DE3781645T2

DE3781645T2 - Blutscheidungsgeraet unter niedrigen druckverhaeltnissen.

Info

Publication number: DE3781645T2
Application number: DE8787309171T
Authority: DE
Inventors: Ian Gibbons; Robert S Hillman
Original assignee: Biotrack Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1986-10-29
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-10-17
Also published as: ATE80461T1; JPH0664051B2; EP0269240B1; AU598312B2; DE3781645D1; CA1307448C; JPS63177059A; AU8043987A; GR3006417T3; US4753776A; ES2035077T3; EP0269240A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Techniken und Vorrichtungen zum Abtrennen von Plasma aus Blut durch Filtration und betrifft insbesondere die Filtration bei geringen Druckwerten.
Auf klinischem Gebiet werden viele Diagnosen unter Verwendung von Blut als eine Probe durchgeführt. Obwohl einige dieser Techniken an Voll-Blut durchgeführt werden können, ist es in vielen Fällen notwendig, Serum oder Plasma als die Probe zu verwenden, um eine genaue Anzeige zu erreichen. Zum Beispiel streuen und absorbieren rote Blutzellen (Erythrozyten) Licht und könnten eine Messung von reflektiertem oder hindurchgelassenem Licht eines Diagnosetests, der auf einer dieser Meßtechniken basiert, negativ beeinflussen.
Üblicherweise sind Plasma und Serum aus Voll-Blut durch Zentrifugieren entweder vor der Gerinnung (für Plasma) oder danach (für Serum) abgetrennt worden. Jedoch ist das Zentrifugieren zeitaufwendig und erfordert eine Ausrüstung, die außerhalb des klinischen Labors im allgemeinen nicht zur Verfügung steht. Dementsprechend ist das An Ort-und-Stelle-Testen zahlreicher Blutsubstanzen, für die Serum oder Plasma notwendig ist, schwierig.
Es ist eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um dieses Problem zu vermeiden. Bei den Techniken wird im allgemeinen eine Filtervorrichtung eingesetzt, die fähig ist, rote Blutzellen von Plasma abzutrennen. In der Vergangenheit sind zahlreiche Materialien zum Bilden von Filtern verwendet worden. Papier, Vliesstoff, folienartiges Filtermaterial bestehend aus Pulvern oder Fasern wie künstlich erzeugte Fasern oder Glasfasern und Membranfilter mit geeigneten Porengrößen sind vorgeschlagen worden. Zum Beispiel offenbart die US-PS-4,256,693 Kondo et al., eine Anzahl von Filtermaterialien in einem integralen chemischen Mehrschichtanalyseelement zum Einsatz für Blut. Die US- PS-4,477,575 Vogel et al., beschreibt eine Zusammensetzung und ein Verfahren, welche die Abtrennung von Plasma oder Serum aus Voll-Blut unter Einsatz von Glasfasern in Kombination mit anderen absorbierenden Schichten ermöglichen.
Jedoch hat sich erwiesen, daß diese Techniken nach dem Stand der Technik für den Einsatz bei Anwendungen ungeeignet sind, bei denen aufgrund von Raum- oder Volumenbeschränkungen nur ein kleiner Filter in einer Vorrichtung eingesetzt werden kann, in der ein einziger Tropfen Blut aufgetrennt und das Plasma ausschließlich mittels Kapillarwirkung durch die Vorrichtung transportiert wird. Demgemäß ist eine weitere Verfeinerung bei Blutauftrennungstechniken wünschenswert.
Es wird eine Vorrichtung und eine Technik zum Abtrennen roter Blutzellen von Plasma geschaffen, wobei eine Probe Voll-Blut unter Bedingungen auf einen Filter aufgebracht wird, unter denen die Antriebskraft zum Transportieren des Plasmas von der Ausgangsfläche des Filters ausschließlich durch Kapillarwirkung gebildet wird.
Der Glasmikrofaserfilter wird je nach Teilchengrößenretention und Dicke ausgewählt, um es zu ermöglichen, daß Plasma rascher durch den Filter gelangt als die roten Blutzellen, deren Hindurchtreten durch den Filter auf ähnliche Weise wie bei Chromatographiesäulen verzögert wird. Obwohl die roten Blutzellen schließlich durch den Filter hindurchtreten, ist genügend Plasma abgetrennt worden und gelangt durch Kapillarwirkung zu einer Reaktionskammer, damit die Analyse des im Plasma vorhandenen Analyten ohne Störung durch die roten Blutzellen ermöglicht wird. Die Technik ist besonders auf den Einsatz bei kleinen Blutvolumina und den geringen Druckwerten abgestimmt, die zur Verwendung für den Transport des Blutes in Kapillarvorrichtungen zur Verfügung stehen.
Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die einen Filter enthält, in der eine Anzahl weiter unten beschriebener Beispiele durchgeführt wurden, worin Fig. 1a eine vergrößerte Seitenansicht, Fig. 1b eine Unteransicht eines jeden der die endgültige Vorrichtung bildenden Bestandteile und Fig. 1c eine Draufsicht der zusammengebauten Vorrichtung ist.
Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die einen Filter enthält, in der zwei oder mehr Kunststofformen geschweißt werden, um eine Vorrichtungseinheit mit Innenkammern zu bilden, worin Fig. 2a eine Seitenansicht und Fig. 2b eine Draufsicht der Vorrichtungseinheit nach dem Zusammenschweißen ist.
Fig. 3 ist eine Draufsicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die einen Filter enthält, die mehrere Wege zum Hindurchtreten von abgetrenntem Plasma in eine Reaktionskammer aufweist.
