 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,43 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,44 (s, 6H), 1,84 (m, 2H).

Beispiel 26

2-Acetoxymethyl-4-(3-benzyloxypropyl)-6-methylpyridin (28)

Ausbeute: 70 %, Öl, Rf=0,64 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 6,95 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,46 (t, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,46 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 1,86 (m, 2H).

Beispiel 27

2-Acetoxymethyl-4-(3-benzyloxypropyl)-6-methylpyridin-N-oxid (29)

Ausbeute: 97 %, Öl, Rf=0,5 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 7,03 (s, 2H), 5,34 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,45 (t, 2H), 2,68 (t, 2H), 2,46 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 1,86 (m, 2H).

Beispiel 28

2,6-Bisacetoxymethyl-4-(3-benzyloxypropyl)pyridin (30)

Ausbeute: 85 %, Öl, Rf=0,69 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 7,08 (s, 2H), 5,14 (s, 4H), 4,46 (s, 2H), 3,45 (t, 2H), 2,70 (t, 2H), 2,09 (s, 6H), 1,86 (m, 2H).

Beispiel 29

2,6-Bishydroxymethyl-4-(3-benzyloxypropyl)pyridin (31)

Ausbeute: 57 %, weiße Kristalle, Rf=0,45 (System B)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,31 (s, 5H), 6,99 (s, 2H), 4,68 (s, 4H), 4,49 (s, 2H), 3,69 (s, 2H, austauschbar), 3,49 (t, 2H), 2,74 (t, 2H), 1,89 (m, 2H).

Beispiel 30

2,6-Bisbrommethyl-4-(3-benzyloxypropyl)pyridin (32)

Ausbeute: 54 %, Öl, Rf=0,70 (System C)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,32 (s, 5H), 7,14 (s, 2H), 4,51 (s, 2H), 4,48 (s, 4H), 3,45 (t, 2H), 2,71 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).

Beispiel 31

4-(3-Benzyloxypropyl)-2,6-bis[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)-aminomethyl]pyridin (33)

Ausbeute: 97 %, Öl, Rf=0,49 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,30 (s, 5H), 7,08 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 4,14 (q, 8H), 3,95 (s, 4H), 3,60 (s, 8H), 3,43 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 1,30 (t, 9H).

Beispiel 32

4-(3-Hydroxypropyl)-2,6-bis[N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl]pyridin (34)

Die Verbindung (33) (520 mg, 0,83 mMol) und Bromwasserstoffsäure (5 ml, 47 %) wurden 3 h am Rückfluß miteinander gekocht. Das homogene Gemisch wurde abgekühlt, und der größte Teil der Säure wurde bei vermindertem Druck abgedampft.
Der Rückstand wurde in 20 ml trockenem Ethanol aufgelöst und 2 h am Rückfluß gekocht. Dieses wiederveresterte Gemisch wurde eingedampft, in Chloroform aufgelöst, und die zurückgebliebene Säure wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die organische Phase wurde abgedampft, und die Titelverbindung wurde durch Kurzsäulenchromatografie gereinigt.
Ausbeute: 376 mg (84 %), Öl, Rf=0,32 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,12 (s, 2H), 4,14 (q, 8H), 3,97 (s, 4H), 3,45- 3,60 (m, 10H), 2,68 (t, 2H), 1,86 (m, 2H), 1,21 (t, 12H).

Beispiel 33

Synthese des Phosohordiesterderivats (35) der Verbindung (34)

Die Verbindung (34) (350 mg, 0,65 mMol) wurde zweimal mit trockenem Pyridin gemeinsam eingedampft und in 10 ml trockenem Pyridin aufgelöst. Sodann wurde eine o-Chlorphenylphosphor-bis-triazolidlösung in trockenem Acetonitril (0, 25 M, 6,0 ml, 1,5 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 60 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Triethylammoniumbicarbonat (10 ml, 1,3 M, pH 7,3) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 5 min lang gerührt. Danach wurde es zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt.
Die kombinierten Chloroformextrakte (3x30 ml) wurden eingedampft, und der Phosphodiester (35) wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung von 20 % MeOH/Chloroform als Elutionsmittel gereinigt.
Ausbeute: 460 mg (92 %), Öl, Rf=0,51 (System D)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):6,90-7,70 (m, 6H), 4,15 (q, 8H), 4,04 (t, 2H), 3,98 (s, 4H), 3,58 (s, 8H), 3,06 (q, 6H), 2,66 (t, 2H), 1,92 (m, 2H), 1,31 (t, 9H), 1,24 (t, 12H).

