DE68922243T2

DE68922243T2 - Immuntest für HIV-1-Antigene unter Benutzung von F(AB')2-Fragmenten als Sonde.

Info

Publication number: DE68922243T2
Application number: DE68922243T
Authority: DE
Inventors: Susan K Ketchum; James Lawrence Stewart; Robert J Stumpf
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-05-03
Publication date: 1995-10-26
Anticipated expiration: 2009-05-04
Also published as: EP0345462A2; JPH0232261A; DE68922243D1; EP0345462B1; ES2074062T3; US4983529A; EP0345462A3; JP2905218B2; CA1340109C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) in Serum, Plasma oder in anderen Körperflüssigkeiten. Insbesondere beschreibt diese Erfindung diagnostische Assays, welche F(ab')&sub2;-Fragmente als Sonde zum Nachweis von HIV-1-Antigenen verwenden.
Es wird angenommen, daß HIV-1 das verursachende Agens des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) ist [Chamberland et al., Ann. Int. Med. (1984) 101:617-623; Seligman et al., New Eng. J. Med. (1984) 311:1286-1292]. Der Virus wurde von Patienten mit AIDS und mit AIDS-verwandtem Komplex (ARC), wie auch von gesunden Personen aus AIDS-Hochrisikogruppen (Gallo et al., Science (1984) 244:500-502) isoliert.
Für die vorliegende Erfindung als Hintergrund von Interesse ist die Schrift DE-C-3 603 085, die die Verwendung von Tracer-gebundenem Antigen zur Verwendung beim Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern offenbart, wobei der Tracer ein markiertes F(ab')&sub2;-Fragment ist, das gegen das Antigen spezifisch ist. Explizit offenbarte Antigene sind Viren vom HTLV-III-Typus.
J.R. Higgins et al., Journal of Clinical Microbiology, Bd. 24, Nr. 3, September 1986, S. 424-430, offenbaren in "Detection and Differentiation by Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay of Human T-Cell Lymphotropic Virus Type III/Lymphadenopathy-Associated Virus- and Acquired Immunodeficiency Syndrome-Associated Retroviruslike Clinical Isolates", Antigen-Einfang-Sandwich-ELISAS, die die Kernproteine des humanen AIDS-Virus in Zellkulturüberständen unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Epitope von p24 verwenden. Von der Empfindlichkeit wird berichtet, daß sie im Nanogrammbereich liegt.
Seit Dezember1986 waren Enzym-Immunoassays, z.B. das Abbott-HIV-1-Antigenassay (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) zu Forschungszwecken zum Nachweis von HIV-1-Antigenen im Handel erhältlich. Diese Tests sind hoch empfindlich und stellen eine direkte Anzeige für die Anwesenheit des Virus zur Verfügung. Demzufolge kann der Nachweis von HIV-1-Antigenen als Hilfe bei der Diagnose und zur Beobachtung der HIV-1-Infektion von Nutzen sein (Pedersen et al., Brit. Med. J. (1987) 295:567- 569; De Wolf et al., Brit. Med. J. (1987) 295:569-572).
Die Empfindlichkeiten der geläufigen HIV-1-Antigenassays sind sehr gut, die Spezifität schwankt jedoch breit. Bei allen Herstellern scheinen Proben aufzutreten, die nicht-spezifisch mit Assaykomponenten reagieren, was zu Fehlreaktivitäten führt. Aus diesem Grund liefert Abbott ein Bestätigungsverfahren, das die Neutralisierung von HIV-1-Antigen in der Probe vor der Durchführung des Assays umfaßt. Obwohl dies die Spezifität auf fast 100% steigert, rechtfertigen die mit dem zusätzlichen Test verbundenen Kosten die Anstrengungen zur Erhöhung der Voraussagekraft von Antigentests. Die hier beschriebene Erfindung liefert ein Verfahren zur wesentlichen Erhöhung der Spezifität, wobei ebenfalls die Assayempfindlichkeit und der Zeitbedarf verbessert werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG.