Die vorliegende Erfindung kann in der Kapillarflußvorrichtung, die im Detail in der EP-A-212314 beschrieben wird, durchgeführt werden. Die in dieser früheren Anmeldung beschriebene Kapillarflußvorrichtung basiert auf Kapillaren, Kammern und Öffnungen zum Pumpen von Fluids; zum Kontrollieren der Messungen von Fluids, Reaktionszeiten und Mischung von Reagenzien; und zum Bestimmen eines nachweisbaren Signals. Die Kapillaren stellen die einzige Antriebskraft für die Bewegung von Flüssigkeit durch die Vorrichtung dar.
Obwohl diese Vorrichtung wie zuvor beschrieben für Voll-Blut verwendet werden könnte, war es beim Einsatz für Serum oder Plasma notwendig, die roten Blutzellen vor dem Aufbringen des Serums oder Plasmas auf die Vorrichtung abzutrennen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Aufbringen von Voll-Blut direkt auf diese Vorrichtung oder jegliche anderen Vorrichtungen, bei denen Kapillarwirkung als Antriebskraft für die Bewegung von Fluids dient. Durch Auswahl von Glasfaserfiltern wie in dieser Beschreibung beschrieben, ist es möglich, die gewünschte Auftrennung in einem sehr kleinen Raum mit einem Minimum an Zelllyse zu erreichen, und ohne daß es notwendig ist, außer der von der Kapillarwirkung gelieferten eine andere zusätzliche Kraft anzuwenden, um das Serum oder Plasma zu einer Reaktionskammer zu bewegen.
Ein nützlicher Aspekt der Erfindung besteht darin, daß die Abtrennung roter Blutzellen von Plasma unter Einsatz einer einzigen Schicht von Filtermaterial und eines geringen Blutvolumens erreicht werden kann. Es hat sich erwiesen, daß für die Blutauftrennung in größerem Umfang eingesetzte Materialien nach dem Stand der Technik und der Einsatz von Mehrfachschichtfiltern mit absorbierenden Schichten unter den gegebenen Trennbedingungen nicht vorteilhaft sind.
Ein Schlüsselbestandteil der vorliegenden Vorrichtung ist ein Glasfaserfilter. Besonders geeignete Glasfaserfilter können aus Fasern aus Borsilikatglas hergestellt werden, ein Material, das zusätzlich zu Siliziumdioxid etwa 10 % Bortrioxid sowie Alkali- und Erdalaklioxide und Oxide anderer Metalle wie Eisen, Aluminium und Zink enthält. Es können jedoch auch andere Gläser eingesetzt werden.
Bei der Herstellung von Glasfaserfiltermedien gemäß der Erfindung werden Mikroglasfasern eingesetzt. Dabei handelt es sich, im Gegensatz zu aus gezogenen Glasfäden erzeugtem Gespinstmaterial, um extrem feine Fasern, die typischerweise durch das Verblasen von Glas durch Düsen hindurch gebildet werden. Typischerweise werden Glasfaserfilter aus Fasern mit einem Durchmesser zwischen 0,10 und 7,0 um hergestellt.
Jedoch ist es wichtig, die Verteilung von in diesem Durchmesserbereich vorhandenen Fasern zu steuern, um einen Glasfaserfilter zu erzeugen, der für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Ein enger Bereich an feinen Fasern mit einem Minimum an Fasern mit großem Durchmesser sollte eingesetzt werden.
Bei einem bevorzugten Filter haben 60 % vorzugsweise 80 % oder mehr seiner Fasern einen Durchmesser von 0,10 bis 1,23 um und nicht mehr als 40 %, vorzugsweise nicht mehr als 20 %, haben einen Durchmesser über 1,23 um. Filter, bei denen im wesentlichen alle ihre Fasern einen Durchmesser unter 4,00 um aufweisen, werden bevorzugt.
Andererseits sollte der Fasergrößenbereich in den oben dargelegten Grenzen nicht zu klein sein. Eine relativ gleichmäßige Durchmesserverteilung im Bereich von 0,10 bis 1,23 um wird bevorzugt. Es hat sich gezeigt, daß ein extrem enger Faserdurchmesserbereich (über einen Gesamtbereich von 0,14 um variierend) nicht geeignet ist, die richtige Filterwirkung zu bieten. Demgemäß ist es vorzuziehen, eine Verteilung von Fasern mit unterschiedlichem Durchmesser einzusetzen, so daß, wenn der 0,10 bis 1,23 um Bereich in 2-5 gleiche Teile, insbesondere 3 oder 4 gleiche Teile geteilt wird, in jeden Teil in etwa die gleiche Anzahl an Fasern (wobei die Anzahl vorzugsweise um nicht mehr als 10 % variiert) fällt (z. B. ein Zahlenverhältnis von 40, 30, 30; 30, 40, 30; oder 35, 30, 35 bei Teilung in drei Durchmesserbereiche).
Geeignete Filterbahnen können durch Einbringen einer Mischung aus Glasfasern als Naßstoff in eine Papiererzeugungsmaschine hergestellt werden. In einigen Fällen kann eine geringe Menge eines organischen Hochpolymerbindemittels eingesetzt werden, obwohl derartige Bindemittel nicht bevorzugt werden. Typische Bindemittel umfassen Zellulose- oder Acrylpolymere.
Die in der Praxis der Erfindung eingesetzten Glasfaserfilter sind als Tiefenfilter bekannt und bestehen aus unregelmäßig filternden Fasern. Abtrennung wird hauptsächlich als Ergebnis der mechanischen Retention von Teilchen erzielt. Da die Fasern sowohl eine unregelmäßige Größe als auch Form aufweisen, ist es schwierig, eine absolute Porengröße eines derartigen Filters anzugeben. Die Filter werden im allgemeinen auf der Basis der Retention klassifiziert, die die Fähigkeit der Filter definiert, Teilchen einer bestimmten Größe aus einer wässerigen oder anderen Lösung zu entfernen.
