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DE3600563A1 - Waermebestaendige sarcosinoxidase n und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Waermebestaendige sarcosinoxidase n und verfahren zu deren herstellung

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Publication number
DE3600563A1
DE3600563A1 DE19863600563 DE3600563A DE3600563A1 DE 3600563 A1 DE3600563 A1 DE 3600563A1 DE 19863600563 DE19863600563 DE 19863600563 DE 3600563 A DE3600563 A DE 3600563A DE 3600563 A1 DE3600563 A1 DE 3600563A1
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DE
Germany
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sarcosine
sarcosine oxidase
enzyme
oxidase
stable
Prior art date
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Application number
DE19863600563
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DE3600563C2 (de
Inventor
Masaru Kashiwa Suzuki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Noda Institute for Scientific Research
Original Assignee
Noda Institute for Scientific Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Noda Institute for Scientific Research filed Critical Noda Institute for Scientific Research
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

NODA INSTITUTE FOR SCIENTIFIC RESEARCH, Noda-Shi / Japan
Wärmebeständige Sarcosinoxidase N und Verfahren zu deren Herstellung
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft eine neue wärmebeständige Sarcosinoxidase N und ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Sarcosinoxidase ist ein Enzym, das die folgende Reaktion katalysiert:
Sarcosin + H^O + O2 —* Glycin + Formaldehyd + H3O2
Sarcosinoxidase ist bekannt und wird z.B. in US-PS 4,216,292 und J. Biochem. 89, 599 (1981), Japan, beschrieben.
yj Auf dem Gebiet der klinischen Medizin erfolgt die quantitative Bestimmung von Creatinin oder Creatin, welche im Serum und Urin vorliegen, gegenwärtig zur Untersuchung von Nierenstörungen, Muskelstörungen, etc.. Zur Durchführung
dieser Bestimmung kennt man die sogenannte Jaffe-Methode, nach welcher Creatinin mit alkalischer Picrinsäure umgesetzt und die erhaltene orange Färbung gemessen wird. Diese Reaktion der Farbentwicklung wird durch verschiedene Substanzen, die im Serum und Urin vorliegen, nachteilig beeinflusst und stellt somit eine nicht-spezifische Reaktion dar. Aus diesem Grunde ist der nach der Jaffe-Methode erhaltene Wert nicht besonders verlässlich.
10 Da ausserdem in vielen Fällen ein Schritt der
Proteinentfernung erforderlich ist, ist das Verfahren in seiner Ausführung schwierig.
In letzer Zeit wurde von einem Verfahren zur enzymatisehen Bestimmung von Creatinin oder Creatin berichtet (Clinical
Science Symposium No. 19, 196 [1979]). Nach diesem Verfahren verwendet man Sarcosinoxidase, wie dies nachfolgend gezeigt wird. In den folgenden Formeln werden die eingesetzten Enzyme in Klammern angegeben.
20
Creatinin + H2O Creatin
(Creatinin-amidohydrolase)
Creatin + H2O — —^ Sarcosin + Harnstoff
25 (Creatin-amidinohydrolase)
Sarcosin + H2O + O2 « ^. Glycin + Formaldehyd +
H2O2
(Sarcosinoxidase) 30
Da jedoch die Menge an Creatinin oder Creatin, die im Serum und Urin vorliegt, sehr klein ist, war es erforderlich, ein hoch sensitives Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von
Creatinin oder Creatin zu entwickeln. 35
ORIGINAL
Kürzlich wurde ein Färbemittel entwickelt, welches eine hoch sensitive Färbung bildet , wenn Wasserstoffperoxid (HJD2) im neutralen oder leicht sauren Bereich mit einer aus Meerrettich erhaltenen Peroxidase behandelt wird. Diese Farbe ist blau oder grün und unterscheidet sich von dem Gelb oder Rot, das von Serumkomponenten herrührt; aus diesem Grunde ist keine Blindmessung für Serum notwendig, was vorteilhaft ist. Die vorstehend genannte Färbung ist jedoch instabil und verschwindet bei pH 7,5 oder darüber. Aus diesem Grunde ist es erforderlich, die enzymatische Reaktion/Farbentwicklungsreaktion im neutralen oder leicht sauren Bereich durchzuführen, um eine stabile Farbentwicklungsreaktion zu erhalten. Da ausserdem das pH-Optimum von Peroxidase bei oder um 6,5 liegt (leicht sauer), ist es erforderlich, dass die gekoppelten Enzyme auch im leicht sauren Bereich eine befriedigende enzymatische Reaktion ergeben.
Es ist erforderlich, dass die Enyzme zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin in einem hoch reinen Zustand vorliegen und frei von Begleitenzymen sind. Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, Enzyme mit hoher relativer Aktivität und hoher Reinheit zu entwickeln, die bei einem Massenreinigungsschritt erhalten werden, wobei andere begleitende Enzyme (z.B. Katalase und Urikase) durch eine Wärmebehandlung vollständig inaktiviert werden.
Da die im Serum und Urin enthaltene Menge an Creatinin oder Creatin gering ist, ist auch die bei der enzymatischen Zersetzung von Creatinin oder Creatin gebildete Menge an Saracosin gering. Aus diesem Grunde ist vom industriellen Standpunkt her die Entwicklung eines Enzymes wünschenswert, das auch in Anwesenheit derart geringer Mengen an Sarcosin reagiert und einen niederen K -Wert (Michaelis-Konstante)
35 aufweist.
