TECHNISCHES GEBIET
-
Die Erfindung betrifft die Diagnose van Lyme-Borreliose
durch den Nachweis von mit dieser Krankheit assoziierten
Organismen.
STAND DER TECHNIK
-
Lyme-Barreliose ist eine van Zecken übertragene, systemische
Krankheit, über die in den Vereinigten Staaten van Amerika
erstmals zu Anfang der Siebziger Jahre dieses Jahrhunderts berichtet
wurde und die gekennzeichnet ist durch eine deutliche
Hautläsian, Erythema chronicum migrans (ECM), die häufig von
Kopfschmerzen, Steifheit, Fieber, Gelenkschmerzen, Unwohlsein und
Müdigkeit begleitet ist. Wenn die Krankheit nicht behandelt
wird, können in ihrer Folge neurologische, kardiologische und
arthritische Komplikationen auftreten.
-
Man nimmt an, daß das für Lyme-Borreliose etiologisch
verantwortliche Agens ein Spirochäten-Bakterium ist, das erstmals
1982 von Zecken (Ixodes dammini) isoliert wurde. Inzwischen wird
die Spirachäte als Borrelia burgdorferi bezeichnet. Es wurden
verschiedene Unterarten und Stämme dieses Organismus
identifiziert, doch ist die Beziehung zwischen ihnen noch nicht
eindeutig bestimmt worden.
-
Zwar ist der Hauptvektar für die Krankheit anscheinend die
vorgenannte Zecke, doch hat Bosler berichtet, daß B. burgdorferi
durch Dunkelfeldmikroskopie nachgewiesen und im Urin des
Nagetiers Peromyscus leucopus kultiviert worden ist. Bosler hat
angedeutet, daß Urin ein Träger für die zeckenfreie Übertragung
der Krankheit sein könnte (S. 12, Second International Symposium
on Lyme Disease and Related Disorders, Compendium of Abstracts,
Hygieneinstitut der Universität Wien, 1985, nachstehend als
"Symposium 1985" bezeichnet). Auf S. 13 des Symposiums 1985 hat
Burges angedeutet, daß in einer Versuchsanordnung ein Kontakt
zwischen Hunden zu einer Infektion führen kann.
-
In der Wissenschaft wird weiter daran gearbeitet,
verschiedene von der Krankheit gewonnene Isolate mit dem Ziel zu
untersuchen, verschiedene Stämme von B. burgdorferi zu identifizieren
und eine Beziehung ihrer Unterschiede mit den verschiedenen in
der ganzen Welt festgestellten klinischen Manifestationen der
Krankheit festzustellen.
-
Zu diesen Arbeiten gehört häufig die Charakterisierung der
verschiedenen Hauptproteinbestandteile von B. burgdorferi durch
Verwendung von monoklonalen Antikörpern; siehe z.B. Barbour et
al., J. Inf. Dis. 153: 478 - 484 (1985); Barbour (Symposium
1985, S. 24); und Wilske (Symposium 1985, S. 25).
-
Die Diagnose der Lyme-Borreliose beruht gewöhnlich auf den
Ergebnissen von serologischen und/oder klinischen
Untersuchungen. Die serologischen Untersuchungen umfassen allgemein Test
auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen B. burgdorferi in den
Seren von Patienten, bei denen diese Krankheit vermutet wird;
siehe z.B. Wilkinson, S. 117-122, Lyme Disease, First
International Symposium, The Yale J. Biol. Med., 1984 (nachstehend als
"Symposium 1984" bezeichnet).
-
Die klinische Beurteilung von Lyme-Borreliose ist derzeit
die üblichere Art des Diagnostizierens der Krankheit und wird
meistens durch Entdecken einer Vorgeschichte von ECM und anderer
mit der Krankheit assoziierter Symptome durchgeführt.
Fehldiagnosen der Krankheit sind im Hinblick auf die große Ähnlichkeit
von Lyme-Borreliose mit anderen Krankheiten und auf Grund
anderer Faktoren, z.B. der späten, subklinischen oder variablen
Äußerung von Symptomen, ein Problem.
-
Es besteht ein Bedarf an einem zuverlässigen, schnellen,
billigen und nicht-invasiven Verfahren für die Diagnose von
Lyme-Borreliose. Bei der Diagnose und der behandlung von Lyme-
Borreliose kann es häufig vorkommen, daß selbst ein
zuverlässiger Test mit einem nur geringen Anteil von falschen positiven
Befunden an sich schon sehr wertvoll wäre, insbesondere zusammen
mit anderen Tests, die zum Ausscheiden der falschen positiven
Befunde verwendet werden könnten, oder mit klinischen
Entdeckungen zum Identifizieren der echten positiven Befunde.