Zum Nachweis von HIV-1-Antigenen in Plasma, Serum, Gewebekultur und anderen biologischen Flüssigkeiten wird beim diagnostischen Assay der vorliegenden Erfindung eine Sonde verwendet. Diese Sonde ist ein chemisch veränderter Antikörper. Die Veränderung umfaßt die enzymatische Spaltung der Antikörper gegen HIV-1 unter Bildung von F(ab')&sub2;-Fragmenten.
Es werden hochspezifische diagnostische Assays zum Nachweis von HIV-1-Antigenen unter Verwendung einer F(ab')&sub2;-Sonde von der Erfindung zur Verfügung gestellt. Ein Assay der vorliegenden Erfindung kann HIV-1-Antigen mit größerer als zuvor bekannter Spezifität und Empfindlichkeit nachweisen, wenn es zusammen mit markierten F(ab')&sub2;-Fragmenten verwendet wird, die für die oben beschriebene F(ab')&sub2;-Sonde spezifisch sind. Die Immunoassays der Erfindung umfassen:
1) das Beschichten eines festen Trägers mit Anti-HIV-1- Antikörper;
2) das in-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer biologischen Probe;
3) das in-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer Sonde, die Anti-HIV-1-F(ab')&sub2;-Fragmente von einer anderen Tierart als der in Schritt 1 verwendeten umfaßt;
4) das in-Kontakt-Bringen des festenTrägers mit F(ab')&sub2;-Fragmenten, die für die Sonde, die in Schritt 3 verwendet wird, spezifisch sind, und die an eine Markierung konjugiert sind; und
5) den Nachweis der Markierung als Maß für die Anwesenheit von HIV-1-Antigen in der Probe.
Bei einem besonders bevorzugten Assay der Erfindung werden monoklonale Antikörper, vorzugsweise die mit 31-42-19 und 31-90-25 bezeichneten, auf den festen Träger aufgezogen, um HIV- 1-p24-Antigene spezifisch einzufangen.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG.

Die vorliegende Erfindung liefert eine verbesserte Vorrichtung zum Nachweis von HIV-1-Antigenen. Die Verwendung von F(ab')&sub2;-Fragmenten als Sonde in einem Immunoassay zum Nachweis von HIV-1-Antigenen erhöht die Assayspezifität, wobei sie gleichzeitig die Assayempfindlichkeit steigert. Z.B. kann diese Sonde vorteilhafterweise verwendet werden, um das Immunoassay zu verbessern, das im US-Patent Nr. 4 748 110, veröffentlicht am 31. Mai 1988, offenbart ist.
Alternativ dazu kann jegliches Antigen-bindende Fragment, wie etwa Fab-Monomere, die durch die Spaltung von Anti-HIV-1- Antikörpern mit dem Enzym Papain erzeugt worden sind, als Sonde bei den erfindungsgemäßen Assays eingesetzt werden.
Zusätzlich zur Verwendung von Anti-HIV-1-F(ab')&sub2;- Fragmenten als Sonde werden F(ab')&sub2;-Fragmente, die für die Sonde spezifisch sind, markiert und zur Messung der Menge von HIV-1- Antigen das in der Probe vorhanden ist, verwendet. Jede Markierung, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals fähig ist, kann bei den Assays der Erfindung verwendet werden. Vertreter für Markierungen umfassen Enzyme, Radioisotope und fluoreszente und chemilumineszente Markierungen. Darüber hinaus können Hapten/markiertes Antihapten-Systeme, wie ein Biotin/markiertes Antibiotin-System bei den erfinderischen Assays eingesetzt werden.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind als Reagenzien zum Einfangen von HIV-1-Antigen auf dem festen Träger, der bei einem Assay der Erfindung verwendet wird, nützlich. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden monoklonale Antikörper von Mäusen gegen HIV-1- p24 zum spezifischen Einfangen des HIV-1-p24-Antigens verwendet, die mit 31-42-19 und 31-90-25 bezeichnet sind, und die in der US-Anmeldung mit dem Titel "Mouse Monoclonal Antibodies to HIV 1 p24 und Their Use in Diagnostic Tests) offenbart sind, angemeldet von S. Metha et al. in Konkurrenz zur vorliegenden Anmeldung und hinterlegt bei ATCC, Rockville, Maryland unter den Hinterlegungsnummern H89726 bzw. H89725.
Die biologischen Proben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht getestet werden können, umfassen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit und Lymphocyt- oder Zellkulturüberstände. Die festen Träger, die bei den Immunoassays der Erfindung verwendet werden können, umfassen Vertiefungen von Reaktionsträgern, Reagenzgläser, Polystyrolperlen, Streifen, Membranen, Mikropartikel und andere feste Matrizen, die dem Fachmann bekannt sind.
Zusätzlich sind die Reagenzien für die Assays der Erfindung ideal für die Herstellung eines Kits geeignet. Ein solches Kit kann eine Trägervorrichtung umfassen, die aufgeteilt ist, um in enger Nachbarschaft ein oder mehrere Behältervorrichtungen wie Ampullen, Flaschen Reagenzgläser und ähnliche aufzunehmen. Jede der Behältervorrichtungen umfaßt eines der getrennten Elemente, die bei dem Assay verwendet werden.
Geläufige Immunoassays zum Nachweis von HIV-1 haben eine eingeschränkte Spezifität insofern, als daß sie routinemäßig Proben als reaktiv oder positiv nachweisen, die keine HIV-1- Antigene aufweisen. Diese falschen Positiven werden zum großen Teil von nicht-spezifischen Reaktionen der verwendeten Antikörpern mit interferierenden Substanzen (z.B. rheumatoiden Faktoren) hervorgerufen. Diese Reaktionen sind oft über den FC- Anteil der Antikörpermoleküle vermittelt. Durch die Verwendung der F(ab')&sub2;-Fragmente kann man die meisten dieser spichtspezifischen Wechselwirkungen ausschalten. Die erhöhte Spezifität, die durch die F(ab')&sub2;-Fragmente erzielt wird, erhöht die Nützlichkeit des Assays nach der vorliegenden Erfindung bei der Diagnose und der Überwachung von Patienten, die mit HIV-1 infiziert sind, wesentlich. Die folgenden Beispiele zeigen weitere Vorteile der Erfindung.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON F(ab')&sub2;-FRAGMENTEN.

