DE3841943A1 - Fusionsprotein-vektoren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Fusionsproteinvektoren und ihre Verwendung zur Expression, Sequenzierung und ortsspe­ zifischen Mutagenese fremder Gene.

Zwei der großen Ziele der biologischen und medizinischen Forschung sind heutzutage a) eine starke Expression eukaryotischer, medizinisch oder biotechnologisch relevanter Proteine in bakteriellen Organismen wie Escherichia coli mit anschließender einfacher und schneller Aufreinigung der Genprodukte sowie b) der schnelle Authentizitätsnachweis positiver Klone aus c-DNA Banken über die Sequenzierung und Expression enzymatisch aktiver Genprodukte der klonierten DNA.

Als Grundlage für die Erstellung von Expressions­ systemen dienen Viren oder Plasmide. Zwei Arten der Expression werden dabei unterschieden: die direkte Expression ins Cytoplasma und die Expression als Fusionsprotein (Balbas, P. et al. [1986], Gene 50, 3-40). Bei der direkten Expression werden Plasmide mit starken Promotoren und Terminatoren verwendet, die eine hohe Transkriptionsrate erlauben (Amman, A. und Brosius, J. [1985], Gene 40, 183-190).

Zur Bildung von Fusionsproteinen wird die fremde DNA so in ein bakterielles Gen einkloniert, daß sich das fremde Gen im Leseraster des bakteriellen Proteins befindet. Statt des reinen prokaryontischen Genprodukts entsteht dann ein Hybrid aus dem bakteriellen Protein und dem Fremdprotein. Fusionsproteingene nutzen den optimierten Transkriptions- und Translations-Apparat der Bakterien, der eine effektive Proteinbiosynthese ausgehend vom bakteriellen Anteil erlaubt. Reine eu­ karyotische Gene sind in vielen Fällen unter anderem wegen der Verwendung anderer Codons ("codon usage") nur schwer direkt in Bakterien zu exprimieren (Marston), A. O. [1986], Biochem. J. 240, 1-12).

Die Bildung eines Hybridproteins kann weiterhin die schnelle Aufreinigung ermöglichen, entweder über die enzymatische Aktivität des bakteriellen Anteils (Silhavy, J., Berman, L. and Englist, L. W. [1984], in "Experiments with gen fusions", pp 186-187, Cold Spring Harbor Labaratory) oder durch Affinitätschromatographie wie z. B. von β-Galaktosidase an APTG-Säulen (Germino, J. and Bastia, D. [1984], Proc. Natl. Sci. USA 81, 4692-4696), von Protein A an IgG-Säulen (Uhlen, M. et al. [1983], Gene 23, 369-378) oder von Glutathion-S- transferase an Glutathion-Säulen (Smith, D. B. and Johnson, K. S. [1988], Gene 67, 31-40).

Diese Möglichkeit, das exprimierte Fremdprotein als Fusionsprotein schnell und quantitativ aufreinigen zu können, ist ein wichtiger Weg zur schnellen Isolierung von Fremdproteinen mit authentischer Aminosäuresequenz.

Der letzte entscheidene Schritt ist die Abtrennung des Fremdproteinanteils aus dem Fusionsprotein. Dies kann entweder chemisch über eine Bromcyan-Spaltung erfolgen (Nishikawa, S. et al. [1986], Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 789-794) oder enzymatisch mittels Proteolyse.

Verschiedene Proteasen, deren Erkennungssequenz nur extrem selten in anderen Proteinen als dem eigentlichen Substrat vorkommen, sind hierzu geeignet. Ein Beispiel für diese hochspezifischen Proteasen ist Collagenase, die ihr Substrat Collagen in der Sequenz

am N-terminalen Ende von Gly spaltet. Polypeptide authentischer Sequenz sind allerdings erst nach weiterer Verdauung der Glycin- und Prolinreste durch Amino­ peptidase zu gewinnen (Daum, J. et al. [1980], Euro­ päische Patentanmeldung EP 00 20 290).

Ein weiteres Beispiel ist der Blutgerinnungsfaktor X _a, der die Sequenz am

C-Terminus von Arginin spaltet und somit fusionierte Fremdproteine direkt freisetzen kann (Nagai, K. and Thorgersen, H. C. [1984], Britische Patentanmeldung GB 84 12 517).

Eine der Schwierigkeiten mit beiden Erkennungsregionen ist, daß sie nach der Spaltung des direkt fusionierten Fremdproteins oft nicht für die Protease zugänglich sind, eine spezifische Proteolyse also unterbleibt.

Weiterhin kann es im Verlauf der Proteinbiosynthese zu einer falschen Faltung des Hybridproteins kommen, wo­ durch dieses in der Zelle präzipitiert und nur mit sehr aufwendigen Methoden wieder renaturiert werden kann. Auch die denaturierten Fusionsproteine werden von den Proteasen nicht immer geschnitten.