-
In der Forschung wurde versucht, das Vorhandensein der
Krankheit mit der Identifikation von B. burgdorferi in
verschiedenen Körpergeweben oder -flüssigkeiten zu korrelieren, z.B.
durch histologische und/oder Kulturbewertung von Proben.
Derartige Bewertungen können beispielsweise mikroskopisch
durchgeführt werden oder durch Gewinnung, z.B. Isolieren und
Kultivieren, des Organismus aus Geweben oder Flüssigkeiten.
-
B. burgdorferi wurde aus dem Blut, der Haut und der
Zerebrospinalflüssigkeit von an Lyme-Borreliose leidenden Patienten
isoliert und gezüchtet; siehe z.B. Steere et al., New England
J.Med. 308:733-740 (1983), und Steere et al., Symposium 1984, S.
107-110. Das Isolieren und Kultivieren von B. burgdorferi ist
jedoch eine schwierige, zeitraubende und problematische Aufgabe;
siehe z.B. A.G. Barbour, Symposium 1984, S. 71-75. Daß es sich
bei den gewonnenen Organismen um B. burgdorferi handelt, wurde
von Steere et al. (1983) durch deren Reaktivität mit einem
monoklonalen Antikörper verifiziert, der gegen das ursprüngliche
Isolat des für Lyme-Borreliose verantwortlichen Organismus
erzeugt worden war.
-
Gemäß beiden Veröffentlichungen von Steere et al. ist es bei
den Forschungsarbeiten nicht gelungen, B.
burgdorferi-Spirochäten aus aus Lymphknoten abgesaugten Flüssigkeiten oder aus dem
Urin von an Lyme-Borreliose leidenden Patienten zu isolieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Nachweisen eines
Antigens eines mit Lyme-Borreliose assoziierten Organismus in einer
Person vor, mit dem nicht nur die An- oder Abwesenheit eines
solchen Antigens, sondern auch die Art oder der Stamm des das
Antigen erzeugenden Organismus festgestellt werden kann. Die
Anmelder haben überraschenderweise gefunden, daß der Urin von
infizierten Personen Antigene derartiger Organismen enthält und
daß diese Antigene im Verlauf der Lyme-Borreliose so früh
entdeckt werden können, daß die Krankheit wirksam behandelt werden
kann, d.h. ehe es zu den vorgenannten Komplikationen kommt.
-
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Nachweisen der
Anwesenheit eines Antigens van Borrelia burgdorferi assoziiert mit
Lyme-Borreliose vor, das die folgenden Schritte umfaßt:
-
a) das Kombinieren einer Probe menschlichen Urins oder einer
Fraktion desselben mit Antikörpern, die für mindestens ein
Antigen von Borrelia burgdorferi spezifisch sind, wobei sich
jedes der im Urin enthaltenen Antigene an die Antikörper
unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes anlagert;
und
b) das Nachweisen der Anwesenheit des Komplexes.
-
Gewöhnlich wird die Anwesenheit des Komplexes mit der
Anwesenheit des Komplexes im von anderen Personen stammenden Urin,
die vom genannten Organismus frei sind, oder mit anderen
Standards
oder Kontrollen verglichen.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht ein zuverlässiges,
schnelles, kostengünstiges und nicht-invasives Verfahren zum
Nachweisen derartiger Antigene auf eine Weise vor, die die
genaue Anpassung und Überwachung eines wirksamen Therapiesystems
ermöglichen kann.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
-
Die Anwesenheit oder die Menge mindestens eines Antigens
eines mit Lyme-Borreliose assoziierten Organismus wird im Urin
nachgewiesen. Gewöhnlich kann erforderlichenfalls die
Anwesenheit oder die Menge des nachgewiesenen Antigens mit der
Anwesenheit oder der Menge des Antigens in einer Urinprobe einer von
Lyme-Borreliose freien Person verglichen werden. Das Antigen
kann von anderen Substanzen frei sein, und es kann ein Fragment
eines größeren Moleküls oder Antigens sein oder kann mit anderen
Antigenen oder Strukturen assoziiert sein einschließlich
intakter lebensfähiger Zellen.
