DE3782768T2

DE3782768T2 - Verfahren fuer die produktion von im wesentlichen reinem albumin.

Info

Publication number: DE3782768T2
Application number: DE8787305191T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Gion; Minoru Inosaka; Yasuo Uehara; Sadao Yabushita
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1986-06-13
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2007-06-13
Also published as: EP0249483A2; DE3782768D1; EP0249483A3; ES2035861T3; EP0249483B1; KR880000465A; JPS62294621A; CA1323139C; US4754019A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Albumin aus einer Proteinlösung, die aus menschlichem Plasma stammendes Albumin enthält, bei dem die Proteinlösung einer Hitzebehandlung unterworfen wird.
Albumin ist ein Plasmaprotein, das im Plasma in einer größeren Menge enthalten ist und das gegen verschiedene Störungen verwendet wird (z.B. Verbrühen, Nephrose, hämorrhagischer Schock, etc.).
Albumin wird industriell aus der Feinfraktion V, erhalten nach dem Cohn'schen Fraktionierungsverfahren mit kaltem Alkohol, gewonnen. Jedoch ist bekannt, daß größere oder kleinere Mengen, d.h. 10 bis 40 % w/v, an Albumin in einer wertvollen Plasmaproteinfraktion oder einer zu verwerfenden Fraktion, die aus der wertvollen Fraktion nach Gewinnung der wertvollen Plasmaproteine erhalten wird, enthalten sind. Ein Verfahren zur Reinigung von Albumin aus solchen Fraktionen ist in der US-A-4 017 470 (Izaka et al.) und der US-A-4 156 681 (Schneider et al.) beschrieben. Beide Verfahren beruhen auf der Hitzestabilität des Albumins im Vergleich zu anderen Proteinen und werden durch Erhitzen einer wässrigen Lösung der Fraktion auf eine Temperatur von 50ºC oder höher zur Denaturierung und Präzipitierung von anderen Proteinen als Albumin durchgeführt. Während des Erhitzens wird eine Fettsäure oder ihr Salz als Stabilisator für Albumin zugesetzt. Die Präzipitation der anderen Proteine wird durch die Zugabe einer spezifischen Menge Alkohol (US-A-4 156 681) beschleunigt. Das Albumin wird aus dem Überstand nach einem bekannten Verfahren, wie Präzipitation mit Polyethylenglycol, Maleinsäure oder Rivanol (2-Ethoxy- 6,9-diaminoacridinlactat) (US-A-4 017 470) gewonnen.
Bei solchen Verfahren treten Probleme auf, weil die Reinheit und die Ausbeute an Albumin nicht ausreichend hoch sind, um die Gewinnung eines Produkts zur Verwendung als Albuminpräparat in guter Ausbeute zu erlauben.
Daher wurden ausgedehnte Untersuchungen hinsichtlich der Hitzebehandlungsverfahren oder -bedingungen zur Gewinnung von reinem Albumin in guter Ausbeute aus einer Albumin enthaltenden Plasmaproteinlösung, insbesondere einer mit α - und/oder ß-Globulin verunreinigten Albuminlösung, die aus menschlichem Plasma stammt, durchgeführt, und als Ergebnis wurde gefunden, daß die vorstehenden Probleme dadurch gelöst werden können, daß man die Lösung einer Hitzebehandlung in einer Kombination aus spezifischen Bedingungen unterwirft, um effektiv im wesentlichen reines Albumin in hoher Ausbeute ohne die vorstehend erwähnten Nachteile zu gewinnen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Reinheit von in einer Albumin und anderes Plasmaproteinmaterial enthaltenden Lösung vorhandenem Albumin, umfassend die Zugabe eines Albuminstabilisators und eines Präzipitierungsmittels für das andere Plasmaproteinmaterial zu der Lösung, Erhitzen der Lösung bis zu einer Temperatur, die zur Denaturierung und Präzipitierung des anderen Plasmaproteinmaterials ausreicht, und das Abtrennen des Präzipitats von der Albumin enthaltenden Lösung, wobei das Verfahren unter Verwendung einer Kombination der nachstehenden Bedingungen durchgeführt wird:
i) vor der Zugabe des Albuminstabilisators und des Präzipitierungsmittels weist die Albumin und anderes Plasmaproteinmaterial enthaltende Lösung eine Proteinkonzentration von 0,5 bis einschließlich 3 % w/v auf,
ii) der Albuminstabilisator ist eine organische Carbonsäure mit drei bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen oder ein physiologisch verträgliches Salz davon und in einer Menge von 3 bis einschließlich 10 mM vorhanden,
iii) das Präzipitierungsmittel ist Ammoniumsulfat und ist in einer Endkonzentration von 1 bis einschließlich 10 % w/v vorhanden, und
iv) das Erhitzen wird 15 bis einschließlich 60 Minuten bei einem pH-Wert von 4,5 bis einschließlich 5,5 und bei einer Temperatur von 65 bis einschließlich 70ºC durchgeführt.
Dieses Verfahren erlaubt die Gewinnung einer im wesentlichen reinen Albuminlösung aus einer Albumin und andere Plasmaproteine menschlichen Ursprungs enthaltenden Proteinlösung.
Bei diesem Verfahren wird die Proteinlösung auf eine Temperatur von 65 bis 70ºC bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5, bevorzugt 4,9 bis 5,4, für 15 bis 60 Minuten in Gegenwart von 3 bis 10 mM der organischen Carbonsäure mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ihres Salzes und 1 bis 10 % w/v Ammoniumsulfat erhitzt, um die Proteine außer Albumin auszufällen, wobei die Proteinlösung eine Lösung ist, die die Proteine in einer Konzentration von 0,5 bis 3 % w/v enthält; das Albumin wird dann aus dem Überstand gewonnen. Bedingungen, unter denen das Verfahren durchgeführt werden kann, sind nachstehend aufgeführt :