Beispiel 34

L-Lysinethylester (36) in Schema 6.

Thionylchlorid (5,0 ml, 8,06 g, 68 mMol) wurde tropfenweise zu 500 ml eisgekühltem, trockenem Ethanol gegeben. Das gerührte Gemisch wurde 20 min lang bei dieser Temperatur gehalten und mit L-Lysinhydrochlorid (20 g, 109 mMol) versetzt.
Das Gemisch wurde sodann 3 h am Rückfluß gekocht und auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Es wurden 200 ml Diethylether zugesetzt, und das kristallisierte Produkt wurde abfiltriert.
Ausbeute: 29 g (97 %)-Dihydrochlorid. Rf=0,20 (System F)

Beispiel 35

ω-N-(4-Nitrobenzoyl)-L-lysinethylester (37)

L-Lysin-HCl (5 g, 27,4 mMol), gelöst in 50 ml Wasser, wurde mit 5 M NaOH zu einem pH-Wert von 10,5 filtriert. 4-Nitrobenzoylchlorid (6,6 g, 36 mMol) in Dioxan (50 ml) und 5 M NaOH wurden langsam zugegeben, wobei das heftig gerührte Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert von 10,5 gehalten wurde.
Nach vollständiger Zugabe und Verschwinden der Rosafärbung wurde das Reaktionsgemisch mit konzentrierter HCl auf einen PH-Wert von 2 angesäuert und viermal mit Diethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Trockene eingeengt, zweimal mit 200 ml trockenem Ethanol gemeinsam eingedampft und in 250 ml trockenem Ethanol, das zuvor mit 10 ml Thionylchlorid behandelt worden war, suspendiert. Das Gemisch wurde 3 h am Rückfluß gekocht, filtriert und eingedampft. Das zurückgebliebene Material wurde zwischen gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Chloroform/Ethanol 1:1 aufgeteilt, und die organische Phase wurde auf Magnesiumsulfat getrocknet, wodurch ein Rohprodukt erhalten wurde, das durch Flash-Chromatografie unter Verwendung von 5 % EtOH/Chloroform als Elutionsmittel gereinigt wurde.
Ausbeute: 1,08 g (12 %), Kristallisation eines Öls beim Stehenlassen, Rf=0,23 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2H, J=9 Hz), 7,93 (d, 2H, J=9 Hz), 6,87 (s, breit, 1H), 3,99-4,34 (q, 2H), 3,30-3,60 (m, 3H), 1,40-1,75 (m, 8H), 1,11-1,37 (t, 3H)

Beispiel 36

α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-(4-nitrobenzoyl)-L-lysinethylester (38)

Die Verbindung (37) (0,54 g, 1,7 mMol) wurde mit Toluol, gelöst in trockenem Acetonitril (10 ml), gemeinsam eingedampft. Bromessigsäuremethylester (0,265 g, 1,7 mMol) wurde zugesetzt, und danach wurde pulverisiertes, trockenes Natriumcarbonat (2,0 g) zugegeben. Das Gemisch wurde 3 h am Rückfluß gekocht.
Das Abfiltrieren der anorganischen Salze und das Abdampfen des Acetonitrils lieferte ein öliges Rohprodukt, das durch Flash-Chromatografie gereinigt wurde.
Ausbeute: 0,45 g (68 %), Öl, Rf=0,26 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2H, J=9 Hz), 7,93 (d, 2K, J=9 Hz), 6,63 (s, breit, 1H), 3,95-4,30 (q, 2H), 3,68 (s, 3H), 3,30-3,60 (m, SH), 1,40-1,75 (m, 7H), 1,11-1,37 (t, 3H).