Λ- Diese Autgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst
Von den Erfindern wurden ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um eine neue Sarcosinoxidase zur Verfugung zu stellen, die zur hochempfindlichen enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin geeignet ist, die auch im leicht Sauren eine befriedigende enzymatische Aktivität aufweist, wärmestabil ist und für Sarcosin einen niederen K -Wert besitzt. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde gefunden, dass beim Kultivieren eines zur Gattung Bacillus gehörenden Stammes, der aus Erde neu isoliert wurde, eine neue Sarcosinoxidase erhalten werden kann, die auch im leicht Sauren eine befriedigende enzymatische Aktivität aufweist, wärmebeständig ist und für Sarcosin einen niederen K -Wert besitzt. Diese Befunde haben zur vorliegenden Erfindung geführt.
Die vorstehende Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N gelöst, die über die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften verfügt:
(a) Aktivität
Sarcosinoxidase N katalysiert die folgende Enzymreaktion, bei welcher Sarcosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird:
Sarcosin + H2O + O2 ^
Glycin + Formaldehyd + 30
(b) Substratspezifität
Sarcosinoxidase besitzt einen K -Wert (Michaelis-
Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einem pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung);
(c) pH-Optimum und stabiler pH-Bereich
der optimale pH von Sarcosinoxidase N liegt bei 6,7 bis lü,0, wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird; der stabile pH-Bereich reicht von 6,5 bis 11,5;
(d) optimaler Temperaturbereich
45 bis 6ü°C
(e) Wärmestabilität
Sarcosinoxidase N behält nach 10-minütigem Behandeln bei 55°C zu 98 % und nach 10-minütigem Behandeln bei 600C zu 75 % ihre enzymatische Aktivität bei;
(f) Molekulargewicht
ca. 49.000 bei Bestimmung nach der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex G-150;
(g) Flavinenzymprotein
Sarcosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent gebundenes Flavin-adenin-dinucleotid (FAD) pro Mol Enzym.
Die Erfindung umfasst im weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer wärmebeständigen Sarcosinoxidase N, das gekennzeichnet ist durch das Züchten eines zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der in der Lage ist, eine wärmbeständige Sarcosinoxidase N zu bilden, in einem Medium und Sammeln der in diesem Kulturmedium gebildeten wärmebeständigen Sarcosinoxidase N.
In üen Zeichnungen zeigt
Fig. 1 den optimalen pH des erfindungsgemässen Enzyms; Fig. 2 gibt den optimalen Temperaturbereich des Enzyms
gemäss der Erfindung wieder; Fig. 3 zeigt die Wärmestabilität des erfindungsgemässen
Enzyms, und
Fig. 4 gibt die pH-Stabilität des Enyzms gemäss der
Erfindung wieder.
10 Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des
erfindungsgemässen Enzyms (wärmebeständige Sarcosinoxidase N), wenn dieses gereinigt ist, werden nachfolgenden näher beschrieben.
15 (1) Aktivität
Das erfindungsgemässe Enzym katalysiert die folgende enzymatische Reaktion, bei welcher Sarcosin unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid oxidativ zersetzt wird:
Saracosin + H2O + O2 · ■>
Glycin + Formaldehyd + H O„
25 (2) Substratspezifität
Die Substratspezifität des vorliegenden Enzyms wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen untersucht.
Zu 0,5 ml einer 0,2 M Substratlösung, 0,1 ml einer 0,3 M Phosphatpufferlösung von pH 7,7, 0,1 ml einer 0,2 %igen 2,4-Dichlorphenolsulfonat-Lösung, 0,1 ml einer 4-Aminoantipyrin (70 mg/dl)-Lösung und 0,1 ml einer Peroxidase (70 Einheiten/ml)-Lösung wurden 0,1 ml einer Lösung zugegeben, welche 17 Einheiten/ml (sofern dies
erforderlich war, erfolgte eine entsprechende Verdünnung mit einer 0,3 M Phosphatpufferlösung von pH 7,7) des vorliegenden Enzyms (wärmebeständige Sarcosinoxidase N) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml 0,5 N Essigsäure gestoppt. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 510 nm gemessen, wobei als Kontrolle das gleiche Reaktionsgemisch mit der Reaktionszeit 0 eingesetzt wurde. Die relative Aktivität für ein Substrat wurde ausgedrückt als Prozent der Extinktion bei 510 nm, wenn das Substrat bei 510 nm der vorstehenden Enzymreaktion unterworfen wurde, bezogen auf N-Methylglycin (Sarcosin), welches der gleichen Enzymreaktion unterworfen wurde.