(1) Ausgangsmaterial

Das verwendete Ausgangsmaterial ist auf keine spezielle Fraktion beschränkt, insoweit sie Albumin eines Plasmas menschlichen Ursprungs enthält, aber im allgemeinen wird eine α - und/oder ß-Globulin enthaltende Fraktion bevorzugt verwendet. Die Fraktion entspricht beispielweise der Fraktion IV, IV-1 oder IV-4 des Cohn'schen Fraktionierungsverfahrens mit Ethanol und einer Präzipitatfraktion wie Rohalbumin entsprechend einer 35 bis 50 %igen Sättigung mit Ammoniumsulfat.

(2) Vorbehandlung

Die vorstehenden Fraktionen können so, wie sie sind, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, aber eine Lösung, aus der die anderen wertvollen Proteine, wie Haptoglobin und andere, extrahiert und gewonnen worden sind, ist vorzuziehen. Beispielsweise wird Haptoglobin durch dessen Ausfällung aus der Lösung durch 50 %ige Sättigung mit Ammoniumsulfat und anschließendes Einstellen des pH-Werts des Überstands auf pH 4,5 bis 4,3 entfernt und gewonnen. Das gebildete Präzipitat wird gewonnen. Das Präzipitat enthält natürlicherweise das verwendete Ammoniumsulfat.

(3) Behandlung

Die das Albumin enthaltende Fraktion, die in obiger Stufe (1) oder (2) erwähnt wurde, enthält im allgemeinen 10 bis 70 % Albumin und wird in etwa 5 bis etwa 20 Volumina eines wäßrigen Mediums, bevorzugt kaltem reinem Wasser, aufgelöst, so daß die entstandene Lösung 0,5 bis 3 % w/v Protein enthält. Diese Lösung wird mit einer organischen Carbonsäure oder ihrem Salz als Albuminstabilisator und Ammoniumsulfat als Präzipitierungsmittel für die Proteine außer Albumin versetzt.
Die organische Carbonsäure unterliegt keinen Beschränkungen, ausgenommen daß sie 3 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten muß, und eine Carbonsäure wie Caprylsäure, Mandelsäure oder Citronensäure ist zu erwähnen. Ein physiologisch verträgliches Salz, wie ein Alkalimetall-, wie z.B. Natrium- oder Kalium-, oder ein Erdalkalimetall-, wie z.B. Calciumsalz, könnenalternativ verwendet werden. Erfindungsgemäß wird die organische Carbonsäure in einer Endkonzentration von 3 bis 10 mM, bevorzugt 3 bis 5 mM, verwendet.
Ammoniumsulfat wird in einer Endkonzentration von 1 bis 10 % w/v verwendet, und wenn die Albuminlösung bereits Ammoniumsulfat enthält, wie es bei dem Material nach vorstehender Stufe (2) der Fall ist, sollte diese Menge berücksichtigt werden.
Die albuminhaltige Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,5, bevorzugt 4,9 bis 5,4 und bevorzugter 5,0 bis 5,3, eingestellt und dann auf eine Temperatur von 65º bis 70ºC, bevorzugt etwa 68ºC, für 10 bis 60 Minuten, bevorzugt etwa 30 Minuten, erhitzt.
Nach dem Erhitzen wird die Lösung auf etwa 10 bis etwa 20ºC abgekühlt, filtriert oder bei 5000 bis 15 000 UpM (4 500 bis 13 000 g) etwa 30 Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die Filtration oder Zentrifugation wird bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 durchgeführt. Eine von dem Überstand abgetrennte, ausgefällte Fraktion enthält hitzekoagulierte Proteine außer Albumin.

