DE2921782C2

DE2921782C2 -

Info

Publication number: DE2921782C2
Application number: DE2921782A
Authority: DE
Inventors: Robert Thomas Edwardsburg Mich. Us Buckler; Hartmut Richard Elkhart Ind. Us Schroeder
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-07-24
Filing date: 1979-05-29
Publication date: 1988-11-17
Also published as: GB2026158A; FR2432038A1; DE2921782A1; JPS5519266A; IL57642A0; IL57642A; GB2042513A; FR2432038B1; GB2026158B; US4225485A; GB2043051B; GB2042513B; GB2043051A; CA1137974A

Description

Spezifische Bindungsuntersuchungen sind technisch stark weiterentwickelt worden von dem ursprünglichen kompetitiven Bindungs-Radioimmuno-Test (Radioimmunoassay RIA) bei dem ein Radioisotop-markiertes Antigen kompetitiv mit einem Antigen in einer Versuchsprobe bei der Bindung an einen spezifischen Antikörper ist. In der RIA-Technik wird eine Antigenprobe quantitativ bestimmt, indem man das Verhältnis der Radioaktivität bestimmt, die in dem Antikörper durch Bindung an das radiomarkierte Antigen (der gebundenen Spezies des markierten Antigens) vorliegt, zu der Radioaktivität, die unassoziiert vom Antikörper (der freien Spezies) vorliegt, und daß das Verhältnis mit einer Standardkurve vergleicht. Ein genauer Überblick über die RIA-Technik findet sich bei Skelly et al in Clin. Chem. 19 : 146 (1973). Gemäß der Definition basiert RIA auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an ein Antigen oder Hapten, jedoch sind radiomarkierte Bindungs-Analyse-Methoden entwickelt worden, die auf anderen spezifischen Bindungs-Wechsel wirkungen beruhen, z. B. zwischen Hormonen und deren Bindungsproteinen.

Ausgehend von radiomarkierten Bindungs-Untersuchungsmethoden wurden nicht-radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme, verwendet werden (US-PS 36 54 090 und 38 17 837). In der DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 werden verbesserte nicht- radioisotopische Bindungs-Untersuchungsmethoden beschrieben, bei denen ganz einmalige Markierungssubstanzen, einschließlich Coenzyme, cyclische Reaktanten, abspaltbare fluoreszente Enzymsubstrate und chemilumineszente Moleküle verwendet werden. Die chemilumineszente Markierung besteht aus einem organischen Molekül, das unter Ausbildung von Licht eine chemische Strukturveränderung erfährt.

Spezifische Beispiele für als chemilumineszente Markierungen geeignete Substanzen finden sich in der DE-OS 26 18 511. Solche Verbindungen sind z. B. Luminol, Iso luminol, Pyrogallol und Luciferin. Insbesondere wird ein Beispiel in der DE-OS 26 18 511 (und in Anal. Chem. 48 : 1933 (1976)) gezeigt, bei dem ein Isoluminol-markiertes Konjugat, bei welchem das Isoluminol durch seine Aminofunktion mittels einer 2-Hydroxypropylen-Brücke an den Liganden Biotin gebunden ist. Das Isoluminol-markierte Konjugat wird in dem Bindungsversuch durch Messen des entweder in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase oder von Kaliumsuperoxid produzierten Lichtes überwacht. Chemilumineszente Phthalhydrazid-markierte Konjugate, bei denen ein Aminophthalhydrazid durch die Aminofunktion über eine 2-Hydroxyalkylen-Brücke an einen Liganden gekuppelt sind, werden in der DE-OS 29 21 781 der Anmelderin beschrieben.

Die Effizienz von Aminophthalhydraziden als chemilumineszente Markierungen wurde dadurch verbessert, daß man sie über die Aminofunktion mit einer geradkettigen Niedrigalkylenbrücke kuppeln konnte.

Die in Liebigs Annalen der Chemie (1974), Seiten 789-808 beschriebenen sind ähnliche Verbindungen wie die erfindungsgemäßen, weisen aber eine wesentlich geringere Chemilumineszenz auf.

Die Erfindung betrifft nun Verbindungen der allgemeinen Formel

worin R einen geradkettigen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und n=2 bis 6 bedeutet, wobei n=4 bevorzugt ist. Als besonders bevorzugt gilt die Verbindung 7-N-Äthyl-N-(4-aminobutyl)-aminonaphthalin-1,2-carbon säure-hydrazid.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen zur Chemilumineszenzmarkierung.

Ein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbares Konjugat hat die Formel

worin R ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Äthyl, n=2 bis 6, vorzugsweise 4, und L(CO ein spezifisch bindungsfähiger Ligand oder ein Bindungsanalog dazu, gebunden durch eine Amidbindung, ist.