Substrat Relative Aktivität (%)
N-Methylglycin (Sarcosin) 100
N-Methyl-L-alanin 31,3
N-Methyl-L-valin 7,3
20 N-Methyl-L-isoleucin 5,3
N-Methyl-L-serin 0
N-Methyl-L-glutaminsäure 0
N-Methyl-L-lysin 0
Sarcosylglycin 0
25 Glycin 0,09
L-Alanin 0
L-Valin 0
L-Isoleucin 0
L-Threonin 0
30 L-Serin 0
D-Glutaminsäure 0
D-Asparaginsäure 0
Tyramin 0
Histamin 0
Ν,Ν-Dimethylglycin O
Betain 0
Cholin 0
1,3-Dimethylharnstoff 0
5 1-Methylguanidin 0
Das vorliegende Enzym besitzt einen Km~Wert (Michaelis-Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einen pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung). 10
(3) Optimaler pH
Der optimale pH des vorliegenden Enzyms liegt bei 6,7 bis 10,0, wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird. Dies ist
Fig. 1 zu entnehmen. In Fig. 1 bedeuten: ο ο PIPES-
Pufferlösung (pH 6,0 bis 6,7); · · eine
2,2-Dimethylglutarat-Pufferlösung (pH 6,0 bis 7,0); Δ Δ
eine Phosphatpufferlösung (pH 7,0 bis 8,5); ^ ^ eine
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5 bis 9,0); ö P eine
Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,0); und X X
eine Glycin-NaCl-NaOH-Pufferlösung (pH 10,0 bis 12,0).
(4) Enzymbestimmung
Erstes Verfahren: Sarcosin wird durch Einwirkung des vorliegenden Enzyms oxidativ zersetzt und das erhaltene Formaldehyd kolorimetrisch bestimmt.
Zu 0,3 ml einer 0,2 M Sarcosinlösung wurden 0,1 ml einer 0,3 M Phosphatpufferlösung (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung, welche eine geeignete Konzentration des vorliegenden Enzyms enthielt, gegeben. Das Ganze wurde 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml einer 1,0 N Essigsäurelösung gestoppt. Es wurden 3 ml eines
Farbreagens (pH 6,5), welches 0,02 % (V/V) Acetylaceton und 10 % (G/V) Diammoniumhydrogenphosphat enthielt, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 40 Minuten bei 37°C zur Farbentwicklung stehen gelassen. Die Extinktion erhaltenen Färbung wurde bei 410 nm unter V rwendung eines fotoelektrischen Fotometers gemessen.
Unter Verwendung einer Kalibrationskurve zwischen Menge Formaldehyd und Extinktion, die vorweg aufgestellt worden war, wurde die zur vorstehend bestimmten Extinktion gehörige Menge Formaldehyderhalten. Aus dieser Menge wurde die Menge des vorliegenden Enzyms berechnet, die zur Bildung von l,uMol Formaldehyd pro Minute bei 37°C erforderlich ist. Diese Menge des vorliegenden Enzyms wurde als eine Einheit
15 bezeichnet.
Zweites Verfahren: Sarcosin wird unter Einwirkung des vorliegenden Enzyms oxidativ zersetzt und das erhaltene Wasserstoffperoxid (H3O2) kolorimetrisch bestimmt.
0,1 ml einer Lösung, welche eine geeignete Konzentration des vorliegenden Enzyms enthielt, wurde zu einem Gemisch aus 0,5 ml einer 0,2 M Sarcosinlösung, 0,1 ml einer 0,3 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), 0,1 ml einer 0,2 %igen 2,4-Dichlorphenolsulfonat-Lösung, 0,1 ml einer 70 mg/100 ml 4-Aminoantipyrin-Lösung und 0,1 ml einer 70 Einheiten/ml enthaltenden Peroxidase-Lösung gegeben, bieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 370C inkubiert. Durch Zugabe von 2 ml 0,5 N Essigsäurelösung wurde die Reaktio gestoppt. Die Extinktion der erhaltenen Färbung bei 510 nm wurde unter Verwendung eines fotoelektrischen Fotometers gemessen.
Unter Verwendung einerKalibrationskurve
Wasserstoffperoxidmenge/Extinktion, die vorher aufgestellt 35
worden war, wurde die der erhaltenen Extinktion entsprechende Menge an Wasserstoffperoxid ermittelt. Aus dieser Menge wurde die Menge an vorliegendem Enzym berechnet, die zur Bildung von l,uMol Wasserstoffperoxid pro Minute bei 37°C erforderlich ist. Diese Menge des vorliegenden Enzyms wurde als eine Einheit definiert.
(5) Optimaler Temperaturbereich
Der optimale Temperaturbereich des vorliegenden Enzyms liegt bei 45°C bis 600C, wie dies aus Fig. 2 hervorgeht.
(6) Wärmestabilität
0,1 ml einer 0,3 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), welche 0,1 Einheiten des vorliegenden gereinigten Enzyms enthielt, wurde 10 Minuten lang bei verschiedenen Temperature belassen und dann jeweils die verbleibenden enzymatischen Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind Fig. 3 zu entnehmen. Aus Fig. 3 ist klar zu ersehen, dass das vorliegende, gereinigte Enzym selbst nach Inkubation bei 6O0C eine Restaktivität von 75% aufwies. Die Aktivität des vorliegenden Enzyms nahm nach einer Behandlung bei 500C für 30 Minuten überhaupt nicht ab. Nach einer 10-minütigen Behandlung bei 550C behielt das
25 Enzym 98% seiner Aktivität.
(7) pH-Stabilität
0,5 ml einer jeden Pufferlösung, welche 0,19 Einheiten des vorliegenden Enzyms enthielt^ wurden 48 Stunden bei 5°C stehen gelasen und dann die verbleibende enzymatische Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Fig. 4 ist zu entnehmen, dass das vorliegende Enzym im
pH-Bereich von 6,5 bis 11,5 stabil ist. In Fig. 4 bedeuten: 35
ο ο eine PIPES-Pufferlösung (pH 6,0 bis 6,7);
eine Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0 bis 8,5); Δ Δ eine
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0 bis 9,0); A A eine
Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,0); und α D
eine Glycin-NaCl-NaOH-Pufferlösung (pH 10,0 bis 12,0).
