DE3787131T2

DE3787131T2 - Varicella-Zoster-Virus als lebende rekombinante Vakzine.

Info

Publication number: DE3787131T2
Application number: DE87305202T
Authority: DE
Inventors: Ronald W Ellis; Elliott Kieff; Robert S Lowe; Edward M Scolnick
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2007-06-13
Also published as: DK312687A; KR960008674B1; NZ220645A; IE60898B1; ZA874434B; IE871639L; AU7449287A; ES2058116T3; KR880000579A; PT85108A; DK312687D0; EP0251534A1; PT85108B; IL82851A0; DE3787131D1; CA1337596C; ATE93543T1; JP2523132B2; AU601747B2; JPS6312277A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Windpocken werden verursacht durch das Varicella-Zoster-Virus (VZV), ein Mitglied der Herpesvirus-Familie. Die Krankheit tritt bei Menschen auf, die zuvor noch keine Immunität gegen VZV besaßen. VZV-spezifische Antikörper können kurz nach Beginn der Krankheit nachgewiesen werden, nehmen während der Rekonvaleszenz ab, bleiben jedoch viele Jahre lang nachweisbar und gehen einher mit einer Immunität gegen die Krankheit. Windpocken sind hoch ansteckend. Über 90% der Bevölkerung werden dem VZV vor dem 20. Lebensjahr ausgesetzt. In den meisten aller Fälle wird VZV latent, möglicherweise in den Ganglienzellen der Hinterwurzel. Aus diesem latenten Stadium heraus kann sich das VZV reaktivieren und Zoster sogar in Gegenwart spezifischer Antikörper verursachen, wahrscheinlich als Ergebnis einer abgeschwächten zellulären Immunität. Die Krankheit ist stark lebensbedrohend für diejenigen mit abgeschwächter Immunität und für die, die das 20. Lebensjahr überschritten haben.
1974 berichtete Takahashi über die Isolierung des Oka-Stammes des VZV aus dem Vesikel eines Kindes mit Windpocken. Dieser Stamm wurde dann durch Kultivieren in embryonalen Meerschweinchenzellen und menschlichen diploiden Fibroblasten abgeschwächt. Die abgeschwächte Variante von VZV/Oka ist an tausenden von jungen Menschen klinisch getestet worden. Sie ist in der Lage, hohe Spiegel von Antikörpern zu erzeugen, die mit der Oberfläche des VZV-Virions reaktiv sind. Des weiteren zeigt dieser Stamm eine Schutzwirkung zur Prävention von Windpocken bei Kleinkindern und bei Immungeschädigten. Erwähnenswert ist, daß dieser Stamm von VZV der einzige verfügbare virale Impfstoff ist, der bei immungeschädigten Patienten sicher verwendet werden kann, was somit das VZV für Grenzanwendungen vielseitig macht.
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist das etiologische Mittel gegen infektiöse Mononukleose. Das EB-Virion besitzt 3 Haupt-Oberflächenglycoproteine: gp350 (350 000 Dalton Glycoprotein), gp220 und gp85. Die gp350- und gp220-Polypeptide sind die Produkte eines einzigen viralen Gens. Diese zwei Glycoproteine sind in der Lage, die Produktion von Antikörpern auszulösen, die in der Lage sind, die EBV- Infektiosität in vitro zu neutralisieren. Darum sind das gp350-Gen und seine Produkte nützlich zur Herstellung eines Impfstoffs gegen eine durch das EBV hervorgerufene Krankheit unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken. Ferner wäre es wünschenswert, Menschen gleichzeitig zu impfen sowohl gegen durch VZV als auch EBZ hervorgerufene Krankheiten oder alternativ sowohl gegen eine durch VZV hervorgerufene Krankheit und eine weitere Krankheit.
Das Hepatitis B-Virus (HBV) ist das infektiöse Agens, das verantwortlich ist für mehrere Arten der menschlichen Lebererkrankung, einschließlich Zirrhose und Leberzellenkarzinom, das jährlich hunderttausende von Menschenleben fordert. Das HB-Virion besteht aus zwei Gruppen von Strukturproteinen, den Kernproteinen und den Hüll- oder Oberflächen ("S")-Proteinen. Abgesehen von der Tatsache, die Haupt- Oberflächenproteine des Virions zu sein, d. h. Dane-Teilchen, sind die "S"-Proteine die alleinigen Bestandteile des Australia-Antigens, oder 22 nm-Teilchens. Die "S"-Proteine sind die Translationsprodukte eines großen offenen Leserasters (ORF), das je nach Serotyp für 389-400 Aminosäuren codiert. Dieses ORF wird in drei Domänen eingegrenzt, von denen jede mit einem ATG-Codon beginnt, das in der Lage ist, in vivo als translationale Initiationsstelle zu fungieren. Diese Domänen werden in dem Gen in ihrer entsprechenden 5'-3'-Reihenfolge als preS-1 (108-119 Aminosäuren), preS-2 (55 Aminosäuren) und S (226 Aminosäuren) bezeichnet. Die sechs Proteinprodukte, die sich von diesem ORF ableiten, weisen die folgenden Zusammensetzungen auf:
1) gp42 (42 000 Dalton Glycoprotein) = preS-1/preS-2/S (bedeutet preS-1, angrenzend an preS-2, angrenzend an S)
2) p39 (p = Protein) = preS-1/preS-2/S
3) gp36 = preS-2/S (zwei Glycosylierungsstellen)
4) gp33 = preS-2/S (eine Glycosylierungsstelle)
5) gp27 = S (eine Glycosylierungsstelle)
6) p24 = S (oder HB-Oberflächenantigen, d. h. HBsAg)
Außer dem Menschen sind Schimpansen die einzige Spezies, die gegenüber einer HBV- Infektion vollkommen anfällig ist, was sich widerspiegelt in den quantitativ bestimmbaren Markern, wie HBs&spplus;, den erhöhten Serumspiegeln von Leberenzymen, etc. Schimpansen wurden mit drei Dosen von gereinigten HBsAg-Teilchen (enthaltend p24) geimpft und dann einer Provokation mit einer starken Dosis von infektiösem HBV ausgesetzt. Während die mit Placebo geimpften Tiere an den Symptomen einer akuten HBV-Infektion litten, waren die mit HBsAg geimpften Tiere vollständig gegenüber jeglichen Symptomen einer Infektion geschützt. Darum waren in diesem experimentellen System die HBsAg-Teilchen, die aus gp27 und p24 (nur die S-Domäne) bestanden, ausreichend, um eine Schutzimmunität hervorzurufen. Angespornt durch diese Beobachtungen haben mehrere Hersteller HB-Impfstoffe hergestellt, die aus HBsAg- Teilchen bestehen.
Neue Daten haben nahegelegt, daß die preS-1- und preS-2-Domänen bei der Immunität gegen HBV-Infektionen eine wichtige Rolle spielen können. Sowohl Antikörper gegen preS-1 (hervorgerufen durch Immunisierung mit einem Peptid, bestehend aus den Aminosäureresten 10-32 von preS-1) als auch Antikörper gegen preS-2 (hervorgerufen durch Immunisierung mit einem Peptid, bestehend aus den Aminosäureresten 1-26 von preS-2) sind in der Lage, die Bindung von HBV an menschliche Hepatom-Zellen in vitro zu blockieren. Die Anti-HB (Seren von Patienten, die mit preS-1- oder preS-2- defizientem HBsAg geimpft worden waren) sind nicht in der Lage, dieses Blockierungsereignis auszulösen. Wenn dieses in vitro-Ereignis eine in vivo-Infektion vortäuscht, können die preS (d. h. preS-1 und preS-2 insgesamt als verknüpfte Einheit) -Domänen die HBV-Bindungsstelle für dessen Leberzellenrezeptor darstellen, und AntipreS kann die Bindung mit HBV und Auslösung der Infektion blockieren. Darüber hinaus wurde gefunden, daß während der Rekonvaleszenzphase von einer akuten HBV- Infektion Anti-preS im Titer ansteigt, was die Rolle dieser Antikörper bei der Rekonvaleszenz beweist. Schließlich wurde gezeigt, daß die Impfung von Schimpansen mit einem preS-Polypeptid aus 108 Aminosäuren (Reste 27-119 von preS-1, angrenzend an 1-16 von preS-2) ein gewisses Ausmaß an Schutz gegen eine HBV-Provokation vermitteln konnte. Insgesamt legten diese experimentellen Beobachtungen nahe, daß die preS-Domänen einen nützlichen Zusatz zu den derzeitigen HB-Impfstoffen darstellen, was somit den Wunsch unterstreicht, das große ORF, das für preS-1/preS-2/S codiert, zu exprimieren.