-
Vorzugsweise ist das Antigen ein solches, das von der
Lipopolysaccharid-Komponente ("LPS") der Zellenwand des Organismus
vorgesehen wird, wie z.B. von Beck et al. in J.Inf.Dis. 152:108-
117 (1985), beschrieben, oder das von einer der
Hauptproteinklassen der Zellmembran des Organismus vorgesehen wird, z.B.
zelluläre Proteine von B. burgdorferi mit scheinbaren
Molekulargewichten von 31 000 ("31k") oder 34 000 ("34k") auch unter den
Bezeichnungen "OspA" bzw. "OspB" bekannt, wird durch
Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt und von Barbour et al. in J.Inf.
Dis. 153:478-484 (1985), und den dort angegebenen
Veröffentlichungen beschrieben. Auf beide Vorveröffentlichungen von Beck et
al. und Barbour (1985) wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
-
Das Antigen kann für einen Stamm, eine Unterart oder Art der
mit Lyme-Borreliose assoziierten Organismen spezifisch sein oder
kann für gewünschte Gruppen van Stämmen, Unterarten oder Arten
spezifisch sein. Notwendig ist nur, daß das nachgewiesene
Antigen van einem Organismus stammt, der mit Lyme-Borreliose
assoziiert ist, d.h., daß die Anwesenheit des Antigens diagnostische
Relevanz über die Anwesenheit, das Stadium oder den Verlauf der
Lyme-Borreliose liefert. Derzeit wird angenommen, daß derartige
Organismen jene sind, die als B. burgdorferi klassifiziert
werden und
daß diese Art tatsächlich Lyme-Borreliose verursacht.
-
In einer bevorzugten Ausführungsfarm der Erfindung wird ein
Antigen nachgewiesen, das allen oder den meisten Mitgliedern der
Art B. burgdorferi gemeinsam ist. In diesem Fall kann der
Nachweis eines einzigen Antigens als umfassender Test auf die
Anwesenheit dieser Art dienen. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform werden ein oder mehrere Antigene z.B. durch eine
Gruppe von Antikörpern derart nachgewiesen, daß eine Unterscheidung
zwischen Mitgliedern der Art B. burgdorferi möglich ist, und
insgesamt die Anwesenheit aller Mitglieder dieser Art
nachgewiesen werden kann.
-
Man kann zwar jeden Rezeptor verwenden, der für die
interessierende antigene Stelle spezifisch ist, doch ist in den
meisten Fällen der Rezeptor ein polyklonaler oder monoklonaler
Antikörper, und es kann zwar jedes beliebige Immunoglobulin
verwendet werden, doch wird meistens IgG verwendet. Ähnlich kann
man sowohl vollständige Antikörper als auch Fragmente derselben
verwenden. Man kann einzelne monoklonale Antikörper oder
Gemische von Antikörpern verwenden, einschließlich Gemischen von
monoklonalen Antikörpern oder Gemischen von polyklonalen
Antikörpern. Die Anzahl und die Art der verwendeten Antikörper sind von
der antigenen Stelle und von der Anzahl der verschiedenen
Antigene abhängig, die nachgewiesen werden sollen. Die
Antikörperzusammensetzung ist typischerweise frei von nicht-spezifischen
Antikörpern, d.h. von Antikörpern, die für andere als die
gewünschten Antigene spezifisch sind.
-
Zum Nachweisen der Antigene kann man Antikörper gegen die
intakte Zelle, Zellmembran oder Antigene erzeugen, die von
Interesse sind, und dann Antikörper gegen eine Anzahl von
verschiedenen Zellen oder zellulären Antigenen sieben. Insbesondere
kann man zum Sieben der Antikörper diese mit Antigenen von
verschiedenen Zellen vereinigen, die sich von den interessierenden
Zellen unterscheiden, insbesondere wenn die Antigene an einen
Träger gebunden sind, wodurch eine leichte Trennung zwischen
Antikörpern, die sich nicht binden, und Antikörpern, die sich
binden, ermöglicht ist. Zum weiteren Reinigen kann man die
Antikörper dann mit den an einen Träger gebundenen Antigenen, die
von Interesse sind, vereinigen und die Antikörper dann mit Hilfe
verschiedener Lösungen freisetzen, z.B. Natriumisocyanat oder
Essigsäure bei einer Konzentration, die ausreichend ist, den
Antigen-Antikörper-Komplex aufzuspalten, und die Gewinnung des
Antikörpers zu ermöglichen.