(8) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung
Das vorliegende Enzym wird jeweils durch 2 mM Cu , Zn , Ag+, Hg , MonoJodessigsäure, Kaliumcyanid und N-Ethylmaleimid stark inhibiert.
Es gibt keinen speziellen Aktivator oder Stabilisator. (9) Reinigung
Das vorliegende Enzym kann nach einem Reinigungsverfahren gereinigt werden, wie es später beschrieben wird.
20 (10) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde mittels einem Säulen-Gel-Filtrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Andrews (P. Andrews, Biochem. J., 96, 595 [1965]) bestimmt. Dabei zeigte sich, dass das vorliegende Enzym ein Molekulargewicht von 49.000 in einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung, welche 0,1 M Natriumchlorid enthielt, besitzt.
(11) Isoelektrischer Punkt
Das vorliegende Enzym besitzt einen isoelektrischen Punkt (pi) von 5,30, bestimmt mit Hilfe der Discelektrophorese-Methode.
(12) Discelektrophorese
Das vorliegende Enzym wurde einer Discelektrophorese [3 mA/Gel, 5°C, 65 Minuten (Migrationszeit des Trenngels)] unter Verwendung eines Gels von pH 9,4 gemäss Davis (B.J. Davis, Ann. New York Acad. Sei., 121, 404 [1964]) unterworfen und dann mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt. Es zeigte sich eine einzige Bande in einer Entfernung von 3,9 cm vom Ausgangspunkt gegen die Anode (Bromphenol-Blau wanderte 4,0 cm), wenn der Acrylamidgehalt in dem Gel 7,5 % betrug. Wenn der Acrylamidgehalt 15 % betrug, konnte man eine einzige Bande in einer Entfernung von 1,3 cm vom Ausgangspunkt in Richtung auf die Anode beobachten.
(13) Flavinenzym
Das vorliegende Enzym ist gelb; ein Mol des Enzymproteins enthält 1 Mol Flavin-adenin-dinucleotid (FAD), welches kovalent an das genannte Enzymprotein gebunden ist.
Das vorliegende Enzym mit den vorstehend genannten physikalisch-chemischen Eigenschaften wird in Tabelle 1 mit konventionellen Sarcosinoxidasen verglichen. 25
pH-Optimum
Tabelle
vorliegendes Enzym
bekanntes Enzym*
6,7 bis 10,0
etwa 9' 2 bekanntes Enzym* CD
CD
1,1 bis 8,5
K -Wert für m
Sarcosin
4,7 χ 10~3 (37°C, pH 7,7) 3,4 χ 10 (370C, pH 7,7)
Wä rmestabi-I i tat
Stabil nach 30-minütigem Stehenlassen bei 500C. Behält seine Aktivität zu 75% bei, wenn man es Minuten bei 600C stehen lässt. Stabil bei 10-minütigem
Stehenlassen bei 4O0C.
Nach 10-minütiger Behandlung bei 600C vollständig
inaktiviert.
Stabil bei 10-minütigem Stehenlassen bei 37°C. Nach 10-minut igem Stehenlassen bei 45°C vol Iständig inaktiviert
Isoelektrischer Punkt
5,30
4,7 4,33
Mo Ieku la rgewi cht
49.000
40.000 174.000
F I avi nenzym
1 Mol FAD* ist kovalent an 1 Mol des Enzymproteins gebunden 1 Mol des Enzymp roteins enthält 1 Mol kovalent gebundenes FAD und 1 Mo I nichtkovalent gebundenes FAD.
Subst ratspez i f i tät
Keine Aktivität auf Betain, Dimethylglycin und Lysin. Aktivität auf Betain (0,03%)
Dimethylglycin (0,01%)
Lysin (0,07%).
Keine Aktivität auf Betain, Dimethylglycin und Lysin.
* 1 Sarcosinoxidase, wie sie in US-PS 4,216,292 beschrieben ist.
*2 Sarcosinoxidase, wie sie in J. Biochem. 89, 599 (1981), Japan, beschrieben ist.
*3 Abkürzung für Flavin-adenin-dinucleotid.
Wir vorstehend erwähnt, unterscheidet sich das vorliegende Enzym von sämtlichen bekannten Saracosinoxidasen in der Enzymchemie und den physikalisch-chemischen Eigenschaften, und insbesondere dadurch, dass es im Vergleich zu konventionellen Sarcosinoxidasen eine sehr hohe Wärmestabilität besitzt. Das vorliegende Enzym wird daher bei Verwendung bei hohen Temperaturen nicht inaktiviert, was vorteilhaft ist. Bei der Reinigung des vorliegenden Enzyms im grossen Massstab können ausserdem andere, begleitende Enzyme (z.B. Katalase, die H3O zersetzt) vollständig inaktiviert werden, wodurch das vorliegende Enzym in einfacher Weise in einer hohen Reinheit erhalten wird.
