DE2818603A1 - Kinetisches glucosereagens und dessen verwendung in einem kinetischen nachweisverfahren - Google Patents
Kinetisches glucosereagens und dessen verwendung in einem kinetischen nachweisverfahrenInfo
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Description
Patentanwälte D:p!.-lng. Cu rt Wallach
Dipl.-Ing. Günther Koch Dipl.-Phys. Dr.Tino Haibach Dipl.-Ing. Rainer Feldkamp
D-8000 München 2 · Kaufingerstraße 8 · Telefon (0 89) 24 02 75 · Telex 5 29 513 wakai d
9 7 PPf
Datum: <- '' hrt
Unser Zeichen: 16201I
Bezeichnung: Kinetisches Glucosereagens und dessen
Verwendung in einem kinetischen Nachweisverfahren
Anmelder: Beckman Instruments, Inc.
Fullerton, Calif., USA
Vertreter: Patentanwälte
Dipl.-Ing. C. Wallach Dipl.-Ing. G. Koch Dipl.-Phys. Dr. T. Haibach
Dipl.-Ing. R. Peldkamp
Erfinder: Kenneth J. Pierre
Vista, Calif., USA
Ker-Kong Tung
Carlsbad, Calif., USA
Carlsbad, Calif., USA
δΟ984Ε/0δ?0
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Reagentien für die Verwendung in dem kinetischen Verfahren zur Bestimmung von Glucose mit Glucosedehydrogencise,
sie betrifft insbesondere ein kinetisches Glucosereagens des Typs, der enthält oder besteht aus einem Puffer,
einem Pyridin-Coenzym und Glucosedehydrogenase, sowie dessen Verwendung in einem kinetischen Nachweisverfahren.
Kinetische Verfahren zur Bestimmung von Glucosekonzentrationen in Proben, beispielsweise in Körperflüssigkeiten, mit Glucosedehydrogenase
sind bereits bekannt. So wird beispielsweise von D. Banauch, W. Brummer, W. Ebeling, H. Metz, H. Rindfrey, H. Lang,
K. Leybold und W. Rick in "Z. Klin. Chem. Klin. Biochem.",
13, 101 (1975), ein kinetisches Verfahren zur Bestimmung von Glucose
unter Verwendung von Glucosedehydrogenase beschrieben. Das Reagens von Banach et al enthält oder besteht aus 160 mHol/l
Tris-Puffer mit einem pH-Viert von 7,8, 0,6 Einheiten (U)/ml Glucosedehydrogenase
und 2,1 mMol/l NAD. Dieses Reagens liefert nach den darin enthaltenen Angaben bei seiner Verwendung in dem kinetischen
Verfahren eine Eichkurve, die bis zu 1000 mg/dl linear ist (das angewendete Verhältnis von Probe zu Reagens ist darin
nicht angegeben). Auch von Lutz et al wird in "Clinical Chemistry", 2J_ (lO), 1372 (1975), ein kinetisches Verfahren zur Uestimmung
von Glucose unter Verwendung der Glucosedehydrogenuse-Reciktion
beschrieben. Das von Lutz et al verwendete GLucosedehydrogenuse-
B0S845/C37
Reagens enthält oder besteht aus 86,5 mg NAD und 6 mg Glucosedehydrogenase
in 50 ml Tris-Puffer (pH 7,8). Lutz et al berichten von einer Abweichung von der Linearität ihres nicht-korrigierten
Glucosedehydrogenase-Verfahrens um 4 % bei 300 mg/?, um 8 % bei
500 mq% und um 19 ^ bei 1000 mg% bei Anwendung eines Verhältnisses
von Probe zu Reagens von 1:41. Auf der Basis ihrer Arbeiten haben
Lutz et al daraus geschlossen, daß es deshalb unmöglich scheint, die von anderen behauptete Linearität (Banauah et al, supra)
zu erreichen. Lutz beschreibt in "Clinical Chemistry", 22 (6), 929 (1976), einen Versuch zur Verbesserung der Linearität des
kinetischen Verfahrens zur Bestimmung von Glucose durch Zugabe von Konkurrenzinhibitoren für GDH zu dem enzymatischen Reagens,