Im Fusionsproteinplasmid pSS20 (Scholtissek, S. and F. Grosse [1988], Gene 62, 55) wurde daher als "Abstands­ halter" zwischen dem bakteriellen lacZ-Gen und dem Fremdprotein-Gen ein 180 Basenpaare langes Collagen-Gen- fragment eingeführt, was zu einer Expression von löslichen Fusionsproteinen führte, die bei einer direkten Fusion präzipitierten und nicht durch Collagenase zu spalten waren. Allerdings lagen die spezifischen Collagenase- Erkennungssequenzen mitten in diesem Genfragment, so daß nach Affinitätsaufreinigung und Proteolyse ein 40 Aminosäuren langer Rest am N-Terminus des fremden Proteins verblieb.

Ein weiterer Typ von Fusionsproteinen besitzt vor dem Fremdgen eine Signalsequenz, die eine Sekretion des Fremdproteins in der peristaltischen Raum oder ins Medium erlaubt (Hahn, U. et al. [1988], Eur. J. Biochem.). Bisher gibt es aber nur wenige erfolgreiche Beispiele einer solchen Sekretion, da es nicht nur auf das Signal­ peptid bei der Prozessierung ankommt. In den meisten Fällen verbleibt das Fusionsprotein mit cytoplasmatischem Fremdprotein in der Zelle, oder es bleibt in der inneren Membran stecken.

In bezug auf eine schnelle eindeutige Identifizierung von c-DNA Klonen fehlt den angesprochenen Fusionspro­ tein-Plasmiden aber ein weiteres wichtiges Element: die Möglichkeit schnell einzelsträngige DNA des Fremdgens zur Sequenzierung und ortsspezifischen Mutagenase herzustellen. Außerdem sind in den meisten bisher be­ schriebenen Fusionsprotein-Plasmiden die "multi-cloning sites" nicht in allen drei möglichen Leserastern vor­ handen und die Auswahl der Restriktionsschnittstellen nicht optimal für eine direkte Klonierung von c-DNA Banken in diese Plasmide.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Vektorsystem zu konstruieren, das die genannten Nach­ teile bisheriger Systeme vermeidet. Es soll sowohl das Problem des Authentizitätsnachweises klonierter Gene oder Genfragmente einer c-DNA Bank prinzipell lösen, als auch die starke Expression mit anschließender schneller Aufreinigung des Genproduktes, die schnelle Sequenzierung und ortsspezifische Mutagenese bekannter fremder Gene ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Konstruktion eines Fusionsproteinvektors gelöst, der auf einem Vek­ toranteil in Transkriptionsrichtung

• a) einen Promotor und gegebenenfalls einen Operator,
• b) ein Gen für ein bakterielles Protein, das über seine enzymatische Aktivität oder durch Affinitäts­ chromatographie aus einer Mischung von Proteinen abgetrennt werden kann,
• c) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit β-Faltblattstruktur kodiert,
• d) eine spezifische Protease-Erkennungssequenz,
• e) eine "multi-cloning"-Stelle zum Einligieren eines Fremdgens und
• f) den Replikationsursprung eines einzelsträngigen DNA-Phagen enthält.

Erfindungsgemäß wird, ausgehend von dem Promotor/Ope­ rator die starke Expression eines Triproteins erlaubt, das aus dem Produkt des Gens (b), der DNA-Sequenz (c) und einem Fremdprotein, das in die "multi-cloning"- Stelle einligiert wird, besteht. Das Triprotein kann in einem Schritt über Affinitätschromatographie oder, wie bereits oben beschrieben, über die enzymatische Aktivi­ tät des bakteriellen Proteins (Silhavy et al., supra) aufgereinigt werden und anschließend durch eine proteo­ lytische Spaltung das Fremdgenprodukt freigesetzt wer­ den. Der Replikationsursprung eines einzelsträngigen DNA-Phagen ermöglicht eine schnelle Herstellung von Einzelstrang-DNA zur Sequenzierung und ortsspezifischen Mutagenese der Fremd-DNA.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ent­ hält die "multi-cloning"-Stelle Restriktionsschnitt­ stellen zur Klonierung von Fremdgenen in allen drei Leserastern. Weiter ist es zur Expression von Fremdgenen bevorzugt, daß der Fusionsproteinvektor Stopcodons für das Fremdgen in allen drei Leserastern enthält. Die starke Expression fremder DNA wird zusätzlich durch eine Terminatorsequenz unterstützt, wobei als Termina­ torsequenz die Lambda-t₀-Sequenz besonders bevorzugt ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er­ findung enthält der Fusionsproteinvektor den Replika­ tionsursprung des Phagen F1.

Als Vektoranteil kann der erfindungsgemäße Fusionspro­ teinvektor alle für die Herstellung von Expressions­ systemen geeigneten DNA-Anteile enthalten. Hierbei wird je nach gewünschter Wirtszelle zur Expression ein Plas­ mid, Cosmid, eukaryontischer Vektor, Hefeplasmid, Shuttle-Vektor oder ein Teil eines solchen bevorzugt. Da eukaryontische Proteine in Prokaryonten nicht post­ transkriptional modifiziert werden können, ist es also nicht möglich, Proteine, die für ihre katalytische Ak­ tivität phosphoryliert oder glykosyliert werden müssen, in E. coli in aktiver Form zu exprimieren. Vorzugsweise werden daher eukaryontische Proteine, welche eine solche posttranskriptionale Modifikation benötigen, unter der Kontrolle eines starken Promotors in niedrigen Eukaryonten wie z. B. Hefe (Saccharomyces cerivisiae), oder unter der Kontrolle eines für Säugerzellen spezi­ fischen Promotors, wie z. B. dem Ratten-Preproinsulin- Genpromotor oder dem SV40 frühen Promotor in Säugetier­ zellen, wie z. B. COS7-Affen-Nieren-Zellen, exprimiert.