Das vorliegende Enzym besitzt ausserdem selbst unter leicht sauren Bedingungen eine ausreichende enzymatische Aktivität, was bei konventionellen Sarcosinoxidasen nicht der Fall ist . Dies ist besonders dann von Vorteil , wenn ein hochempfindliches Farbreagens, das die Bestimmung einer kleinen Menge Creatinin oder Creatin erlaubt, verwendet wird. Der Grund hierfür ist folgender: Das genannte Farbreagens, welches im langwelligen Bereich (600 bis 750 nm) ein Extinktionsmaximum besitzt, entwickelt eine Färbung hoher Empfindlichkeit, ist jedoch bei pH 7,2 oder darüber instabil; der optimale pH der verwendeten Peroxidase in den gekoppelten Reaktionen zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin liegt um 6,5; somit ist es erforderlich, die Enzymreaktion zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin bei pH 6/5 bis 7,2 auszuführen; im Hinblick darauf ist das vorliegende Enzym weit besser geeignet als irgendwelche konventionellen Enzyme.
Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung wärmebeständiger Sarcosinoxidase N gemäss der Erfindung beschrieben.
Der gemäss der Erfindung verwendete Mikroorganismus stellt einen Stamm dar, der zur Gattung Bacillus gehört und in der Lage ist, eine neue Sarcosinoxidase N zu produzieren. Spezifische Beispiele des Mikroorganismus umfassen Bacillus sp. NS-129. Es kann auch eine Variante oder eine Mutante desselben verwendet werden. Bacillus sp. NS-129 ist ein Stamm, der neuerdings von den Erfindern aus Erde isoliert wurde und die folgenden taxonomischen Eigenschaften besitzt.
10 (a) Morphologie
Mikroskopische Beobachtung beim Züchten bei 30°C für 1 bis 3 Tage in einem Bouillon-Agar-Medium.
(l) Grosse der Zellen: Bacillus mit 1,3 - 1,9 x 3,8 - 6,4 /U .
(2) Polymorphismus der Zellen: keiner.
(3) Motilität: Peritriktische Lokomotion.
(4) Spore: Bildet Endosporen in 2 bis 3 Tagen im Mittelpunkt oder nahe dem Rand der Zelle. Die Gestalt der Sporen ist elliptisch. Ihre Grosse ist 1,5 χ 2,3,u. Die Zellen sind von den Sporen gequollen.
(5) Gram-Färbung: Positiv.
(6) Säurefeste Färbung: Negativ. 25
(b) Wachstum in verschiedenen Medien
(1) Bouillon-Agar-Plattenkultur: Bildung leicht grau-brauner Kolonien nach 24 h bei 300C. Diese Kolonien haben eine glatte Oberfläche und einen matten Glanz und sind opak. Keine Pigmentbildung.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur: Gutes Wachstum. Ebenso wie in (1).
(3) Bouillon-Flüssigkultur: In stationärer Kultur ist das Wachstum schlecht; die gezüchteten Bakterienzellen präzipitieren.
(4) Bouillon-Gelatine-Stichkultur (stab culture) : Selbst beim Züchten bei 5 25°C oder 300C erfolgt keine Verflüssigung. Das
Bakterium wächst auch in Schüttelkultur, es tritt jedoch keine Verflüssigung auf.
(5) Lacmusmilch: Keine Veränderung.
(c) Physiologische Eigenschaften
(1) Nitratreduktion: positiv
(2) Denitrifikationsreaktion: negativ
(3) MP-Test: negativ (4) vP-Test: negativ
(5) Indol-Bildung: negativ
(6) Schwefelwasserstoffbildung: positiv
(7) Stärkehydrolyse: negativ
(8) Kasein-Hydrolyse: negativ
20 (9) Zersetzung von Harnsäure (Produktion von Urikase): negativ
(10) Zersetzung von Tyrosin: negativ
(11) Hydrolyse von Cellulose: negativ
(12) Verwertung von Citronensäure: negativ im Simons-Medium 25 und positiv im Christensen-Medium
(13) Verwertung von anorganischem Stickstoff: Verwertet Ammoniak, jedoch schwach. Verwertet Nitrate kaum.
(14) Urease: negativ
(15) Oxidase: positiv (16) Katalase: positiv
(17) Pigmentbildung: negativ
(18) Salzresistenz: wächst bis zu 5 % (NaCl)
(19) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
(20) Wachstumsbereiche: der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 6,0 bis 9,0. Der Temperaturbereich für das Wachstum liegt zwischen 25° und 45°C.
(21) Extinktionstemperatur: keine Extinktion bei einer Behandlung bei 800C für 30 Minuten. Vollständige Extinktion bei einer Behandlung bei 85°C für 30 Minuten .
(22) O-F-Test: keine Reaktion. Keine Veränderung in einem Agarmedium, welches Glycerin oder Glucose verwendet. In einer aeroben Schüttelkultur wächst das Bakterium in einem Pepton-Hefeextrakt-Medium gut, jedoch keine Säurebildung.