Beispiel 37

ω-N-Monomethoxytrityl-L-lysinethylester (39)

Trockenes Triethylamin (1,8 ml, 18 mMol) wurde zu einer Suspension von (36) (1,5 g, 6 mMol) in 20 ml trockenem Pyridin gegeben. Zu diesem bei Raumtemperatur gerührten Gemisch wurde festes Monomethoxytritylchlorid (1,96 g, 6 mMol) (MMTrCl) in kleinen Portionen während einer Zeitspanne von 1 h zugesetzt, wonach das Gemisch weitere 2 h gerührt wurde. Eine Standard-Natriumbicarbonat-Aufarbeitung, gefolgt von Extraktion mit Chloroform, ergab ein Rohprodukt, das mit dem α-MMTr- Isomeren verunreinigt war.
Die reine Titelverbindung wurde leicht durch Flash-Säulenchromatografie aufgrund der großen Rf-Unterschiede zwischen den Isomeren isoliert.
Ausbeute: 1,35 g (48 %), Öl, Rf=0,43 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):7,5-6,75 (m, 14H), 4,18-4,13 (q, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,45-3,37 (m, 1H), 2,14-2,10 (t, 2H, J=7 Hz), 1,75-1,35 (m, 9H), 1,26 (t, 3H).

Beispiel 38

α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-monomethoxytrityl-L-lysinethylester (40)

Ein teilweise geschütztes L-Lysinderivat (39) (1,0 g, 2,13 mMol) wurde nach der in Beispiel 36 beschriebenen Methode in das Produkt (40) umgewandelt.
Ausbeute: 0,81 g (70 %), Öl, Rf=0,73 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):7,46-6,77 (m, 14H), 4,19-4,14 (q, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,31-3,45 (q, 2H), 3,22-3,25 (t, 1H), 2,09-2,12 (t, 2H), 1,35-1,70 (m, 6H), 1,23-1,27 (t, 3H).

Beispiel 39

ω-N-Trifluoracetyl-L-lysinethylester (41)

Die Verbindung (36) (2,0 g, 8,1 mMol), gelöst in 10 ml trockenem Ethanol, wurde mit trockenem Triethylamin (4,09 g, 40,4 mMol) behandelt. Ethyltrifluoracetat (1,5 g, 10,5 mMol) wurde zu der gebildeten, gerührten Suspension zugegeben, und das Gemisch wurde 6 h am Rückfluß gekocht.
Sodann wurden alle flüchtigen Stoffe abgedampft, und der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumcarbonatlösung und Chloroform/Ethanol 1:1 aufgeteilt.
Die kombinierte organische Phase (5x60 ml) wurde eingedampft, mit Toluol gemeinsam eingedampft und flash-chromatografiert, wodurch die Titelverbindung in Form eines farblosen Öls erhalten wurde.
Ausbeute: 1,9 g (87 %), Rf=0,72 (System D)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;):7,10 (t, 1H, austauschbar), 4,21-4,16 (q, 2H), 3,45-3,40 (m, 1H), 3,38-3,31 (m, 2H), 1,84 (s, 2H, austauschbar), 1,82-1,40 (m, 6H), 1,28 (t, 3H).

Beispiel 40

α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-trifluoracetyl-L-lysinethylester (42)

Das L-Lysinderivat (41) (1,0 g, 3,7 mMol) wurde in das Produkt (42) durch ein dem Beispiel 36 analoges Verfahren umgewandelt.
Ausbeute: 1,05 g (83 %), Öl, Rf=0,48 (System A)
H¹NMR (60 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 4,4-4,0 (q, 2H), 3,68 (s, 3H), 3,5-3,1 (m, 5H), 1,8-1,4 (m, 6H), 1,23 (t, 3H).

Beispiel 41

ω-N-(4-Hydroxybutyryl)-L-lysinethylester (43)

Der L-Lysinethylester x 2 HCl (36) (2 g, 8,1 mMol) in 30 ml trockenem Ethanol wurde mit trockenem Triethylamin (5,63 ml, 40,5 mMol) und γ- Butyrolacton (0,7 g, 8,1 mMol) behandelt. Die resultierende Suspension wurde 3 h am Rückfluß gekocht.
Das Abdampfen der flüchtigen Stoffe und das gemeinsame Eindampfen mit Toluol ergab ein Rohprodukt, das durch Flash-Chromatografie unter Verwendung von 20 % Methanol/Chloroform als Lösungsmittel gereinigt wurde.
Ausbeute: 1,54 g (73 %), Öl, Rf=0,28 (System D)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 4,30-4,22 (q, 2H), 3,72-3,77 (m, 1H), 3,58-3,65 (t, 2H), 3,18-3,28 (m, 2H), 2,30-2,36 (t, 2H), 1,40-2,00 (m, 8H), 1,28-1,34 (t, 3H).