AUFGABEN DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, das natürlich vorkommende VZV-Genom zu verändern, um rekombinante Viren herzustellen, die heterologe, d. h. nicht von VZV stammende DNA besitzen. Eine weitere Aufgabe ist es, die heterologe DNA, die für ein immunogenes Polypeptid eines anderen menschlichen Pathogens codiert, zu verwenden. Noch eine weitere Aufgabe ist es, Verfahren zur Expression von einer solchen heterologen DNA als Teil des VZV-Genoms bereitzustellen. Noch eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Impfung von Menschen bereitzustellen, um in ihnen eine Immunantwort auf die heterologen Polypeptide auszulösen, die von der neu eingeführten DNA codiert werden. Diese und weitere Aufgaben der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das VZV-Genom wurde durch Einführen von heterologer DNA modifiziert, die für ein immunogenes Polypeptid eines anderen menschlichen Pathogens codiert. Dieses heterologe Polypeptid wird in Zellen exprimiert, die mit rekombinantem Virus infiziert worden sind. Da der Impfstoff-Stamm von VZV im klinischen Test in der Lage ist, Windpocken bei Kindern zu verhindern, ist das rekombinante VZV, das heterologes genetisches Material aufweist, als Impfstoff gegen Windpocken sowie gegen heterologe Pathogene geeignet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist ein Schema, das die Herstellung von pAM2 zeigt.
Fig. 2 ist ein Schema, das die Herstellung von pAM3 zeigt.
Fig. 3 ist ein Schema, das die Herstellung von pPK-3 zeigt.
Fig. 4 ist ein Schema, das die Herstellung von pPK-4 zeigt.
Fig. 5 ist ein Schema, das die Erzeugung von rekombinantem VZV zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Herstellung von rekombinantem VZV, das als Impfstoff fungieren kann sowohl für Windpocken als auch für Krankheiten, die von anderen menschlichen Pathogenen verursacht werden. Abgesehen von seinem Sicherheits- und Wirkungsprofil in den klinischen Tests mit gesunden Kindern erwies sich der Impfstoff-Stamm von VZV bei klinischen Tests mit immungeschädigten Menschen als sicher und wirksam. Es ist nicht erwünscht, andere lebende abgeschwächte Viren als Impfstoffe bei solchen Individuen zu verwenden. Somit ergibt sich bei der Verwendung von VZV und seinen rekombinanten Derivaten, wie erfindungsgemäß beschrieben, ein deutlicher Vorteil.
Es ist vorteilhaft, ein heterologes immunogenes Polypeptid in Form von lebendem rekombinantem VZV anzubieten, als Impfstoff aus einer Untereinheit, die von einer Rekombinaten abstammt, und zwar aus drei hauptsächlichen Gründen. Erstens kann ein Polypeptid, das dem Immunsystem als Replikationsstruktur angeboten wird, oft eine länger andauernde Immunität hervorrufen als wenn es als nicht replizierende, d. h. Untereinheit-Struktur, angeboten wird. Zweitens kann das Anbieten auf einer Replikationsstruktur die zellvermittelte Immunität wirksamer hervorrufen als das Anbieten als Untereinheit-Struktur. Schließlich durchläuft das Polypeptid insoweit als das heterologe Polypeptid in menschlichen Zellen exprimiert wird, post-translationale Modifikationen, die meistens denen stark ähnlich sind, die auftreten, wenn das Polypeptid bei natürlichen menschlichen Infektionen durch das heterologe Pathogen exprimiert wird. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die post-translationalen Modifikationen in dem heterologen Polypeptid, das als Produkt rekombinanten Ursprungs in Prokaryoten- oder Eukaryoten-Zellen exprimiert wird, oft von diesen Modifikationen, die auftreten, wenn das Polypeptid während einer natürlichen menschlichen Infektion exprimiert wird. Weiterhin werden durch Expression der heterologen Polypeptide als Teil eines rekombinanten VZV jegliche potentiellen Risiken umgangen, die mit der Verwendung eines lebenden abgeschwächten heterologen Pathogens als Impfstoff einhergehen. Dies ist vorteilhaft, da ein solches lebendes abgeschwächtes heterologes Pathogen die theoretische Möglichkeit einer Umwandlung in eine infektiösere und darum pathogenere Form hat.
Das lebende rekombinante VZV-Genom wird wie folgt dargestellt:
Ein DNA-Klon, bei dem eine natürlich vorkommende VZV-Promotorsequenz unmittelbar angeordnet ist in Position 5' zu der Codierungssequenz für das EBV-Gen gp350, wird wie folgt hergestellt. Ein VZV-Plasmid, das das vollständige VZV-Gen gpI enthält (einschließlich der gesamten 5'-Flankierungssequenzen), wird mit SfaN1 verdaut und mit stumpfen Enden versehen, wobei sich ein Fragment von 0,9 kbp ergibt, das den VZV-Promotor gpI sowie die ersten 34 Aminosäuren des primären gpI- Translationsprodukts enthält. Ein EBV-Plasmid, das das gp350-Gen enthält, wird mit BamHI und XhoII verdaut, wobei sich ein 4,3 kbp-Fragment ergibt, das die vollständige gp350-Codierungssequenz mit Ausnahme der ersten 21 Aminosäuren enthält. Oligonucleotide, die für die Aminosäuren 34-36 von VZV-gpI sowie die Aminosäuren 