DE3689288T2

DE3689288T2 - Substituierte Pyridinderivate.

Info

Publication number: DE3689288T2
Application number: DE86103662T
Authority: DE
Inventors: Ron L Hale; Dennis W Solas
Original assignee: Baxter Diagnostics Inc
Current assignee: Baxter Healthcare Corp
Priority date: 1985-03-18
Filing date: 1986-03-18
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2006-03-19
Also published as: US4761481A; EP0525825A3; EP0195413A2; JPS62187454A; EP0525825B1; JP2623452B2; EP0195413A3; CA1276028C; EP0195413B1; JPH07116148B2; DE3689288D1; EP0525825A2; DE3650706T2; DE3650706D1; JPH07267927A

Description

Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Chemie und Biologie und stellt eine Fluorassay-Methode zur Verwendung auf diesen Gebieten zur Verfügung. Insbesondere betrifft sie eine Gruppe von Aryl-substituierten Pyridin-Verbindungen und deren Verwendung als Komponenten oder als Zwischenprodukte für Komponenten von fluoreszierenden Chelat-Markierungen für Fluorassay-Techniken.
Fluorassay-Techniken finden in der Chemie, Biochemie und bei medizinischen Analysen in verstärktem Maße Anwendung. Fluoreszenz-Meßmethoden sind intrinsisch höchstempfindlich. In der Praxis ist jedoch die Sensibilität von Fluorenszenz-Assays durch die Anwesenheit von Hintergrund-Fluoreszenz begrenzt.
In US-A-4 150 295 und 4 058 732 und in einem Kapitel auf den Seiten 67-80 von "Immunofluorescence and Related Staining Techniques", Herausgeber Knapp et al (1978, Elsevier/North Holland Biomedical Press) ist die allgemeine Ansicht ausgedrückt worden, daß Hintergrund-Fluoreszenz relativ kurzlebig ist und daß man als Fluoreszenz-Meßspezies Materialien vorteilhaft einsetzen kann, die eine langlebigere Fluoreszenz besitzen. In dieser Arbeit wird weiterhin festgestellt, daß man bei Verwendung einer intermittierenden Anregungsquelle und einer zeitgebundenen Fluoreszenzmessung die Hintergrund-Fluoreszenz im wesentlichen vermeiden oder abweisen kann, während die gewünschte Fluoreszenz gemessen wird.
Auf dem Fachgebiet sind Chelate seltener Erden als Materialien mit langlebiger Fluoreszenz nachgewiesen worden. Solche Materialien umfassen Metall-Ionen seltener Erden wie Terbium oder Europium, die mit einem oder mehreren Liganden wie Aminpolysäuren ein Chelat bilden (siehe US-A-4 352 751 von Wieder und Wollenberg), "Heteroatom-enthaltende Gruppen" einschließlich Iminodiacetat-substituierte Phenole, Cumarine und Phenanthroline (siehe Eastman Kodak EP-A-68875) und aromatische Diketone (siehe DE-A-2 628 158), um eine Zahl repräsentativer Veröffentlichungen zu nennen.
Auf dem Fachgebiet hat man erkannt, daß die folgenden Eigenschaften bei einer Chelat-bildenden Gruppe erwünscht sind.
1. Sie sollte einen stabilen Chelatkomplex mit der seltenen Erde bilden, d. h. mit einer Stabilitätskonstante (log K) von 17 oder mehr.
2. Der fluoreszierende Chelatkomplex mit der seltenen Erde sollte eine langlebige Fluoreszenz haben, d. h. eine Fluoreszenz, die nicht wesentlich abgeklungen ist, wenn die Hintergrund-Interferenz bereits abgeklungen ist.
3. Die Fluoreszenzanregung sollte bei einer längstmöglichen Wellenlänge erfolgen, vorzugsweise bei 300 nm oder mehr, 50 daß eine Beeinflussung vermieden wird, die gewöhnlich bei biologischen Proben bei Wellenlängen von etwa 270 nm auftritt.
4. Der fluoreszierende Komplex sollte eine starke Emission aufweisen, d. h. er sollte eine hohe Quantenausbeute haben.
Weiterhin sollten die Materialien Löslichkeit, chemische Stabilität und andere Eigenschaften haben, die mit der Natur der Proben (gewöhnlich wäßrige Proben) vereinbar sind, mit denen die Materialien verwendet werden.
Ungeachtet dieser Erkenntnisse auf dem Fachgebiet haben die bisher beschriebenen Materialien im allgemeinen eine oder mehrere dieser Eigenschaften nicht aufgewiesen. Zum Beispiel wird in EP-A-68875 darauf hingewiesen, daß die Fluoreszenz von Reagenzien wie aromatische Diketone (DE-A-2 628 158) wegen Problemen bezüglich der "wäßrigen Stabilität" in Wasser gelöscht wird, während die aromatischen Phenol-Ketonverbindungen, Cumarine und Phenanthroline (die besonders in EP- A-68875 beschrieben worden sind) einen Mangel an chemischer Stabilität und eine geringe Quantenausbeute aufweisen. Als Ergebnis dieser Mängel ist bisher kein weitverbreitetes verwendbares Reagenzsystem für Fluorassay-Techniken hergestellt worden.
Es besteht ein Bedarf nach einem fluoreszierenden Chelat- System, das diesen Eigenschaften besser entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Familie von substituierten Pyridin-Derivaten sowie Zwischenprodukte für diese, die in langlebige fluoreszierende Strukturarten mit seltenen Erdmetallen eingebracht werden können. Hinweise auf die allgemeinen Klassen substituierter Pyridin-Derivate geben z. B. US-A- 4 008 239, 3 970 662 und 3 907 808 sowie Carbeteas und Williams: "J. Heterocycl. Chem . . 11(5), 819 (1974)"; Weller und Luellen: "Tetrahedron Letters, Band 22 Nr. 44, S. 4381-84 (1981)" und Weller, Luellen und Weller: "J. Org. Chem. 47, 4803-06 (1982)". Die oben erwähnte EP-A-68875 ist ebenfalls von Interesse.
Es wurde nun gefunden, daß ein 2,6-Bis-[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin, das mit einem substituierten Aryl Ringsubstituiert ist, eine Gruppe ist, die zur Verwendung als ein Ligand bei der Bildung von fluoreszierenden Chelaten besonders attraktiv ist.
Entsprechend eines Aspekts schafft daher die vorliegende Erfindung Verbindungen, die durch Fluoreszenz nachweisbar sind, indem eine mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-Bis[N,N-di-[carboxyalkyl]aminoalkyl]pyridin-Komponente eingebunden wird. Diese Verbindungen umfassen vorzugsweise zusätzlich ein biologisch aktives Material und/oder die substituierte Arylgruppe ist eine Arylgruppe, substituiert mit einer oder mehreren Elektronen-abgebenden Gruppen, insbesondere jene, die ausgewählt sind aus C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;Alkyl-, Amino-, Dialkylamino-, Aryl-(einschließlich Aralkyl-) und Aryloxy- (einschließlich Aralkyloxy) -Gruppen.
Entsprechend einem speziellen Aspekt schafft diese Erfindung Verbindungen, die durch Fluoreszenz nachweisbar sind, und zwar infolge der Einbindung einer mit einer substituierten Arylgruppe substituierten 2,6-[N,N-Bis(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin-Komponente mit der Formel (I):
worin n und n' unabhängig voneinander 1 oder 2 sind, Ar Aryl bedeutet, n'' eine ganze Zahl gleich der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen von Ar ist, M Wasserstoff oder ein Metallion ist und jede der n'' R- und R'- und R''-Gruppen unabhängig voneinander ausgewählt werden aus Wasserstoff, Elektronen-abgebenden Gruppen einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, C&sub1;-C&sub4;- Alkyl, Amino, Dialkylamino, Aryl (einschließlich Aralkyl) und Aryloxy (einschließlich Aralkyloxy), und einer Verbindungsgruppe einschließlich einer kovalenten Bindung und einer Überbrückungsgruppe, die eine Bindung zum Rest des Moleküls schaffen kann, unter der Voraussetzung, daß wenigstens eine der n'' R-Gruppen eine Elektronen-abgebende Gruppe ist und daß wenigstens eine der R'-, R''- und n'' R-Gruppen eine Verbindungsgruppe zum Rest des Moleküls ist.
Der Rest des Moleküls kann ein biologisch aktives Material umfassen, das heißt, eine Hälfte eines biospezifischen (z. B. immunologischen) Paares sein, so daß es möglich ist, biospezifische. Assays durchzuführen.
Die Erfindung schafft Verbindungen, die die obige Komponente einbinden, welche Tetrasäuren sind (d. h. M = Wasserstoff). Sie schafft weiterhin Verbindungen, die Metallsalze sind, worin die 4 M eines oder mehrere Metallionen einschließlich eines Iones der seltenen Erdmetalle umfassen, um fluoreszierende Chelate der seltenen Erden zu bilden.
Die Verbindung stellt weiterhin als Zwischenprodukte Ester der obigen Tetrasäuren zur Verfügung.
Nach einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung Aryl-substituierte Pyridin-tetrasäure-Verbindungen im Gegensatz zu den oben erwähnten substituierten Pyridin-Komponenten. Diese Verbindungen haben die folgende Formel:
und Salze von diesen, die ebenfalls langlebige fluoreszierende Chelate mit seltenen Erden bilden, sowie Tetraester als Vorläufer von Tetrasäuren. In der Formel sind n und n' ganze Zahlen, ausgewählt von 1 und 21 R, R' und R'', die gleich oder verschieden sein können, sind Gruppen ausgewählt aus Wasserstoff und Elektronen-abgebenden Gruppen wie C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;- C&sub4;-Alkyl-, Amino-, (Di)alkylamino-, Aryl (einschließlich Aralkyl-) und Aryloxy- (einschließlich Aralkyloxy)-Gruppen, Ar ist eine Arylgruppe, insbesondere eine Phenyl- oder Naphthylgruppe und n'' ist eine ganze Zahl entsprechend der Zahl kovalenter Bindungsstellen, die an der Ar-Gruppe verfügbar sind. Diese Pyridin-tetrasäure-Verbindungen bilden Chelate mit seltenen Erdmetallen, vorzugsweise Europium und Terbium. Es wird bevorzugt, daß in den Gruppen der Formel (Ia) n und n' jeweils 1 ist und/oder wenigstens eine (und besonders bevorzugt eine) der R', R''-, n'' R-Gruppen eine Aminogruppe ist. In dem eben erwähnten, besonders bevorzugten Falle kann die Aminogruppe zu einer Isothiocyanat-Gruppe umgeformt werden.
Die erfindungsgemäßen Materialien bieten den Vorteil, daß sie Anregungswellenlängen von 280 nm oder mehr haben, wobei Anregungswellenlängen von 310 nm bis 325 nm oder mehr möglich sind, so daß Hintergrundinterferenz vermieden wird. Frühere Materialien, die Verschiebungen zu diesen Wellenlängen ermöglichten, verwendeten Strukturen, bei denen aromatische Ringe mit den Pyridinringen kondensiert waren. Im Vergleich zu diesen kondensierten Ringverbindungen weisen die erfindungsgemäßen Komponenten wesentlich verbesserte Quantenwirkungsgrade auf. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Materialien chemisch stabil, wasserlöslich und bilden hochstabile Metallkomplexe.
Entsprechend eines weiteren Aspekts schafft diese Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Erhöhung der Anregungswellenlängen von fluoreszierenden Seltenen-Erdchelaten bei hohen Quantenwirkungsgraden, sowie verbesserte Verfahren für Fluoroassay, wobei diese Verfahren die Verwendung der erfindungsgemäßen, aromatischen Ring-substituierten Pyridine als Chelat-bildende Liganden umfaßt.
Insbesondere schafft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer oder mehrerer der Verbindungen, die eine mit substituierter Arylgruppe substituierte 2,6-Bis-[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin- Komponente umfassen, wie hier beschrieben, wobei das Verfahren die photometrische Anregung der genannten Moleküle und die Anregung einer Fluoreszenzemission von dem genannten Molekül umfaßt.
Vorzugsweise erfolgt die genannte Anregung mit einem Strahlungsimpuls mit einer Dauer, die im Vergleich zu der Fluoreszenz-Abklingzeit des genannten Moleküls kurz ist, und der Nachweis der Fluoreszenz des genannten Moleküls erfolgt, nachdem die Fluoreszenz anderer anwesender Substanzen im wesentlichen abgeklungen ist.
Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausführungsform des genannten Verfahrens wird ein Chelat eines seltenen Erdmetalls des genannten Moleküls vor der genannten Anregung gebildet.