um die Linearität der Reaktion zu verbessern. Durch Anwendung einer Gleichung zum Korrigieren der Nicht-Linearität ist es Lutz
nur gelungen, den Linearitätsbereich bis auf etwa 500 mg/dl zu erweitern unter Anwendung eines Verhältnisses von Probe zu
Reagens von 1:41. H. Rindfrey, R. Helger und H. Lang haben mit
ihrem Aufsatz "Kinetic Glucose Determination with Glucose Dehydrogenase" in "Z. Anal. Chem.", 279., 196 (1976), danach
die Behauptung von Lutz et al bestätigt, daß die Angaben von Banauch et al in ihrem Artikel in bezug auf den Linearitätsbereich
falsch sind. Rindfrey et al haben angegeben, duß die kinetische Glucosebestimmung mit Glucosedehydrogenase bis zu
300 mg/dl linear ist und daß bei 500 mg/dl der Fehler -10 % beträgt (das angewendete VerhäLtnis von Probe zu Reagens betrug
1:50).
E r f LndurujsgeniaiJ wurde nun geFunden, daß der Bereich der Linearität
yjius / na?η
des kinetischen Verfahrens zur Bestimmung von Glucosekonzentrationen
unter Verwendung eines Reagens des Typs, der enthält oder besteht aus einem Puffer, einem Pyridin-Coenzym und Glucosedehydrogenase,
beträchtlich erhöht (ausgedehnt) wird, wenn der in dem Reagens verwendete Puffer einen pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 9,0 aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ein kinetisches Glucosereagens des Typs, der enthält oder besteht aus einem Puffer, einem Pyridin-Coenzym
und Glucosedehydrogenase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Puffer einen pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 9,0 aufweist.
Durch Verwendung dieses verbesserten kinetischen Glucosereagens bei der kinetischen Glucosebestimmung wird der Bereich der Linerarität
gegenüber der bisherigen Grenze von etwa 300 bis etwa 500 mg/dl bis auf etwa 1200 mg/dl erweitert bzw. ausgedehnt (bei einem Verhältnis
von Probe zu Reagens von 1:41).
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand der beiliegenden Zeichnung (Fig. 1) näher erläutert.
Die beiliegende Fig. 1 zeigt ein Diagramm, in dem ,AA/Minute gegen
die Glucosesubstratkonzentration aufgetragen ist, die bei Verwendung
des erfindungsgemäßen verbesserten Reagens erhalten wurde.
Das verbesserte erfindungsgemäße kinetische Glucosereagens wird in einem kinetischen Nachweisverfahren (Assay) zur Bestimmung
des Glucosegehaltes einer Probe, beispielsweise einer biologischen
Flüssigkeit, wie Blutserum und Urin, verwendet. Das kinetische Nachweisverfahren (Assay) beruht auf der folgenden Reaktion:
8098ÄB/OS70
.3.
Glucose-Glucose + Pyridin-Coenzym Dehydrogenase. Gluconolacton + reduziertes (l)
Pyridincoenzym
Die Glucosekonzentration in der Probe wird bestimmt durch Bestimmung
der Geschwindigkeit der Zunahme der Absorption (Extinktion), die mit der Dildung von reduziertem Pyridin-Coenzym verbunden ist und
die ein Maß für die Glucosekonzentration darstellt.
Erfindungsgemäß ist es wesentlich, daß die zu bestimmende Glucosemenge
geschwindigkeitsbegrenzend ist.Die Menge der verschiedenen Bestandteile des erfindungsgemäßen kinetischen Glucosereagens sollte
daher in geeigneten Bereichen liegen, um sicherzustellen, daß die beobachtete Reaktionsgeschwindigkeit fUr die oben angegebene
Reaktion I charakteristisch ist für und bestimmt wird durch die Glucosekonzentration in der Probe.