-
Antikörper gegen Antigene von B. burgdorferi, einschließlich
monoklonaler Antikörper, können nach bekannten Verfahren erzeugt
werden, wie in den hier angegebenen Beispielen sowie z.B. von
Barbour et al., Infect.Immun. 41:795-804 (1983); auf welche
Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben.
-
Die spezielle Methode, nach der die Anwesenheit von B.
burgdorferi-Antigenen nachgewiesen wird, ist in dieser Erfindung
nicht signifikant, sofern sie den gewünschten Grad an
Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit hat. Es gibt eine Reihe von
verschiedenen Tests mit verschiedenen Anwendungsvorschriften und
Markierungsstoffen. Die allgemein verfügbaren Tests zum
Nachweisen spezifischer Determinantenstellen sind meistens kompetitive
Proteinbindungstests oder Immunoassays, in welchen Antikörper
oder Fragmente hievon verwendet werden. Beispiele der
verschiedenen Tests sind in den US-Patenten 3 654 090, 3 817 837,
4 233 402, 4 275 149 und 4 584 268 beschrieben.
-
Angesichts der Vielzahl von Anwendungsvorschriften werden
die spezifischen Anwendungsvorschriften hier nicht beschrieben.
Gemeinsam ist den Tests die Bildung einer Reagenslösung, die
einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen enthält.
Außer der markierten Komponente enthält die Reagenslösung
weitere Additive, wie Puffer, z.B. Phosphat, Tris, Barbital oder
dgl., normalerweise in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,01
bis 10 mM, welche Konzentration zum Aufrechterhalten des pH-
Wertes im Bereich von etwa 6 bis 9, üblicher 7 bis 8, während
des Tests ausreichend ist. Andere Additive sind
Konservierungsmittel, z.B. Natriumazid, inertes Protein, z.B. Serumalbumin,
Natriumchlorid, Detergentien oder dgl., die zum Konservieren der
markierten Komponente, zur Erhöhung der Bildung des Antigen-
Antikörper-Komplexes, der Verhinderung nicht-spezifischer
Bindung oder unmarkierter Komponente usw. beitragen.
-
Eine geeignete Methode zum Nachweisen van Antigenen gemäß
dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt die Elektrophorese der
Urinprobe z.B. auf einem SDS-Polyacrylamidgel nach bekannten
Verfahren, z.B. dem Verfahren van Laemmli, Nature, 227:680-685
(1970). Die abgetrennten Fraktionen können unter Anwendung
bekannter Verfahren, wie jenes von Towbin et al., Proc.Nat.Acad.
Sci. 76, 4350-4354 (1979), Transblotting auf Nitrozellulose
unterzogen werden. Die Nitrozelluloseblots werden dann mit einem
ausgewählten monoklonalen Antikörper getestet. Die
Antigen-Antikörper-Komplexe werden unter Verwendung von mit alkalischer
Phosphatase konjugierten Antimaus-Antikörpern nachgewiesen, die
mit einem Nitroblau-tetrazolium/5-Brom-4-chlorindolylphosphat-
Substrat reagieren. Die die Anwesenheit des B.
burgdorferi-Antigens im Blot anzeigende Farbveränderung wird leicht erkannt und
durch Immunoreaktivität und Molekulargewicht bestätigt. Auf die
Veröffentlichungen von Laemmli und Towbin et al. wird hier
ausdrücklich Bezug genommen.
-
In einem bevorzugten Verfahren zum Nachweisen der
Anwesenheit van Antigenen im Urin wird ein enzymgekoppelter
Immunosorbens-Test (ELISA) verwendet, wie z.B. im US-Patent 4 016 043
beschrieben ist, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
ELISA ist ein Test, der gewöhnlich zum Nachweis sowohl von
zellulären Antigenen als auch von löslichen Antigenen verwendet
wird. Durch die Einverleibung monoklonaler Antikörper in einen
derartigen Test wird die Spezifität des Verfahrens erhöht. Die
Urinproben werden mit 5 bis 10 % SDS-Tris-Puffer verdünnt und in
Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen und
Nitrozellulosemembranen gegeben ("Millititer", Millipore Corp.) und
Pufferlösung wird zugesetzt. Zum Löslichmachen- der Bestandteile
des Urins und um ein Verstopfen z.B. von Nitrozellulosemembranen
zu verhindern, wird der Urin vor dem Verdünnen und Plattieren
vorzugsweise 5 bis 10 Minuten gekocht. Die Platten werden z.B.
mit 2 % Rinderserumalbumin in Puffer behandelt, um
nicht-spezifische Bindung des Antikörpers an die Wände zu verhindern, und
ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper wird als
verdünnte Pufferlösung, z.B. 2 % Rinderserumalbumin in 0,1 M Tris, pH
8,0, zugesetzt und inkubiert. Dann werden die Wände mit Puffer
gewaschen und ein an ein Enzym, wie alkalische Phosphatase,
konjugierter Anti-Mausantikörper zugesetzt und Vertiefungen werden
wieder inkubiert, z.B. bei Raumtemperatur, wie 20ºC.