Weiter erlauben die erfindungsgemäßen Fusionsprotein­ vektoren jedoch auch das schnelle Umklonieren der Teile gemäß Merkmal (a) bis (f) und gegebenenfalls der Stop­ codons und Terminatorsequenzen in einen Shuttle-Vektor, um die Expression in niedrigen oder höheren eukaryon­ tischen Zellen zu gewährleisten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Gen gemäß Merkmal (b) des Hauptan­ spruches das lacZ-Gen, das Glutathiontransferasegen, das Gen für Protein A oder ein Teil eines dieser Gene oder eines Gens für ein Protein mit enzymatischer Aktivität, der jedoch die Bindungsspezifität des Gesamt­ gens bei der Affinitätschromatographie bzw. die enzyma­ tische Aktivität beibehält.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß das Gen (b) unter der Kontrolle seines homologen Promotors und gegebenen­ falls Operators gemäß Merkmal (a) steht. Hierbei ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, daß der Fusions­ proteinvektor das lacZ-Gen unter der Kontrolle des lac- Promotors/Operators enthält. Weiter ist es erfindungs­ gemäß besonders bevorzugt, daß die DNA-Sequenz gemäß Merkmal (c) des Patenthauptanspruches ein Teil des Collagenasegens ist. Hierbei ist es möglich, die Protease-Erkennungssequenz gemäß Merkmal (d) des Patenthauptanspruches mit der DNA-Sequenz gemäß Merkmal (c) zusammenzufassen, da das Collagenasegen mehrere Erkennungssequenzen für Collagenase aufweist. Diese Collagenase-Erkennungssequenz muß jedoch in der DNA- Sequenz gemäß Merkmal (c) sich die Collagenase-Erken­ nungssequenz direkt am Ende der Collagen-DNA-Sequenz befinden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er­ findung erlaubt daher ein erfindungsgemäßer Fusions­ proteinvektor, ausgehend vom lac-Promotor/Operator die induzierbare starke Expression eines Triproteins, das aus β-Galactosidase, einer β-Faltblattstruktur, wie z. B. Collagen, als "Abstandhalter", einer spezifischen Protease-Erkennungssequenz und dem Fremdprotein besteht. Das Tri-Protein kann in einem Schritt über Affinitätschromatographie an APTG-Sepharose aufgerei­ nigt werden und anschließend durch eine proteolytische Spaltung mit Collagenase oder Faktor XA freigesetzt werden. Der erfindungsgemäß bevorzugte Replikationsur­ sprung des Einzelstrang-DNA-Phagen F1 ermöglicht eine schnelle Herstellung von Einzelstrang-DNA zur Sequen­ zierung und ortsspezifischen Mutagenese der Fremd-DNA.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Fusionsprotein- Vektoren sind die Vektoren pAX4a+, DSM 5059, pAX4a-, DSM 5060, pAX4b+, DSM 5061, pAX4b-, DSM 5062, pAX4c+, DSM 5063, pAX4c-, DSM 5064.

Die Konstruktion dieser neuen erfindungsgemäßen Fusions­ proteinvektoren wurde ausgehend von Plasmid pSS20 wie folgt durchgeführt:

Das Plasmid besitzt als erstes wichtiges Element ein vollständiges lacZ-Gen ( β-Galaktosidase) mit lac Promotor/- Operator Region. Direkt von dem 3′-Ende des lacZ-Gens ist als zweites Element ein 180 Basenpaare langes Collagen-Genfragment im Leseraster fusioniert, das drei Erkennungsregionen für die Collagenase besitzt. An­ schließend folgt in allen drei Leserastern eine "multi­ cloning site".

Im ersten Schritt der Konstruktion der pAX4-Vektoren wurde über die Ligation des folgenden Oligodesoxynukleo­ tides die Erkennungssequenz für den Blutgerinnungsfaktor X _a am 3′-Ende des Collagen-Genfragmentes von pSS20 über die PstI-Schnittstelle eingeführt.

Der neue Vektor mit der Faktor X _a-Erkennungssequenz wurde pAX1 genannt. Er besitzt zusätzlich zur "multi­ cloning site" von pSS20 noch die Restriktionsschnitt­ stellen NruI und SAlI.

Im nächsten Schritt wurde zunächst aus dem Plasmid pSS9 (Scholtissek, S. and F. Grosse [1985], Nucleic Acids Res. 15, 3185) der t₀-Terminator des Bacteriophagen Lambda als 84 bp NruI/HindIII Fragment (Abb. 4 und Abb. 5 I) isoliert.

Dieses Fragment wurde mit zwei synthetischen komplementären Oligonukleotiden zur Einführung von Stop-Codons in alle drei Leseraster (Abb. 5 II) ligiert und in die PstI/HindIII- Schnittstellen von pAX1 (Abb. 5 III) kloniert.