Bei der Auswahl von Glasfiltern sollten Teilchengrößenretention, Zusammensetzung der Glasdicke und Dichte berücksichtigt werden, um adäquate Filtration ohne Hämolyse zu bieten. Eine Dicke von 0,5 bis 0,9 mm wird bevorzugt, wobei 0,50 bis 0,80, insbesondere 0,66 bis 0,76 mm, mehr vorzuziehen sind. Borsilikat und anderes leicht alkalisches Glas (pH 8,0-11,0, vorzugsweise etwa 9,0-10,5) wird bevorzugt. Die Partikelgrößenretention liegt im Bereich von etwa 1,0 bis 3,0 um, mehr bevorzugt von 1,4 bis 3,0 um, und am meisten bevorzugt wird von 2,3 bis 3,0 um. Eine Dichte im Bereich von 0,10 bis 0,30 g/cm³ wird bevorzugt, mehr vorzuziehen ist 0,20 g/cm³- 0,28 g/cm³, und am meisten bevorzugt wird etwa 0,25 g/cm³. Da die ungefähre Dichte von Borsilikatglas 2,61 g/cm³ beträgt, kann die Dichte als Maß für die Porosität des Glasfilters gesehen werden.
Die oben angegebenen Zahlen gelten für Borsilikatglasfilter. Partikelgrößenretention und Dicke wären für andere Glasarten gleich, aber die Dichten würden proportional mit der Dichte des jeweils gewählten Glases variieren.
Eine Anzahl kommerziell erzeugter Glasfilter kann in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel stellt Micro Filtration Systems (MFS) drei einsetzbare Glasfaserfilter her, die die Herstellungsnummern GA-200, GB-100R und GC-90 haben. GB-100R und GG-90 werden bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung als Doppelfilter eingesetzt. GA-200 hat eine Dichte von etwa 0,25 g/cm³, eine Dicke von 0,70 mm und eine Retentionsgröße von 2,3 um beim Filtern von Flüssigkeiten. Eine doppelte Dicke von GB-100R hat eine Dichte von 0,25 g/cm³, eine Dicke von 0,76 mm und eine Teilchengrößenretention von 2,0 um. Eine doppelte Schicht von GC-90 hat eine Dichte von 0,30 g/cm³, eine Dicke von 0,66 mm und eine Teilchengrößenretention von 1,7 um.
Whatman, Inc., in Clifton, New Jersey, und Schleicher & Schüll, eine Westdeutsche Firma mit Vertrieb in Keene, NH, stellen ebenfalls eine Anzahl verschiedener Glasmikrofaserfilter her. Jedoch hat sich aufgrund eines Unterschieds in der Größenverteilung der zur Herstellung ihrer Filter verwendeten Glasfasern und der sich daraus ergebenden Wirkungen auf die Retention roter Blutzellen keiner der getesteten Filter von Whatman oder Schleicher & Schüll (Whatman GF/C, GF/B, GF/D, GF/F, 934-4H; S+S 3362) als nützlich für den Zweck der vorliegenden Erfindung erwiesen. Andere Glasfaserfilter wurden ebenfalls getestet und es zeigte sich, daß sie keine adäquate Trennung bieten: P300, von Nucleopore, Pleasanton, CA (mit organischem Bindemittel); HB-5341 und BG-08005 von Hollingsworth & Vose, East Walpole, MA; Glasfaserfilter 111, 121, 131, 141, 151 und 161 von Eaton-Dikeman, Carlisle, PA; und die Glasfaserfilter 85/90F von Machery & Nagel, Düren, Westdeutschland.
Alle oben beschriebenen erzeugten Glasfasern sind (wenn nicht anders angegeben) ohne organische Bindemittel hergestellt. Organische Bindemittel neigen dazu, die Porengrößen zu verringern und auf andere Art mit roten Blutzellen zu interagieren, wenn diese durch Filter hindurchgehen. Demgemäß werden bindemittelfreie Glasfilter bevorzugt.
Es kann jedoch möglich sein, Bindemittel in Glasfiltern zu verwenden, indem die Dichten und Fasergrößen so gewählt werden, daß sie zu gleicher Teilchengrößenretention führen.
Eine Anzahl verschiedener Filtertypen wurden auf ihre Fähigkeit getesten, die Trennung von Plasma von Serum unter Verwendung einer Vorrichtung zu bewirken, deren einzige Treibkraft die Kapillarwirkung ist. Von allen getesteten Filtern ergaben bindemittelfreie Glasfaserfilter mit der oben besprochenen Verteilung von Faserdurchmessern die beste Trennung. Das durch Kapillarwirkung verursachte Druckgefälle ist offensichtlich deutlich geringer als jenes, das entweder als ein Ergebnis der Schwerkraft auf große Proben oder als Ergebnis des Kontakts zwischen einem Glasfilter des in der US-PS-4,477,575 beschriebenen Typs wie oben besprochen und einem Saugkissen exisitiert. Typischerweise liegt der verfügbare Druck im Bereich von 2,5 mm Hg (34 mm H&sub2;O) oder weniger.
Bindemittelfreie Glasmikrofaserfilter mit einem Volumen von etwa 7- 10 ul ergaben etwa 3-4 ul Plasma, wenn 25 ul Blut aufgebracht wurde. Wenn der Filter in einer Vorrichtung wie in Fig. 1 gezeigt eingesetzt wurde, die unten im Detail beschrieben wird, erschien etwa fünf Sekunden nach dem Aufbringen von Voll-Blut auf dem Filter Plasma auf der Oberseite des Filters. Etwa 12 Sekunden nach dem Aufbringen erschien Plasma im Näpfchen. Obwohl schließlich Blutzellen durch den Filter gelangten, was darauf hindeutet, daß die Blutzellen nicht abgeblockt sondern nur aufgehalten wurden, war zu diesem Zeitpunkt ausreichend Plasma aufgetreten, um eine adäquate Analyse durchzuführen. Es ist gezeigt worden, daß Filter dieses Typs beim Filtern von Blut mit Hämatokritwerten im Bereich von 33 bis 60 % nützlich sind. Das Verhältnis zwischen erhaltenem Plasma und Filtervolumen kann durch die Verwendung von Filtern mit größerem Durchmesser unter Beibehaltung der gleichen Filterdicke erhöht werden.