(4) Nachbehandlung

Der Überstand enthält sehr reines Albumin mit einer Reinheit von 90% oder mehr, z.B. bis zu 98%, und kann zur Herstellung eines Albuminpräparats so, wie er ist, verwendet werden. Jedoch kann er einem bekannten Reinigungs- und Verarbeitungsverfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats unterworfen werden. Beispielsweise wird er mit einem Ionenaustauscher behandelt, einem Reinigungsverfahren zur Entfernung von vorhandenem Salz unterworfen und 10 Stunden bei 60ºC zur Inaktivierung von Viren hitzebehandelt.
Alternativ oder gegebenenfalls können die in der US-A-4 156 681 und/oder US-A-4 017 470 beschriebenen Verfahren zur Reinigung verwendet werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann hochreines Albumin in hoher Ausbeute erhalten werden. Folglich kann ein qualitativ hochwertiges Albuminpräparat, das klinisch verwendbar ist, bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zu 1 kg einer pastenartigen Masse aus Fraktion IV-4, die 20% Albumin und 80 % andere Proteine enthielt, wurden 9 l destilliertes Wasser gegeben, und es wurde dann zwei Stunden gerührt, um eine Lösung zu erhalten. Diese wurde dann zentrifugiert, um einen Überstand abzutrennen (pH 7,0). Der Überstand wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 10 % w/v und mit Natriumcaprylat bis zu einer Endkonzentration von 4 mM versetzt. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt, dann 30 Minuten auf 68ºC erhitzt und auf 20ºC abgekühlt. Der pH-Wert wurde auf 4 bis 6 eingestellt, und dann wurden gebildete Präzipitate abzentrifugiert. Der abgetrennte Überstand enthielt 97 % reines Albumin in einer Ausbeute von 90 %.

Beispiel 2

Haptoglobin wurde aus der Lösung der Cohn's Fraktion IV (pH 7,0) mittels Ammoniumsulfatfällung präzipitiert. Der Überstand, der verworfen werden sollte und 30 % w/v Ammoniumsulfat enthielt, wurde auf einen pH-Wert in der Nähe des isoelektrischen Punkts von Albumin, pH 4,55, eingestellt, um das Albumin zu präzipitieren, das als Rohalbumin in einer pastenartigen Fraktion gewonnen wurde.
Zu 1 kg der pastenartigen Fraktion, die 60 % Albumin und 40% andere Proteine enthielt, wurden 9 l destilliertes Wasser gegeben, um die Fraktion aufzulösen. Das verbleibende Ammoniumsulfat in der so erhaltenen Lösung hatte dann eine Endkonzentration von 2 % w/v. Die Lösung wurde mit Natriumcaprylat bis zu einer Endkonzentration von 4 mM versetzt. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt, 30 Minuten auf 68ºC erhitzt und dann auf 20ºC abgekühlt, um Präzipitate zu erhalten, die dann abzentrifugiert wurden. Das in der Lösung enthaltene Albumin hatte eine Reinheit von 98 % und lag in einer Ausbeute von 90 % vor.

Versuchsbeispiel 1

Die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in der Lösung und der erhaltenen Albuminausbeute wurde untersucht. Das Vorgehen in Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß unterschiedliche Proteinkonzentrationen verwendet wurden. Die Menge an Albumin in den Gesamtmengen der Proteine wurde nach dem elektrophoretischen Verfahren mit einer Celluloseacetatmembran (Kohn, J. Clin. Chim. Acta. 2 (1957), 297) gemessen, und die Gesamtmenge der Proteine wurde nach dem UV-Absorptionsverfahren (Tombs et al., Biochem. J. 73 (1959), 167) gemessen. Tabelle 1 Proteinkonzentration in der verwendeten Lösung (% w/v) erhaltene Albuminausbeute (%)