Kaninchen-Anti-HIV-1-Antikörper wurden der Spaltung mit Pepsin gemäß den Standardverfahren (Fanger et al., J. Immunol. (1970) 105:1484-1492; Parham, J. Immunol (1983) 131:2895-2902) unterzogen. Die F(ab')&sub2;-Fragmente wurden aus der Aufschlußmischung durch Gelfiltrationschromatographie isoliert. Die Analyse mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (Laemmli, Nature (1970) 227:680-685) bestätigte die Anwesenheit intakter F(ab')&sub2;-Fragmente. Bei diesem Produkt ist die Spezifität zur Erkennung von HIV-1-Proteinen erhalten geblieben, während die nicht-spezifischen Reaktionen, die oft durch den Fc-Anteil des Antikörpergesamtmoleküls vermittelt sind, ausgeschaltet werden.

BEISPIEL 2

F(ab')&sub2;-FRAGMENTE ZUR VERWENDUNG ALS SONDE BEI ENZYM-IMMUNOASSAYS (EIA) ZUM NACHWEIS VON HIV-1-ANTIGENEN.

Ein repräsentatives Assay nach der Erfindung ist unten beschrieben:
1) Eine mit humanem polyklonalem Anti-HIV-1-IgG beschichtete 1/4-inch-Polystyrolperle wurde mit 100 ul Plasma, Serum oder einer anderen biologischen Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Nach der Inkubation über Nacht (16 bis 20 Stunden) bei Raumtemperatur wurde die Perle 3 mal mit 5 ml Wasser zum Entfernen ungebundener Probe gewaschen.
2) Die gewaschene Perle wurde mit 200 ul Kaninchen- F(ab')&sub2;-Anti-HIV-1 in Kontakt gebracht und 1 Stunde lang bei 40ºC in einem Wasserbad inkubiert. Die Perle wurde dann wie in Schritt 1 beschrieben gewaschen, um ungebundenes Reagens zu entfernen.
3) Die gewaschene Perle wurde mit 200 ul Ziegen-F(ab')&sub2;- Antikaninchen-F(ab')&sub2;, das an Meerrettichperoxidase (HRPO) konjugiert war [Pel-Freeze Biologicals, Rogers, Arkansas] versetzt, und 2 Stunden lang bei 40ºC auf einem Wasserbad inkubiert. Die Perle wurde erneut gewaschen, wie dies in Schritt 1 beschrieben ist.
4) Die gewaschene Perle wurde mit 300 ul o- Phenylendiamin-Wasserstoffperoxidlösung bei Raumtemperatur 30 Minuten in Kontakt gebracht, wobei sich in Gegenwart der Meerrettichperoxidase ein gelb-orange gefärbtes Produkt bildete. Die Reaktion wurde mit 1 N H&sub2;SO&sub4; gelöscht; dann wurde die Extinktion bei 492 nm abgelesen.
Alternativ dazu können die Schritte 2 und 3 zu einem Schritt zusammengefaßt werden, um die Vorgehensweise zu vereinfachen. Andere Antikörperspezies als humane Antikörper können zum Einfangen von HIV-1-Antigenen verwendet werden, und Spezies von F(ab')&sub2;-Fragmenten, die nicht vom Kaninchen stammen, können als Sonde verwendet werden. Es wird eine bessere Spezifität erzielt, wenn die Einfang- und Sondenantikörper von verschiedenen tierischen Spezies stammen. Auch können F(ab')&sub2;- Fragmente zur Beschichtung der Perlen verwendet werden, zusätzlich zu ihrer Verwendung als Sonde und Konjugat.
Zusätzlich werden kürzere Inkubationszeiten möglich, indem die Reaktionsmischungen bei 40ºC in einem Wasserbad oder einem dynamischen Inkubator inkubiert werden. Z.B. können beim oben beschriebenen Assay die Inkubationszeiten der Probe der Anti-HIV-1-F(ab')&sub2;-Fragmente und des Konjugats auf 1,5, 0,5 bzw. 2 Stunden reduziert werden, wenn die Inkubation bei 40ºC in einem Wasserbad stattfindet.