Es kann möglich sein, einen Filter einzusetzen, um die Durchgangsrate von Plasma oder Blut zu steuern (letztere beim Einsatz eines reinen Papierfilters oder einem aus anderem Material, welches rote Blutzellen nicht vom Plasma trennt). Der Filter und die aus dem Filter austretende Kapillare wirken jeweils als Widerstandspunkt gegen den Fluß von Fluid durch die Vorrichtung. Tatsächlich wirken sie jeweils als ein Ventil in einem Fluidstrom. Wenn das Hindurchtreten von Fluid durch den Filter auf mehr Widerstand stößt als der Fluß durch die Kappilare, wirkt das System, als ob ein erstes Ventil teilweise geschlossen ist, während ein zweites Ventil im Fluidstrom offen ist. Es ist jedoch möglich, die Kapillarflußrate so zu variieren, daß in der Kapillare ein größerer Widerstand vorhanden ist. Ein derartiges System wirkt als ob das erste Ventil offen ist, während das zweite Ventil teilweise geschlossen ist. Durch Variieren von Filterdicke und -dichte und durch Auswahl eines geeigneten Kapillardurchmessers kann eine beträchtliche Kontrolle über den Fluidfluß durch das System erreicht werden.
Der Filter wie oben beschrieben ist in den Testvorrichtungen eingesetzt worden, die in der hierin durch Verweis eingeschlossenen EP-A-212314 beschrieben werden. Eine kurze Beschreibung dieser Vorrichtung ist hier eingeschlossen, um zu zeigen, wie der Filter in Kombination mit dem Rest der Vorrichtung eingesetzt wird, bei der (1) kleine Blutvolumina und (2) Kapillarwirkung verwendet werden, um Plasmabewegung zu bewirken.
Eine in vielen der unten beschriebenen experimentellen Untersuchungen eingesetzte Testvorrichtung wird in Fig. 1 dargestellt. Die Vorrichtung wurde aus drei Kunststoffteilen, die in etwa die Größe und Form von Objektträgerplättchen aufweisen, und doppelseitigem Klebeband hergestellt. Das obere Plättchen 10 weist ein Loch 12 auf, dessen Durchmesser kleiner ist als der des einzusetzenden Filters und das vollständig durch Blättchen 10 und doppelseitiges Klebeband 14 gebohrt ist und sich in der gezeigten Ausführungsform nicht über die gesamte Länge des oberen Plättchens erstreckt aber das gewünschtenfalls tun kann. Das mittlere Plättchen 20 hat ein Loch 22, das vollständig durch Plättchen 20 und doppelseitiges Klebeband 24 gebohrt ist, das auf der Unterseite von Plättchen 20 angebracht ist. Das doppelseitige Klebeband 24 weist einen aus dem Klebeband ausgeschnittenen Abschnitt 26 auf, um Kapillarkanäle und Kammern zu schaffen, wenn die gesamte Vorrichtung zusammengebaut ist. Kapillarraum 26A führt von Loch 22, das den Filter hält, zu Reaktionskammer 26B.
Eine zusätzliche Kapillarkammer 26C schafft eine Entlüftung, indem sie sich von der Reaktionskammer zum Rand des Klebebandes erstreckt. Das unter Plättchen 30 ist ein ebenes Plättchen, das eine Bodenfläche für die Filter-, Kapillar- und Reagenzräume bildet, die vom mittleren Plättchen 20 und Klebeband 24 gebildet werden.
Die zusammengestellte Vorrichtung wird in Fig. 1C gezeigt, in der punktierte Linien verwendet werden, um die Innenkammern zu zeigen, die gebildet wurden. Blut wird an der Eingangsöffnung (Loch) 12 aufgebracht, tritt mit dem in Kammer 22 gehaltenen Filter in Berührung und wird in Plasma getrennt, während die roten Blutzellen auf dem Filter zurückgehalten werden. Plasma tritt durch Kapillare 26A hindurch zu Reaktionskammer 26B, während Luft durch die Kapillarentlüfung 26C entlüftet wird.
Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung, die durch Zusammenschweißen von zwei oder mehr Kunststoffteilen hergestellt wird, so daß eine Vorrichtungseinheit mit inneren Kammern gebildet wird. Zahlreiche Ausführungsformen dieser Vorrichtung werden in der EP-A-0212314 dargelegt. Blut wird an der Eingangsöffnung 42 aufgebracht, die einen kleinerem Durchmesser als die Kammer 44 aufweist, die den Filter 46 enthält. Plasma tritt vom Boden des Filters in den Sammelraum 48 aus und wird durch Kapillare 50 zur Kammer 52 transportiert. Die Entlüftung 54 ist zwecks Austreten von Luft aus der Vorrichtung vorgesehen. Gewünschtenfalls können Stege 56 vorgesehen sein, um das Aufbringen von Blut an der Eingangsöffnung zu unterstützen. Zusätzliche Kapillaren, Kammern, Entlüftungen und ähnliches, wie in den eingeschlossenen Patentanmeldungen beschrieben, können in Vorrichtung 40 vorhanden sein, werden in dieser Figur aber aus Gründen der Klarheit weggelassen.
Eine Voll-Blut-Probe, wahlweise durch Hinzufügen von gerinnungshemmenden Mitteln oder anderen Reagenzien formuliert, die zum Sammeln von Blut oder zur Durchführung einer Reaktion mit dem Analyten, der gemessen wird, nützlich sind, wird in die Eingangsöffnung in der Aufnahmeeinheit einer Testvorrichtung eingebracht. Die Aufnahmeeinheit kann eine Kapillare oder eine größere Kammer sein. Die Aufnahmeeinheit kann verwendet werden, um das spezielle Probevolumen zu messen, oder kann einfach dazu dienen, die Probe aufzunehmen und die Probe zum Filter zu lenken. Wenn Voll-Blut mit dem Filter in Berührung kommt, wird es wie oben beschrieben in seine Bestandteile aufgetrennt. Der erste Bestandteil, der den Filter verläßt, ist Plasma oder Serum, je nach der Quelle der Probe. Für den Rest der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff Plasma verwendet werden, dieser soll aber für Plasma oder Serum stehen.