Das erfindungsgemäße Reagens enthält oder besteht aus einem Puffer
mit einem pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 9,0, einem Pyridin-Coenzym
und Glucosedehydrogenase. Der Puffer hat vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 8,5 und insbesondere einen pH-Wert
von etwa 8,2. Es kann jeder beliebige Puffer verwendet werden, der mit den anderen Bestandteilen des erfindungsgemäßen Reagens verträglich
(kompatibel) ist und einen pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereiches aufweist. Zu beispielhaften Puffern gehören Triethanolamin-,
Natrium-5,5-diäthylbarbiturat-, Tri(hydroxymethyl)aminomethan-,
Diäthanolamin- und Phosphatpuffer. Phosphatpuffer sind die für die
erfindungsgemäße Verwendung bevorzugten Puffer. Zu beispielhaften Phosphatpuffern gehören Kaliumphosphat- und Natriumphosphatpuffer.
809845/0Ö7U
Obgleich die genaue Menge des verwendeten Puffers nicht kritisch ist, liegt der Puffer vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1
bis etwa 1 Mol, insbesondere von etwa 0,5 Mol, pro Liter Reagens vor.
Bei dem (den) in dem erfindungsgemäßen kinetischen Reagens enthaltenen
Pyridin-Coenzym(en) handelt es sich vorzugsweise um Nicotinamidadenindinucleotid
(NAD) oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP ), insbesondere NAD. Andere geeignete Pyridin-Coenzyme sind
z.B. Thio-NAD, Thio-NADP, Nicotinamidpurindinucleotid, Nicotinamid-(6-methylpurin)dinucleotid
oder Nicotinamid-(2-chlor-6-methylpurin)dinucleotid. Die genaue Konzentration des Pyridin-Coenzyms
ist nicht kritisch, so lange die Glucose in der zu untersuchenden Probe geschwindigkeitsbegrenzend ist. Vorzugsweise liegt das Coenzym
jedoch in Mengen von etwa 0,001 bis etwa 0,025 Mol, insbesondere von etwa 0,0027 Mol, pro Liter Reagens vor.
Die erfindungsgemäß verwendete Glucosedehydrogenase kann aus Mikroorganismen
hergestellt werden. Die Glucosedehydrogenase wird vorzugsweise gewonnen aus einer Bacillus megaterium- oder einer
Bacillus cereus-Mikrobenquelle. Die genaue Menge der in dem erfindungsgemäßen
kinetischen Glucosereagens verwendeten Glucosedehydrogenase ist nicht kritisch, so lange die Glucose in der zu
untersuchenden Probe geschwindigkeitsbegrenzend ist. Die Glucosedehydrogenase ist jedoch vorzugsweise in einer Menge von etwa 100 bis
etwa 3000 internationalen Einheiten (IL)) pro Liter (l) Reugens
vorhanden. Die besonders bevorzugte Menge an Glucosedehydrogenase variiert in Abhängigkeit von dem Verhältnis von Probe zu Reagens,
5/0870
sie liegt jedoch im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 300 bis etwa 2000 IU/l. Optimal sind etwa 1600 IU/l Glucosedehydrogenase
.
Obgleich die Ionenstärke des Reagens nicht kritisch ist, hat das erfindungsgemäße Reagens vorzugsweise eine Ionenstärke von
etwa 0,5 bis etwa 7 M, insbesondere von etwa 2 bis etwa 4 M, um die Wärmebeständigkeit von Glucosedehydrogenase zu erhöhen.
Zur Einstellung der Ionenstärke des Reagens kann jedes beliebige Salz verwendet werden, das mit den anderen Bestandteilen des
Reagens verträglich (kompatibel) ist. Zu beispielhaften Salzen gehören Alkalichloridsalze, wie z.B. Lithium-, Natrium- und Kaliumchlorid;
Kaliumphosphat; Natriumphosphat; Ammoniumphosphat; und Mischungen davon. Das bevorzugte Salz ist Kaliumchlorid.