Beispiel 42

α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-(4-hydroxybutyryl)-L-lysinethylester (44)

Die Verbindung (43) (1,22 g, 4,68 mMol) in 20 ml trockenem Acetonitril wurde in einer derjenigen des Beispiels 36 analogen Reaktion in das Produkt (44) umgewandelt.
Ausbeute: 1,04 g (64 %), Öl, Rf=0,18 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 6,25 (s, breit, 1H), 4,16-4,21 (q, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,67-3,69 (t, 2H), 3,33-3,49 (m, 2H), 3,20-3,30 (m, 3H), 2,34-2,37 (t, 2H), 1,40-1,90 (m, 8H), 1,26-1,30 (t, 3H).

Beispiel 43

2-[N,N-Bis(ethoxycarbonylmethyl)]aminomethyl-6-{N-methoxycarbonylmethyl-N-[5-N-(4-nitrobenzoyl)-1-ethoxycarbonylaminopentyl]}aminomethylpyridin (47)

Stufe A:

2,6-Bisbrommethylpyridin (241 mg, 0,91 mMol) in trockenem Acetonitril (10 ml) wurde mit der Verbindung (38) (360 mg, 0,91 mMol) in Gegenwart von 2 g pulverisiertem, trockenem Natriumcarbonat bei Raumtemperatur unter heftigem Rühren umgesetzt. Das resultierende Gemisch, bestehend aus nicht-umgesetztem Pyridinderivat, Monobromdiester (45) (Rf=0,72 in System A) und Tetraester (46) (Rf=0,47 in System A), wurde eingedampft, mit Toluol gemeinsam eingedampft und flash-chromatografiert, wodurch reines (45) mit einer Ausbeute von 52 % - Öl erhalten wurde.
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,23 (d, 2H, J=8,5 Hz), 8,00 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,25-7,55 (m, 3H), 6,83 (s, 1H, breit), 4,49 (s, 2H), 4,15-4,23 (q, 4H), 3,91-4,06 (dd, 2H, J=5 Hz), 3,54-3,69 (dd, 2H, J=8 Hz), 3,63 (s, 3H), 3,42-3,52 (m, 3H), 1,50-1,95 (m, 6H), 1,30 (t, 3H).
Die Weiterführung dieser chromatografischen Reinigung ergab die Isolierung des symmetrischen Tetraesters (46) in einer Ausbeute von 18 % Öl.
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,24 (d, 4H, J=9 Hz), 8,01 (d, 4H, J=9 Hz), 7,37 (s, 3H), 6,94 (t, 2H, breit), 4,16 (q, 4H, J=6,1 Hz), 3,94 (dd, 4H, J=15 Hz), 3,58 (dd, 4H, J=17,7 Hz), 3,63 (s, 6H), 3,38-3,50 (m, 6H), 1,50-1,80 (m, 12H), 1,28 (t, 6H).

Stufe B:

Die Verbindung (45) (100 mg, 0,17 mMol) wurde mit trockenem Acetonitril gemeinsam abgedampft, in 3 ml Acetonitril gelöst und mit 1 g trockenein, pulverisiertem Natriumcarbonat versetzt. Danach wurde Iminoessigsäurediethylester (36 mg, 0,19 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht am Rückfluß gekocht, filtriert und eingedampft.
Der Rückstand wurde chromatografiert, wodurch die reine Titelverbindung (47) erhalten wurde.
Ausbeute: 92 %, Öl, Rf=0,57 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2H, J=7 Hz), 8,02 (d, 2H, J=7 Hz), 7,40-7,55 (m, 3H), 6,91 (t, 1H, breit), 4,12- 4,22 (m, 6H), 3,89-4,04 (dd, 2H, J=15 Hz), 4,00 (s, 2H), 3,52-3,68 (dd, 2H, J=17,5 Hz), 3,63 (s, 3H), 3,59 (s, 4H), 3,40-3,50 (m, 3H), 1,50- 1,80 (m, 6H), 1,20-1,30 (m, 9H).