Der entstandene Vektor pAX2 besitzt nun die Elemente: X _a-Erkennungsstelle, direkt anschließend singuläre Restriktionsschnittstellen für NruI, SalI, PstI und SmaI, Stop-Condons in drei Leserastern und den t₀-Ter­ minator.

Zur Herstellung von Einzelstrang-DNA der klonierten fremden Gene wurde der Replikationsursprung des Bakterio­ phagen f1 aus dem Vektor pEMBL8+ (Dente, L. et al. [1983], Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655) als 514 Basenpaare langes RsaI-Fragment isoliert. Der Vektor pAX2 wurde mit DraII geschnitten, die überstehenden Enden aufgefüllt und das RsaI-Fragment über eine "blunt­ end"-Ligation in pAX2 eingeführt. Da sich bei dieser Ligation zwei Orientierungen für den Replikationsursprung ergeben, wurde die Orientierung der jeweiligen Klone über spezifische Restriktionsverdauungen identifiziert. Die neuen Fusionsprotein-Plasmide wurden entsprechend pAX3+ und pAX3- genannt und sind ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Zur Eliminierung der beiden EcoRI-Schnittstellen in den Vektoren pAX3+/- wurde folgende Strategie angewandt: Die EcoRI-Stelle am Ende des lacZ-Gens (Position 5761) wurde durch ortsspezifische Mutagenese mittels zweier "Mismatch Primer" nach der Methode von Taylor und Eckstein ([1985] Nucleic Acids Res. 13, 8765-8785) durchgeführt. Die EcoRI-Schnittstelle im pBR322 Anteil (Position 6173) wurde nach Linearisierung durch EcoRI aufgefüllt und wieder ligiert. Die so erzeugten Vektoren wurden pAX4+/- genannt.

Zur einfachen Klonierung fremder DNA wurde schließlich eine neue "multi-cloning-Position" mit Schnittstellen in allen drei Leserastern einkloniert. Die jeweiligen Linker wurden durch automatische Oligonukleotid-Synthese dargestellt.

Insgesamt sind somit sechs verschiedene besonders bevorzugte Fusionsprotein-Plasmide konstruiert worden: pAX4a+, pAX4a-, pAX4b+, pAX4b-, pAX4c+, pAX4c-.

Diese sechs Plasmide sind am 06.12.1988 unter den Nummern 5059, 5060, 5061, 5062, 5064 und 5064 bei der DSM hinterlegt worden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten durch Expression eines Expressionsvektors, der ein für das gewünschte Produkt kodierendes Gen enthält, in geeigneten Wirtszellen und Isolierung des Produkts aus den Zellen oder dem Kulturmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in die "multi-clo­ ning"-Stelle eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 24 das Gen für das gewünschte Produkt insertiert, den entstehenden Expressionsvektor exprimiert, das gebildete Fusionsprotein aus aufgeschlossenen Zellen oder dem Kulturmedium über seine enzymatische Aktivität oder über Affinitätschromatographie isoliert und durch Verdauung mit der der Proteaseerkennungssequenz entspre­ chenden Protease das gewünschte Produkt aus dem Fusions­ protein abtrennt und gewinnt.

Zur Expression eines eukaryontischen Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle wird die cDNA des Gens in­ sertiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man einen Fusionsproteinvektor, der als Merkmal (b) das lacZ-Gen enthält und führt die Isolierung des Fusionsproteins an APTG-Affinitätschro­ matographiesäulen durch. Ebenfalls erfindungsgemäß mög­ lich und bevorzugt sind die Verwendung des Gens für Protein A und die Isolierung über IgG-Säulen oder von Glutathion S-Transferase und die Isolierung an Gluta­ thionsäulen.

Mit den erfindungsgemäßen Vektoren konnten sowohl prokaryotische Gene, wie z. B. Histidyl-tRNA-Synthetase aus E. coli (Freedman, R. et al. [1985], J. Biol. Chem. 260, 10063), als auch eukaryotische Gene, wie z. B. Isoleucyl-tRNA-Synthetase aus Saccharomyces cerevisiae (Englisch, U. [1987], Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 971-979) erfolgreich als Fusionsprotein in Escherichia coli exprimiert werden. Nach der Aufreinigung durch Affinitätschromatographie an APTG-Sepharose konnten die Fremdproteine selektiv durch Spaltung mit der Protease Faktor X _a freigesetzt werden.

Sowohl die Fusionsproteine als auch die durch Spaltung freigesetzten Synthetasen zeigen eine den nativen Enzymen vergleichbare Aktivität.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Fusionsproteinvektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung von Einzelstrang-DNA der Fremd-DNA zur Sequenzierung oder zur ortsspezifischen Mutagenese der Fremd-DNA.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiele 1. Allgemeine Arbeitsvorschriften 1. Restriktionsendonukleolytisches Schneiden von DNA

Eine wäßrige Lösung der betreffenden DNA wurde unter den nachfolgenden Reaktionsbedingungen und Zusatz der betreffenden Restriktionsendonukleasen bei 37°C inkubiert.