Die Filter gemäß vorliegender Erfindung umfassen typischerweise eine einzelne Materialschicht anstelle von Mehrfachschichten. Sie sind für die Auftrennung eines einzelnen Blutstropfens bestimmt, der typischerweise ein Volumen von 30-50 ul oder weniger aufweist. Demgemäß ist auch das Volumen des Filters gering, typischerweise im Bereich von 5 bis 20 ul, um zu vermeiden, daß das gesamte Plasma absorbiert und zurückgehalten wird. Die Dicke (d. h. in Richtung des Flußwegs gemessen) liegt vorzugsweise im Bereich von 0,2-1,5 mm. Dieser Bereich gilt für alle Filter und ist somit etwas größer als der oben angeführte für Glasmikrofaserfilter. Auf die Teilchengrößenretention für Glasmikrofaserfilter wird oben eingegangen.
Das Plasma wird gewöhnlich, wenn es den Filter verläßt, von einer oder mehreren Kapillaren aufgenommen. Wenn Blut auf die Oberseite eines Filters aufgebracht wird, wird Plasma von der Unterseite gesammelt. Die Seiten des Filters stehen in engem Kontakt mit den Wänden, um zu verhindern, daß rote Blutzellen um die Kanten des Filters herum gelangen. Wahlweise kann ein Abdichtmittel (gewöhnlich eine Polymerverbindung) an den Seiten des Filters verwendet werden. Plasma, das die Unterseite des Filters verläßt, kann sich in Rinnen oder anderen Räumen zwischen dem Filter und der Oberfläche der Vorrichtung, die den Filter enthält, in engstem Kontakt mit der Unterseite des Filters sammeln. Kapillaren ziehen Plasma von dem/den Sammelraum-/räumen ab. Es ist zu beachten, daß die Worte Oberseite, Unterseite und Seiten wie hierin verwendet relative Begriffe sind und nicht notwendigerweise eine Ausrichtung des Filter in bezug auf die Erdoberfläche darstellen. Kapillaren haben gewöhnlich Durchmesser im Bereich von etwa 0,01 mm bis 2 mm. Die Kapillaren variieren in der Länge, sind aber im allgemeinen kürzer als 10 cm und gehen gewöhnlich nicht über 5 cm hinaus.
Die erste Kapillare kann die Flußrate in die Kammer steuern, die gewöhnlich als Reaktionskammer dient. So kann die Kapillare zur Steuerung der Zeitdauer beitragen, über die das Plasma mit einem Reagens in Kontakt ist, das in den Wänden der Kapillare und/oder Reaktionskammer enthalten oder an diese gebunden ist. Jedoch ist die Flußrate von Plasma durch den Filter in vielen Fällen, wie oben beschrieben, einschränkend, so daß die Kapillare Plasma oft so rasch transportiert, wie es den Filter verläßt. Das Reagens schafft eine Farbveränderung oder eine andere Einrichtung zum Bestimmen der Menge an im Plasma vorhandenem Analyten.
Die Kapillare stellt die einzige Antriebskraft für die Bewegung von Flüssigkeit durch die Vorrichtung nach dem Hindurchgehen der Probe durch den Filter dar. Die Vorrichtung wird normalerweise so eingesetzt, daß die Kapillaren, Reaktionskammern und anderen Kammern in einer horizontalen Ebene ausgerichtet sind, so daß die Schwerkraft die Flußrate nicht beeinflußt. Die Vorrichtung wird ohne zusätzliche Bewegungskraft, wie eine Pumpe, die Schwerkraft oder ähnliches eingesetzt. Demgemäß ist es wesentlich, einen Filter wie hierin beschrieben auszuwählen, um die Trennung zu erreichen, während es der Kapillarkraft ermöglicht wird, Plasma durch die Vorrichtung zu pumpen. Versuche haben gezeigt, daß die gemäß dem Stand der Technik, wie den US-PS 4,477,575 und 4,256,693 beschriebenen Filter zum Trennen großer Volumina an Blut, die von der Schwerkraft unterstützt werden oder von relativ großen Dochtwirkungskräften abhängig sind, die von den Filter berührenden absorbierenden Substanzen abhängig sind, in Kapillarflußvorrichtungen des Typs, wie sie gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, unwirksam sind.
Obwohl die hierin beschriebenen Filter in den gleichen Vorrichtungen wie zuvor beschrieben eingesetzt werden können, wird eine bevorzugte Konfiguration zum Einsatz von Vorrichtungen mit Glasfaserfiltern in Fig. 3 gezeigt. Bei dieser Vorrichtung wird Voll-Blut einer Eingangsöffnung 42' zugeführt, die über einem Filter angeordnet ist, der als ein Bluttrenner bezeichnet wird. Eine Anzahl von Kapillaren (50') sind an der Peripherie des Bluttrenners angeordnet, um Plasma in das Reagensgebiet zu transportieren. Die Kapillaren können unterschiedliche Länge und Durchmesser aufweisen, sind aber so konstruiert, daß sie es dem Plasma ermöglichen, das Reagensgebiet 52' im wesentlichen gleichzeitig von jeder Kapillare zu erreichen. Die EP-A-0212314 beschreibt die Ordnung von Kapillaren nach Größe, um diese Wirkung zu erreichen. Diese Konstruktion ermöglicht das gleichmäßige und rasche Füllen des Reagensgebiets.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele weiter beschrieben, die nur zum Zweck der Veranschaulichung eingeschlossen sind und, wenn nicht anders angegeben, keinerlei Einschränkung der Erfindung darstellen.