BEISPIEL 3

Die Spezifität des in Beispiel 2 beschriebenen Assays wurde durch die Verwendung von acht nicht-spezifischen Proben bestimmt. Diese Proben hatten sich als wiederholt reaktiv aber als nicht bestätigend im Sinne der Abbott-HIV-1-Antigenassays erwiesen. Dieses Assay verwendet ganze Antikörpermoleküle als Sonde. Für beide Assays wurde ein Extinktionswert der 0,05 O.D.- Einheiten größer als derjenige des negativen Blindwerts war, als der Schwellenwert betrachtet. Proben, die höhere Extinktionswerte als den Schwellenwert aufwiesen, wurden als auf HIV-1-Antigene reaktiv erachtet. Daher wurden Proben mit einem Proben-zu-Schwellenwert-Extinktionsverhältnis (S/C) größer gleich 1,0 als reaktiv erachtet. Alle reaktiven Proben wurden mit einem Abbott-HIV-1-Neutralisationstest überprüft, der von Abbott Laboratories für Forschungszwecke im Handel erhältlich ist. Eine Probe, die durch das Verfahren neutralisiert wurde, wurde als auf HIV-1-Antigene bestätigt positiv erachtet.
Die in der Tabelle 1 angegebenen Daten zeigen an, daß alle acht Proben bei Verwendung zweier verschiedener Chargen von Kaninchen-F(ab')&sub2;-Fragmenten als Sonde negativ waren. TABELLE 1 VERGLEICHSPROFIL NICHT-SPEZIFISCHER PROBEN Probe-zu-Schwellenwertverhaltnis Probennummer Abbott HIV-1-Ag-Assay F(ab')&sub2; Charge 1

BEISPIEL 4

Um die Assayempfindlichkeit zu untersuchen, die in Picogramm HIV-1-p24 pro ml, welche einen Extinktionswert ergeben, der gleich dem Schwellenwert ist, definiert ist, wurde eine Verdünnungsreihe von gereinigtem HIV-1-p24-Antigen einem Assay unterzogen, und es wurde die Empfindlichkeit mittels linearer Regression bestimmt. Das Signal-zu-Rauschverhältnis das als das Verhältnis des Mittelwertes der Extinktionswerte der positiven Blindprobe zum Mittelwert der Extinktionswerte der negativen Blindprobe definiert ist, wurde ebenfalls verglichen.
Das Experiment, dessen Ergebnisse in Tabelle 2 gezeigt sind, verglich die Leistung des F(ab')&sub2;-Sondenassays unter Verwendung von sowohl humanem polyklonalem Anti-HIV-1-IgG (dem gleichen wie in den Abbott-HIV-1-Antigenassays) oder monoklonalem Anti-HIV-1-IgG von Mäusen (die als 31-42-19 und 31- 90-25 bezeichneten Antikörper) auf dem festen Träger. Die Assayempfindlichkeiten wurden unter Verwendung eines Standardverfahrens für alle drei Assays gemessen, wobei die Inkubationszeiten jeweils 16 bis 20 Stunden, 4 Stunden bzw. 2 Stunden für die Probe, die Anti-HIV-1-Sonde und das Konjugat betrugen. Bei beiden Assays wurden F(ab')&sub2;-Fragmente verwendet, und das Signal-zu-Rauschverhältnis war erhöht, und die Nachweisbarkeit von HIV-1-Antigen war wesentlich verbessert. Insbesondere wenn die F(ab')&sub2;-Sonde im Zusammenhang mit den monoklonalen Antikörpern verwendet wurde, betrug die Empfindlichkeit weniger als 1 pg/ml. TABELLE 2 Mittelwert d. positiven Blindwert Empfindlichkeit (pg p24/ml) Abbott HIV-1-Antigen-Assay F(ab')&sub2;-Sonde (Human-IgG-Fangreagens) F(ab')&sub2;-Sonde (monklonales-IgG-Fangreagens)
Die Empfindlichkeit wurde ebenfalls mit einer Vergleichstafel von HIV-1-Antigen-positiven Proben verglichen, die aus sauberen und verdünnten Proben von sechs unterschiedlichen HIV-1-Antigen-positiven Donoren bestand. Die gleichen Perlen, die mit humanem Anti-HIV-1-IgG beschichtet waren, wurden für beide Assays verwendet. Die Ergebnisse, die in Tabelle 3 dargestellt sind, zeigen, daß das F(ab')&sub2;-Sondenassay in der Lage war, 23 aus 29 Proben als positiv nachzuweisen, verglichen mit den 16 aus 29, die das Abbott-HIV-1-Antigenassay nachwies. TABELLE 3 Probe-zu-Schwellenwert-Verhältnis Donor Bestandteil Abbott HIV-1-Antigen-Assay Positiv insgesamt
Aufgrund des verstärkten Signals und der verbesserten Empfindlichkeit, die mit F(ab')&sub2;-Fragmenten erhalten wird, ist es möglich, die für Assayproben notwendige Zeit wesentlich zu verringern. Viele kurze Versuchsvorschriften wurden angewendet, einschließlich eines Assays von 3,5 Stunden Dauer mit Inkubationszeiten von je 1 Stunde bei 40ºC, für das Einfangen des Antigens auf dem festen Träger durch monoklonale Anti-HIV-1- Antikörper, Inkubation des festen Trägers mit Kaninchen-F(ab')&sub2;- Anti-HIV-1 und Inkubation des festen Träger mit Ziegen-F(ab')&sub2;- Antikaninchen-F(ab')&sub2; gefolgt von der Farbentwicklung mit o- Phenylendiamin. Obwohl die Inkubationszeit um über 20 Stunden verkürzt war, betrug die berechnete Empfindlichkeit bei diesem Verfahren 2,7 pg p24/ml.