Restriktionsendonuklease
Reaktionsbedingungen
DraII, RsaI
50 mM Tris/Hcl pH 8,0
	10 mM MgCl₂
NaeI	50 mM Tris/HCl pH 8,0
	10 mM MgCl₂
	20 mM NaCl
HindIII, PstI	50 mM Tris/HCl pH 8,0
	10 mM MgCl₂
	50 mM NaCl
NruI	50 mM Tris/HCl pH 8,0
	10 mM MgCl₂
	50 mM NaCl
	50 mM KCl

Nach erfolgter Inkubation wurden entstandene DNA-Fragmente gelelektrophoretisch getrennt und das betreffende Fragment isoliert. Die Isolierung der DNA-Fragmente aus Agarosegelen erfolgte durch Adsorption an Glasmilch (Vogelstein, B. and D. Gillespie [1979], Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76, 615), aus Acrylamidgelen durch Diffusion (Maxam, A. M. and Gilbert, W. [1977], Proc. Natl, Acad. Sci. USA 74, 560-564.

Alternativ wurde die DNA-Lösung mit 1/10 Vol. 3M NaoAC-Lösung pH 4,8 und 2 Vol Ethanol versetzt und 20 min bei -78°C oder 12 h bei -20°C gefällt. Nach Zentrifugation (15 min, 5000 g) und Trocknen des Pellets im Vakuum (bis 0.1 hPA) wurde der Rückstand im angegebenen Volumen Wasser gelöst.

2. Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation in E. coli

Hybridisierung: Verwendete Oligonukleotide wurden in wäss. Lösung in den unten angegebenen Konzen­ trationen 5 min auf 95°C erhitzt, 30 min bei 37°C und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Die zu ligierenden Fragmente wurden in der ange­ gebenen Konzentration 6-16 h bei 25°C in 50 mM Tris/HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5% (w/v) PEG 6000, 1 mM ATP und 1 mM DTT unter Zusatz von T4-DNA- Ligase inkubiert. Anschließend wurden kompetente Zellen (Hanahan, J. [1983], J. Mol. Biol. 166, 557-580), TG1 oder MJ109, mit unten angegebenen Volumina des Ligationsansatzes transformiert, die entstandenen Transformanden auf LB _amp (50 µg Ampicillin/ml) selektiert und die nach Birnboim und Doly ([1979], Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) isolierte DNA mittels Restriktionsanalyse charak­ terisiert.

3. Oligodesoxynukleotidsynthese

Die Oligodesoxynucleotidsynthese erfolgte nach der Festphasen-Phosphoamiditmethode (Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H. [1981], Tetrahedron Lett. 22, 1859) mit einem DNA Synthesizer der Fa. Applied Biosystem, Modell 380 A oder der Fa. Biosearch, Modell Sam One.

3.1. Synthetisierte Oligodesoxynukleotide Beispiel 1 Darstellung der Fusionsprotein-Plasmide pAX4a+/-, pAX4b+/-, pAX4c+/- 1.1 Darstellung von pAX1 1.1.1. Linearisierung des Vektors pSS20^xc

70 µg pSS20^xc wurden nach Zusatz von 30 U PstI in einem Gesamtvolumen von 50 µl nach 1.1 linea­ risiert. Die mit Ethanol gefällte DNA wurde in 50 µl Wasser gelöst.

1.1.2. Ligation des X _a-Linkers in pSS20^xc

Je 160 pmol X _a-Linker I und II wurden mit 2 µl des linearisierten pSS20^xc aus 2.1.1. in 21 µl Wasser hybridisiert und anschließend in einem Gesamtvolumen von 30 µl unter Zusatz von 2 U T4-DNA-Ligase 6 h ligiert. Zur Transformation (TG1-Zellen) wurden 3 µl des Ligationsansatzes verwendet. Der korrekte Einbau des Linkers wur­ de durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung (Köchel, H. G. [1982], Dissertation, Braunschweig) und Re­ striktionsanalyse bestätigt.

1.2 Darstellung von pAX2 1.2.1. Vorbereitung des Vektors pAX1

10 µg pAX1 wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl mit je 20 U PstI und HindIII inkubiert. Das geschnittene Plasmid wurde über ein 1%iges Agarosegel abgetrennt, nach 1.1. isoliert und in 50 µl Wasser aufgenommen.

1.2.2. Isolierung des t₀-Terminators

30 µg pSS9 wurden in einem Endvolumen von 100 µl zunächst mit 30 U HindIII linearisiert und nach Umpuffern mit 30 U NruI nachgeschnitten. Das freigesetzte 84 bp-t₀-Terminator-Fragment wurde über ein 8%iges Acrylamidgel abgetrennt, nach 1.1 isoliert und in 50 µl Wasser aufgenommen.

1.2.3. Ligation der Stop-Oligos und des t₀-Terminators in pAX1

500 ng des geschnittenen pAX1 aus 2.2.1., 50 ng des t₀-Fragments aus 2.2.2. wurden mit je 100 pmol der Stop-Oligos I und II in einem Volumen von 21 µl hybridisiert und nach Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase 8 h ligiert. Zur Transformation (TG1-Zellen) wurden 10 µl des Ligationsansatzes eingesetzt.

Der korrekte Einbau des Linkers und des Termi­ nators wurde durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung bestätigt.