BEISPIEL 1

Materialien und Verfahren

Blut

Bei den folgenden Versuchen wurde Voll-Blut in 15 UPS Einheiten/ml Lithiumheparin verwendet.

Filterscheiben

Die Filterscheiben wurden aus im Handel erhältlichen Filtern oder anderen angegebenen Materialien unter Verwendung einer 4,57 mm (0,180'')-Stanze hergestellt.
Geschweißte Patronen. ABS (Acrylamidbutadienstyrol)-Plättchen wurden mit dem Branson-Ultraschallschweißer unter den folgenden Bedingungen geschweißt: Druck = 4,24·10&sup5; Pa (60 psi), Schweißdauer = 0,3 s(sec), Haltezeit = 1,5 s(sec), Abwärtsgeschwindigkeit = 3,0.
Die wesentlichen Teile der Vorrichtung waren eine 0,851 mm (33,5 mil) dicke Filterkammer mit einem Gesamtvolumen von 16 ul, eine Verbindungskammer (weiter als eine normale Kapillare) mit einer Dicke von 3,5 mm, und eine Reaktionskammer mit Entlüftungsloch. Das Gesamtvolumen von Verbindungskammer und Reaktionskammer betrug 8,5 ul

Klebebandplättchen

Azetatkunststoffstreifen (152,4 mm·25,4 mm (6'' ·1'')) wurden in Sparkleen-Lösung gewaschen, in entionisiertem Wasser gespült und dann unter Verwendung flusenfreier Tücher getrocknet. Die Kunststoffstreifen wurden dann in Plättchen mit einer Größe von 63,5 mm·25,4 mm (2,5''·1'') geschnitten. Kunststoffoberflächen, die mit Plasma in Berührung kamen, wurden vor dem Zusammenstellen in einem Plasmaätzer geätzt. Das obere Plättchen war ein reines Kunststoffstück, auf dessen Unterseite ein 25,4 mm·12,7 mm (1'' ·0,5'') großes Stück eines doppelseitigen Klebebandes klebte. Ein doppelseitiges, 89 um (3,5 mil) dickes, Klebeband Marke Scotch mit einem Muster, das Kapillaren und andere aus dem Klebeband ausgeschnittene Innenkammern bildete, wurde auf die Unterseite des als mittleres Plättchen vorgesehenen Teils geklebt. Mit einem 16er-Bohrer (4,39 mm (0,173'')) wurde ein Loch gebohrt, um einen Napf zu bilden. Ein 25er-Bohrer (3,8 mm) wurde verwendet, um in dieses Deckplättchen ein Entlüftungsloch zu machen. Der obere Streifen wurde auf die Oberseite des mittleren Streifens geklebt, wobei die Löcher sorgfältig ausgerichtet wurden. Der gewählte Filter wird dann in den Napf des mittleren Plättchens gegeben und ein an der Unterseite geätztes Plättchen wurde an das Klebeband des mittleren Plättchens geklebt. Der Filter fluchtete mit der oberen Oberfläche des unteren Plättchens. Das fertige Plättchen wird in Fig. 1 gezeigt.