Versuchsbeispiel 2

Die Beziehung zwischen der Konzentration der organischen Carbonsäure und der Albumingewinnung wurde untersucht. Das Vorgehen in Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß unterschiedliche Konzentrationen der Carbonsäure verwendet wurden. Die Menge an Albumin wurde nach dem Verfahren der Einzel-Radial-Immundiffusion (Mancini, G., et al., Immunochemistry 2 (1965), 235) gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Konzentration der organischen Carbonsäure (Natriumcaprylat) (mM) Ausbeute (%)

Versuchsbeispiel 3

Die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Lösung und der Reinheit des erhaltenen Albumins wurde untersucht.
Das Vorgehen in Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die pH-Werte variiert wurden. Die Menge an gewonnenem Albumin wurde nach dem Verfahren der Einzel- Radial-Immundiffusion gemessen, und die Reinheit des Albumins wurde nach dem elektrophoretischen Verfahren mit einer Celluloseacetatmembran gemessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 pH-Wert Ausbeute (%) Reinheit (%) Bewertung schlecht ziemlich gut gut

Versuchsbeispiel 4

Der Einfluß der Konzentrationen an Ammoniumsulfat wurde untersucht.
Das Vorgehen in Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß variierende Konzentrationen an Ammoniumsulfat verwendet wurden. Die Menge des gewonnenen Albumins wurde auf der Basis des UV-Absorptionsverfahrens gemessen, und die Reinheit des Albumins wurde nach dem elektrophoretischen Verfahren mit einer Celluloseacetatmembran gemessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Konzentration an Natriumsulfat (% w/v) Reinheit des Albumins in dem Überstand (%) Ausbeute (%)

Versuchsbeispiel 5

Der Einfluß der Hitzebehandlungszeiten wurde untersucht. Das Vorgehen in Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß unterschiedlich lang erhitzt wurde. Die Menge des gewonnenender Albumins wurde nach dem Verfahren der Einzel-Radial-Immundiffusion gemessen, und die Reinheit des Albumins wurde nach dem elektrophoretischen Verfahren mit einer Celluloseacetatmembran gemessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Erhitzungszeit (min) Reinheit des erhaltenen Albumins (%) Ausbeute (%)

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der Reinheit von in einer Albumin und anderes Plasmaproteinmaterial enthaltenden Lösung vorhandenem Albumin, umfassend die Zugabe eines Albuminstabilisators und eines Präzipitierungsmittels für das andere Plasmaprotein zu der Lösung, Erhitzen der Lösung bis zu einer Temperatur, die zur Denaturierung und Präzipitierung des anderen Plasmaproteinmaterials ausreicht, und das Abtrennen des Präzipitats von der Albumin enthaltenden Lösung, wobei das Verfahren unter Verwendung der nachstehenden Bedingungen, in Kombination, durchgeführt wird:

i) vor der Zugabe des Albuminstabilisators und des Präzipitierungsmittels weist die Albumin und anderes Plasmaproteinmaterial enthaltende Lösung eine Proteinkonzentration von 0,5 bis einschließlich 3 % w/v auf,

ii) der Albuminstabilisator ist eine organische Carbonsäure mit drei bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen oder ein physiologisch verträgliches Salz davon und in einer Menge von 3 bis einschließlich 10 mM vorhanden,

iii) das Präzipitierungsmittel ist Ammoniumsulfat und ist in einer Endkonzentration von 1 bis einschließlich 10 % w/v vorhanden, und

iv) das Erhitzen wird 15 bis einschließlich 60 Minuten bei einem pH-Wert von 4,5 bis einschließlich 5,5 und einer Temperatur von 65 bis einschließlich 70ºC durchgeführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Albumin und anderes Plasmaprotein enthaltende Lösung α- und/oder ß-Globulin enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Albumin und anderes Plasmaprotein enthaltende Lösung von Cohn's Fraktion IV, IV-1, IV-4 oder deren Äquivalenten abstammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Albumin und anderes Plasmaprotein enthaltende Lösung eine Lösung ist, aus der ein nützliches Plasmaprotein gewonnen worden ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Erhitzen bei einem pH-Wert von 4,9 bis 5,4 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Menge der verwendeten organischen Carbonsäure 3 bis 5 mM ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Erhitzen bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,3 durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Erhitzen bei einer Temperatur von etwa 68ºC durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Erhitzen etwa 30 Minuten durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Trennen der Albuminlösung bei einer Temperatur von 10 bis 20ºC durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die abgetrennte Albuminlösung ferner einer Reinigung unterworfen wird.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die abgetrennte Albuminlösung einer Virus-inaktivierenden Hitzebehandlung unterworfen wird.