1.3. Darstellung von pAX3+ und pAX3- 1.3.1. Linearisierung des Vektors pAX2

10 µg pAX2 wurden in einem Reaktionsvolumen von 50 µl mit 20 U DraII linearisiert. Nach voll­ ständiger Verdauung wurde die DNA gefällt und überstehende Enden nach Maniatis ("Molecular Cloning - A laboratory manual", Cold Spring Harbor, New York [1982]) in einem 100-µl-Ansatz mit 5 U Klenow-Polymerase aufgefüllt und nach erneuter Fällung in einem 50-µl-Ansatz mit 2 U alkalischer Phosphatase (Maniatis, T. s. o.) de­ phosphoryliert und wiederum gefällt. Das Pellet wurde in 50 µl Wasser aufgenommen.

1.3.2. Isolierung des f 1-oris

30 µg pEMBL8+ wurden in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit 30 U RsaI geschnitten. Die Fragmente wurden auf einer 2%igen HEC (Hydroxyethyl­ cellulose)-Agarose getrennt, das 514-bp-f1-ori- Fragment nach 1.1 isoliert und in 50 µl Wasser aufgenommen.

1.3.4. Ligation des f1-oris in pAX2

500 ng des linearisierten pAX2 aus 2.3.1. wurden mit 100 ng des 514-bp-Fragmentes aus 2.3.2 in einem Volumen von 21 µl hybridisiert und nach Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase in einem 30-µl-An­ satz 6 h ligiert. Zur Transformation (TG1-Zellen) wurden 10 µl des Ligationsansatzes eingesetzt. Die Orientierung des f1-oris in den positiven Klonen konnte durch Doppelverdauung mit NaeI und HindIII bestimmt werden.

1.4 Darstellung von pAX4+/- 1.4.1. Präparation von einzelsträngiger DNA der Plasmide pAX3+ und pAX3- (Vernet, T., Dignard, D. a. Thomas, D. Y. [1987], Gene 52, 225-233)

10 ml einer Zellsuspension (TG1-pAX3+ bzw. Tg1/pAX3-) in LB _amp wurden bei einer Zelldichte von 0,8 OD_{600 nm} mit 10 µl einer Phagensuspen­ sion M13KO7 (Pharmacia PL Biochemicals, Inc.) infiziert, 1 h bei 37°C inkubiert, anschließend mit 40 ml LB-Medium + 50 µg Ampicillin/ml und 70 µg Kanamycin/ml versetzt und weitere 5 h bei 37°C inkubiert. Die Aufarbeitung der Einzel­ strang-DNA erfolgt nach einer Vorschrift von Eckstein (Nakamaye, K. L. and Eckstein, F. [1986] Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698). Die Einzel­ strang-DNA wurde in 100 µl Wasser gelöst (Aus­ beute ca. 100-200 µg/50 ml Ansatz).

1.4.2. Ortsspezifische Mutagenese zur Eliminierung der EcoRI-site (Pos. 5761)

Für die "Annealing"-Reaktion wurden 10 µg ein­ zelsträngige DNA des Plasmides pAX3+ bzw. pAX3- mit 8 pmol der EcoRI-mismatch-Oligodesoxynukleo­ tide pAX3+ bzw. pAX3- eingesetzt. Die weiteren Reaktionen wurden nach Vorschrift von Eckstein und Taylor (Nucl Acids Res. 8765-8785 [1985]) durchgeführt.

1.4.3. Eliminierung der EcoRI-site an Position 6173

Je 10 µg der Plasmide pAX3+/-EcoRI 5761 und pAX3-(EcoRI 5761 wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl mit 20 U EcoRI linearisiert und nach vollständiger Hydrolyse gefällt. In einem 50 µl Ansatz wurden die überstehenden Enden mit 5 U Klenow-Polymerase aufgefüllt (s. 2.3.1.). Die gefällte DNA wird in 50 µl Wasser gelöst.

1.4.4. Ligation

500 ng der linearisierten DNA aus 2.4.3. wurden in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 2 U T4-DNA- Ligase 6 h ligiert. 10 µl des Ligationsansatzes wurden zur Transformation in kompetenten TG1- Zellen eingesetzt. Die Eliminierung beider EcoRI-sites wurde durch Maxam-Gilbert-Sequen­ zierung (s. 2.1.2.) bestätigt.

1.5. Darstellung von pAXa4+/-, pAXb4+/- und pAX4c+/- 1.5.1. Vorbereitung der Vektoren pAX4+ und pAC4-

Je 10 µg der Plasmide pAX4+ bzw. pAX4- wurden in einem Endvolumen von 50 µl zunächst mit 20 U PstI linearisiert und nach Umpuffern mit 20 U NruI weiter verdaut. Die geschnittenen Vektoren wurden über ein 1%iges Agarosegel abgetrennt, nach 1.1. isoliert und in je 50 µl Wasser aufge­ nommen.

1.5.2. Ligation der Linker in pAX4+ und pAX4-

Ligationsansätze
1.) 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1.
+100 pmol Linker I/pAX4a+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4a+/-
2.) 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1.	+100 pmol Linker I/pAX4b+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4b+/-
3.) 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1.	+100 pmol Linker I/pAX4c+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4c+/-
4.) 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1.	+100 pmol Linker I/pAX4a+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4a+/-
5.) 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1.	+100 pmol Linker I/pAX4b+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4b+/-
6.) 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1.	+100 pmol Linker I/pAX4c+/-
	+100 pmol Linker II/pAX4c+/-

Die Ansätze (3 µl Vektor300 ng DNA) wurden in einem Volumen von 20 µl hybridisiert und unter Zugabe von je 2 U T4-DNA-Ligase in einem 30-µl- Ansatz 6 h ligiert. Zur Transformation (TG1- Zellen) wurden je 10 µl der Ligationsansätze eingesetzt.