Claims

1. Immunoassayverfahren zum Nachweis von HIV-1-Antigenen in einer biologischen Probe, welches folgendes umfaßt:

(a) Beschichten eines festen Trägers mit anti-HIV-1- Antikörper von einer ersten Tierart;

(b) in-Kontakt-Bringen des beschichteten Trägers mit der Probe;

(c) in-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer Sonde, welche anti-HIV-1-F(ab')&sub2;-Fragmente von einer zweiten Tierart umfaßt;

(d) in-Kontakt-Bringen des Trägers mit markierten F(ab')&sub2;-Fragmenten, die für die Sonde spezifisch sind; und

(e) Nachweis der Markierung als Maß für die Anwesenheit von HIV 1 Antigen in der Probe.

2. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung ein Radioisotop, ein Enzym, eine fluoreszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung oder ein Glied eines spezifischen Bindungspaars umfaßt.

3. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, wobei der auf den festen Träger aufgezogene anti-HIV-1-Antikörper wenigstens einen monoklonalen Antikörper umfaßt.

4. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, wobei der auf den festen Träger aufgezogene anti-HIV-1-Antikörper einen polyklonalen anti-HIV-1 umfaßt.

5. Immunoassayverfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der auf den festen Träger aufgezogene anti-HIV-1-Antikörper desweitern F(ab')&sub2;-Fragmente umfaßt.

6. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von HIV-1-Antigenen in einer biologischen Probe, welches folgendes umfaßt:

(b) in-Kontakt-Bringen des beschichteten Trägers mit der Probe, Inkubieren und Auswaschen;

(c) in-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer Sonde, welche anti-HIV-1-F(ab')&sub2;-Fragmente von einer zweiten Tierart umfaßt, Inkubieren und Auswaschen;

(d) in-Kontakt-Bringen des Trägers mit markierten F(ab')&sub2;-Fragmenten, die für die Sonde spezifisch sind, Inkubieren und Auswaschen;

(e) in-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer o- Phenylendiamin-Wasserstoffperoxyd-Lösung; und

(f) Messen der Extinktion des farbigen Produktes, das sich bei 492 nm bildet, zum Nachweis der Anwesenheit von HIV-1- Antigenen in der Probe.

7. Diagnostisches Kit zum Nachweis von HIV-1-Antigenen, welches umfaßt:

(a) anti-HIV-1-F(ab')&sub2;-Fragmente; und

(b) markierte F(ab')&sub2;-Fragmente, die für die anti-HIV-1 F(ab')&sub2;-Fragmente aus (a) spezifisch sind.