(23) Bildung von Säuren und Basen aus Sacchariden: Die Säurebildung wurde in einer stationären Kultur wie auch in einer Schüttelkultur untersucht. Die Gasbildung wurde in einer stationären Kultur untersucht. Es ergab sich, dass weder Säure noch Gas aus den folgenden eingesetzten Sacchariden gebildet wurde: Inosit, D-Galactöse D-Mannose, D-Ribose, Trehalose, L-Arabinose, D-Xylose, Erythrit, L-Rhamnose, Mannit, Sucrose, Maltose, Fructose, Lactose, D-Arabinose, L-Sorbose, L-Rhamnose, Dextrin, Sorbit, D-(+)-Raffinose, Salicin, Inulin, D-(+)-Melibiose, Glycerin, Glucose, Cellobiose, Melezitose, Xylit.
(d) Weitere Eigenschaften
Die Bakterien wachsen gut in einem Medium, welches Vitamin-freie Casaminsäure, Kaliumphosphat und 30 MgSO4 ' 7H2O enthält.
Wenn man die taxonomischen Eigenschaften des vorliegenden Stammes, der in der Lage ist, wärmebeständige Sarcosinoxidase N zu produzieren, mit der Klassifizierung in 35
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,8. Ausgabe (1974), vergleicht, so wird man folgern, dass der vorliegende Stamm der Gattung Bacillus angehört, da er einen Bacillus mit einer positiven Gram-Färbung darstellt und aerobe Endosporen bildet; ausserdem folgert man, dass der vorliegende Stamm entweder von Bacillus firmus, Bacillus brevis, Bacillus fastidiosus, Bacillus freudenreichii, Bacillus badius, etc. herrührt, da die von dem vorliegenden Stamm gebildeten Sporen elliptisch bis oval sind und um das Zentrum der Bakterienzelle lokalisiert sind, und der vorliegende Stamm weder Säure noch Gas aus Glucose bildet, kein Acetoin bildet, sehr aerob ist und bei 3°C nicht wächst. Da jedoch Bacillus oxidativ aus Glucose Säuren bildet und Biotin erfordert, Bacillus fastidiosus Harnsäure kräftig zersetzt und alkalisch wird, und salpetrige Säure nicht reduziert, Bacillus freudenreichii Harnstoff verwertet und alkalisch wird, und Bacillus badius wurzeiförmige oder wollartige Kolonien in seinem Wachstum ausbildet, unterscheidet sich der vorliegende Stamm von diesen Bacilli . Der vorliegende Stamm gleicht am ehesten Bacillus brevis in seinen Eigenschaften, unterscheidet sich jedoch von demselben durch Hydrolyse von Tyrosin und Wachstum in 5%iger NaCl. Aus diesem Grunde wurde der vorliegende Stamm als Bacillus sp. NS-129 bezeichnet. Mit Wirkung vom 3.
Dezember 1984 wurde Bacillus sps?NS-129 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt; er erhielt
30 die Hinterlegungsnummer FERM BP-671.
Das gemäss der Erfindung verwendet Kulturmedium kann jedes beliebige synthetische oder natürliche Medium darstellen, so
lange es eine geeignete Kombination einer Kohlenstoffquelle, 35
einer Stickstoffquelle, anorganischer Salze und anderer Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle kann z.B. verwendet werden: Creatinin, Creatin/ Sarcosin/ Citronensäure und Fettsäuren. Als Stickstoffquelle können vorzugsweise z.B. verwendet werden: Substanzen vom Proteintyp und deren Abbauprodukte/ wie Pepton, Casein-Digest und Sojabohnenpulver, sowie auch stickstoffhaltige organische Substanzen, wie z.B. Hefeextrakt. Als anorganische Salze können z.B. verwendet werden: Salze von Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium, Calcium, Eisen, Kobalt und dergleichen.
Gemäss der Erfindung kann wärmebeständige Sarcosinoxidase N in höchster Ausbeute erhalten werden, wenn der vorliegende Stamm in einem creatinin-, creatin- oder sarcosinhaltigen Medium gezüchtet wird. Als bevorzugtes Beispiel eines solchen Kulturmediums ist z.B. zu nennen: ein Medium von pH 6,5, welches 0,8 % Sarcosin, 0,8 % Hefeextrakt, 2 % Polypepton, 0,05 % Kaliumbiphosphat, 0,05 % Kaliumdiphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat und 0,005 % Eisensulfat enthält.