Beispiel 44

2-(N,N-Bis(ethoxycarbonylmethyl)]aminomethyl-6-{N-methoxycarbonylmethyl-N-[5-N-(4-aminobenzoyl)-1-ethoxycarbonylaminopentyl]}aminomethylpyridin (48)

Festes Natriumborhydrid (11,3 mg, 0,3 mMol) wurde zu einem Gemisch der Verbindung (47) (100 mg, 0,15 mMol) und 2 g Palladium auf Kohle (10 %) in 5 ml trockenem Ethanol gegeben. Das Gemisch wurde 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt und zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die verdampften organischen Extrakte wurden flash-chromatografiert, wodurch (48) in Form eines Öls erhalten wurde.
Ausbeute: 89 %, Rf=0,37 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,63 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,38-7,55 (m, 3H), 6,64 (d, 2H, J=8,7 Hz), 6,28 (t, 1H, breit), 4,12- 4,20 (m, 6H), 3,89-4,05 (dd, 2H, J=15,2 Hz), 4,01 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,64 (s, 4H), 3,50- 3,67 (dd, 2H, J=17,7 Hz), 1,45-1,80 (m, 6H), 1,20-1,30 (m, 6H).

Beispiel 45

Hydrolyse der Verbindung (48) Bildung des Europiumchelats und seine Umwandlung in das Isothiocyanat (49)

Dieser Standardzyklus von Reaktionen erfolgte nach den allgemeinen Vorschriften des Beispiels 12.
Das Produkt wurde auf folgender Basis charakterisiert:
a) IR-Spektroskopie - Anwesenheit der Isothiocyanatvibration bei 2070 cm&supmin;¹,
b) Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von Acetonitril/Wasser (4:1) als Lösungsmittel - einziger Flecken mit Rf=0,28, der einen positiven (UV-360 nm) Test auf Europium³&spplus; nach dem Besprühen mit einer ethanolischen Lösung von 2-Naphthoyltrifluoraceton (2-NTA) und einen ne gativen Test auf freie Aminogruppen - Besprühen mit Fluoram - zeigt,
c) HPLC-Chromatografie - unter Verwendung einer Ionenaustauscher- Ultrapac-Säule - TSK DEAE-5PW (LKB). Laufbedingungen: Triethylammoniumbicarbonatpuffer, pH 7,3, linearer Gradient 0,01T0,60 M in 30 min. Fließgeschwindigkeit 1,2 ml/min und Erfassung bei 278 nm.

Beispiel 46

2-[(N,N-Bis(ethoxycarbonylmethyl)]aminomethyl-6-[N-methoxycarbonylmethyl-N-(5-N-trifluoracetyl-1-ethoxycarbonylaminopentyl)]aminomethylpyridin (50)

Dieses Produkt wurde nach der zweistufigen Verfahrensweise des Beispiels 43 und unter der Verwendung der Verbindung (42) als Substrat in Stufe A synthetisiert. Die endchromatografische Trennung ergab das gewünschte Produkt als farbloses Öl mit einer Gesamtausbeute von 45 % (bezogen auf das Ausgangs-2,6-dibrommethylpyridin).
Rf=0,48 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,64 (t, 1H, J=7,7 Hz), 7,45 (d, 1H, J=7,7 Hz), 7,42 (d, 1H, J=7,7 Hz), 7,15 (s, 1H, breit), 4,13-4,22 (m, 6H), 4,03 (s, 2H), 3,88-4,04 (dd, 2H, J=15 Hz), 3,66 (s, 3H), 3,61 (s, 4H), 3,48- 3,68 (dd, 2H, J=17,8 Hz), 3,33-3,45 (m, 3H), 1,50-1,80 (m, 6H), 1,20-1,32 (m, 9H).