21-22 von EBV gp350 codieren, werden synthetisiert. Die 0,9 kbp-DNA wird in pUC19 kloniert, mit BamHI verdaut und mit dem 4,3 kbp-Fragment ligasiert. Der resultierende Vektor (pAM2) wird mit SphI, BamHI und SfaNI verdaut. Die resultierenden 0,9 und 7,0 kbp-Fragmente werden mit synthetischen Oligonucleotiden synthetisiert, was pAM3 ergibt. Ein VZV-Plasmid, das das Thymidinkinase (tk)-Gen (pPK-1) enthält, wird mit AccI und TagI verdaut, was ein 1,5 kbp-Fragment ergibt, das die vollständige tk-Codierungsregion enthält, die dann in pUC13 kloniert wird. Dieser tk- DNA-KIon (pPk-2) wird mit SphI verdaut und mit glatten Enden versehen. Alternativ wird das tk-Gen (pPK-1)-haltige Plasmid mit NsiI verdaut und mit glatten Enden versehen. pAM3 wird mit SphI und SmaI verdaut, mit glatten Enden versehen und in die glattendige SphI-Stelle von pPk-2 oder die glattendige NSiI-Stelle von pPk-1 kloniert. Dadurch wird ein DNA-Fragment erzeugt, das das nicht essentielle VZV-tk-Gen enthält, das den VZV-gpI-Promotor und die EBV-gp350-Codierungssequenz (tk-Kassette) umschreibt.
Die VZV-Gen-DNA in voller Lange und die tk-Kassette, die oben beschrieben worden sind, werden zusammen auf den Zellenstamm MRC-5 menschlicher diploider Fibroblasten übertragen. Die Plaques aus dieser Transfektion werden mit Hilfe monoklonaler Antikörper auf die Anwesenheit von EBV-gp350 getestet. Es wird rekombinantes VZV gefunden, welches EBV-gp350 exprimiert. Diese Rekombinante kann zellfrei subkultiviert werden und ist bei wiederholtem zellengekoppeltem Subkultivieren stabil. Die DNA-Hybridisierungsanalysen unter Verwendung von EBV-gp350- und VZV-tk-DNA-Sonden bestätigen ferner die Struktur des rekombinanten VZV.
Dane-Teilchen werden verwendet als Quelle für HBV-Nucleinsäure zur Isolierung des preS-1/preS-2/S-ORF. Die endogene Polymerase-Reaktion wird eingesetzt, um kovalent geschlossene ringförmige doppelsträngige DNA des HBV-Genom aus der gespaltenen Form mit einem Einzelstrangbruch herzustellen, die ursprünglich in dem HB- Virion vorkommt. Die reparierte DNA wird isoliert und vollständig mit EcoRI verdaut. Der E. coli-Klonierungsvektor pBR322 wird ebenfalls mit EcoRI verdaut, mit HBV- DNA ligasiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Rekombinante Plasmide werden ausgewählt, die das HBV-Genom in ringförmig permutierter Form enthalten, in der die EcoRI-Schnittstelle die vollständige preS-1/preS-2/S-Codierungsregion in eine 5'-Domäne von 0,4 Kilobasen-Paaren (kbp) und eine 3'-Domäne von 0,8 kbp aufteilt. Diese zwei Domänen werden letzten Endes subkloniert, um das gesamte Gen wieder zusammenzusetzen. Für die 3'-Domäne wird pUC19 mit EcoRI und BamHI verdaut, dann mit einem synthetischen Oligonucleotid ligasiert, das aus den letzten 5 Nucleotiden der Codierungsregion besteht, und zwar aus dem Stopcodon, einer HindIII-Stelle und einem BamHI-Ende. Der 3'-Teil des preS-1/preS-2/S-Gens, der aus einem 0,8 kbp-EcoRI-AccI-Fragment besteht, wird in diesen Vektor kloniert. pUC18 wird mit HindIII und EcoRI verdaut und mit einem synthetischen 72 bp-Oligonucleotid ligasiert, das das vollständige ORF von der BamHI-Schnittstelle stromaufwärts, über die distale ATG und eine nicht translatierte 10 bp-Leadersequenz bis zu einem HindIII- kompatiblen Ende wiederhergestellt. Das 0,3 kbp BamHI-EcoRI-Fragment der 5'- Domäne wird dann mit diesem Oligonucleotid-verknüpften Klonierungsvektor ligasiert. Die pUC18 5'- und pUC19 3'-Klone werden durch Wachstum in E. coli amplifiziert und die Codierungsregionen von den isolierten Plasmiden als HindIII-EcoRI-Fragmente verdaut. Die 5'- und 3'-Fragmente werden ligasiert, mit HindIII verdaut, mit glattem Ende versehen, und das vollständige ORF mit glattendigen Termini wird in pUC18 kloniert, das zuvor mit BamHI verdaut und mit glatten Enden versehen worden war.
Das VZV-Plasmid, das das vollständige VZV-gp1-Gen enthält, wird mit AvaI verdaut. Das 3,7 kbp-Fragment wird durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Es werden 4 Oligonucleotide synthetisiert, hybridisiert und ligasiert, um einen 55 Basenpaar (bp)-AvaI-XbaI-Linker zu bilden. Dieser Linker wird mit dem 3,7 kbp- Fragment ligasiert. Das Gemisch wird mit EcoRV verdaut, und das 0,9 kbp-Fragment (das dem gpI-Promotor enthält) wird durch präparative Agarosegel-Elektrophorese isoliert, mit glatten Enden versehen und in die Smal-Schnittstelle des preS-1/preS-2/S- haltigen pUC18 Vektors kloniert. Dieser Vektor (der den VZV-gpI-Promotor und die preS-1/preS-2/S-Codierungsregion enthält) wird mit SacI und PstI verdaut, mit glatten Enden versehen und in die glattendige NsiI-Schnittstelle von pPk-1 kloniert. Dies erzeugt ein DNA-Fragment, das das nicht essentielle VZV-tk-Gen enthält, das den VZV- gpI-Promotor und die preS-1/preS-2/S-Codierungssequenz (tk-Kassette) umschreibt.