Überschüssiger Antikörper wird durch Waschen mit Puffer entfernt und die
Platten werden mit einer Kombination von Enzymsubstrat und
Farbindikator bis zum Feststellen einer Farbveränderung entwickelt.
Für die Verwendung mit alkalischer Phosphatase stehen
verschiedene
Substrate zur Verfügung, z.B. solche, die Farbbildung oder
Erzeugung von Fluoreszenzlicht bewirken. Andere in diesem Test
verwendbare Enzyme sind z.B. Peroxidase und β-Galactosidase.
-
In manchen Fällen kann zum Feststellen des Vorhandenseins
van B. burgdorferi-Antigenen der Urin des Patienten untersucht
werden. In der ersten Diagnose, wenn vermutet wird, daß ein
Patient an Lyme-Borreliose leidet, kann man einfach den Urin auf
die Anwesenheit derartiger Antigene untersuchen. Diese
Untersuchung kann mit anderen Untersuchungen kombiniert werden, um die
statistische Sicherheit einer Diagnose von Lyme-Borreliose zu
erhöhen.
-
Der Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplex in einer Probe
von einer Person, bei der Lyme-Borreliase vermutet wird, wird
typischerweise mit der Anwesenheit oder der Menge des Komplexes
verglichen, die in einer ähnlichen Probe von einer Person, die
die Krankheit nicht hat, nachweisbar ist oder wäre, d.h. mit
einem Hintergrundwert des Komplexes verglichen. Für derartige
Vergleiche geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt und
schließen Paralleluntersuchungen von Proben von nicht erkrankten
Personen und/oder geeignete Verwendung anderer Standards,
Kontrollen und dgl. ein.
-
Urinproben, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren zu
positiven Befunden geführt hat, können erforderlichenfalls in der
vorstehend beschriebenen Weise mit klinischen oder serologischen
Befunden korreliert werden oder biochemisch und/oder
immunologisch weiter untersucht werden, um die Möglichkeit falscher
positiver Befunde auszuschließen. Zu den weiteren biologischen
und/oder immunologischen Untersuchungen gehören z.B.
Elektrophorese und Transblotting der erhaltenen Gele, wie hier
beschrieben.
-
Je nach der Spezifität des nachgewiesenen Antigens für
bestimmte Stämme von B. burgdorferi kann man die
Untersuchungsergebnisse dazu verwenden, ein auf den Einzelfall zugeschnittenes
Therapiesystem festzulegen, in dem Antibiotika verwendet werden.
Nach einer Behandlung von Lyme-Borreliose kann durch erneute
Urinanalyse die Anwesenheit von Rest-B.burgdorferi-Infektion
festgestellt werden.
-
Der Urin kann für die Untersuchung auf jede bekannte Weise,
die den Nachweis von B. burgdorferi-Antigenen nicht
beeinträchtigt,
erhalten und zubereitet werden. Vorzugsweise gewinnt man
den Urin nach einem üblichen "Reinauffang"-Verfahren. Man kann
den Urin auch nach jeder beliebigen Methode behandeln, die die
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht
beeinträchtigt, z.B. durch Fraktionieren, Extrahieren, Verdünnen,
Konzentrieren, Zentrifugieren, Filtrieren, Dialysieren, Puffern und
dgl.
-
Die markierten Antikörper werden gewöhnlich als
gefriergetrocknetes Pulver zusammen mit herkömmlichen Stabilisatoren und
anderen Additiven einschließlich Puffern, neutralen Salzen,
Füllstoffen, inerten Proteinen, Detergentien, z.B. einem nicht-
ionischen Detergens, und anderen Additiven, die mit der Natur
des Markierungsstoffes assoziiert sind, z.B. Substraten für das
Enzym, geliefert. Diese Additive sind in unterschiedlichen
Mengen vorhanden, wobei die Antikörper in einer Menge von etwa
0,005 bis 5 Gew.-%, Konservierungsstoffe in einer Menge von etwa
0,001 bis 1 Gew.-%, neutrales Salz in einer Menge von etwa 0 bis
15 Gew.-%, Protein in einer Menge van etwa 0 bis 10 Gew.%
vorhanden sind und der Rest aus Füllstoff besteht. Der markierte
Antikörper wird gewöhnlich zusammen mit verschiedenen
Exzipienten verwendet, die als Streckmittel dienen und die Handhabung
und Stabilisierung des markierten Antikörpers unterstützen
können.