Die substituierten Pyridin-Komponenten

Die erfindungsgemäßen substituierten Pyridin-Komponenten werden in die Moleküle eingebunden, um aus diesen Molekülen durch Fluoreszenz nachweisbare Aryl-substituierte 2,6-Bis[N,N- di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridine zu machen. Die Aryl- Substituenten sind selbst substituiert, vorzugsweise mit wenigstens einer Elektronen-abgebenden Gruppe. Diese Materialien können durch die folgenden allgemeine Formel I beschrieben werden:
In dieser Formel sind n und n' ganze Zahlen von entweder 1 oder 2 und vorzugsweise gleich, mehr bevorzugt 1. Der Pyridinring trägt die Substituenten R', R'' und -Ar-(R)n''. Die R'- und R''-Substituenten können sein: Wasserstoff, Elektronen-abgebende Gruppen wie niedere Alkoxygruppen, d. h. C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, besonders Methoxy oder Ethoxy, niedere Alkylgruppen wie C&sub1;- C&sub4;-Alkyle wie Methyl, Ethyl, n- und Iso-Propyl und dergleichen; Aminogruppen; Alkylamino, z. B. Mono- und Dialkyl- und besonders Dialkylamino, z. B. Dialkylaminogruppen, worin jede der Alkyle 1-4 Kohlenstoffatome aufweist wie Dimethylamino; Aryle mit 6 Kohlenstoffatomen und Aralkyl mit bis zu 9 Kohlenstoffatomen wie Phenyl oder Benzyl und dergleichen, mit der Einschränkung, daß solche Arylgruppen an den Pyridinring gebunden und nicht mit diesem kondensiert sind, und Aryloxygruppen oder Aralkyloxygruppen mit bis zu 9 Kohlenstoffatomen wie Phenyloxy- oder Benzyloxy-Strukturen; und eine Verbindungsgruppe einschließlich einer kovalenten Bindung und einer Überbrückungsgruppe, die eine Bindung zum Rest des Moleküls schaffen kann, wie dies noch beschrieben wird.
Der Ar-(R)n''-Substituent am Pyridinring ist selbst ein Aryl mit n'' R-Substituenten. Das Aryl ist vorzugsweise entweder ein Phenyl- oder ein Naphthylring. Die Zahl n'' ist eine ganze Zahl entsprechend der Anzahl der kovalenten Bindungsstellen, die an dem Ar-Substituenten verfügbar sind, z. B. 5 im Falle von einem Phenyl oder 7 im Falle eines Napthyls. Die R-Substituenten an der Ar-Gruppe können von den gleichen Gruppen ausgewählt sein wie die R'- und R''-Substituenten.
Dementsprechend können die Ar-Rn''-Substituenten strukturmäßig dargestellt werden z. B. von den allgemeinen Formeln (IIa) und (IIb).
worin die kovalente Bindung zum Pyridinring ist, abhängig davon, ob die Ar-Einheit ein Phenyl oder Naphthyl ist. Phenyl ist die am meisten bevorzugte Ar-Einheit.
Bevorzugte Aryl-substituierte Pyridine können detaillierter durch eine Kombinationsstruktur mit Einbringung der allgemeinen Formel I und einer der Formeln (IIa) oder (IIb) dargestellt werden. Dies führt zu der allgemeinen Formel (III):
worin R', R'', die R-Gruppen, M und n und n' wie vorstehend definiert sind. Vorzugsweise jedoch sind alle M-Gruppen Wasserstoff und/oder n und n' sind beide 1 und/oder R' und R'' sind beide Wasserstoff. Ebenso bevorzugt werden Komponenten der Formel (III), worin die M-Gruppen ein oder mehrere Metallionen, einschließlich eines Seltenen-Erdmetallions in Komplexkombination mit den vier Carboxylgruppen umfassen. Entsprechend einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Rest des Moleküls ein biologisch aktives Material. Obwohl wir glauben, daß jedes der vorgenannten Materialien in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung arbeitet, liegt unsere größte Erfahrung bei den Materialien mit der Ar-(R)n- Gruppe, wenn sie in der Position 4 an das Pyridin gebunden ist, d. h. in para-Position zu dem Pyridin-Stickstoff, und auf dieser Basis wird diese Kombination bevorzugt. Ebenso bevorzugt werden Materialien, worin die Verbindungsgruppe eine der R-Gruppen ist, und nicht die R'- und R''-Gruppen, und worin eines oder beide der R'- und R''-Gruppen Wasserstoff sind, und besonders, worin eine bis drei der R-Gruppen C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy sind und der Rest der R-Gruppen Wasserstoffist.
Wenn in der obigen Formel (III) alle R'- und R''-Gruppen Wasserstoff sind und Ar Phenyl ist, ergibt dies eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel (IIIa):
Die Aryl-substituierten Pyridin-Komponenten können an andere Gruppen gebunden sein. Diese Bindung kann durch eine kovalente Bindung oder durch andere Verbindungsgruppen erfolgen, was jeweils durch eine der R'-, R''- oder R- Gruppen erfolgt, besonders durch eine der R-Gruppen. Diese Bindung ermöglicht es, mit den fluoreszierenden Pyridin- Komponenten eine biologisch aktive, biospezifische Gruppe zu kombinieren ("tag").
Wenn die Bindung durch eine Verbindungsgruppe erfolgt, sollte diese R-Gruppe eine aktive oder bindungsfähige Stelle aufweisen wie ein Amin, ein Hydroxyl, ein Carboxyl, ein Ester oder dergleichen, um die Bindung der biospezifischen Gruppe zu erleichtern. Beispiele solch bindungsfähiger R-Gruppen sind die Aminogruppe (-NH&sub2;), primäre und sekundäre Amingruppen mit Alklylengruppen wie -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; oder -CH&sub2;-CH&sub2;- primäre und sekundäre Amingruppen mit Arylendgruppen und Aryloxy-Gruppen wie
und deren Isomere; Hydroxyl-enthaltendes Alkyl wie -CH&sub2;-CH&sub2;OH, -CH&sub2;-CH-&sub3; und Hydroxyl-enthaltende Aryl- und Aryloxygruppen wie
Andere geeignete funktionale Gruppen zur Bildung einer Bindung zu der biospezifischen Gruppe umfassen Amide, Amidine, Thioamide, Harnstoffe, Thio-Harnstoffe, Guanidine, Diazogruppen, Thioether, Carboxy- und Phosphatester und Thioester und andere kovalente Bindungen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Eine bevorzugte Verbindungsgruppe ist die einfache Aminogruppe. Die Verbindungsgruppen können direkt an die biologisch aktive Gruppe ankoppeln oder sie können durch ein bifunktionales Spacer-Mittel gebunden sein, wie ein Element der Gruppe -CO(CH&sub2;)&sub4;-, -CS-, -CO (CH&sub2;)&sub8;NHCOCH&sub2;ON=, -COCH&sub2;ON=, -CO(CH&sub2;)&sub5;NHCO(CH&sub2;)&sub6;CO-, -CO(CH&sub2;)&sub2;SS(CH&sub2;)&sub2;CO-, -CSNH(CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NHCO(CH&sub2;)&sub6;CO-, -CSNH(CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NHCO(CHOH)&sub2;CO- und -CSNH ( CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub3;NHCOCH&sub2;ON=
Solche Verbindungsgruppen sind beispielhaft angegeben, und können Wechselwirkungen zwischen dem fluoreszierenden Pyridin und der biospezifischen Gruppe verändern oder beeinflussen.