Das Züchten des vorliegenden Stammes wird üblicherweise bei 25° bis 400C durchgeführt, vorzugweise bei oder um 300C. Der Ausgangs-pH des Kulturmediums beträgt gewöhnlich 6 bis 8, vorzugsweise um 6,5. Beim Durchführen einer Schüttelkultur oder einer Submers-Rührkultur für 16 bis 24 h unter den entsprechende Bedingungen,wird eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N gebildet und in effizienter Weise in dem
30 Kulturmedium akkumuliert.
Gelegentlich führen lange Kultivierungszeiten zu einer Bakteriolyse des vorliegenden Stammes, wodurch sich eine
Produktion des vorliegenden Enzymes ausserhalb der Zellen 35
ergibt. Üblicherweise befindet sich jedoch das vorliegende Enzym innerhalb der Zellen. Aus diesem Grunde unterwirft man das Kulturmedium einer Zentrifugation, Filtration ©dec dergleichen, um die Bakterienzellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen werden in einer geeigneten Menge ei&€£ Pufferlösung zerstört und zwar mittels der Ultraschall-Methode, einer Methode unter Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms, einer chemischen Selbst-Abbau-Methode oder irgendeiner anderen geigneten
10 Methode, wobei das vorliegende Enzym in der Lösung
solubilisiert und isoliert wird. Aus der so erhaltenen enzymhaltigen Lösung entfernt man Nucleinsä'ure und Zellwinde mit Hilfe eines üblichen Verfahrens, unlösliches wird durch Filtration oder Zentrifugation entferntf wobei eine
15 wärmebeständige Sarcosinoxidase N erhalten wird.
Das erhaltene vorliegende Enzym wird, sofern dies erforderlich ist, einem üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Enzymen unterworfen. Z.B. kann das vorstehende Enzym unterworfen werden:
(1) Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Celluloee,
(2) Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat,
(3) Säulenchromatografie mittels QAE-Sephadex,
(4) hydrophober Chromatografie mittels TSK-GeI Butyl-Toyo Pearl 650C, hergestellt von TOYO SODA MFG. Co., Ltd.,
(5) Gelfiltration mittels Sephadex, oder
(6) einer geeigneten Kombination derselben, wodurch das vorliegende Enzym in gereinigter Form erhalten werden kann.
Ein Beispiel zur Reinigung des vorliegenden Enzyms wird nachfolgend beschrieben.
Die aus dem Kulturmedium gesammelten Bakterienzellen werden in einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 3,0
BAD ORIGINAL
suspendiert. Dazu wird ein Lysozym in einem Anteil von 50 mg/1 gegeben und die Bakteriolyse 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Dann gibt man hierzu ein Agens zur Entfernung von Nucleinsäuren, wie z.B. Magnesiumsulfat, Polyethylimin, Protaminsulfat, Streptomycin oder dergleichen. Der gebildete Niederschlag wird durch Cellulosefiltration entfernt. Die erhaltene Enzymlösung wird 1 bis 2 h bei 500C behandelt; daraufhin wird die Lösung erneut einer Cellulosefiltration unterworfen. Das Filtrat lässt man an QAE-Sephadex A-50 (gepackt in einer Säule) adsorbieren, welches vorher mit einer 0/01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 8/0 gepuffert worden war; wäscht mit einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 8/0/ welche 0,1 M Natriumchlorid enthält, und führt dann eine Eluierung mittels Konzentrationsgradient unter Verwendung von 0,1 bis 0,6 M NaCl-Lösungen durch. Die eluierten aktiven Fraktionen werden vereinigt. In diesem Eluat löst man Ammoniumsulfat in einem Anteil von 20 g/100 ml auf. Die erhaltene Lösung adsorbiert man an TSK-GeI Butyl-Toyo Pearl 650C (hergestellt von TOYO SODA MFG. Co./ Ltd.), gepackt in einer Säule, welche vorher mit einer 0/01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0/ welche 20 % Ammoniumsulfat enthielt, gepuffert worden war, wäscht mit der gleichen Pufferlösung und eluiert dann unter Verwendung von 0/01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 8/0, welche 10%iges Ammoniumsulfat enthält, wobei ein gelbes Enzym eluiert wird. Diese aktive Fraktion unterwirft man einer Säulenchromatografie mittels Sephadex G-150, welches vorher mit einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung von pH 8/0/ welcher 0/1 M NaCl enthielt/ gepuffert worden war/ wobei man eine Fraktion erhält/ die das vorliegende Enzym enthält. Die Fraktion wird konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man das vorliegende Enzym als gereinigtes Enzympulver erhält.
Die vorliegende Erfindung stellt eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N zur Verfügung, die als diagnostisches Enzym zur Bestimmung von Nierenstörungen/ Muskelstörungen/ etc., sehr geeignet ist. Ausserdem wird ein Verfahren zur effizienten Herstellung diese Enzyms geschaffen. Somit hat die vorliegende Erfindung eine besondere industrielle Bedeutung.
Im folgenden wird ein Beispiel gemäss der Erfindung beschrieben, das jedoch keine Beschränkung der Erfindung darstellen soll.
Beispiel
Bacillus sp. NS-129 (FERM BP-671) wurde in 100 ml eines Bouillon-Mediums, welches sich in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben befand, inokuliert; die Kultivierung erfolgte 16 h bei 300C. Das erhaltene Impfkulturmedium wurde in 200 ml eines emzymproduzierenden Mediums von pH 6,5 inokuliert, welches enthielt: 0,8 % Sarcosin, 2 % eines Polypeptons, 8 % Hefeextrakt, 0,05 % Kaliumbiphosphat, 0,05 % Dikaliumphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat und 0,005 % Eisensulfat; die Kultur befand sich in einem Fermenter mit einem 30-Liter-Kolben. Die Kultivierung erfolgte 18 h bei 300C unter folgenden Bedingungen: Luftströmung 20 l/Min., Rühren bei 350 UpM. Das erhaltene Kulturmedium wurde zum Sammeln der Bakterienzellen zentrifugiert.