-
Die markierten Antikörper werden gewöhnlich in einem
Materialsatz zusammen mit Kontrollen für das Erzeugen einer
Standardkurve geliefert. In den Kontrollen ist das Antigen gewöhnlich
mit geringeren Mengen von Additiven, wie inertem Protein, nicht-
ionischen Detergentien, wie Triton X-100, Puffer,
Konservierungsmitteln oder dgl., formuliert. Ferner sind darin
Füllstoffe, wie Mannit, enthalten. Die in geringerer Menge vorhandenen
Additive machen etwa 0,001 bis 2 Gew.-% aus. Das Antigen ist in
unterschiedlichen Mengen vorhanden, damit bei Lösen in einem
vorgeschriebenen Volumen die gewünschte Konzentration erzielt
wird.
BEISPIELE
-
Die folgenden Beispiele sollen diese Erfindung erläutern,
jedoch nicht beschränken.
Beispiel 1 : Erzeugung von monoklonalen Antikörpern
gegen B. burgdorferi
-
Fünf weibliche Balb/C-Mäuse (Charles River, Andover, MD)
wurden zweimal mit 10&sup7; Stamm B-31 B. burgdorferi
(ATCC-Hinterlegungs-Nr. 35210, Rockville, MD) intraperitoneal in einem
Zeitabstand von 14 Tagen immunisiert. Sechzehn Tage später wurden sie
einmal intravenös immunisiert und drei Tage später durch
Halsdislokation getötet. Die Milz wurde entfernt, und die
Milzleukozyten wurden mit dem NS-1 Mausmyelom in einem Verhältnis von
Leukozyten zu Myelomzellen von 4:1 gemischt. Das Zellengemisch
wurde zentrifugiert, und nach dem Absaugen der überstehenden
Flüssigkeit wurde 35 % Polyäthylenglykol ("PEG", Aldrich
Chemicals, Milwaukee, WI) zugesetzt. Danach wurden die Zellen 5
min bei 800 x g zentrifugiert und dann weitere 3 min
stehengelassen, bevor das PEG abgesaugt wurde. Danach wurde das
restliche PEG aus den Zellen herausgewaschen und die Zellen wurden
über Nacht in HEPES-gepuffertem Dulbecco's Modified Eagle's
Medium (Irvine Scientific, Santa Anna, CA) mit 10 %
Kalbfötusserum kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Zellen im gleichen
Medium, das mit Hypoxanthin, Thymin und Aminopterin ergänzt war
("HAT"-Medium, Sigma Chemical, St. Louis, MO), in
Mikrotiterplattenvertiefungen mit 7,5 x 10&sup5; Zellen/ml plattiert. Wenn in
einzelnen Vertiefungen Wachstum erkennbar war, wurden die Zellen
expandiert und der Überstand unter Verwendung eines
enzymgekoppelten Immunoassays auf Antikörper getestet.
-
Wie oben beschrieben hergestellte monoklonale Antikörper
wurden untersucht, um ihre Reaktivität mit verschiedenen B.
burgdorferi-Stämmen einschließlich neun von Menschen, zwei von
Tieren und eines von einer Zecke isolierter Stämme zu bestimmen.
-
Die getesteten Stämme wurden nach dem Verfahren von Laemmli,
U.K. Nature 227:680-685 (1970), Elektrophorese in
SDS-Polyacrylamidgelen unterworfen. Es wurden Duplikatgele verwendet, eines
für Anfärben mit Coomassie-Blau zum Nachweis von Gesamtproteinen
und eines für Transblotting auf Nitrozellulose nach dem
Verfahren von Towbin et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 76:4350-4354 (1979).
-
Die Nitrozelluloseblots wurden mit einem der zu bewertenden
monoklonalen Antikörper sondiert. Die
Antigen-Antikörper-Komplexe auf Nitrozellulose wurden unter Verwendung von mit
alkalischer Phosphatase konjugierten Antimaus-Antikörpern
nachgewiesen,
die mit einem Nitroblau-tetrazolium
(NBT)/5-Brom-4-chlorindolylphosphat-Substrat reagierten.