Die biospezifische Gruppe

Wie oben erwähnt, ist bei vielen zweckmäßigen Anwendungen eine biologisch aktive, d. h. biospezifische Gruppe an das substituierte Pyridin gebunden. Die Bezeichnungen "biospezifische Gruppe" und "biologische aktive Gruppe" werden in weitem Sinne verwendet, um alle molekularen Strukturen zu erfassen, die mit einer anderer Molekularart "spezifisch erkennen" oder "spezifisch reagieren" oder "spezifisch darauf einwirken". Solche Gruppen können immunologisch spezifische Gruppen umfassen wie Antikörper und deren jeweilige Antigene oder Haptene, Hormone und deren Rezeptoren, Bindungspaare wie das Biotin-Avidin-Paar. Sie können weiterhin umfassen: Nukleinsäuresequenzen, die mit deren komplementären Sequenzen in spezifischer Weise hybridisieren.
Die biospezifischen Gruppen können so ausgewählt werden, daß sie sich mit einem Ziel-Molekül verbinden oder anderweitig vereinigen, oder sie können so ausgewählt werden, daß sie das Ziel-Molekül imitieren oder einschließen, so daß sie mit dem Ziel-Molekül bei der biospezifischen Reaktion konkurrieren.
Wie oben erwähnt, kann das biologische aktive Material (MB) in den Formeln in den Positionen R' oder R'' sein, ist jedoch vorzugsweise als eine der R-Gruppen gebunden, und man erhält einen Fluoreszenz-markierten, biospezifischen Reaktionsteilnehmer mit der Formel
worin MB, M, n, n', n'' wie vorstehend beschrieben sind, und die R-, R'- und R''-Gruppen, unabhängig voneinander, ausgewählt sind aus Wasserstoff und Elektronen-abgebenden Gruppen.
In ähnlicher Weise kann ein bevorzugter, Fluoreszenz-markierter, biospezifischer Reaktionsteilnehmer die Formel
worin M ein Metallion oder Wasserstoff, n* eine ganze Zahl von 1 bis 4, Alk ein C&sub1;-C&sub4;-Alkyl und MB ein biologisch aktives Material bedeuten. Vorzugsweise ist jedes M Wasserstoff oder jedes M ein Metallion. Es wird auch bevorzugt, daß M ein oder mehrere Metallionen umfaßt einschließlich eines Seltenen- Erdmetallions in Komplexkombination mit den vier Carboxylgruppen.

Das Ziel-Molekül

Ist eine biospezifische Gruppe anwesend, kann das Ziel- Molekül oder der Analyt ein monoepitopisches oder polyepitopisches Material sein. Es kann ohne Einschränkung aus Materialien ausgewählt werden wie: Arzneimitteln, Stoffwechselprodukten, natürlichen Produkten, Schädlingsbekämpfungsmitteln und Verunreinigungssubstanzen der Luft und des Wassers. Als Beispiele kann man Arzneimittel aufführen, die umfassen: Digoxin, Digitoxin, Phenytoin, Theophyllin, Gentamycin und Tobramycin; Alkaloide wie Morphin, Heroin, Kokain, Mutterkorn-Alkaloide und dergleichen; Steroide wie Steroidhormone, einschließlich Östrogene und Androgene, z. B. Estriol und entzündungshemmende Steroide, z. B. Cortison; Laktame wie Barbiturate, einschließlich Phenobarbital; Aminoalkylbenzole wie die Amphetamine; Vitamine, Prostaglandine wie F&sub2;alpha und E, Antibiotika und dergleichen, kurze Peptidsequenzen oder Aminosäuren wie Thyroxin, Tr&ijlig;odthyronin und Oxytocin. Beispiele von Verunreinigungsstoffen und Schädlingsbekämpfungsmitteln umfassen PCB, Dioxin, halogenierte Biphenyle, Carbamate, Thiophosphite, Phosphate-Ester und deren Metabolite. Solche Materialien können Molekulargewichte von etwa 50 bis etwa 100 aufweisen.
Das Ziel-Molekül kann auch ein polymeres Material sein wie ein Protein oder eine andere Poly(aminosäure), eine Polynukleinsäure oder ein Polysaccharid. Derartiges Proteinmaterial kann aus jeder Proteinklasse stammen einschließlich, und ohne darauf beschränkt zu sein, Globuline, Albumine, Lipoproteine, Glycoproteine, Histone und dergleichen, hochsensible Proteine einschließlich Albumin, die Immunglobuline wie das IgE, Fibrinogen, Transferrin, die verschiedenen Komplement-Faktoren, die Tumor-Markierungsmittel wie CEA (carcinoembrionisches Antigen) und PAP, die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren und Proteinhormone einschließlich Beta-hCG, FSH, Gastrin, LH und Prolactin; Insulin, Thyrotropin, Gonadotropin und dergleichen. Beispiele biospezifischer Polysaccharide sind jene, die von Mikroorganismen stammen wie solche in Verbindung mit verschiedenen Spezies von Salmonella, Streptococcus und Klebsiella. Andere Zielsubstanzen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Materialien, die aufinfektiöse Krankheitsbedingungen wie Infektionen mit Hepatitis oder Rubella ansprechen.
Die vorstehende Liste soll nur einen kurzen Überblick darstellen. Es sei darauf hingewiesen, daß andere äquivalente Materialien, wie sie ausführlicher auf dem Fachgebiet beschrieben worden sind (siehe US-A-4 193 983, Spalten 7-11) in Verbindung mit den erfindungsgemäße Fluorophoren verwendet werden können.

Nicht-gebundene Produkte

Zusätzlich zu den eben beschriebenen Verbindungen, worin eine der R-, R'- oder R''-Gruppen eine Bindung zu einer biospezifischen, biologisch aktiven Gruppe darstellt, stellt diese Erfindung auch andere Materialien mit der gleichen allgemeinen Struktur der Formeln I und III zur Verfügung, die keine Bindung zu einem biospezifischen Material enthalten. Das heißt, daß alle R-, R'- und R''-Gruppen Wasserstoff oder Elektronen-abgebende Gruppen sind. Derartige Materialien insbesondere der Formeln I und III, worin M Wasserstoff ist, sind als Chelat-bildende Mittel für Metalle geeignet, und wenn diese ein Chelat mit einem seltenen Erdmetall gebildet haben, ergeben sie fluoreszierende Spezies, die als Indikator für quantitative oder qualitative Fluoreszenzmessungen von Seltenen-Erdmetallionen in Lösungen dienen können.

Das seltene Erdmetall

Die erfindungsgemäßen Aryl-substituierten Pyridine bilden langlebige fluoreszierende Komplexe mit seltenen Erdmetallen, einschließlich Terbium, Dysprosium, Europium, Samarium und Neodym, in Form von deren Ionen. Terbium und Europium (Tb&spplus;&spplus;&spplus; und Eu&spplus;&spplus;&spplus;) sind die bevorzugten seltenen Erdmetall-Ionen. Die Komplexe, die mit den Metallionen (M) und den erfindungsgemäßen Tetrasäure-Liganden gebildet werden, werden allgemein als äquimolarer 1 : 1 Metall:Ligand-Chelatkomplex angesehen. Sie werden strukturell dargestellt durch die Struktur der allgemeinen Formel IV

Präparative Methoden

Die erfindungsgemäßen substituierten Pyridine können mit zwei Verfahren hergestellt werden. Das erste Verfahren wird bevorzugt, wenn die Endstruktur keine reaktiven funktionellen Amingruppen oder andere funktionelle Gruppen enthält, die mit den verwendeten Reaktionsteilnehmern unverträglich sind. Das zweite Verfahren erlaubt die Einbringung solcher Gruppen.