Die VZV-Genom-DNA in voller Lange und die tk-Kassette, die oben beschrieben worden sind, werden zusammen auf MRC-5-Zellen transfiziert. Die Plaques aus dieser Transfektion werden mit Hilfe monoklonaler Antikörper auf das Vorliegen von HBV "S"-Proteinen geprüft. Es wird rekombinantes VZV gefunden, das HBV-Proteine exprimiert. Diese Rekombinante kann zellfrei subkultiviert werden und ist bei einer wiederholten zellverknüpften Subkultivierung stabil. Die DNA-Hybridisierungsanalysen unter Verwendung geeigneter DNA-Sonden bestätigen außerdem die Struktur des rekombinanten VZV.
Das EBV-gp350-Gen ist nur ein Beispiel einer nicht-VZV DNA-Sequenz, die in das VZV-Genom inseriert werden kann. Oft, jedoch nicht immer, sind die nützlichsten solcher Sequenzen, die, die für Proteine auf den Oberflächen menschlicher Pathogene, einschließlich Viren und Bakterien, codieren. Die EBV-gp350-Sequenz besitzt von Natur aus keine Qualitäten, was sie einzigartig macht im Vergleich zu anderen DNA- Sequenzen zur Rekombination in das VZV-Genom. Somit ist es für Fachleute klar, daß das Prinzip, das EBV-gp350-Gen als nicht-VZV DNA in das VZV-Genom zu inserieren, sich auf irgendeine nicht-VZV DNA-Sequenz erstreckt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, preS-1/preS-2/S-ORF von HBV. Da das Genom von VZV sehr groß ist, ist es ferner in der Lage, eine umfangreiche nicht-VZV DNA-Sequenz unterzubringen. Gleich, ob die nicht-VZV DNA ein einziges vollständiges Gen oder mehr als ein Gen aufweist, tritt die Expression des Fremdgens ein. Wenn mehr als ein Gen hinzugefügt wird, tritt die Expression mehrerer Fremdgene auf. Somit ist es für Fachleute klar, daß das Prinzip, das EBV-gp350-Gen als nicht-VZV DNA in das VZV- Genom zu inserieren, sich auf mehr als ein Gen erstreckt.
Der VZV-gpI-Promotor ist im Verlauf einer viralen Infektion physiologisch sehr aktiv. Das VZV-Genom enthält viele Gene, die von Promotoren flankiert sind, die nützlich sind, um die Synthese von nicht-VZV Genen zu lenken, da es gut bekannt ist, daß eine Codierungssequenz exprimiert werden kann, sogar wenn sie von einem Promotor und einem unterschiedlichen Gen flankiert wird. Ferner wurden zahlreiche, aus Säugerzellen stammende Promotorsequenzen beschrieben, die wirksam sind bei der Steuerung der Fremdgen-Expression. Solche Promotoren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, die von Metallothionein, die der langen endständigen retroviralen Wiederholungssequenz und die des Affenvirus 40. Der Promotor ist definiert aufgrund seiner Eignung, die Gentranskription zu steuern, und nicht aufgrund seines Ursprungs. Darum ist es für Fachleute klar, daß die Wahl eines Promotors in der Expressionskassette sich auf einen eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promotor erstreckt, der in der Lage ist, die Gentranskription in Zellen zu lenken, die durch das rekombinante VZV infiziert worden sind.
Es wurde gezeigt, daß das tk-Gen für die Replikation und Stabilität von VZV nicht essentiell ist. Dies wurde gezeigt anhand der Fähigkeit, das lebensfähige tk-VZV zu selektieren. Darum ist die Nützlichkeit von tk als Insertionspunkt für nicht-VZV DNA insbesondere geeignet im Hinblick auf dessen nicht essentielle Natur bei der VZV- Replikation. Aufgrund der Zugänglichkeit der vollständigen VZV-Genom-DNA- Sequenz können weitere nicht essentielle Regionen definiert und verwendet werden. Darum ist es für Fachleute klar, daß die Wahl eines Insertionspunktes für nicht-VZV DNA sich auf irgendeine nicht essentielle Region in dem VZV-Genom erstreckt.
Das Impfstoff-Virus wurde zur Verwendung als Vektor für die Expression von Fremdproteinen, z. B. Hepatitis B, vorgeschlagen. Es wurde erkannt, daß die Verwendung des Impfstoff-Virus in immungeschädigten Individuen oft zu einer gravierenden Morbidität und Sterblichkeit führt. Andererseits ist die Verwendung eines abgeschwächten Stammes des Varicella-Zoster-Virus als Vektor zur Expression von Fremdproteinen als Impfstoff für immungeschädigte Individuen geeignet, wobei eine Immunisierung erfolgt gegen Varicella sowie eine Krankheit, deren kausatives Agens für das von dem Vektor exprimierte Fremdprotein codiert. Der Impfstoff kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, einschließlich, jedoch beschränkt auf, subkutan oder intramuskulär. Einige Beispiele für Fremdproteine sind die, die exprimiert werden von EBV, Hepatitis B, dem menschlichen Immundefizienz-Virus (HIV), dem synzytikalen respiratorischen Virus, dem Herpes simplex-Virus Typ 1 und Typ 2 und dem Zytomegalie-Virus. Die erfindungsgemäßen Vektoren rufen bei Säugerspezies und beim Menschen die Bildung von schützenden Antikörpern in einer Konzentration pro Dosis von 10²-10&sup4; PFU pro individuellem Empfänger, z. B. Callithrix jacchus, hervor.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch hierauf zu begrenzen. Die Beschreibung eines jeden in den folgenden Beispielen erwähnten Zitats wird hier als Referenz mit angegeben.