-
Drei monoklonale Antikörper, von denen gefunden wurde, daß
sie mit jedem der neun untersuchten B. burgdorferi-Stämme
Antigen-Antikörper-Komplexe bildeten, wurden im Hinblick auf die
Tatsache ausgewählt, daß festgestellt wurde, daß sich ein
monoklonaler Antikörper an das 31k (OspA)-Protein, einer an das 34k
(OspB)-Protein und einer an die Lipopolysaccharidbande jedes der
neun Stämme gebunden hatte. Die Identität der
Lipopolysaccharidbande des Elektrophoresegels wurde durch Ex-traktion von LPS
nach dem Verfahren von Beck et al., J.Inf.Dis. 152:108-117
(1985), bestätigt. Bei American Type Culture Collection,
Rockville, MD, wurde eine Hybridomzellinie hinterlegt, die einen
monoklonalen Antikörper erzeugt, der das 34k-Protein bindet, und
erhielt die ATCC-Hinterlegungs-Nr. HB9126.
Beispiel 2 : Nachweis von B. burgdorferi in mit dem
Organismus versetztem Urin - Empfindlichkeit des monoklonalen
Antikörpertests
-
Gefrorene B. Burgdorferi-Zellen (0,1 ml) in physiologischer
Kochsalzlösung (10¹&sup0;/ml) wurden in einer durch Reinauffangen
eines Mittelstroms gewonnenen menschlichen Urinprobe (1,0 ml)
resuspendiert. Zum Lösen der Organismen und Solubilisierung
ihrer Bestandteile wurden 100 ul 5 % Natriumdodecylsulfat ("SDS")
in Tris-Puffer (pH 8,3) zugesetzt. Dann wurde mit zusätzlichem
Urin oder mit 20 % Methanol in Tris-Puffer, pH 8,3, die
Bakterienkonzentration auf 10&sup8;/ml eingestellt. Aufeinanderfolgende 10-
Fachverdünnungen der Bakterienlysate in Urin oder Tris-Methanol
von 10&sup7; auf 10³ Organismen/ml wurden hergestellt und 100
ul-Proben wurden in dreifache Vertiefungen von "Millititer"-Platten
(Millipore Corp., Bedford, MA) mit 96 Vertiefungen gegeben. Die
Proben wurden durch Vakuum durchgezogen und die restlichen
Stellen mit 2 % Rinderserumalbumin ("BSA") in Tris-Puffer blockiert.
Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit phosphatgepufferten
Kochsalzlösungen Tween 20 (0,5 %) (PBS-Tween 20) (3 x 250 ul)
gewaschen und in jede Vertiefung wurden 100 ul verdünnter
monoklonaler Antikörper gegeben. Nach einstündigem Inkubieren wurden
die Antikörper entfernt und das nicht-gebundene Material durch
drei weitere Wäschen mit PBS-Tween 20 entfernt. In jede
Vertiefung
wurden 100 ul mit Peroxidase markiertes Antimaus-IgG
gegeben, eine weitere Stunde inkubiert und nicht-gebundenes Material
durch drei zusätzliche Wäschen mit PBS-Tween 20 entfernt. In
jede Vertiefung wurde Enzymsubstratlösung (100 ul) gegeben, 5
min später gefolgt von 50 ul 2,5 M H&sub2;SO&sub4;) und dann für jede
Vertiefung die optische Dichte bei 490 nm bestimmt.
-
Aus den in der Tabelle 1 angegebenen Ergebnissen geht
deutlich hervor, daß B. burgdorferi-Antigene im Urin durch
monoklonale Antikörper gegen die zellulären 31k- und 34k-Proteine
nachweisbar sind und daß sie mit zusätzlichem Urin oder Puffer
verdünnt werden können, was anzeigt, daß die Bindung des
Antikörpers nicht von nicht-spezifischer Natur ist. Unter den dabei
angewandten speziellen Bedingungen war die Empfindlichkeit in mit
Puffer verdünnten Proben etwas besser als bei den mit
Tris-Methanol verdünnten Proben, was anzeigt, daß vielleicht in
ersterem Fall das Antigen effektiver an die Nitrozellulosemembran
gebunden wird.