Das erste Verfahren umfaßt

A. die Umsetzung eines geeigneten substituierten Benzaldehyds oder Naphthaldehyds mit wenigstens zwei Mol 2- Acyl-furan und ergibt ein 1,5-Di(2-furyl)-1,5-pentandion;
B. Umformung des Produktes von A zu dem entsprechenden Di(furyl)pyridin durch Umsetzung mit Hydroxylamin in flüssiger Phase bei erhöhten Temperaturen wie zwischen 40ºC und 170ºC, insbesondere von 80ºC bis 150ºC;
C. Oxidieren des Produktes von B zu der entsprechenden Pyridin-2,6-dicarboxylsäure durch Kontakt mit einem Oxidierungsmittel in einer organischen flüssigen Phase. Ein Beispiel dieser Oxidation ist die Verwendung eines Überschusses an Kaliumpermanganat in einem Alkanol bei einer Temperatur von etwa 50ºC bis etwa 100ºC für 30 bis 120 Minuten;
D. Umformung der Pyridin-2,6-dicarbonsäure zu dem Diamid, was unter Verwendung eines Überschusses an oxalylchlorid, gefolgt von Ammoniumhydroxid bei niedriger Umgebungstemperatur erfolgen kann;
E. Umformung des Diamids zu dem Dinitril durch Umsetzung mit einem Dehydratisierungsmittel wie Essigsäureanhydrid oder Trifluoressigsäureanhydrid bei einer Temperatur von etwa -10º bis +35ºC;
F. Reduzierung des Dinitrils zu dem Diamin, was katalytisch unter Verwendung eines Edelmetallkatylsators und molekularen Wasserstoffs in Anwesenheit von Spuren von Säure erfolgen kann;
G. Kupplung der Estergruppen an die Amingruppen, was durch Umsetzung mit einem Alkylhalogenacetat, z. B. einem Alkylbromacetat, in Anwesenheit von 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin oder einer anderen geeigneten Base erfolgen kann; und
H. Umformung der Estergruppen zu Säuren durch Verseifung mit einer anorganischen Base wie einem Alkalimetallcarbonat oder -Hydroxid bei gemäßigter Temperatur, z. B. von etwa 5ºC bis etwa 45ºC. Es wird darauf hingewiesen, daß verschiedene Trenn- und Reinigungsschritte, die nicht genannt worden sind, in der Praxis durchzuführen sind.
Bei dem Herstellungsverfahren 2 werden die ersten drei Schritte im wesentlichen wie bei dem Verfahren 1 durchgeführt mit der Änderung, daß das Arylaldehyd, z. B. Benzaldehyd oder Naphthaldehyd, eine Nitrogruppe trägt, wo letztlich ein Amin-Substituent erwünscht ist, oder eine andere Gruppe trägt, die mit den nachfolgenden Umsetzungen des Verfahrens 1 inkompatibel ist. Das Produkt dieser drei Schritte ist eine Nitrophenyl- oder Nitronaphthylpyridin-2,6-dicarboxylsäure mit verschiedenen R-, R'- und R''-Substituenten, wie sie jeweils erwünscht und entsprechend in den Ausgangsmaterialien vorhanden sind.
Bei Schritt D des zweiten Verfahrens werden die zwei Carbonsäuregruppen selektiv reduziert; das heißt, sie werden unter Bedingungen reduziert, die nicht die Nitrogruppe reduzieren. Boran ist ein Reduktionsmittel, das entsprechend wirksam ist. Diese Reduktion kann unter Verwendung eines Überschusses an Boran und bei gemäßigten Temperaturen und trockenen Bedingungen erfolgen. Dies ergibt das Dicarbinol, das der Dicarbonsäure entspricht.
E. Das Dicarbinol wird dann mit einem Reaktionsteilnehmer umgesetzt, der die funktionelle Carbinolgruppe zu Alkylhalogeniden umformt. Thionylbromid in molarem Überschuß erbringt bei erhöhten Temperaturen wie 50ºC bis 125ºC diese Umformung und ergibt ein Produkt, das das gewünschte Nitroarylpyridin ist, das an den Positionen 2 und 6 zu dem Pyridinstickstoff mit Alkylbromiden substituiert ist.
F. Bei diesem Schritt wird das Alkylbromid-substituierte Pyridin mit einem Imino-diessigsäure-diester umgesetzt, um die beiden Bromidgruppen mit Imino-disäuregruppen zu ersetzen. Das kann unter Verwendung einer Base wie 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin bei gemäßigter Temperatur von etwa 25ºC bis etwa 55ºC und unter inerter Atmosphäre erfolgen. Dies ergibt den Tetraester.
G. Die vier Estergruppen können dann unter Anwendung von Verseifungsbedingungen wie in Schritt H bei Verfahren i entfernt werden.
H. Bei dem letzten Schritt des Verfahrens wird die Nitrogruppe am dem Aryl-Substituenten zu einem Amin reduziert. Das kann katalytisch unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators und molekularem Sauerstoff erfolgen. Beispiele von Katalysatoren umfassen Platin und Palladium auf Tonerde oder Kohle. Der Wasserstoffdruck kann im Bereich von etwa atmosphärischem Druck bis zu einigen Atmosphären, z. B. 1-10 at, liegen. Es werden im allgemeinen Temperaturen von etwa Umgebungstemperatur bis etwa 75ºC angewendet, um die gewünschte selektive Reduktion zu erhalten. Dies ergibt das gewünschte Amin-substituierte Pyridinmaterial. Andere, gleichartige Herstellungsverfahren können gegebenenfalls auch angewendet werden. Zum Beispiel kann eine Amingruppe durch eine Modifizierung des Verfahrens 1 eingebracht werden, wobei das Produkt von Schritt G mit rauchender Salpetersäure nitriert und die so eingebrachte Nitrogruppe nachfolgend wie in Verfahren 2 reduziert wird.

Zwischenprodukte

Bei diesen Verfahren werden intermediäre Schlüsselverbindungen hergestellt. Diese umfassen die 2,6-Dicarbonsäure-substituierten Pyridine, die als Säuren, Salze oder als Mono- oder Diester vorliegen können mit der Formel
worin Ar ein Aryl, n'' eine ganze Zahl gleich der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen von Ar ist; R, R' und R'' unabhängig voneinander ausgewählt werden aus Wasserstoff, Elektronen-abgebenden Gruppen einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, C&sub1;- C&sub4;-Alkyl, Amino, Dialkylamino, Aryl und Aryloxy; und Verbindungsgruppen; und R* und R** unabhängig voneinander ausgewählt werden aus Metallionen, Wasserstoff und C&sub1;-C&sub4;- Alkyl.
Verbindungen der Formel (VII) sind z. B. in Chem. Abstr., Bd. 62 Nr. 12, 1965, Spalte 14619; Beilsteins Handbuch der Organischen Chemie, 4. Ausg. E 3/4, Bd. 22, Teil 3, 1979, S. 2626; und J. Org. Chem. Bd. 47, 1982, S. 3761-3763, beschrieben worden.

Verwendung der Produkte

Die erfindungsgemäßen Produkte haben eine weite Verwendbarkeit als Liganden für die Chelatbildung seltener Erdmetalle. Die so gebildeten Chelate sind fluoreszierend und liefern daher ein Verfahren zur Messung des Ionengehalts seltener Erdmetallmaterialien. Die hierin beschriebenen substituierten Pyridine sind besonders als Chelate seltener Erdmetalle bei einer Vielzahl von Assayverfahren nützlich, wo deren fluoreszierende Eigenschaften sie dazu befähigen, als Markierungen für biospezifische Moleküle zu dienen. Normalerweise wird ein erfindungsgemäßer Ligand oder ein Chelat so hergestellt, daß sie eine reaktive, funktionelle Gruppe wie eine Isothiocyanat-, Amin-, Imidat-, Diazo- oder eine andere geeignete Gruppe aufweisen, die mit einer geeigneten reaktiven Gruppe eines biospezifischen Moleküls wie einem Antikörper, Antigen, Hapten oder einem anderen Zielmolekül umgesetzt wird. Der so markierte Teil eines Bindungspaares eines biospezifischen Moleküls kann bei einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Assay- Methoden einschließlich konkurrierenden Bindungs-Assays und immunometrischen, Sandwich-Typ-Assays verwendet werden.

BEISPIELE

Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung von

A. Herstellung von 5-Di(2-furyl)-3-phenyl-1,5-pentandion

Benzaldehyd 62,6 g (60 ml) (0,59 Mol)
2-Acetylfuran, 85% 165 g (150 ml) (1,27 Mol)
Kaliumhydroxid, 85% 35 g (0,53 Mol)
Das KOH wird in Methanol (etwa 600 ml) unter Erhitzen und
Rühren gelöst. Die Lösung wird leicht gekühlt und eine Mischung aus Aldehyd und Furan wird gleichzeitig zugegeben. Die Mischung wird auf 60ºC erhitzt und 45-60 Min. gerührt. Zunächst entwickelt sich eine grüne Färbung, die schnell dunkler und braun wurde. Die Reaktionsmischung verfestigt sich zu einer Masse von orange-braunen Kristallen. Ethanol wird zugegeben (150 ml) und der Feststoffaufgebrochen. Die Mischung wird über Nacht gekühlt und die entstandenen Kristalle werden durch Filtration gewonnen und mit eiskaltem Ethanol (etwa 400 ml) gewaschen, gefolgt von einer Wäsche mit Pentan (etwa 200 ml). Die Kristalle werden unter Vakuum bei 80ºC getrocknet. Die Ausbeute an Pentandion beträgt 103,5 g oder 57,3%.