Es ist auch bevorzugt, daß das erfindungsgemäße kinetische Glucosereagens
(Äthylendinitril)tetraessigsäure (EDTA) enthält. Die genaue Menge an vorhandener EDTA ist nicht kritisch, sie beträgt
jedoch vorzugsweise etwa 0 bis etwa 0,02 Mol, insbesondere etwa 0,005 Hol, pro Liter Reagens.
Das erfindungsgemäße Reagenssystem kann in Form einer wäßrigen
Lösung gelagert (auFbewahrt) werden oder die Lösung kann auf konventionelle Weise gefriergetrocknet und bei ihrer Verwendung
mit Wasser wieder angerührt werden«, Das Reagenssystem kann auch
hergestellt werden durch Verwendung ihrer [Jes tandtei Le in pulveriger
Form, die bei ihrer Verwendung mit Wasser solubi lisiert (löslich gemacht) we;rden.
8 Ü 9 « η '-> . 0 8 7 Π
. η I-
Die Bestimmung der Rate der verminderten Pyridin-Enzym-Produktion und
die Umwandlung dieser Rate in die Konzentration von Glucose kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Bei einem derartigen Verfahren
wird ein Spektrophotometer zur Bestimmung der Änderung der Lichtabsorption
als Folge der Bildung von reduziertem Pyridin-Coenzym bei Wellenlängen von etwa 300 bis etwa 370 nm bei einer Temperatur
von etwa 15 bis etwa 50 C verwendet. Eine Wellenlänge von etwa 340 nm bei einer Temperatur von etwa 25 C bis etwa 37 C ist
bevorzugt.
Ein bequemes Verfahren zur Bestimmung des Glucosegehaltes einer Probe mit dem erfindungsgemäßen Enzymreagens ist das folgende:
Wellenlänge (λ) 340 nm
Inkubationstemperatur 30 - 37 C
Wirkungsweise Absorptions
(Extinktion)
Absorptions- bzw. Extinktionsbereich 0 - 2 A
Küvetten-Weglänge 1,0 cm
Gesamtreaktionszeit etwa 90 Sek.
Reagens/Probe-Verhältnis etwa 41:1
oder höher
Verfahren
1.) Zur Herstellung einer Standardkurve auf die nachfolgend beschriebene
Weise werden Glucose-Standardlösungen mit 50 mg/dl, 150 mg/dl, 300 mg/dl und 600 mg/dl verwendet:
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α) In jede in geeigneter Weise markierte Küvette werden 1,0 ml
eines erfindungsgemäßen Reagens einpipettiert und bei 30 C odei
37 C äquilibriert.
b) Zu einem bestimmten Zeitpunkt werden 25 μΐ des ersten Standards
der geeigneten Küvette zugegeben, diese wird mit einem Parafilm bedeckt und durch langsames Umrühren gemischt. Genau 30 Sekunden
nach der Zugabe des Standards wird die Absorption (Extinktion) bei 340 nm in einem in geeigneter Weise geeichten Spektrophotometer
abgelesen und aufgezeichnet. Dabei handelt es sich um den Wert A_n.
Man läßt die Reaktion bei der gewählten Temperatur weitere 60 Sekunden lang fortschreiten. Dann wird genau 90 Sekunden nach der
Zugabe des Standards die Absorption (Extinktion) bei 340 nm abgelesen und aufgezeichnet. Dabei handelt es sich um den Wert AQ .