Beispiel 1

Konstruktion eines modifizierten VZV-tk-Gens das eine für EBV gp350 codierende Expressionskassette enthält

Das VZV-gpI Glycoprotein stellt eines der Haupt-Strukturproteine dar, die in dem VZV-Virion enthalten sind [Ellis et al., J. Virology, 53 : 81(1985)]; die von dem VZV gpI-Promotor bestimmte Transcriptionsgeschwindigkeit ist relativ groß. Das SacI G- Fragment [Davison et al., J. Gen. Virol. 64 : 1181(1983)] von VZV, das das vollständige gpI-Gen umschreibt, wurde in ein modifiziertes pBR322(pRES) kloniert, das erzeugt worden ist durch Verdauung von pBR322 mit BamHI, Erzeugen von glatten Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Ligasieren mit einem octameren Oligonucleotid, das die Restriktionsschnittstelle für SacI (Collaborative Research) enthält, und Verdauen mit SacI. Das resultierende Plasmid (pVSGO-12) wurde mit SfaN1 verdaut und das 0,9 kbp-Fragment, das die stromaufwärts gelegenen Promotorsequenzen und die Codierungsregion für die ersten 34 Aminosäuren von VZV gpI enthielt, wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt (Fig. 1A). Das 0,9 kbp-Fragment wurde mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und in die HincII-Schnittstelle von pUC19 kloniert [Yanisch-Perran et al., Gene 33 : 103 (1985)], wodurch sich pAM1 bildete. Das Strukturgen für EBV gp350 und gp220 ist identisch mit und vollständig enthalten in dem BamHI-L-Genom-Fragment des Plasmids B68' [Hummel et al., J. Virology 49 : 413 (1984)]. Das B68'-Plasmid, das BamHI-L enthält, wurde mit BamHI verdaut. Das 0,5 kbp-BamHI-L-Fragment wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde dann mit XhoII verdaut. Das 4,3 kbp-Fragment, das das vollständige Strukturgen mit Ausnahme der ersten 63 bp der gp350-Codierungsregion, jedoch einschließlich der transcriptionalen Terminationssequenz, enthielt, wurde durch präparative Agarosegel- Elektrophorese gereinigt (Fig. 1B). pAM1 wurde mit BamHI verdaut und mit dem 4,3 kbp-Fragment ligasiert. Das resultierende Plasmid (pAM2, Fig. 1C) wurde mit SphI verdaut. BamHI und die 0,9 kbp und 7,0 kbp-Fragmente wurden durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt (Fig. 2A). Das 0,9 kbp-Fragment wurde mit SfaN1 verdaut, was ein weiteres 0,9 kbp-Fragment erzeugte, das durch präparative Agarosegel-Elektrophorese isoliert wurde.
Ein Oligonucleotid-Linker, der die folgende Sequenz enthielt, wurde synthetisiert (Fig. 2B):
Dieser Linker enthält SfaN1- und BamHI 5'-Überlappungen und stellt die Codierungssequenz für die Aminosäuren 34-36 des VZV-gpI-Gens dar, auf die die Aminosäuren 21-22 von EBV gp350 folgen. Der Linker, das 0,9 kbp-Fragment und das 7,0 kbp-Fragment wurden zusammen ligasiert. Das resultierende Plasmid (pAM3, Fig. 2C) wurde mit SphI und SmaI verdaut. Das 3,7 kbp-Fragment wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und anschließend mit T4 DNA- Polymerase mit glatten Enden versehen (Fig. 3A). Das SacI-H-Fragment [Davison et al., J. Gen. Virol. 64 : 1181(1983)] von VZV, das das vollständige tk-Gen umschreibt, wurde in pRES kloniert. Das resultierende Plasmid (pPK-1) wurde mit AccI und TaqI verdaut, wodurch ein 1,5 kbp-Fragment erzeugt wurde, das die gesamte Codierungsregion für tk enthielt (Fig. 3B). Dieses Fragment wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und in die SmaI-Schnittstelle von pUC13 kloniert [Pharmacia Inc., 1984 Katalog Nr. 27-4954-01]. Das resultierende Plasmid (pPK-2, Fig. 3C) wurde mit SphI verdaut, der in der tk-Codierungssequenz zweimal eine Verdauung durchführt, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit dem 3,7 kbp-Fragment ligasiert. Das resultierende Plasmid (pPK-3, Fig. 3D) enthält die VZV gpI/EBV gp350- Expressionskassette in dem VZV-tk-Gen. Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde pPK-3 verwendet, um ein rekombinantes VZV zu erzeugen, das EBV-gp350 exprimiert und die folgenden herausragenden Eigenschaften aufweist: 1) VZV-tk-Flankierungssequenzen zur Erzeugung einer homologen Rekombination zwischen VZV-DNA und dem rekombinanten Plasmid. 2) Den VZV gp1-Promotor zur Erzeugung hoher Expressionsniveaus von EBV gp350 während der viralen Replikation. 3) Die VZV gpI- Leadersequenz zur Insertion von gp350 in das rauhe endoplasmatische Reticulum und Expression infektiöser Zellen auf der Plasmamembran. 4) Die gp350 Codierungsregion zur Expression von EBV gp350-Proteinen 5) Den gp350-Membrananker, die translationalen Terminations- und die poLyA-Additionssequenzen.

Beispiel 2

Konstruktion eines weiteren modifizierten VZV tk-Gens, das eine für EBV-gp350 codierende Expressionskassette enthält

pAM3 (Beispiel 1) wurde mit SphI und SmaI verdaut. Das 3,7 kbp-Fragment wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und anschließend mit T4 DNA- Polymerase mit glatten Enden versehen (Fig. 4). pPK-1 (Beispiel 1) wurde mit NsiI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit dem 3,7 kbp- Fragment von pAM3 ligasiert. Das resultierende Plasmid (pPK-4) enthält die VZV gpI/EBV gp350-Expressionskassette in dem VZV-tk-Gen. pPK-4 wurde verwendet, um ein rekombinantes VZV zu erzeugen, das EBV gp350, wie in Beispiel 3 beschrieben, exprimiert und dieselben herausragenden Eigenschaften wie pPK-3 (Beispiel 1) aufweist, mit den folgenden Ausnahmen: Die tk-Flankierungssequenzen wurden ausgedehnt, so daß sie das gesamte VZV SacI-H-Fragment enthielten, was die 5'-Flankierungssequenz um 3,7 kbp und die 3'-Flankierungssequenz um 0,6 kbp relativ zu pPK-3 vergrößerte.