Hämolysemessung

Die prozentuelle Hämolyse wurde durch Messen der Absorption von 570 nm Licht durch das Plasma quantifiziert. Die Absorption wurde an einem Hewlett-Packard 8451A-Spektrophotometer gemessen. Die Anzeigen wurden unter Verwendung von Zellen mit Weglängen von etwa 0,01 cm erhalten. Die 0,01 cm Weglänge befand sich in einer wie oben beschrieben hergestellten Klebebandpatrone. Die Absorption wurde durch Multiplikation der Absorption mit einem Umwandlungsfaktor in prozentuelle Hämolyse umgewandelt. Der Peak bei 570 nm wurde für die Zellen mit 0,01 cm Weglänge verwendet und die Umwandlungskonstante war 42,0.

Glasfaserfilter

Eine Anzahl von Glasfaserfiltern wurde getestet, darunter auch der GA-200 von Micro Filtration Systems (MFS), welcher derjenige Filter ist, der für alle Beispiele verwendet wurde, wenn nicht ein anderer Filter angeführt ist. GA-200 ist ein Glasfaservliesfilter, der Glasmikrofasern enthält, die typische Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 1,0 um aufweisen. Der Filter ist 0,70 mm dick und hielt in der Flüssigphase Teilchen mit einem Durchmesser von 2,3 um zurück. Die Dichte des Filters beträgt 0,25 g/cm³. Die Werte für Dichte und Dicke sind vor der leichten Komprimierung angegeben, die während des Herstellungsvorgangs der Kapillarvorrichtung stattfand.

Ergebnisse

Blut von einem Patienten mit Sichelzellenanämie, Blut mit künstlich erzeugten hohen und niederen Hämatokritwerten und normales Blut wurden durch die GA-200 Filter gefiltert, um festzustellen, ob Blut mit einem anormalen Hämatokritwert wirksam gefiltert wird. Blutart Filtration Zeit 1* (sec) Lyse (%) Sichelzelle Blutart Filtration Zeit 1* (sec) Zeit 2* (sec) Volumen** (ul) Frisches Blut * Zeit ist die Zeit zwischen dem Hinzufügen von Blut zum Filter und dem Austreten roter Blutzellen aus dem Filter. Zeit 2 ist die Zeit, die das Blut benötigt, um den Reagensnapf zu erreichen. ** Volumen = das Plasmavolumen, das aus dem Filter austrat, bevor rote Blutzellen aus dem Filter austraten.
Es ist offensichtlich, daß die Filter beim Filtern von Blut mit anormalem Hämatokritwert ebenso wirksam sind wie bei normalem Blut; tatsächlich scheint Blut mit niedrigem Hämatokritwert schneller durch die Filter zu fließen als Blut mit normalem oder hohem Hämatokritwert.
Das Blut mit niedrigerem Hämatokritwert wurde wirksamer gefiltert; das heißt, mehr Volumen an Plasma pro Volumen an Blut trat vor den roten Blutzellen aus den Filtern aus. Jedoch wurde auch bei Blut mit hohem Hämatokritwert genügend Plasma abgetrennt, um Plasmatests zu ermöglichen.

Vergleich von MFS-Filtern

Eine Anzahl verschiedener Filter von Micro Filtration Systems wurde auf die Fähigkeit getestet, rote Blutzellen von Plasma abzufiltern. Die Nomenklatur der MFS-Filter basiert auf ihren physikalischen Eigenschaften. Je weiter hinten der zweite Buchstabe des Namens im Alphabet steht, desto fester die Webung des Filters und desto langsamer der Fluß durch den Filter. Die Zahlen im Namen entsprechen der Dicke des Filters, das heißt, je höher die Zahl, desto dicker der Filter. Drei Filter aus der untersuchten Gruppe erwiesen sich als zufriedenstellend: der GA-200, zwei aufeinandergeschichtete GB-100R und zwei aufeinandergeschichtete GC-90. Filter Zeit 1 (sec) Zeit 2 (sec) Volumen (ul) % Lyse* * nach dem Entfernen von roten Blutzellen durch Zentrifugieren gemessene Lyse = 0,37%