Der korrekte Einbau der Linker wurde durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung (s. 1.1.2.) be­ stätigt.

Beispiel 2 Expression, Isolierung und Spaltung des Fusionproteins bestehend aus β-Galaktosidase, Collage­ nase-Erkennungsregion, Faktor X _a-Erkennungsregion und Histidyl-tRNA-Synthetase aus E. coli 2.1 Klonierung der Histidyl-tRNA-Synthetase (HRS) aus E. coli in pAX1 2.1.1. Isolierung des NruI/PstI geschnittenen Vektors pAX1

70 µg pAX1 wurden mit 40 U PstI 2 h in 150 µl Gesamtvolumen nach 1.1. geschnitten. Nach Zu­ gabe von 2,5. µl 3M KCl-Lösung und 40 U NruI wurde nochmals 4 h inkubiert.

Nach der Ethanol-Fällung wurde das Pellet in 50 µl Wasser gelöst.

2.1.2. Ligierung des Histidyl-tRNA-Synthetasegens in pAX1

50 ng eines 1441 bp NruI/PstI-Fragments des HRS-Gens mit Terminatorsequenz wurde mit 500 ng des geschnittenen Vektors aus 3.1.1. mit 2 U T4-DNA-Ligase in 30 µl Gesamtvolumen 6 h li­ giert. 3 µl des Ligationsansatzes wurden für die Transformation in kompetente JM109-Zellen ver­ wendet.

Das entstandene Plasmid ist mit pAR10 bezeichnet worden.

2.2. Expression und Isolierung des Fusionsproteins

Das verwendete NZYMTA-Medium (Scholtissek S. [1987], Dissertation, Hannover) enthielt 50 µg Amicillin/ml.

Je 2×750 ml NZYMTA-Medium wurden in einem 21 Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 2,5 ml einer Übernachtkultur E. coli JM109/pAR10 in NZYMTA ver­ setzt und 20 h bei 25°C geschüttelt. Anschließend wurde mit je 250 mg IPTG versetzt und weitere 5 h bei 25°C geschüttelt. Nach Zentrifugation (10 min, 5000 g) wurden 12 g Zellen (Naßgewicht) erhalten, welche, in 40 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM Mercaptoethanol suspendiert und nach Zugabe von 10 mg in 500 µl Wasser gelöstem Lysozym und 400 µl 100 mM PMSF in Isopropanol bei -20°C einge­ froren wurden. Nach dem Auftauen auf Eis und Zu­ gabe von 400 µl 100 mM PMSF in Isopropanol und 50 µl DNAse (20 kU/µl) wurde in einer French-Presse der Fa. SLM Instruments, Modell 20 k, SLM Aminco, bei 1200 psi aufgeschlossen. Nach Zugabe von 60 mg in 500 µl gelöstem CHAPS wurde 10 min auf Eis ge­ rührt und anschließend 15 min bei 10 000 g zentri­ fugiert.

Das Zentrifugat enthielt nach Bradford (Bradford, M. [1976], Anal. Biochem. 72, 248-253) auf BSA be­ zogen 2,8 g Gesamtprotein.

Durch Zugabe von gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung pH 7,5 wurde das Zentrifugat auf 30% Sättigung an (NH₄)₂SO₄ gebracht. Nach 30 min Rühren bei 4°C wurde 15 min 10 000 g zentrifugiert. Das Zentri­ fugat enthielt 2,6 g Gesamtprotein.

Das Pellet wurde in 9 ml 20 mM Tris/HCl pH 7,4 10 mM MgCl₂, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 10 mg CHAPS und 1 ml Glycerin aufgenommen und gegen 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM EDTA 6 mit zwei Wechseln nach je 2 h dialysiert. Die Lösung enthielt 200 mg Gesamtprotein. Nach Zentrifugation 15 min 10 000 g enthielt das Zentrifugat 120 mg Gesamtprotein. Die Aufreinigung wurde nach Ullmann (Ullmann, A. [1984], Gene 29, 27-31) mittels einer APTG-Sepharose durchgeführt.

Das aufgereinigte Protein wurde gegen 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 5 mM Mercapto­ ethanol, 45% Glycerin 6 h dialysiert, mit einem Pufferwechsel nach 2 h.

Die Lösung enthielt 14 mg Gesamtprotein und wurde bei -20°C gelagert.

2.2. Spaltung des Fusionsproteins

20 µg aufgereinigtes Fusionprotein wurden in 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM CaCl₂ in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit 200 ng Faktor X _a 16 h bei 4°C inkubiert.

Beispiel 3 Expression, Isolierung und Spaltung des Fusionsproteins bestehend aus β-Galaktosidase, Colla­ genase- und Faktor X _a -Erkennungsregion und Isoleucyl- tRNA-Synthetase aus saccaromyces cerevisiae 3.1. Klonierung der Isoleucyl-tRNA-Synthetase (IRS) aus saccharomyces cerivisiae in pAX4+ 3.1.1. Linearisierung von pAX4+

10 µg pAX4+ wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl mit 20 U SmaI linearisiert und nach Umpuffern in einem Endvolumen von 100 µl mit 20 U SalI umgesetzt.