Beispiel 3

Erzeugung von VZV rekombinanter Virusexpressions EBMA

Jeweils 1 ug VZV/Oka-Genom-DNA und pPK-3 oder pPK-4 in 200 ul 2X HBS (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 12 mM Dextrose, 42 mM Hepes, pH 6,9) plus sterilem destilliertem Wasser (auf ein Endvolumen von 380 ul) wurden in ein 12·75 mm Röhrchen gegeben. 20 ul 2M Calciumphosphat, 10 mM Hepes, pH 5,5, wurden dann hinzugegeben. Im Verlauf von 30 Minuten bildete sich bei 23ºC zusätzlich ein DNA-Niederschlag. Der Niederschlag wurde zu 1,5 ml Wachstumsmedium gegeben [Dubecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus 10% fetales Kalbserum], das die MRC-5-Zellen bedeckte, am folgenden Tag auf 3·10&sup5;-Zellen/35 mm-Gewebekulturplatte eingestellt und 4 Stunden lang in einem 37ºC warmen CO&sub2;- Inkubator (Fig. 5) inkubiert. Das Medium wurde entfernt, die Zellen wurden mit 1 ml Wachstumsmedium gewaschen. 15% Glycerin in IX HBS wurde 3 Minuten lang auf die Zellen einwirken gelassen. Die Zellen wurden nochmals mit Wachstumsmedium gewaschen und in 1,5 ml Wachstumsmedium 24 Stunden lang in einem 37ºC warmen CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und auf 2 60 mm- Platten, die 4 ml Wachstumsmedium pro Platte enthielten, subkultiviert und in einem 37ºC CO&sub2;-Inkubator inkubiert, bis virale Plaques beobachtet wurden. 5-10 Tage später wurden die Zellen, die das Replikationsvirus enthielten, was durch die Anwesenheit einer Zytopathizität bewiesen wurde, trypsinisiert und auf einer 80-90%igen konfluenten Monoschicht aus MRC-5-Zellen zellassoziiert subkultiviert. 2 Tage später, als die viralen Plaques deutlich waren, wurde das Wachstumsmedium durch frisches Wachstumsmedium ersetzt, das 10 ug/ml eines monoklonalen Antikörpers (McAb) enthielt, der für EBV-gp350 spezifisch war [Cl. 4, Thorley-Lawson et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77 : 5307 (1980)] und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit DMEM gewaschen und 1 Stunde lang bei 37ºC in Gegenwart von Wachstumsmedium inkubiert, das menschliche Erythrocyten enthielt, die mit Antimaus-Kaninchen-Immunglobulin gemäß dem folgenden Verfahren gekoppelt worden waren: menschliche Erythrocyten (Typ AB positiv) wurden bei 23ºC 5 mal in 150 mM NaCl gewaschen. 2 ml Antimaus-Kaninchen-IgG (1 mg/ml) wurden unter leichtem Verwirbeln zu 1 ml gewaschenen gepackten Erythrocyten gegeben. 2 ml 0,033% (Gew./Vol.) Chrom(III)-chlorid, pH 5,0, wurden unter konstantem Rühren tropfenweise zu den Erythrocyten gegeben. Die Zellen wurden dann 7 Minuten lang bei 23ºC geschüttelt, bei 4ºC 5 mal mit Salzlösung gewaschen, bei 4ºC 1 mal mit Hank's ausgewogener Salzlösung (HBSS) gewaschen und in 50 ml HBSS zur Verwendung in einer 1 : 10-Verdünnung resuspendiert. Nach 1stündiger Inkubation wurden die viral infizierten Zellen noch 3 mal mit DMEM gewaschen und visuell auf die Bildung von Rosetten von Erythrocyten auf den VZV-Plaques geprüft. Solche Rosetten sind der Beweis für Zellen, die gp350 exprimieren. Etwa 10% der Plaques waren unter Verwendung von Cl.4 McAb Rosetten-positiv. Zwei weitere gp350-spezifische McAb, bezeichnet als 2L10 und BMA-17 und ein polyklonales Anti-EBV+ Humanserum riefen ebenfalls eine Rosettenbildung hervor, während normales Humanserum dies nicht bewirkte. Antikörper gegen gp350 waren nicht in der Lage, eine Rosettenbildung auf den Plaques hervorzurufen, die durch eine Transfektion von VZV/Oka allein erzeugt worden waren. McAb, gerichtet gegen das Hepatitis A-Virus VPI, war nicht in der Lage, die Rosettenbildung auf den rekombinanten VZV Plaques hervorzurufen, was somit die Spezifität dieses Tests zur Detektion der gp350- Expression bewies. Das zellfreie Virus wurde erzeugt durch 2minütiges Ultraschallbehandeln infizierter Zellen bei 4ºC in DMEM und Leiten des Ultraschallbehandelten Überstands durch einen 0,22 um-Filter. Das rekombinante VZV, das EBV gp350 exprimiert, kann als zellfreies infektiöses Virus subkultiviert werden, und solche Klone können in Gegenwart von 0,01% (Gew./Vol.) 5-Brom-2'-desoxyuridin subkultiviert werden, was die Rekombination innerhalb des tk-Gens beweist. Zusätzlich wurde das rekombinante VZV in zellassoziierter Form 30 mal subkultiviert, ohne daß seine Fähigkeit zur Expression von EBV-gp 350 außer Kraft gesetzt wurde, was durch Binden an 3 anti-gp350 McAb bewiesen wurde.
Aus den MRC-5-Zellen, die entweder mit rekombinantem VZV oder elterlichem VZV/Oka infiziert worden waren, wurden Lysate hergestellt, auf 6%ige Polyacrylamidgelen einer Elektrophorese unterzogen und ein Western Blot auf Nitrocellulose durchgeführt. Unter Verwendung von polyklonalem menschlichem Anti EBV+-Humanserum wurde gefunden, daß gp350 und gp220 in dem rekombinanten VZV-infizierten Zellextrakt vorhanden waren, jedoch nicht in dem elterlichen VZV- infizierten Zellextrakt. Diese Glycoproteine wanderten zusammen mit gp350 und gp220, die in den L-Zellen der Maus gebildet worden waren, die mit einem Eukaryoten-Expressionsplasmid für gp350 stabil transfiziert worden waren. VZV- Genom-DNA aus rekombinanten und elterlichen Viren wurde dann durch Southern Blot Analyse charakterisiert. 20 ug gereinigte virale DNA wurde mit BaglII, HpaI, KpnI oder SalI verdaut, auf einem 0,8%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose übergeführt und mit DNA von dem gp350-Gen sondiert, das mit α[³²P]dCTP durch eine Nick-Translation markiert worden war. Nur DNA-Fragmente, die auf den Spuren vorhanden waren, die das rekombinante VZV enthielten, hybridisierten mit der gp350-Sonde, was die Verknüpfung des gp350-Gens in dem VZV- Genom bewies.