B. Herstellung von 4-Phenyl-2,6-di(2-furyl)pyridin

1,5-Di(2-furyl)-3-phenyl- 1,5-pentandion 143 g
Hydroxylamin-hydrochlorid 129 g (Aldrich 102337)
n-Butanol 1600 ml (Sigma 13F-5070)
Das "Dion", hergestellt nach Schritt A und eine Wiederholung desselben, das Hydroxylamin und das Butanol werden in einem 5 l-Dreihalskolben, ausgerüstet mit einem mechanischem Rührer und Kühler, kombiniert und unter Rückfluß 5 Stunden gerührt, gekühlt und für etwa 60 Stunden gerührt. Die entstandene schwarze Lösung wird in 2 l 15% NaOH gegossen und mit Toluol (1 l) extrahiert. Die organische Schicht wird mit entionisiertem Wasser (1 x 200 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der dicke Rückstand wird in CH&sub2;Cl&sub2; (etwa 250 ml) aufgenommen. Hexan (etwa 250 ml) werden zu der entstandenen Lösung zugegeben, die durch Silikagel filtriert und mit 1 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/Hexan (etwa 500 ml) eluiert wird. Das Filtrat wird konzentriert, Ethanol (etwa 200 ml) zugegeben und die Mischung wird in Eis gekühlt. Das Filtrieren der erhaltenen Kristalle und Waschen in eiskaltem Ethanol (etwa 200 ml) und Trocknen unter Vakuum bei Raumtemperatur ergibt eine erste Ausbeute an Kristallen von etwa 65 g. Das Filtrat wird konzentriert, gereinigt und gekühlt und ergibt eine zweite Ausbeute von 13.6 g Kristallen.

C. 4-Phenyl-2,6-pyridin-dicarbonsäure

Das Difuryl-pyridin-Produkt nach Schritt B wird mit Permanganat oxidiert.
Produkt aus Schritt B 23 mMol
KMnO&sub4; 45,4 g
t-Butanol 1500 ml
Wasser 300 ml
Das Butanol (etwa 1 l) wird in einen Dreihalskolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer, einer Ummantelung und einem Kühler ausgestattet ist. Das Produkt aus Schritt B wird zugegeben und mit dem übrigen t-Butanol in den Kolben gegossen. Die Mischung wird erhitzt und gerührt, bis eine Lösung entsteht. Dann wird das H&sub2;O zugegeben; wenn die Temperatur etwa 75º erreicht, wird das KMnO&sub4; in Teilen über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten zugegeben. Die Mischung wird 90 Minuten unter Rückfluß gehalten. Der Alkohol wird im Wasserstrahlvakuum abdestilliert und der heiße Rückstand durch Celite® filtriert und mit heißem t-BuOH/H&sub2;O im Verhältnis 1 : 1 gewaschen. Alles restliche KMnO&sub4; wird mit NaHSO&sub3; vernichtet, und die Lösung wird auf etwa 150 ml auf einem Rotationsverdampfer (etwa 65ºC) konzentriert. Nach dem Ansäuern mit 2 N HCl (25 ml) werden die erhaltenen Kristalle der gewünschten 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonsäure filtriert, gewaschen und getrocknet.

D. 4-Phenyl-2,6-pyridindicarboxamid

4-Phenyl-2, 6-pyridin- Dicarbonsäure 21,5 mMol
Oxalylchlorid 4,8 ml
Methylenchlorid 80 ml
Dimethylformamid 5 Tropfen
Die Pyridindicarbonsäure wird in einen 100 ml Zweihalskolben mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und einem Rührstab gegeben. Der Kolben wird mit einem CaSO&sub4;-Trocknungsrohr verschlossen und in Eis gekühlt. Dann wird das Oxalylchlorid über einen Zeitraum von 5 Minuten mit einer Injektionsspritze zugegeben und etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Lösung wird auf einem Rotationverdampfer konzentriert und ergibt das feste Säurechlorid; Benzol (150 ml) wird zugegeben und mit einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand vakuumgetrocknet. Das Säurechlorid wird zu NH&sub4;OH, 28%, (50 ml) über einen Zeitraum von 5-10 Minuten unter Rühren zugegeben, für 1 Stunde gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen und getrocknet und ergibt das gewünschte Amid.

E. 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonitril

4-Phenyl-2,6-pyridin- Dicarboxamid 17,5 mMol
p-Dioxan 170 ml
Pyridin 11,3 ml
Trifluoressigsäureanhydrid 11, 0 ml
Die ersten 3 Bestandteile werden in einem 250 ml-Kolben mit einem Rührstab kombiniert. Der Kolben wird unter Argon verschlossen, in Eis gekühlt, bis gefrorenes Dioxan vorhanden ist (100). Das Anhydrid wird über einen Zeitraum von etwa 10 Minuten zugegeben (Temp. etwa 15ºC), und die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende dunkle Lösung wird in Wasser gegossen und dann drei Mal mit 150 ml- Portionen von Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf dem Rotationsverdampfer zu einem dunklen Feststoff konzentriert, der dann in Methylenchlorid aufgenommen und durch Silikagel mit zusätzlichem Methylenchlorid eluiert wird. Der Eluent wird zu einem Feststoff konzentriert und getrocknet und ergibt das gewünschte Dicarbonitril.

F. 4-Phenyl-2,6-di(aminomethyl)-pyridin

4-Phenyl-2 , 6-pyridin- Dicarbonitril 13,5 mMol
Ethanol mit 2% HClO&sub4; 370 ml
10% Palladium auf Kohle 3,7 g
Das Nitril wird in dem Ethanol suspendiert, zu welchem 10,5 ml 70% HClO&sub4; zugegeben worden waren, und die Mischung wird in Gin Parr-Gefäß umgefüllt. Das Gefäß wird mit Stickstoff gespült und der Katalysator zugegeben. Das Gefäß wird dann einem Wasserstoffdruck von 0,28 MPa (40 psi) ausgesetzt. Nach 30 Minuten wird die Flasche geöffnet und und die Flüssigkeit entnommen und zu einer dunklen Flüssigkeit konzentriert. Ein gelber Feststoff wird durch Zugabe der Flüssigkeit zu Diethylether und Filtrieren gewonnen. Das feste Perchlorat-Salz wird mit einer Vakuumpumpe getrocknet. Das Amin-perchlorat wird dann in etwa 30 ml Wasser gelöst und zu 40% NaOH zugegeben. Das freigesetzte erhaltene Amin wird mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in einer Vakuumpumpe zu einem dunklen Öl konzentriert.

G. 4-Phenyl-2,6-bis[N,N-di[methoxycarbonylmethyl)aminomethyl]pyridin

Amin nach Schritt F 12,0 mMol
1,8-Bis (dimethylamino)naphthalin 10,3 g
Methyl-bromacetat 7,35 g
Acetonitril 130 ml
Die Base wird in einen Kolben gegeben. Das Amin wird mit Acetonitril aufgenommen und mit diesem in den Kolben gegeben. Ein Rührstab wird zugefügt und die Mischung bei 45ºC gerührt, bis sie homogen ist. Dann wird das Methylbromacetat in 40 ml Acetonitril eingetropft, wobei das System unter Argon gehalten wird. Nach etwa 16 Stunden bei etwa 450 C wird das Produkt in 150 ml Wasser und 1,5 ml 0,1 M Zitronensäure gegossen. Die Mischung wird dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden gewaschen, getrocknet, konzentriert, wieder gelöst und durch Silika filtriert. Das Produkt wird durch Silikagel-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Methylenchlorid als Lösungsmittel gereinigt.

H. Verseifung von Tetraester

Der Tetraester aus Schritt G wird verseift, indem er in Methanol/Wasser im Verhältnis 1 : 1 unter Zufügung eines molaren Überschusses an K&sub2;CO&sub3; gegeben und bei Raumtemperatur 2,5 Stunden gerührt wird. Dann wird die Lösung auf einen pH-Wert von 7 angesäuert und getrocknet und ergibt die gewünschte Tetrasäure, deren Identität durch NMR bestätigt wird.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird im wesentlichen wiederholt mit der Veränderung, daß in Schritt A eine äquivalente Menge an 2,4-Dimethoxybenzaldehyd das Benzaldehyd ersetzt, so daß das gebildete Zwischenprodukt 4-(2,4-Dimethoxyphenyl)-2,6- pyridindicarbonsäure und das Endprodukt das 2,4-Dimethoxyanaloge des Produktes aus Schritt H in Beispiel 1 ist. Man erhält die folgenden verschiedenen Ausbeutewerte aus den verschiedenen Schritten:
Schritt A 95%
Schritt B 72%
Schritt E 84% des gewünschten Produktes 4-(2,4-Dimethoxyphenyl)-2,6- bis [N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-pyridin.

Beispiele 3-17

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird im wesentlichen 15 Mal wiederholt mit der Veränderung, daß das Benzaldehyd durch eine äquivalente Molmenge der folgenden substituierten Benzaldehyde ersetzt wird:
Beispiel Nr. Benzaldehydanalog
3 4-Methoxybenzaldehyd
4 3,4-Dimethoxybenzaldehyd
5 3,4,5-Trimethoxybenzaldehyd
6 2,5-Dimethoxybenzaldehyd
7 2,4,5-Trimethoxybenzaldehyd
8 4-Ethoxybenzaldehyd
9 2,4-Dipropoxybenzaldehyd
10 2-Ethoxy-4-methoxy-benzaldehyd
11 4-Benzyloxy
12 3-Methoxy-4-benzyloxy
13 3,4-Methylendioxy
14 2-Methoxy-4-benzyloxy
15 2,4-Dimethoxy
16 2,4,6-Trimethoxy
17 3-Methoxy-4-(4-nitrobenzyloxy)
Mit diesen verschiedenen Benzaldehydverbindungen wurden die entsprechenden 2,6-Pyridindicarbonsäure-Zwischenprodukte und Tetrasäure-Endprodukte erhalten.