Zu einem Teil (110 g) dieser Bakterienzellen wurden 1,5 1 einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) zugegeben und die Zellen gründlich in der Lösung dispergiert. Dazu wurden 100 mg Lysozym, das aus Eiweiss erhalten worden war, gegeben und die Bakteriolyse 1 h bei 37°C durchgeführt; daraufhin wurde 2 h auf 5O0C erwärmt, um andere begleitende Proteine
zu denaturieren. Daraufhin wurde eine gesättigte Lösung (pH 7,5) Protaminsulfat zugegeben, bis sich kein Niederschlag mehr bildete. Nacheinander wurden 5 g Cellulosepulver zugegeben und, nach gründlichem Rühren, wurde das Gemisch durch ein Filterpapier filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde auf eine QAE-jSephadex A-50-Säule (hergestellt von Pharmacia Co., 3 cm Durchmesser x 50 cm), welche vorher mit einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,05 M NaCl enthielt, gepuffert worden war, gegeben. Gründliches Waschen erfolgte mit einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,1 M NaCl enthielt. Daraufhin wurde das Enzym mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0,1 bis 0,5 M eluiert. In den aktiven Fraktionen des Eluats wurde Ammoniumsulfat in eine m Anteil von 20 g/100 1 aufgelöst. Diese Lösung wurde an TSK-GeI Butyl-Toyo Pearl 650C, gepackt in einer Säule (3 cm Durchmesser x 10 cm), welche vorher mit 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welcher 20 % Ammoniumsulfat enthielt, gepuffert worden war, adsorbiert, mit der gleichen, ammoniumsulfathaltigen Pufferlösung gewaschen und
2" dann mit 0,01 M Phosphat-Pufferlösung, welche 10 %
Ammoniumsulfat enthielt, eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden mittels einer
Ultra-Filtrations-Vorrichtung (Fraktionierungsmembran 10.000), hergestellt von Amicon Co., USA, konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration mittels Sephadex G-150, gepackt in einer Säule (1,2 cm Durchmesser χ 100 cm), welche vorher mit einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,1 M NaCl enthielt, gepuffert worden war, unterworfen. Die erhaltene aktive Fraktion wurde auf ca.
30 3 ml mittels einer Ultra-Filtrations-Vorrichtung
konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei 90,9 mg eines gereinigten gelben Enzympulvers erhalten wurde. Dieses wies eine relative Aktivität von 30,1 Einheiten/mg auf; die Ausbeute betrug 17,1 %.
- Leerseite -

Claims (10)

HODA INSTITUTE FOR SCIENTIFIC RESEARCH, Noda-Shi / Japan Wärmebeständige Sarcosinoxidase N und Verfahren zu deren Herstellung PATENTANSPRÜCHE
1. Wärmebeständige Sarcosinoxidase N, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
(a) Aktivität ι
Sarcosinoxidase N katalysiert die folgende <■
Enzymreaktion, bei welcher Sarcosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird:
Sarcosin + H3O + O„
Glycin+Formaldehyd + H3O2 (b) Substratspezifität
Sarcosinoxidase N besitzt einen K -Wert (Michaelis-Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einem pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung);
rlf-Γ: OP.:1»
(c) pli-Optimum und stabiler pH-Bereich
der optimale pH von Sarcosinoxidase N liegt bei 6,7 bis 10,0, wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird; der stabile pH-Bereich reicht von 6,5 bis 11,5;
(d) optimaler Temperaturbereich
45 bis 600C
10
(e) Wärmestabilität
Sarcosinoxidase N behält nach 10-minütigem Behandeln bei Sb0C zu 98 % und nach 10-minütigem Behandeln bei 600C zu 75 % ihre enzymatische Aktivität bei;
(f) Molekulargewicht
j ca. 49.000 bei Bestimmung nach der
Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex G-150;
(g) Flavinenzymprotein
Sarcosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent gebundenes Flavin-adenin-dinucleotid (FAD) pro Mol Enzym.
2. Verfahren zur Herstellung wärmebeständiger
Sarcosinoxidase N, gekennzeichnet durch Kultivieren eines der Gattung Bacillus angehörenden
Mikroorganismus, der in der Lage ist, wärmebeständige Sarcosinoxidase N zu produzieren, in einem Medium und dann Sammeln der in dem Kulturmedium gebildeten Sarcosinoxidase N.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der der Gattung Bacillus angehörende Mikroorganismus Bacillus sp. NS-129 (FERM BP-671) darstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Quelle für anorganische Substanz enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Creatinin, Creatin oder Sarcosin enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren bei 25°C bis 4O0C bei einem pH von 6 bis 8 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren 16 bis 24 Stunden in Schüttelkultur oder Eintauch-Rührkultur erfolgt.
8. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin, dadurch gekennzeichnet, dass in einer gekoppelten Enzymreaktion Sarcosinoxidase N mit den in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Sarcosinoxidase N aus einem der Gattung Bacillus angehörenden Mikroorganismus isoliert wurde.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Sarcosinoxidase N aus Bacillus sp
35 NS-129 (Ferm BP-671) isoliert wurde.
BAD ORfGiNAL
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