Der gefällte Vektor wurde anschließend in einem Ansatz von 50 µl mit 2 U alkalischer Phosphatase dephosphoryliert (s. 2.3.1.). Das Pellet der Ethanol-Fällung wurde in 50 µl Wasser aufgenommen.

3.1.2. Ligation des IRS-Gens in pAX4+

500 ng des mit SmaI und SalI geschnittenen Vek­ tors pAX4+ aus 4.1.1. wurden mit 300 ng eines 3221-pb-SalI/EcoRV-Fragmentes des IRS-Gens in einem Gesamtvolumen von 30 ul mit 2 U T4-DNA- Ligase 6 h ligiert. Für die Transformation in TG1-Zellen wurden 10 µl des Transformationsan­ satzes eingesetzt. Das entstandene Plasmid wurde mit pPM10 bezeichnet.

3.2. Expression und Isolierung des Fusionsproteins

Die Aufarbeitung erfolgt nach 3.2. Aus einer Zellmasse von 2,6 g (Naßgewicht) konnten 2.4 mg sauberes Fusionsprotein gewonnen werden.

3.3. Spaltung des Fusionsproteins

Die Spaltung erfolgt nach Vorschrift 3.3.

Claims (28)

1. Fusionsproteinvektor, enthaltend nacheinander auf einem Vektoranteil in Transkriptionsrichtung:

• a) einen Promotor und gegebenenfalls einen Ope­ rator,
• b) ein Gen für ein bakterielles Protein, das über seine enzymatische Aktivität oder durch Affinitätschromatographie aus einer Mischung von Proteinen abgetrennt werden kann,
• c) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit β-Faltblattstruktur kodiert,
• d) eine spezifische Protease-Erkennungssequenz,
• e) eine "multi-cloning"-Stelle zum Einligieren eines Fremdgens und
• f) den Replikationsursprung eines einzelsträngi­ gen DNA-Phagen enthält.

2. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die "multi-cloning"-Stelle Restriktionsschnitt­ stellen zur Klonierung von Fremdgenen in allen drei Leserastern enthält.

3. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er Stopcodons für das Fremdgen in allen drei Leserastern enthält.

4. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine Terminatorsequenz aufweist.

5. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Terminatorsequenz die Lambda-t₀-Sequenz ist.

6. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er den Replikationsursprung des Phagen f1 enthält.

7. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sein Vektoranteil ein Plasmid, Cosmid, eukaryontischer Vektor, Hefeplasmid, Shuttle-Vektor oder ein Teil eines solchen ist.

8. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen (b) das lacZ-Gen, das Glutathiontransfferasegen oder das Gen für Protein A ist.

9. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen (b) unter der Kontrolle seines homologen Promotors und gegebenenfalls Operators als Merkmmal (a) steht.

10. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er das lacZ-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors und -Operators enthält.

11. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz (c) ein Teil des Collagengens ist.

12. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease­ erkennungssequenz (d) eine Collagenaseerkennungs­ sequenz ist.

13. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteaseerkennungssequenz (d) die Erkennungssequenz für den Faktor Xa ist.

14. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er anstel­ le des vollständigen Gens (b) nur einen Teil davon, der die enzymatische Aktivität oder die Bindungsspezifität bei der Affinitätschromatographie aufweist, enthält.

15. Vektor pAX4a+, DSM 5059.

16. Vektor pAX4a-, DSM 5060.

17. Vektor pAX4b+, DSM 5061.

18. Vektor pAX4b-, DSM 5062.

19. Vektor pAX4c+, DSM 5063.

20. Vektor pAX4c-, DSM 5064.

21. Vektor pAX3+.

22. Vektor pAX3-.

23. Vektor pAX4+.

24. Vektor pAX4-.

25. Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder pro­ teinhaltigen Genprodukten durch Expression eines Expressionsvektors, der ein für das gewünschte Produkt kondierendes Gen enthält, in geeigneten Wirtszellen und Isolierung des Produkts aus den Zellen oder dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man in die "multi-cloning"-Stelle eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 24 das Gen für das gewünschte Produkt insertiert, den entste­ henden Expressionsvektor exprimiert, das gebildete Fusionsprotein aus aufgeschlossenen Zellen oder dem Kulturmedium über seine enzymatische Aktivität oder über Affinitätschromatographie isoliert und durch Verdauung mit der der Proteaseerkennungsse­ quenz entsprechenden Protease das gewünschte Pro­ dukt aus dem Fusionsprotein abtrennt und gewinnt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Expression eines eukaryontischen Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle die cDNA des Gens insertiert.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Fusionsproteinvektor verwendet, der als Merkmal (b) das lacZ-Gen enthält und die Iso­ lierung an APTG-Affinitätschromatographiesäulen durchführt.

28. Verwendung eines Fusionsproteinvektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung von Einzelstrang-DNA zur Sequenzierung und zur ortsspezi­ fischen Mutagenese der Fremd-DNA.