Analytwiedergewinnung nach Aussetzen einem Glasfaserfilter

Der Zweck dieses Versuchs bestand darin, festzustellen, ob potentielle Analyten vom Glasfaserfiltermaterial adsobiert werden. Die getesteten Analyten waren Cholesterin, Kalium und Gesamtprotein. Der Versuch wurde unter Verwendung der folgenden Vorschrift durchgeführt:
1. Serum wurde aus Voll-Blut durch Ziehen des Blutes in Vacutainer-Röhrchen aus Glas, Übertragen des Blutes in Zentrifugierröhrchen, 20minütiges Stehenlassen des Blutes bei Raumtemperatur und anschließendes 5minütiges Zentrifugieren der Blutabsetzung auf einer TRIAC-Zentrifuge (Clay Adams) erhalten.
2. Die Probe wurde dann aufgeteilt, wobei eine Probe mit dem Glasfaserfiltermaterial in Berührung gebracht und die andere bis zur Laboranalyse stehengelassen wurde.
3. Das Volumen der Filterscheiben in den Klebebandplättchen betrug 12,6 ul. Angenommen, 50 ul Blut wird zum Filter hinzugefügt, betrug das Verhältnis Blutvolumen zu Filtervolumen etwa 4. Bei dem Versuch wurden 2 ml Serum mit einer Scheibe mit 24 mm Durchmesser (Tiefe = 0,7 mm) mit einem Gesamtvolumen von 317 ul in Berührung gebracht. Das Volumenverhältnis Blut/Filter war bei dem Versuch 2000/317 = 6,3.
4. Die Filter enthaltenden Proben wurden bei mittlerer Geschwindigkeit etwa 20 Sekunden lang verwirbelt und dann 5 Minuten lang in einer TRIAC-Zentrifuge zentrifugiert, um die Glasfasern abzutrennen. Das Serum wurde unter Verwendung einer Glaspipette abgezogen. Das Serum wurde dann analysiert. ohne Filter mit Filter wiedergewonnene Fraktion Cholesterin (mg/dl) Kalium (mEq/ml) Gesamtprotein (gm/dl)
Die Ergebnisse für Kalium, Gesamtprotein und Cholesterin deuten darauf hin, daß die Analyten nach dem Kontakt mit dem Filter fast vollständig wiedergewonnen wurden.
Alle in der Beschreibung zitierten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen geben den Stand der Technik der Fachleute auf dem Gebiet an, auf das sich die Erfindung bezieht. Jede Veröffentlichung ist im gleichen Ausmaß einzeln durch Verweis hierin eingeschlossen, als ob jede einzelne Veröffentlichung und Patentanmeldung durch Verweis einzeln an der Stelle eingeschlossen worden wäre, wo sie zitiert wurde.

Claims

1. Vorrichtung zur klinischen Diagnose, in der die Antriebskraft für die Bewegung von Flüssigkeit durch einen röhrenförmigen Kapillarweg von einer Einlaßöffnung zu einer Reaktionskammer in der genannten Vorrichtung durch Kapillardruck entsteht, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Vorrichtung eine Blutauftrennungsvorrichtung beinhaltet, die ein im genannten Weg eingeschalteter Niederdruckfilter ist, wodurch auf die genannte Einlaßöffnung aufgebrachtes Voll-Blut durch den genannten Filter in Plasma und rote Blutzellen aufgetrennt wird, wobei der genannte Filter ein Glasmikrofaserfilter mit einer Teilchengrößenretention im Bereich von etwa 1 um bis etwa 3 um und einem Flußweg im Bereich von etwa 0,25 bis 2,0 mm ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der genannte Filter im wesentlichen aus Borsilikatglasfasern besteht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der genannte Filter ein bindemittelfreier Glasmikrofaserfilter ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin der genannte Filter eine Dicke von 0,5 bis 0,9 mm und eine Teilchengrößenretention von etwa 1,2 bis 2,8 um aufweist und Glasfasern umfaßt, deren Durchmesser alle im wesentlichen im Bereich von 0,10 bis 4,0 um liegen, wobei zumindest 60% der Fasern Durchmesser im Bereich von 0,10 bis 1,23 um aufweisen.

5. Verfahren zum Trennen von Plasma von roten Blutzellen, das umfaßt:

Aufbringen von Voll-Blut auf eine Oberfläche eines Niederdruckfilters, worin der genannte Filter

ein Glasmikrofaserfilter mit einer Teilchengrößenretention im Bereich von etwa 1,2 um bis etwa 2,8 um und einem Flußweg im Bereich von etwa 0,25 bis 2,0 mm ist,

in einem geschlossenen Behälter mit einer Einlaßöffnung zum Aufbringen des genannten Blutes und eine Auslaßöffnung zum Sammeln des genannten Plasmas; und

das Abziehen von Plasma aus dem Kontakt mit einer zweiten Oberfläche des genannten Filters mit einer röhrenförmigen Kapillare, worin die zum Abziehen des genannten Plasmas eingesetzte Kraft durch die Kapillarwirkung der genannten Kapillare geliefert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der genannte Filter ein bindemittelfreier Glasmikrofaserfilter ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der genannte Filter eine Dicke von 0,5 bis 0,9 mm und eine Teilchengrößenretention von etwa 1 bis 3 um aufweist und Glasfasern umfaßt, deren Durchmesser alle im wesentlichen im Bereich von 0,10 bis 4,0 um liegen, wobei zumindest 60% der Fasern Durchmesser im Bereich von 0,10 bis 1,23 um aufweisen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin 50 ul oder weniger an Voll-Blut auf den genannten Filter aufgebracht werden.