Beispiel 18

Dieses Beispiel zeigt die Einführung von Amin-Substituenten in den Phenylring. Schritte A, B und C nach Beispiel 1 werden wiederholt mit der Veränderung, daß anstelle des Benzaldehyds eine äquimolare Menge 3-Nitrobenzaldehyd verwendet wird. Dies ergibt 4-(3-Nitrophenyl)-2,6-pyridindicarbonsäure.

D. 4-(3-Nitrophenyl)-2,6-pyridindimethanol

Disäure wie oben 28,8 g (0,1 Mol)
Boran/THF-Komplex 288 ml, 1 molar
Die Disäure wird in einen trockenen 2 l-Kolben mit 1000 ml THF und einem Rührstab gegeben. Ein Trocknungsrohr wird aufgesetzt und dem Kolben wird Argon als Schutzgas zugeführt. Dann wird der Boran/THF-Komplex allmählich über einen Zeitraum von 20- 30 Minuten unter heftigem Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Es wird 4 Stunden weitergerührt, sodann wird das überschüssige Boran mit verdünnter HCl (20 ml 6N und 85 ml H&sub2;O) hydrolisiert: Dann werden 60 ml 10% Na&sub2;CO&sub3; zugegeben und die Lösung wird auf einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Rückstand wird zu wäßrigem Bicarbonat zugegeben und dreimal mit Ethylacetat extrahiert, die Extrakte werden getrocknet und abgestrippt, um das gewünschte Diol als einen orangen Feststoff zu erhalten.

E. 4-(3-Nitrophenyl)-2,6-bis (brom-methyl)pyridin

Diol aus Schritt D 9,1 g (35 mMol)
Thionylbromid 7,0 ml (90 mMol)
Das Diol aus Schritt D wird in einen Kolben gegeben und etwa 20 ml Methylenchlorid gefolgt von dem Thionylbromid zugegeben. Der Kolben wird mit einem Destilliervorstoß verschlossen und in ein Ölbad bei 80ºC gesetzt. Man läßt das Methylenchlorid und HBr entweichen, und es verbleibt ein viskoser Rückstand. Dieser wird in wäßriges Na&sub2;CO&sub3; gegeben und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden getrocknet, konzentriert, mit Methylenchlorid verdünnt und durch Silika filtriert. Das Filtrat wird gesammelt und verdampft und ergibt das gewünschte Dibromid.

F. 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-[3-nitrophenyl)-pyridin-tetramethylester

Dibromid aus Schritt E 3,44 g (8,9 mMol)
Iminodiessigsäure- Dimethylester 2,88 g
1, 8-Bis(dimethylamino)naphthalin 3,76 g
Acetonitril 140 ml
Die Base wird in einen Kolben gegeben. Der Iminodiester wird mit dem Acetonitril vermischt und zugegeben. Dem Kolben wird Argon als Schutzgas zugegeben und auf 45ºC erhitzt. Dann wird das Dibromid in Lösung in THF über einen Zeitraum von 60-90 Minuten unter Rühren mit einem Magnetrührer zugegeben. Nach 18 Stunden wird die Mischung abgekühlt und bei Raumtemperatur für etwa 2 Tage gerührt. Die Mischung wird zu Benzol zugegeben, filtriert, mit 0,1 M Zitronensäure und Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wird dann zu einem Öl konzentriert, in Methylenchlorid aufgenommen und zweimal durch Silikagel mit Ethylacetat/Methylenchlorid geleitet, gefolgt von Ethylacetat als Eluierungsmittel. Es werden Fraktionen entnommen und das gewünschte Material wird isoliert und zu einem bernsteinfarbenen Öl konzentriert.

G. Reduktion der Nitrogruppe zum Amin

Nitrotetramethylester aus Schritt F 2,7 g (4,94 mMol)
5% Palladium auf Kohle 2,7 g
Ethylalkohol 300 ml
Die Nitroverbindung wird in einen 1 l-Kolben mit 300 ml
Ethanol gegeben. Der Kolben wird mit Stickstoff gespült und der Katalysator zugefügt. Der Kolben wird dann unter 0,1 MPa (1 at) Wasserstoffdruck gesetzt. Nach 1 Stunde wird die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat mit einem Rotationsverdampfer zu einem gelben Öl konzentriert. Es wird festgestellt, daß das Öl der Aminotetramethylester ist, der dem Produkt aus Schritt F entspricht.

H. Verseifung

Die Estergruppen des Aminotetramethylesters nach Schritt G werden unter Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 1 verseift. Dies ergibt die gewünschte 3-Aminotetrasäure.

Beispiel 19

A. Herstellung von 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]- 4-(4-nitrophenyl)-pyridin-tetramethylester

Rauchende Salpetersäure (0,03 ml, 0,4325 mMol) wird bei Raumtemperatur zu einer Lösung von Trifluormethansulfonsäure in Methlenchlorid (4 ml) zugegeben. Nach 5 Minuten Rühren wird langsam bei 0ºC eine Lösung von 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-phenyl-pyridin-tetramethylester wie nach Schritt G aus Beispiel 1 ( 86 mg, 0,173 mMol) in einer kleinen Menge von Methylenchlorid zugegeben. Man läßt die Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur ansteigen und rührt für 1 Stunde weiter. Die Reaktionsmischung wird dann auf Eis gegossen und mit Natriumcarbonat neutralisiert. Extraktion mit Methylenchlorid, gefolgt von Trocknen über Natriumsulfat und Verdampfen ergibt 90 mg des Rohproduktes.

B. Herstellung von 2,6,-Bis [N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl)- 4-(aminophenyl)-pyridin-tetramethylester

Das Rohprodukt aus der obigen Umsetzung (90 mg, 0,17 mMol) wird in Ethanol (13 ml) gelöst, 50 mg 10% Pd/Kohle wird zugegeben, und die Mischung wird bei Raumtemperatur unter 0,1 MPa (1 at) Wasserstoffdruck 1 Stunde gerührt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel verdampft und ergibt 60 mg der 4-Amino-Verbindung. Die 3-Amino-Verbindung (51 mg) wird in ähnlicher Weise aus 70 mg (0,129 mMol) der entsprechenden 3-Nitro-Verbindung hergestellt, die nach dem Herstellungsverfahren 2 hergestellt worden war. Diese Herstellung erfolgte im wesentlichen wie in Beispiel 18 angegeben. Gegebenenfalls können diese oder ähnliche Arylpyridine mit Aminsubstituenten an deren Arylringen mit Thiophosgen umgesetzt werden unter Bedingungen, die für die Umsetzung von Thiophosgen mit Arylaminen bekannt sind und das Amin zu einem Isothiocyanat umwandeln, welches wiederum an ein Amin-enthaltendes Ziel-Molekül ankuppeln kann.
Konjugation von 2,6-Bis[N,M-di(carboxymethyl)aminomethyl]- 4-(4-und 3-aminophenyl)-pyridin-tetramethylester mit Theophylin-8-buttersäure Isobutylchlorformiat (0,02 ml, 0.117 mMol) wird zu einer Lösung von Theophyllin-8-buttersäure (31,3 mg, 0,117 mMol) in Dimethylformamid (1,5 ml), enthaltend Triethylamin (0,20 ml, 0,117 mMol), bei 0ºC unter einer Argon-Atmosphäre zugegeben. Nach 0,5 Stunden bei 0ºC wird eine Lösung des 4-Amin (60 mg, 0,117 mMol) in Chloroform langsam zugegeben. Die Lösung wird 17 Stunden bei 0-5ºC gerührt, und dann werden die Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt, was 103 mg des Rohprodukts ergibt. Das Material wird an Silikagel mit Chloroform:Methanol (9 : 1) und an Umkehrphasen C-18-Silikagel mit Methanol:Wasser (7 : 3) chromatographiert und ergibt 60 mg (67% Ausbeute) des gewünschten Produktes. Die entsprechende 3-Aminverbindung (51 mg, 0,01 mMol) wird ähnlich behandelt und ergibt 50 mg eines Materials, das in Position 3 das konjugierte Theophyllinderivat aufweist.

D. Herstellung von 2,6-Bis(N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl)- 4-(4-(theophyllin-8-butyramido)-phenyl]-pyridin-tetrasäure

Der Tetramethylester (34 mg, 0,045 mMol) aus dem vorhergehenden Schritt wird in Methanol (2 ml), das 0,2 ml 1 N Natriumhydroxid enthält, gelöst und 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann in einem Eisbad gekühlt und mit 1 N HCl angesäuert und verdampft und ergibt das Rohprodukt. Reinigung mittels Umkehrphasen-Säulenchromatographie in Methanol: Wasser (6 : 4) ergibt 14 mg der Tetrasäure. Die Verseifung von 40 mg (0,05 mMol) der analogen 3-substituierten Verbindung ergibt nach Umkehrphasen-Chromatographie 14,6 mg der entsprechenden Tetrasäure.

E. Herstellung von Chelaten

Die Tetrasäuren aus Schritt D werden einzeln in 0,01 M Natriumboratlösung zu einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M gelöst. Dann wird eine äquivalente Molmenge wäßrigen Terbiumchlorids zu jeder der Mischungen zugegeben, und man läßt diese für einige Minuten stehen. Fluoreszenzmessungen werden durchgeführt und zeigen, daß 1 : 1 (Mol) Chelatkomplexe der Tetrasäuren und des Terbiums gebildet worden sind und daß solche Komplexe fluoreszieren und stabil sind.