Es wird die Änderung der Absorption (Extinktion) bei einer 60 Sekunden-Reaktionsperiode bestimmt:
ΔΑ/60 Sek = A0 - A
c) Auf die gleiche Weise werden alle Standardlösungen untersucht zur Bestimmung von ΔΑ/60 Sekunden für jeden Standard.
d) Es wird eine Standardkurve hergestellt durch Auftragen der für A A/60 Sekunden erhaltenen Werte gegen die bekannte Glucosekonzentration
der verwendeten Standardlösungen.
2.) Alle zu prüfenden Proben werden auf die gleiche Weise wie die Standardlösungen untersucht, wobei für jede Probe Δ A/60 Sekunden
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bestimmt wird.
Die Glucosegehalte werden wie folgt berechnet: Der in der obigen Stufe 2. erhaltene Wert für Δ.Α/60 wird verwendet
zur direkten Ablesung der Glucosekonzentration in mg/dl von der Standardkurve:
Konzentration des unbekannten Materials (mg/dl) = . . / / , , ,ν Konzentration des Standards
ΔΑ/, ^unbekannt; χ ■—? Π i—j
60 v a A/,„-Standard
öl)
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Nachfolgend ist die Zusammensetzung eines bevorzugten erfindungsgemäßen
Reagens angegeben:
| Bestandteile | optimale Konzentration |
bevorzugter Konzentrations bereich |
| Puffer | ||
| K2HPO4 | 0,5 M | 0,1 - 1 M |
| KH2PO4 Alkalimetalic hlori d |
||
| KCl | 0,5 M | 0,1 - 1 M |
| EDTA | 0,005 M | 0 - 0,02 M |
| Pyridin-Coenzym | ||
| NAD | 0,0027 M | 0,001 - 0,025 M |
| GIucosedehydrogenäse | 1600 IU/l | 100 - 3000 IU/l |
| PH-Wert | -in/ c / η η "7 Π |
Der pH-Wert wird vorzugsweise auf etwa 8,0 bis etwa 8,5 eingestellt
und er beträgt besonders bevorzugt 8,2.
Ein 5000 mg^-Glucosestandard wurde hergestellt und bei Raumtemperatur
über Nacht stehen gelassen. Beim Verdünnen dieses Standards wurde eine Reihe von Proben mit bekannten Konzentrationen erhalten.
In eine Küvette wurde 1,0 ml des optimalen Reagens des Beispiels einpipettiert. Die Küvette wurde dann in ein Wasserbad gestellt
und bei 37 C äquilibrieren gelassen. In die Küvette wurden dann 25 μΐ einer eine bekannte Menge Glucose enthaltenden Probe eingeführt.
Die Reaktion wurde in einem Beckman -Spektrophotometer, Modell 25, durchgeführt. Die Kurve wurde kontinuierlich zwischen
und 90 Sekunden mit einem Aufzeichner aufgenommen und das Ablesen der Kurve wurde durchgeführt zur Bestimmung von ΔΑ/Min. Dieses
Verfahren wurde bei der Untersuchung jeder der eine bekannte Konzentration Glucose enthaltenden Proben angewendet und die dabei
erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt und in der Fig. 1 in Form eines Diagramms dargestellt. Eine Überprüfung
der Fig. 1 zeigt, daß bei Durchführung einer Glucosebestimmung unter Verwendung eines Glucosedehydrogenase enthaltenden
Reagens man in der Lage ist, eine Linearität von etwa 1200 mg/2
bei einer Verdünnung (Verhältnis Probe zu Reagens) von 1:41 zu erhalten.
In der weiter unten folgenden Tabelle II wird die Linearität des
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verbesserten erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Linearität von bekannten Verfahren verglichen.
Tabelle I Linearität für das Glucosedehydrogenase-Reagens bei pH 8,2
Glucosekonzentration ΔΑ/min
(mg%) 60-90 Sek.