Beispiel 47

Hydrolyse der Verbindung (50), Bildung des Europiumchelats und seine Umwandlung in das Bromacetamidderivat (51)

Die Hydrolyse der Verbindung (50) (0,75 g, 1,14 mMol) und ihre Chelatbildung erfolgten nach den allgemeinen Vorschriften des Beispiels 12. Zu der wäßrigen Lösung dieses Europiumchelats wurde N-Ethyl-N,N-diisopropylamin (0,29 g, 2,24 mMol) zugegeben und anschließend Bromacetylchlorid (0,54 g, 3,43 mMol), gelöst in 10 ml Chloroform. Diese Lösung wurde 15 min lang gerührt. Die Chloroformphase wurde abgetrennt, und die Wasserphase wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert. Das gewünschte Produkt (51) wurde in Form eines weißen Pulvers nach Einengung der Wasserphase und Ausfällung mit Aceton erhalten.

Beispiel 48

2-[N,N-Bis(ethoxycarbonylmethyl)]aminomethyl-6-{N-methoxycarbonylmethyl-N-[5-N-(4-hydroxybutyryl)-1-ethoxycarbonylaminopentyl]}-aminomethylpyridin (52)

Dieses Produkt wurde nach der zweistufigen Verfahrensweise des Beispiels 43 und unter Verwendung der Verbindung (44) als Substrat in Stufe A synthetisiert.
Ausbeute: 56 %, Öl, Rf=0,25 (System A)
H¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 7,66 (t, 1H, J=7,6 Hz), 7,47 (d, 2H, J=7,6 Hz), 6,28 (s, breit, 1H), 4,17 (q, 6H, J=7,0 Hz), 4,03 (s, 2H), 3,96 (dd, 2H, J=15,1 Hz), 3,70 (t, 2H, J=7,0 Hz), 3,67 (s, 3H), 3,61 (s, 4H), 3,59 (dd, 2H, J=17,3 Hz), 3,43 (t, 1H, J=5,6 Hz), 3,23 (m, 2H), 2,36 (t, 2H, J=6,8 Hz), 1,86 (m, 2H), 1,72 (m, 2H), 1,38-1,60 (m, 4H), 1,29 (t, 3H), 1,27 (t, 6H).

Beispiel 49

Synthese des Phosphoramidatderivats (53) der Verbindung (52)

Zu der Verbindung (52) (0,52 g, 1 mMol), gelöst in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml), wurde Diisopropylethylamin (0,78 ml, 4,6 mMol), gefolgt von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphochloridat (0,47 g, 2 mMol), gegeben.
Nach 15-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit kalter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, mit Dichlormethan extrahiert, eingedainpft und durch Silicagel-Säulenchromatografie unter Verwendung von Petrolether/Triethylamin 9:1 als Elutionslösungsmittel gereinigt.
Ausbeute: 85 %, farbloses Öl, Rf=0,42 (System A)
P³¹NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 148,5 ppm. Singlett (Referenz 85%ige Phosphorsäure).

Beispiel 50

Kopplung der Verbindung (49) an Schweine-IgG

Eine IgG-Fraktion Schweine-Anti-Maus-IgG wurde mit Eu³&spplus; unter Verwendung verschiedener bifunktioneller chelatbildender Mittel markiert. Die verwendeten Reagentien waren p-Isothiocyanatophenyl-EDTA, das gemäß Sundberg et al. (J. Med. Chem. 1974; 17, 1304-7) synthetisiert worden war, die N-1- und N-2-Derivate von p-Isothiocyanatobenzyl-DTTA nach Mikola et al. (EP-A-139675) und das vorstehend beschriebene Pyridinderivat (49). 1 mg IgG wurde in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,8, mit einem 50fach molaren Überschuß an Isothiocyanat-aktivierten Markierungsreagentien bei +4ºC über Nacht inkubiert. Das markierte IgG wurde von den freien Reagentien durch Gelfiltration über einer Sephadex G50-Säule getrennt, und der Markierungsgrad (Eu/IgG) wurde durch fluorimetrische Messung von Eu³&spplus; berechnet (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 1984; 137, 335- 43). Die Bromacetyl-aktivierten Chelate wurden unter ähnlichen Bedingungen an IgG gekoppelt, jedoch mit der Ausnahme, daß man die Kopplung über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen ließ.