TABELLE 1
O.D. bei 490 nm
31k-Protein
34k-Protein
log Bakterien/ml
Urin
Tris-MeoH
Beispiel 3 : Versetzter menschlicher Urin
-
Urinproben von 10 normalen Spendern und Urin von einem
Nierentransplantationspatienten bzw. von einem SLE-Patienten mit
akuter Nierenentzündung am Höhepunkt wurden vor und nach
Versetzen mit 10&sup7; Organismen unter Verwendung des ELISA-Tests und
eines wie in Beispiel 1 erzeugten monoklonalen Antikörpers gegen
das 31k-Protein getestet. Die Proben wurden 1:10 in 250 mM Tris,
pH 8,4, 20 % Methanol, verdünnt und in Vertiefungen einer
"Millititer"-Platte gegeben. Die Vertiefungen wurden einmal mit
PBS-Tween 20 gewaschen und dann mit 400 ul pro Vertiefung 2 %
Rinderserumalbumin in 0,1 M Tris, pH 8,0, behandelt, um nicht-
spezifische Bindung des Antikörpers an die Vertiefungen zu
verhindern,
Die Vertiefungen wurden zweimal mit PBS-Tween 20
gewaschen und 50 ul monoklonaler Antikörper (in PBS-Tween 20 1:2000
verdünnt) wurden zugesetzt und 30 min bei Raumtemperatur
inkubieren gelassen. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS-
Tween 20 gewaschen. In jede Vertiefung wurden 50 ul an
alkalische Phosphatase konjugierter zweiter Antimaus-Antikörper (von
Kirkegaard and Peery Laboratories, Gaithersburg, MD, erhältlich)
gegeben (verdünnt 1:1000) und weitere 30 min inkubieren
gelassen. Durch Waschen mit PBS-Tween 20 wie oben wurde der
überschüssige zweite Antikörper entfernt und die Platten wurden mit
einem Substrat für alkalische Phosphatase/Indikator (Kirkegaard
and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) entwickelt, bis eine
Farbveränderung festgestellt wurde. Bei einem positiven Befund
entwickelte sich nach etwa 20 min eine dunkle Purpurfarbe.
-
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß in jeder der
versetzten Proben B. burgdorferi festgestellt werden konnte und daß
es im Test durch die 12 Proben von menschlichem Urin,
einschließlich der zwei Proben von Patienten mit geschwächter
Nierenfunktion, keine Beeinträchtigung gab.
TABELLE 2
O.D. bei 490 nm
Probe
versetzt
nativ
Normal
Transplantationspatient
SLE-Patient
Beispiel 4 : Nachweis von B. burgdorferi im Urin von
Personen mit unbekanntem Gesundheitszustand
-
Acht Urinproben von Personen mit unbekanntem
Gesundheitszustand wurden wie in Beispiel 3 untersucht.
-
Bei fünf der getesteten Urinproben wurden Antigene von B.
burgdorferi festgestellt. An jede der fünf Proben wurde ein
Bestätigungstest unter Anwendung der Western-Blotting-Technik
durchgeführt, d.h. durch Elektrophorese der Proben, gefolgt von
Transblotting gemäß dem oben beschriebenen Verfahren.
-
Das Sondieren der Blots mit dem monoklonalen Antikörper
zeigte, daß nur in zwei der fünf Proben Antigene von B.
burgdorferi vorhanden waren. Die positiven ELISA-Testergebnisse
für die drei anderen Proben waren wahrscheinlich auf
physikalische Einwirkung zurückzuführen, die durch ein Verlegen der Poren
der Nitrozellulosemembran verursacht war.
-
Inzwischen ist erkannt worden, daß eine derartige Störung
oft vermieden werden kann, z.B. indem die Urinprobe vor dem
ELISA-Test 10 min bei 100ºC gekocht wird, um die Komponenten des
Urins gründlicher zu solubilisieren.
-
Es wurde bestätigt, daß die beiden Proben, in denen positive
Ergebnisse auf B. burgdorferi-Antigene festgestellt wurden, von
Patienten mit der klinisch diagnostizierter Lyme-Borreliose
stammten. Einer der Patienten hatte keinen serologischen
Antikörpertiter gegen B. burgdorferi, zeigte aber die mit der
Krankheit assoziierte ECM-Hautläsion. Bei dem anderen Patienten war
diese Läsion nicht vorhanden, doch ergab die serologische
Untersuchung einen hohen Antikörpertiter. Die sechs Patienten, die
die anderen Proben lieferten, litten tatsächlich nicht an
Lyme-Borreliose.