200 0,077
400 0,152
500 0,190
600 0,232
800 0,303
1000 0,371
1200 0,441
1 500 0,521
1800 0,631
2000 0,682
2500 0,804
3000 0,940
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pH-Wert Probe/Reagens Linearität Endkonzentration Art des Verfahrens
7,8 nicht angegeben 1000 mg?i nicht angegeben
| 7,8 | 1:41 |
| 7,6 | 1:265 |
| 7,8 | 1:50 |
| 7,8 | 1:41 |
| 8,2 | 1:41 |
^ 500 300
500 1200
7,3 1,9 6
12,2 29,3
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Z.Anal. Chem. 279, 196 (1976) Rindfrey, Helger
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Clin. Chem. 22, 929 (1976) Lutz erfindungsgemäß
Aus der vorstehenden Tabelle II geht hervor, daß durch die vorliegende Erfindung der Bereich der Linearität eines Glucosenachweisverfahrens
bei Verwendung eines Glucosedehydrogenase enthaltenden Reagens beträchtlich erhöht (erweitert) wird. Aus
der Spalte "Endkonzentration" der Tabelle II geht eindeutig hervor, daß bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und
bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens es nun möglich ist, die Glucosemenge genau zu bestimmen, die in einer Probe mit einer
Glucosekonzentration vorhanden ist, die mehr als 2 mal höher ist als in Proben, die mit bekannten Verfahren und bekannten
Reagentien genau gemessen werden können.
Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte
Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie keineswegs darauf beschränkt ist,
sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden
Erfindung verlassen wird.
80984 5/0870
eerseite
Claims (1)
- Patentansprüche1. Kinetisches Glucosereagens des Typs, der enthält oder besteht aus einem PufFer, einem Pyridin-Coenzym und Glucosedehydrogenase, dadurch gekennzeichnet , daß der PufFer einen pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 9,0 aufweist.2. Glucosereugotis nach Anspruch 1, dadurch gel· ennzeichne t, daß der Puffer einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwn 8,5 aufweist.3. Glucosereagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pu F Fe r «inen pH-Wert von ο two ii,2 (iiiFweir, t.H Il H 3 4 I ! 0 R 7 il ORIGINAL INSPECTED4. Glucosereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ausgewählt wird aus der Gruppe der Triäthanolamin-, Natrium-5,5-diäthylbarbiturat-HCl-, Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-, Diethanolamin, und Phosphatpuffer.5. Glucosereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Puffer um einen Phosphatpuffer handelt, der ausgewählt wird aus der Gruppe Kaliumphosphat undNa triumphosphat.6. Glucosereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter Reajen:; enthält:a) etwa 0,1 bis etwa 1 Mol des Puffers,b) etwa 0,1 bis etwa 1 Mol eines Alkalimetallchlorids,c) etwa 0 bis etwa 0,02 flol Athylendinitri lte traessigsäure (EDTA),d) etwa 0,001 bis etwa 0,025 Mol des Pyridin-Coenzyms unde) etwa 100 bis etwa 3000 internationale Einheiten (iU) Glucosedehydrogenase.7. Glucosereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch cjH-ennzeir-l.net, daß es pro Liter Reagens enthalt:a) etwa J, f) f Io 1 de:; Pu f Pens,h) et Wd U,fi hol elf?"» Alkd Linie! ta Lieh lor id ;,c) et-vci (), ()()ί) Mol Ll)TA.dl it two 0,01).!/ tloL des P /i i J i π -Counzynis unde) et wc ι Irtui ι π te r n.i t iorni It- linheiten G Iu cusüile.hyd r iMjeiui >e .t ! tie; Ί"ΐι r. liW-· i . . · t i .ι fit en ^ Λ >·,>.) dc . I..I ί! ■'' !Iein kinetisches GIucosereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wird, das enthält oder besteht aus einem Puffer, einem Pyridin-Coenzym und Glucosedehydrogenase, dadurch gekenn·*· zeichnet, daß man das Nachweisverfahren bei einem pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 9,0 durchführt.9. Nachweisverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 8,5 durchgeführt wird.10. Nachweisverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert von etwa 8,2 durchgeführt wird.8098AB/0870
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