Beispiel 51

Die Stabilität der Chelate und ihrer IgG-Konjugate wurde getestet und mit DTTA-Eu-Konjugaten (EP-A-139 675) unter verschiedenen Bedingungen verglichen.
1. Die Freisetzung von Eu³&spplus; aus der Verbindung (12) wurde bei 98ºC getestet. Trotz der kleinen anfänglich freigesetzten Fraktion blieb das Chelat unverändert (Tabelle 1). Tabelle 1 Inkubationszeit (min) Gesamt-Eu³&spplus; (pM) freies Eu³&spplus; (pM) freies Eu³&spplus; %
2. Die Verbindung 13 und ihr IgG-Konjugat wurden in einer Acrylamidgelelektrophorese unter Anlegung von 1500 V bei 60ºC in einem 10 mM EDTA-Puffer getestet. Die zum Vergleich verwendeten Verbindungen waren die N-1- und N-2-Derivate von p-Isothiocyanatobenzyl-DTTA-Eu³&spplus; und ihre IgG-Konjugate. Unter diesen Bedingungen dissoziierte das Eu³&spplus; vollständig von dem N-1-DTTA-Eu, dem N-2-Derivat um 20 %, und bei dem Pyridinderivat (Verbindung 13) dissoziierte kein Eu³&spplus;.
3. Die Stabilitäten der markierten IgGs (Beispiel 50) wurden nach Lagerung in einem 0,1 mM EDTA-Puffer bei 37ºC verfolgt. Das verbleibende Eu³&spplus; wurde täglich mittels Immunbindung an MIgG-beschichtete Mikrotiterstreifen bewertet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1: Auf dem markierten Anti-Maus-IgG nach Lagerung bei 37ºC in einem 0,1 mM EDTA-Puffer zurückgehaltenes Eu³&spplus;. Die Symbole bedeuten Phenyl-EDTA-Eu (Δ), N-1-Benzyl-DTTA-Eu (Δ), N-2-Benzyl-DTTA-Eu (o) und ein erfindungsgemäßes Pyridinderivat (Verbindung 49) ( ). Schema 1 Schema 2 R¹-geschützte Seitenkette von jeder multifunktionellen α-Aminosäure Schema 3 Schema 4 Schema 5 Schema 6 Monomethoxytritylchlorid Schema 7 Schema 8

Claims

1. Bifunktionelle chelatbildende 2,6-disubstituierte Pyridinverbindung mit der Struktur Substituent

worin

(i) n eine ganze Zahl 1 oder 2 ist,

(ii) R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Gruppen sind, die aus Wasserstoff, Alkyl und Aralkyl ausgewählt sind, wobei diese Gruppen jeweils 0 bis 12 Kohlenstoffatome und kein Elektronenpaar, das zu einer Delokalisierung und zu einer Resonanz mit dem Pyridinring im Stande ist, aufweisen, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Gruppen R&sub1;&submin;&sub3; Wasserstoff sind,

(iii) Z und Z' gleiche oder verschiedene Strukturen darstellen, die mindestens ein Heteroatom mit einem freien Elektronenpaar umfassen und die so angeordnet sind, daß das genannte mindestens eine Heteroatom zusammen mit dem Stickstoffatom des Pyridinrings ein Metallion chelatieren kann, wobei die genannte Gruppe Z und Z' aus N-Biscarboxymethylamino, N- Biscarboxyethylamino und den analogen Phosphaten und Phosphonaten ausgewählt ist,

(iv) - - - - - angibt, daß X-Y ein Substituent ist, der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; oder einen Wasserstoff in Z oder Z' ersetzt,

(v) X-Y eine organische Gruppe darstellt, die kein Heteroatom näher als in einem Abstand von vier Atomen von den Heteroatomen, die an der Chelatierung des Metallions teilnehmen, aufweist, wobei der Substituent

(a) X aus

einer rein geradkettigen, verzweigten oder cyclischen aromatischen und/oder aliphatischen Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und mindestens einem Strukturelement, ausgewählt aus sekundärem oder tertiärem Amid (-CONR- oder -NRCO-, wobei R für Wasserstoff oder Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen steht), aliphatischem Disulfid, aliphatischem Thioether, Ether, Ester und Diaza (-N=N-) besteht, und