Beispiel 4

Konstruktion eines modifizierten VZV tk-Gens, das eine für HBV-preS-1/preS-2/S codierende Expressionskassette enthält

Durch die etablierten Verfahren werden Dane-Teilchen (Untertyp ayw) aus dem Plasma von infizierten Individuen gereinigt [Landers et al., J. Virology 23: 368 (1977)]. Die HBV-Genom-DNA befindet sich in einer gespaltenen Form mit Einzelstrangbrüchen in dem Virion [Hruska et al., J. Virology 21: 666 (1977)]. Um diese DNA zur molekularen Klonierung herzustellen, wird eine endogene Polymerasereaktion angewendet, um kovalent geschlossene ringförmige doppelsträngige DNA herzustellen [Landers et al., J. Virology 23: 368 (1977)]. Die DNA wird durch Inkubieren in Puffer, der Natriumdodecylsulfat und Proteinase K enthält, deprotoniert, worauf mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und durch eine Ethanolfällung konzentriert wird. Diese gereinigte DNA wird vollständig mit EcoRI verdaut. Der E. coli-Klonierungsvektor pBR322 wird ebenfalls mit EcoRI verdaut, mit der verdauten HBV-DNA ligasiert und zur Transformation von E. coli verwendet. Es werden rekombinante Plasmide isoliert, die das HBV-Genom in einer ringförmig permutierten Orientierung um die einzigartige EcoRI-Schnittstelle enthalten, die die vollständige preS-1/preS-2/S-Codierungsregion in eine 5'-Domäne von 0,4 kbp und eine 3'-Domäne von 0,8 kbp aufteilt [Galibert et al., Nature 281: 646 (1979)]. Diese zwei Domänen werden letzten Endes für eine Neuordnung des gesamten Gens subkloniert. pUC19 wird mit EcoRI und BamHI verdaut, dann mit einem synthetischen Oligonucleotid ligasiert, das aus den letzten 5 Nucleotiden der Codierungsregion, dem Stopcodon, einer HindIII-Schnittstelle und einem BamHI-Ende besteht. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet
Der 3'-Teil des preS-1/preS-2/S-Gens, der aus einem 0,8 kbp EcoRI-Acd-Fragment besteht, wird in diesen Vektor (pUC19/DSD) kloniert. pUC18 [Yanisch-Perran et al., Gene 33: 103 (1985)] wird mit HindIII und EcoRI verdaut und mit einem synthetischen 72 bp-Oligonucleotid ligasiert, das das vollständige ORF aus der BamHI-Schnittstelle stromaufwärts von dem distalem ATG über eine nicht-translatierte 106p-Leadersequenz zu einem kompatiblen HindIII Ende wiederhergestellt. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet:
(* die natürliche Sequenz enthält statt T C; die obige Änderung zerstört die HinfI- Schnittstelle, ohne die codierte Aminosäure zu verändern). Das 0,4 kbp-BamHI-EcoRI- Fragment der 5'-Domäne wird dann mit diesem Oligonucleotid-verknüpften Klonierungsvektor (pUC19/DSD) ligasiert. Die 5'-pUC18- und 3'-pUC19-Klone werden durch Kultivieren in E. coli amplifiziert. Die Codierungsregionen werden als HindIII-EcoRI-Fragmente aus den isolieiten Plasmiden verdaut. Diese Fragmente werden ligasiert, mit HindIII verdaut, mit dem PolI-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen. Das vollständige ORF mit den glatten Enden wird in pUC18 kloniert, das mit BamHI verdaut worden ist, und wird mit dem PolI-Fragment von DNA Polymerase I (pUC18/PSSC) mit glatten Enden versehen.
Zur Herstellung eines Fragments, das den VZV-gpl-Promotor enthält, wird pVSGO-12 mit AvaI verdaut. Das 3,7 kbp-Fragment wird durch präparative Agarosegel- Elektrophorese gereinigt. Dieses Fragment enthält die VZV-pgI-Promotorsequenzen ohne die 0,05 kbp unmittelbar in Position 5' zu dem translationalen ATG-Startcodon von VZV-pg1. Es werden 4 Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
Die Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 werden wie die Oligonucleotide Nr. 3 und Nr. 4 hybridisiert. Die zwei Paare werden dann miteinander ligasiert, wobei ein 55 bp-Linker erzeugt wird, der AvaI- und XbaI 5'-Überlappungen enthält und die VZV-gpI- Promotorsequenz unmittelbar in Position 5' zu der Codierungssequenz von VZV-gpI darstellt. Dieser 55 bp-Linker wird mit dem 3,7 kbp-Fragment von pVSGO-12 ligasiert. Das Gemisch wird mit EcoRV verdaut. Das 0,9 kbp-Fragment wird durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und anschließend mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Das gereinigte 0,9 kbp-Fragment wird in die SmaI- Schnittstelle von pUC18/PSSSC kloniert. Dieser Vektor (der den VZV-gpI-Promotor und die preS-1/preS-2/S-Codierungsregion enthält) wird mit SacI und PstI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und in die mit glatten Enden versehene (durch T4 DNA-Polymerase) NsiI-Schnittstelle von pPK-1 kloniert, und somit wird pPK-5 erzeugt. Dieses Plasmid (pPK-5) wird verwendet, um eine vero-Zellinie zu erzeugen, die HBV-preS-1/preS-2/S exprimiert, das die folgenden herausragenden Eigenschaften aufweist: 1) den VZV-gpI-Promotor und die Stelle der RNA- Cupstruktur; 2) die vollständige Protein-Codierungssequenz für HBV-preS-1/preS-2/S; und 3) die Sequenz für die transcriptionale Termination und polyA-Addition.