F. Homogener Fluoroimmunassay für Theophyllin durch Verstärkung der Fluoreszenz durch Bindung markierten Theophyllins an Antikörper

Es wird ein Assay für Theophyllin durchgeführt, indem man das Terbiumchelat des Fluorphor-markierten Theophyllin-Tracer wie oben (das ist 2,6-Bis[N,N-di(carboxymetyl)aminomethyl]-4-[4- (theophyllin-8-butyramino)-phenyl)-pyridin-terbiumchelat) mit Theophyllin-Standardpräparaten zur Bindung an Antitheophyllin-Antikörper konkurrieren ließ. Das markierte Theophyllin erfährt bei der Bindung an Antikörper eine Verstärkung seiner Fluoreszenz und diese Verstärkung ist proportional der Menge an markiertem, gebundenen Theophyllin und umgekehrt proportional der Menge des anwesenden Theophyllins in der Probe. Der Assay erfolgt in Polystyrolröhren (12·15 mm), zu welchen 1 ml 0,01 M Natriumboratpuffer, pH-Wert 8,5, zugegeben wurde. Es folgt eine Zugabe von 10 ul von 1 uM Tracer (8,7 ng) und 10 ul Theophyllin-Standard (0, 5,4, 16,2, 54 und 540 ng). Die Zugabe von 25 ul von etwa 0,3 uM Anti-Theophyllin-Antikörper in 0,01 M Borat, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und 1% normales menschliches Serum ( Endkonzentration in der Assayröhre etwa 7,5 nM), führt zum Anwachsen der beobachteten Fluoreszenz von 400% - 50% für die verschiedenen Standardpräparate. Das entspricht B/Bo-Werten von 80, 64, 53 und 14% für die 5,4-, 16,2-, 54- bzw. 540 ng-Standardpräparate.

=Beispiel 20

A. Herstellung von O-Benzylvanillin

Vanillin 100,4 g (0,66 Mol) Aldrich
Benzylchlorid 84,0 g (77 ml; 0,66 Mol)
Kaliumcarbonat 115 g
Aceton 21
18-Crown-6 3 g
Die obigen Materialien werden in einem 3 l-Dreihalskolben mit rundem Boden, ausgestattet mit einer Ummantelung, Kühler und mechanischem Rührer, vereint. Die Mischung wird unter Rückfluß 70 Std. gerührt. Während der ersten 24 Stunden wird diese leicht gelb und verändert sich am dritten Tag unter Rückfluß zu leicht gelbbraun. Dann wird etwa 1 l Aceton abdestilliert und der Rückstand wird in zerstoßenes Eis (etwa 2 l) und Wasser (etwa 500 ml) unter Rühren gegossen. Die Lösung wird angeimpft und ergibt einen festen Niederschlag, den man etwa 20 Minuten stehen läßt und dann filtriert, mit EtOH (00 C, 400 ml) wäscht, und unter Vakuum trocknet, was 120 g des gewünschten Produktes mit einer Ausbeute von etwa 75% ergibt.

B. 2,6-Di(2-furyl)-4-(3-methoxy-4-benzyloxyphenyl)-pyridin

O-Benzylvanillin (aus Schritt A) 31,5 g (0,13 Mol)
Acetylfuran 43 g (0,39 Mol) Aldrich
Methanol 300 ml
Die obigen Materialien werden in einem 500 ml-Kolben kombiniert, auf etwa 55ºC erhitzt und bis zur Homogenität (etwa 20 Min.) gerührt. Dann werden etwa 5 ml 20% KOH/MeOH zugegeben, erhitzt und 45-60 Min. weiter gerührt. Danach werden weitere 15 ml 20% KOH/MeOH zugegeben, die Kolbenöffnung wird leicht abgedeckt und der Inhalt erhitzt und etwa 16 Stunden gerührt. Das Produkt wird mit 6N HCl (etwa 10 ml) angesäuert und auf einem Rotationsverdampfer bei etwa 55ºC konzentriert. Dann werden 22 g Hydroxylamin und 250 ml n-Butyl-Alkohol zugegeben, und die Mischung wird unter Verwendung einer Ummantelung 3 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Butanol wird auf einem Rotationsverdampfer bei etwa 65ºC entfernt und der Rückstand wird in Wasser (etwa 200 ml) gegossen, mit 6N NaOH (60 ml) basisch gemacht und mit Toluol (2·200 ml) extrahiert. Die Extrakte werden mit H&sub2;O (etwa 100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf dem Rotationsverdampfer bei etwa 65ºC zu einem schwarzen Öl konzentriert. Dieses wird durch Silikagel (etwa 200 g) filtriert und mit CH&sub2;Cl&sub2;/Hexan (etwa 1 l) im Verhältnis 1 : 1 eluiert. Das Eluat wird zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird wiederum einer Silika- Filtration unterzogen, wiederum zu einem Öl konzentriert und durch Silika (etwa 200 g) filtriert, und diesmal mit Toluol/CH&sub2;Cl&sub2; - 9 : 1 (etwa 1 l) eluiert. Das Eluat wird zu einem bernsteinfarbenen Öl konzentriert, das in EtOH (etwa 50 ml) gelöst und wieder zu einem Öl konzentriert wird. Die Produktausbeute ist etwa 25 g.

C. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-pyridindicarbonsäure

Difurylpyridin 19 g (0,045 Mol) (aus Schritt B)
t-Butylalkohol 3 l
DI Wasser 0,6 l
Kaliumpermanganat 93 g
Das Verfahren von Schritt C nach Beispiel 1 wird wiederholt mit den folgenden Änderungen: Nach Zugabe von KMnO&sub4; wird die Mischung 1 1/2 Stunden erhitzt und gerührt. Dann wird das t- BuOH abdestilliert. Nach Konzentrierung auf etwa 200 ml wird das Produkt mit 2 N HCl (etwa 50 ml) angesäuert. Es bildet sich ein kanariengelber Niederschlag, der mit einigen ml Wasser verdünnt, filtriert und mit kaltem Wasser (etwa 50 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet wird, um 15,2 g des Produkts mit einer Ausbeute von etwa 90% zu ergeben.

D. 4- (3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-pyridindicarbonsäurechlorid

Disäure (aus Schritt C) 6,07 g (0,016 Mol)
Methylenchlorid 60 ml
Oxalylchlorid 3,5 ml
Dimethylformamid 4 Tropfen
Die Disäure wird in einen 100 ml-Zweihalskolben mit rundem Boden, der mit einer Trocknungsröhre und einem Septumstopfen ausgerüstet ist, eingewogen. Ein Rührstab wird zusammen mit CH&sub2;Cl&sub2; (etwa 60 ml) und 4 Tropfen DMF eingeführt. Die Mischung wird in Eis gerührt, wobei das Oxalylchlorid (3,5 ml) langsam mit einer Injektionsspritze (Zugabezeit etwa 5 Minuten) zugegeben wird. Dann wird die Reaktionsmischung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Säure geht innerhalb etwa 1 Stunde in Lösung, wobei sich HCl entwickelt. Die dunkle Lösung wird in einen 250 ml-Kolben umgefüllt und das Lösungsmittel wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Benzol (etwa 100 ml) wird zu dem gelben Rückstand zugegeben und auf dem Rotationsverdampfer entfernt, was 6,65 g eines dunkelgrünen Feststoffs ergibt, der das gewünschte Chlorid ist.

E. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,5-pyridindimethanol Disäurechlorid

(aus Schritt D) 6,65 g (0,016 Mol)
Diglyme® 300 ml
Natriumborhydrid 1,5 g
Tetrahydrofuran 20 ml
Das NaBH&sub4; wird in einen trockenen 500 ml-Dreihalskolben eingewogen, der mit einem Argon-Einlaßrohr, einem Thermometer und einem Tropftrichter ausgerüstet ist. Ein Rührstab und Diglyme® (etwa 300 ml) werden zugegeben, und der Kolben wird mit Argon gespült und auf 0ºC gekühlt. Das Disäurechlorid wird in Diglyme® (etwa 40 ml) gelöst und THF (etwa 20 ml) wird in den Tropftrichter gegeben und tropfenweise unter Rühren und Kühlen über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten (Temperatur 0ºC) in den Kolben gegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Die Farbe der Lösung wechselt während der ersten Stunde von bernsteingelb zu korallenrot und verbleicht dann während der nächsten Stunde zu einem trüben gelbbraun. Das Produkt wird in Wasser (etwa 500 ml) und etwa 100 ml 0,1 M wäßrige Zitronensäure gegossen und auf einem Rotationsverdampfer (60ºC) konzentriert. Der Rückstand (etwa 500 ml) wird in Wasser (etwa 1 l ) gegossen und mit Et&sub2;O (4·100 ml) extrahiert. Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und ergeben 4,0 g des gewünschten Diols als einen gelbbraunen Feststoff, der in DMSO löslich ist.

F. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-di(brommethyl)-pyridin Diol (aus Schritt E)

plus eine Wiederholung) 5,1 g (21,1 mMol)
Triphenylphosphin 15,2 g
Brom 3,0 ml
Das Phosphin wird in einen trockenen 250 ml-Dreihalskolben mit runden Boden eingewogen. CH&sub3;CN (etwa 50 ml) und ein Rührstab werden in den Kolben gegeben, der mit einem Septum und einem Argoneinlaßrohr verschlossen wird. Die Lösung wird auf 0ºC in Eis/MeOH gekühlt und Br&sub2; wird tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Diol wird in CH&sub3;CN (etwa 75 ml) suspendiert, in den Phosphin-Bromin-Komplex transferiert, 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und in Wasser (etwa 600 ml) und nachfolgend in gesättigte NaHCO&sub3; (etwa 150 ml) gegossen. Diese wäßrige Suspension wird dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (2·200 ml) extrahiert. Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, durch Silikagel filtriert und mit CH&sub2;Cl&sub2; eluiert. Die Eluante werden auf einem Rotationsverdampfer zu 2,2 g eines weißen Feststoffs konzentriert, der das gewünschte Dibromid ist und Spuren von Triphenylphosphinoxid enthält.

G. 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(3-methoxy- 4-benzyloxyphenyl)-pyridin-tetramethylester

Dibromid (aus Schritt F) 2,15 g (4,5 mMol)
Iminodiessigsäure-dimethylester 1,45 g (9,0 mMol)
1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin 1,94 g
Der Iminoester wird in einen 100 ml Dreihalskolben eingewogen und die Base und CH&sub3;CN (etwa 50 ml) werden zugefügt. Das Dibromid wird in THF (etwa 35 ml) gelöst und in den Kolben gegeben, wobei unter einer Argonatmosphäre bei 45ºC über Nacht gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird in Wasser (etwa 150 ml) und 0,1 M Zitronensäure (etwa 150 ml) und EtOAc (etwa 150 ml) gegossen. Die EtOAc-Schicht wird abgetrennt; es wird mit 0,1 M Zitronensäure (etwa 100 ml), Wasser (etwa 100 ml) und Salzlösung (etwa 100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem dicken purpurnen Öl konzentriert. Das Öl wird in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und durch eine Schicht Silikagel (35 g) filtriert. Ein purpurnes Band wird mit 10% EtOAc in CH&sub2;Cl&sub2; (etwa 200 ml) eluiert. Dann wird der gewünschte Tetraester mit 50% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) und 80% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; (etwa 200 ml) eluiert. Die Eluantfraktionen, die den Tetraester enthalten, werden auf etwa 2,5 g Öl konzentriert.

H. Verseifung des Tetraesters

Der Tetraester aus Schritt G wird unter Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 1 verseift und ergibt die gewünschte Tetrasäure.

Beispiel 21

Entsprechend dem allgemeinen Verfahren nach Beispiel 19 werden die 4-[4 (oder 3)-Aminophenyl]-2,6-bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-pyridin-tetraester mit Digoxigeninon-3-O- carboxymethyloxim, Phenytoin-3-[8-octansäure] und Cortisol- 3-O-carboxymethyloxim gekuppelt und ergeben die konjugierten Materialien. Die Verseifung der Tetraester ergibt die Tetrasäuren, die mit den seltenen Erdmetallen die Fluoreszenzmarkierten, immunologisch aktiven Analoge der Zielanalyten bilden.

Claims

l. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß dieses eine mit einer substituierten Arylgruppe substituierte 2,6-Bis[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl)pyridin-Komponente umfaßt.
2. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 1, das zusätzlich ein biologisch aktives Material umfaßt.
3. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder beiden der Ansprüche 1-2, worin die substituierte Arylgruppe eine solche ist, die mit einer oder mehreren Elektronen-abgebenden Gruppen substituiert ist.
4. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 3, worin die Elektronen-abgebenden Gruppen ausgewählt werden aus C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Amino-, Dialkylamino-, Aryl- (einschließlich Aralkyl)- und Aryloxy- (einschließlich Aralkyloxy)-Gruppen.
5. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, worin die genannte, mit einer substituierten Arylgruppe substituierte 2,6-Bis[N,N- di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin-Komponente die allgemeine Formel (I):

hat m, worin n und n' unabhängig voneinander 1 oder 2 sind, Ar Aryl bedeutet, n'' eine ganze Zahl gleich der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen von Ar ist, M Wasserstoff oder ein Metallion ist und jede der n'' R- und R'- und R''- Gruppen unabhängig voneinander ausgewählt ist aus Wasserstoff, Elektronen-abgebenden Gruppen einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, Amino, Dialkylamino, Aryl (einschließlich Aralkyl) und Aryloxy (einschließlich Aralkyloxy), und einer Verbindungsgruppe einschließlich einer kovalenten Bindung und einer Überbrückungsgruppe, die eine Bindung zum Rest des Moleküls schaffen kann, unter der Voraussetzung, daß wenigstens eines der n'' R- Gruppen eine Elektronen-abgebende Gruppe ist und daß wenigstens eine der R'-, R''- und n'' R-Gruppen eine Verbindungsgruppe ist.
6. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 5, worin n und n' jeweils 1 sind.
7. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 5 oder 6, worin Ar Phenyl ist und wenigstens eines der n'' R -Gruppen ein C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy ist.
8. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-7, worin die M-Gruppen ein oder mehrere Metallionen einschließlich eines Ions der seltenen Erdmetalle in Komplexverbindung mit den vier Carboxylgruppen umfassen.
9. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8, worin der Rest des Moleküls, an welches die Pyridin-Komponente gebunden ist, ein biologisch aktives Material ist.
10. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß dieses umfaßt: eine mit einer substituierten Aryl-gruppe substituierte 2,6-Bis[N,N-di-(carboxylkly)aminoalkyl]-pyridin-Komponente der allgemeinen Formel (III):

worin M Wasserstoff oder ein Metallionen ist, n und n' unabhängig voneinander 1 oder 2 sind, jedes der 5 R-, R'- und R''-Gruppen unabhängig voneinander ausgewählt werden aus: einer kovalenten Bindung, Wasserstoff und Elektronen-abgebenden Gruppen einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, Amino, Dialkylamino, Aryl und Aryloxy unter der Voraussetzung, daß wenigstens eine oder mehrere der 5 R-Gruppen eine Elektronen-abgebende Gruppe ist und daß wenigstens eine der R' und R'' und 5 R-Gruppen eine Bindung zum Rest des Moleküls schaffen.
11. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 10, worin alle M-Gruppen Wasserstoff sind und/oder n und n' beide 1 und/oder R' und R'' beide Wasserstoff sind.
12. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach Anspruch 10, worin die M-Gruppen ein oder mehrere Metallionen einschließlich eines seltenen Erdmetalls in Komplexverbindung mit den vier Carboxylgruppen umfassen.
13. Durch Fluoreszenz nachweisbares Molekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 10-12, worin der Rest des Moleküls ein biologisch aktives Material umfaßt.
14. Durch Fluoreszenz nachweisbares spezifisches Bindungsreaktionsmittel mit der allgemeinen Formel (V):

worin M ein Metallion oder Wasserstoff ist, n* eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, Alk C&sub1;-C&sub4;-Alkyl bedeutet und ein biologisch aktives Material ist.
15. Durch Fluoreszenz nachweisbares spezifisches Bindungsreaktionsmittel nach Anspruch 14, worin jede M-Gruppe Wasserstoff oder jede M-Gruppe ein Metallion ist.
16. Reaktionsmittel nach Anspruch 14 oder 15, worin M ein oder mehrere Metallionen einschließlich eines Ions der seltenen Erdmetalle in Komplexverbindung mit den vier Carboxylgruppen umfaßt.
17. Mit einer substituierten Arylgruppe substituiertes 2,6- Bis[N,N-Di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin-Verbindung der allgemeinen Formel (Ia):

worin n und n' unabhängig voneinander 1 oder 2 sind, jede der n'' R-Gruppen und R' und R'' unabhängig voneinander ausgewählt werden aus Wasserstoff und Elektronenabgebenden Gruppen, einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;- C&sub4;-Alkyl-, Amino-, Dialkylamino-, Aryl- (einschließlich Aralkyl)- und Aryloxy- (einschließlich Aralkoyoxy)- Gruppen, Ar eine Arylgruppe bedeutet und n'' eine ganze Zahl gleich der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen von Ar ist.
18. Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) nach Anspruch 17, worin n und n' jeweils 1 sind.
19. Verbindung nach Anspruch 17 oder 18, worin wenigstens eine der R'-, R''- und n'' R-Gruppen eine Amino-Gruppe ist.
20. Verbindung nach einem oder mehreren der Ansprüche 17-19, worin eines von R', R'' und n'' R eine Amino-Gruppe ist.
21. Verbindung nach Anspruch 20, worin die genannte Aminogruppe zu einer Isothiocyanatgruppe umgewandelt worden ist.
22. Verbindung nach einem oder mehreren der Ansprüche 17-21,

worin R' und R'' Wasserstoff ist und Ar ein Phenyl ist, so daß die Verbindung die allgemeine Formel (IIIa) hat:
23. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit des Moleküls nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-16, welches das photometrische Anregen des genannten Moleküls und das Nachweisen einer fluoreszierenden Emission von dem genannten Molekül umfaßt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das genannte Anregen mit einem Strahlungsimpuls erfolgt, wobei der genannte Impuls eine Dauer hat, die im Vergleich zu der Fluoreszenz-Abklingzeit des genannten Moleküls kurz ist, und der Nachweis der Fluoreszenz des genannten Moleküls erfolgt, nachdem die Fluoreszenz anderer anwesender Substanzen im wesentlichen abgeklungen ist.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, worin vor der genannten Anregung ein Chelat des seltenen Erdmetalls mit dem genannten Molekül gebildet wird.