(b) Y

eine funktionelle Gruppe ist, die aus Isothiocyanat, Bromacetamid, Iodacetamid, Bernsteinsäureamid, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxy und aktiven Estern davon, Hydroxy, Aldehyd, Amin, Diazonium, Tosyl, Mesytylyl, Trexyl, Phosphodiester, Phosphotriester oder einem Rest eines biologisch aktiven Moleküls mit der Fähigkeit, an biospezifischen Affinitätsreaktionen zwischen Antigenen (Haptenen) und den homologen, aktiven Antikörperkomponenten oder zwischen komplementären Nucleinsäuren teilzunehmen, ausgewählt ist,

mit der Maßgabe, daß X-Y auf dem Wege über ein an den genannten Ring angeheftetes Kohlenstoffatom (-CH&sub2;-) angeknüpft ist,

oder eine Säure-, Salz- oder Chelatform der genannten Komponente.

2. Chelatbildende Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das n=1 und R&sub1;=R&sub3;=Wasserstoff und daß X-Y R&sub2; ersetzt.

3. Chelatbildende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß X-Y einen Wasserstoff in Z und/oder Z' ersetzt.

4. Chelatbildende Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Z und Z' aus N-Biscarboxymethylamin und analogen Phosphaten und Phosphonaten ausgewählt ist und daß der Wasserstoff, der durch X-Y ersetzt ist, ein CH&sub2;-Wasserstoff ist.

5. Chelatbildende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y die funktionelle Gruppe ist.

6. Chelatbildende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y der Rest einer organischen Verbindung ist.

7. Verfahren zur kovalenten Bindung eines chelatbildenden 2,6-disubstituierten Pyridins an eine organische Verbindung, die mindestens eine funktionelle Gruppe A enthält, wobei die organische Verbindung ein biologisch aktives Molekül ist, das die Fähigkeit hat, an biospezifischen Affinitätsreaktionen zwischen Antigenen (Haptenen) und den homologen, aktiven Antikörperkomponenten oder zwischen komplementären Nucleinsäuren teilzunehmen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein chelatbildendes 2,6-disubstituiertes Pyridin der Formel Substituent

worin

(i) n eine ganze Zahl 1 oder 2 ist,

(iii) Z und Z' gleiche oder verschiedene Strukturen darstellen, die mindestens ein Heteroatom mit einem freien Elektronenpaar umfassen und die so angeordnet sind, daß das genannte mindestens eine Heteroatom zusammen mit dem Stickstoffatom des Pyridinrings ein Metallion chelatieren kann, wobei die genannte Gruppe Z und Z' aus N-Biscarboxymethylamino, N-Biscarboxyethy-lamino und den analogen Phosphaten und Phosphonaten ausgewählt ist,

(a) X aus

einer reinen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen aromatischen und/oder aliphatischen Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und mindestens einem Strukturelement, ausgewählt aus sekundärem oder tertiärem Amin, Amid (-CONR- oder -NRCO-, wobei R für Wasserstoff oder Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen steht), aliphatischem Disulfid, aliphatischem Thioether, Ether, Ester und Diaza (-N=N-) besteht, und

(b) Y

eine funktionelle Gruppe ist, die aus Isothiocyanat, Bromacetamid, Iodacetamid, Bernsteinsäureamid, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxy und aktiven Estern davon, Hydroxy, Aldehyd, Amin, Diazonium, Tosyl, Mesytylyl, Trexyl, Phosphodiester oder Phosphotriester, ausgewählt ist,

mit der Maßgabe, daß X-Y an den Pyridinring über ein Methylenkohlenstoffatom (-CH&sub2;-), das an den Ring gebunden ist, angeknüpft wird,

oder eine Säure-, Salz-, Benzyl- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylester- oder Chelatform der genannten Verbindung mit der genannten Verbindung so kontaktiert, daß Y und A miteinander so umgesetzt werden, daß die genannte Verbindung und das genannte 2,6-disubstituierte Pyridin kovalent gebunden werden, worauf man, wenn vorhanden, die genannte Ester-, Säure- oder Salzform ggf. in an sich bekannter Weise in die erforderliche Chelatform umwandelt.