Beispiel 5

Erzeugung von rekombinantem VZV exprimierendem HBV-preS-1/preS-2/S

Jeweils 1 ug der pPK-5- und VZV/Oka-Genom-DNA werden zusammen ausgefällt und genau wie in Beispiel 3 beschrieben zu MRC-5-Zellen gegeben. Die mit rekombinantem VZV infizierten Zellen werden mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers und Indikators für menschliche Erythrocyten genau wie in Beispiel 3 beschrieben auf die Produktion von HBV-preS-1/preS-2/S getestet, was zu einer Identifizierung von etwa 10% der Plaques als HBV-preS-1/preS-2/S-positiv führt. Antikörper gegen HBV-"S"- Proteine sind nicht in der Lage, eine Rosettenbildung auf den durch Transfektion von VZV/Oka allein erzeugten Plaques hervorzurufen. Ein McAb, das gegen das Hepatitis A-Virus VPI gerichtet ist, ist nicht in der Lage, die Rosettenbildung auf rekombinanten VZV-Plaques hervorzurufen, was die Spezifität dieses Tests für die Detektion der Expression von preS-1/preS-2/S beweist. Das zellfreie Virus wird erzeugt durch eine zweiminütige Ultraschallbehandlung infizierter Zellen bei 4ºC in DMEM und Filtrieren des Überstands über einen 0,22 um-Filter. Das rekombinante VZV, das HBV-preS-1/preS-2/S exprimiert, kann als infektiöses zellfreies Virus subkultiviert werden. Solche Klone können in Gegenwart von 0,01% (Gew./Vol.) 5-Brom-2- desoxyuridin subkultiviert werden, was die Rekombination innerhalb des tk-Gens beweist. Die Expression wird ferner verifiziert anhand des Nachweises von HbsAg durch die Reaktivität gegenüber AUSRIAO® (Abbott) in Kulturlysaten.
Die Lysate werden aus MRC-5-Zellen hergestellt, die entweder mit rekombinantem VZV oder elterlichem VZV/Oka infiziert worden sind, auf 6%igen Acrylamidgelen einer Elektrophorese und auf Nitrocellulose einem Western Blot unterzogen. Unter Verwendung eines Anti-HBV-"S"-Proteinserums sowie eines anti-preS-Serums wird gefunden, daß preS-1/preS-2/S-Proteine in dem rekombinanten VZV-infizierten Zellextrakt, jedoch nicht dem elterlichen VZV-infizierten Zellextrakt vorhanden sind. Diese Proteine wandern zusammen mit den "S"-Proteinen, die von den HBV-Dane- Teilchen stammen. VZV-Genom-DNA rekombinanter und elterlicher Viren wird dann durch eine Southern Blot-Analyse charakterisiert. 20 ug gereinigte virale DNA wird mit BglII, HpaI, KpnI oder SalI verdaut, auf einem 0,8%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose übertragen und mit DNA aus dem HBV- preS-1/preS-2/S-Gen sondiert, das durch eine Nick-Translation mit α[³²P]dCTP markiert worden ist. Nur die DNA-Fragmente, die in den Spuren vorhanden waren, die das rekombinante VZV enthielten, hybridisierten mit der gp350-Sonde, was die Bindung des HBV-preS-1/preS-2/S-Gens innerhalb des VZV-Genoms bewies.

Beispiel 6

Das gemäß Beispiel 3 durch Ultraschallbehandeln infizierter Zellen erzeugte zellfreie Virus wird subkutan an eine Gruppe von 4 Callithrix jacchus-Affen in einer Konzentration pro Dosis von 10&sup7;PFU/Tier verabreicht. Einer Kontrollgruppe von 4 Callithrix jacchus-Affen wird eine Salzlösung als Placebo verabreicht. Nach 30 Tagen werden beide Gruppen mit 10&sup8; PFU oder EBV provoziert. Während eines Beobachtungszeitraums von 6 Monaten nach der Provokation zeigte keiner der Affen aus der ersten Gruppe irgendein Zeichen einer Replikation von EBV, während alle Tiere der Kontrollgruppe Zeichen einer EBV-Replikation aufwiesen. Dieses Ergebnis beweist die Entwicklung einer Immunantwort in der ersten Gruppe vor der Provokation.

Claims

1. Abgeschwächter Variella-Zoster-Virus (VZV), modifiziert durch Anwesenheit von Non-VZV-DNA in seinem Genom.

2. VZV nach Anspruch 1, bei dem die Non-VZV-DNA die Codierungssequenz für ein Polypeptid enthält, welches benachbart liegt zu einer Promotor-Sequenz, die angepaßt ist, um die Transkription der Non-VZV-DNA zu lenken.

3. VZV nach Anspruch 1, bei dem die Non-VZV-DNA mehr als eine Codierungssequenz enthält, wobei jede Sequenz für ein verschiedenes Polypeptid codiert und jede Sequenz benachbart ist zu einer Promotor-Sequenz, die angepaßt ist, um die Transkription der benachbarten Non-VZV-DNA zu lenken.

4. VZV nach Anspruch 2, bei dem die Codierungssequenz ein Immunogenprotein eines menschlichen Pathogens bestimmt.

5. VZV nach Anspruch 4, bei dem die Codierungssequenz den Epstein-Barr- Virus gp350 bestimmt.

6. VZV nach Anspruch 4, bei dem die Codierungssequenz HBV preS1/preS2/S bestimmt.

7. VZV nach Anspruch 2, bei dem sich die Promotorsequenz von VZV ableitet.

8. VZV nach Anspruch 7, bei dem sich die Promotorsequenz von dem gpI-Gen von VZV ableitet.

9. Verfahren zur Herstellung von VZV nach Anspruch 1, welches umfaßt Aufgeben eines Mediums auf einer Zell-Monoschicht, welches VZV und Non-VZV- DNA enthält, worin die Non-VZV-DNA verknüpft ist mit Sequenzen, die mit der DNA colinear sind, die in einer nicht-essentiellen Region des VZV-Genoms vorliegen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die nicht-essentielle Region das Thymidinkinase-Gen darstellt.

11. Impfstoff, der VZV nach Anspruch 1 enthält.

12. Impfstoff, der VZV nach Anspruch 3 enthält.

13. Verwendung des Produkts nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments, welches geeignet ist zur Immunisierung eines Mitglieds einer gegen Windpocken und mindestens ein weiteres Pathogen empfindlichen Spezies.

14. Verwendung nach Anspruch 13, bei der das Mitglied einer empfindlichen Spezies immun-kompromittiert ist.