Diese chemilumineszenten Naphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid- markierten Konjugate werden in spezifischen Bindungsversuchen zum Nachweis des Liganden oder eines Bindungspartners davon verwendet. Die markierten Konjugate werden in der Bindungs-Untersuchungsmethode (bindung assay) hinsichtlich ihres Verhaltens überwacht, indem man die markierten Konjugate oxidiert und das erzeugte Licht entweder als gesamtes erzeugtes Licht oder als Peak-Lichtintensität mißt. Bei einem spezifischen Bindungsversuch zum Nachweis eines Haptens in einem flüssigen Medium kann man diese Untersuchung z. B. ausführen, indem man eine Probe des flüssigen Mediums mit einem Antikörper für das Hapten und mit einem markierten Konjugat der vorliegenden Erfindung, bei dem das Hapten oder ein Bindungsanalog davon mit dem chemilumineszenten Gruppierung markiert ist, inkubiert. Während der Inkubierung steht jegliches Hapten, das in dem flüssigen Medium vorliegt, im Wettbewerb mit dem markierten Konjugat, hinsichtlich der Bindung an den Antikörper. Anschließend bestimmt man die Menge des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies im Vergleich zu der freien Spezies (wobei diese Menge in umgekehrter Funktion zu der Menge des Haptens in der zu untersuchenden Flüssigkeit steht) und diese Bestimmung (d. h., Überwachung) erfolgt entweder in homogener Weise, wenn der Chemilumineszenz-Charakter des markierten Konjugats in der freien Spezies unterschiedlich ist gegenüber der gebundenen Spezies, oder die Bestimmung erfolgt in heterogener Weise, wenn in beiden Spezies dieser Charakter im wesentlichen gleich ist. In der homogenen Versuchsanordnung wird die nicht getrennte Reaktionsmischung, die beide Spezies des markierten Konjugats enthält, mit einem geeigneten Oxidationssystem für die chemilumineszente Markierung kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen. Bei der heterogenen Versuchsanordnung wird die gebundene von der ungebundenen Spezies in üblicher Weise abgetrennt, das Oxidationssystem wird mit einer Spezies kombiniert und das gebildete Licht wird gemessen.

Die überwachbare chemilumineszente Reaktion kann wie folgt beschrieben werden:

worin H ν die emittierte elektromagnetische Strahlung be deutet.

Brauchbare Oxidationssysteme schließen Wasserstoffperoxid in Kombination mit einem der nachfolgenden Katalysatoren, Peroxidase (insbesondere Mikroperoxidase), Katalse, Deuterohämin, Hämatin oder Ferricyanidionen; Hypochloridionen kombiniert mit Kobaltionen; Persulfationen; Kaliumsuperoxid; Perjodationen; Hypoxanthin kombiniert mit Xanthinoxidase oder Kalium-t-butoxid, ein.

Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren chemilumineszent markierten Konjugate können in allen üblichen homogenen oder heterogenen Bindungs-Untersuchungsmethoden, einschließlich den kompetitiven Bindungsmethoden, Sequenz-Sättigungsmethoden, Direkt-Bindungsmethoden und "Sandwich"-Bindungsmethoden angewendet werden. Zum Stand der Technik über die verschiedenen Bindungs-Untersuchungs verfahren wird auf die schon erwähnten DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 verwiesen.

Die hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht anders angegeben, folgende Bedeutung: "spezifisch bindungsfähiger Ligand" ist eine organische Substanz von analytischem Interesse, für die ein spezifischer Bindungspartner vor liegt; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist die Substanz, welche eine nicht-kovalente Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß von anderen Substanzen hat; und "Bindungsanalog des Liganden" ist eine organische Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von dem Liganden unterscheidet, aber sich im wesentlichen genauso wie der Ligand hinsichtlich der Bindungsaffinität an den spezifischen Bindungspartner des Liganden verhält.

Der spezifische bindungsfähige Ligand oder dessen Analog in den vorliegenden markierten Konjugaten ist hinsichtlich seiner chemischen Art im allgemeinen ein Protein, Polypeptid, Peptid, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für die ein spezifischer Bindungspartner erhältlich ist. Funktionell ausgedrückt ist der Ligand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin, ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür. Meistens ist der Ligand ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500.

Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen erhältlichen markierten Konjugate werden im allgemeinen hergestellt, indem man eine Peptid- oder Amidkupplung zwischen (1) einem Aminoderivat eines chemilumineszenten Naphthalin-1,2-dicarbonsäure-hydrazids und (2) entweder dem Liganden, falls dieser eine Carbonsäurefunktion enthält, oder einem Bindungsanalog des Liganden (d. h., einem Derivat des Liganden) welcher die gewünschte Carbonsäurefunktion enthält, herstellt. Solche Kondensationsreaktionen können durch Umsetzung des Aminoderivates der Markierung direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem Analog des Liganden unter Anwendung üblicher Peptid-Konden sationsreaktionen durchgeführt werden, z. B. der Carbodiimidreaktion (Science 144 : 1344 (1964)), der Mischanhydridreaktion (Erlanger et al, Methods in Immunology and Immunochemistry, herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press (New York 1967), S. 149), und den Säureazid- und Aktivesterreaktionen (Kopple, Peptides and Amino Acids, W. A. Benjamin, Inc. (New York 1966)). Ein allgemeiner Überblick hierzu findet sich in Clin. Chem. 22/726 (1976).

Selbstverständlich können andere bekannte Verfahren zum Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das Aminoderivat der Markierung angewendet werden. Insbesondere können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivates, enthaltend eine Carbonsäure oder eine Aminogruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin- Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis-imidoester und Glutaraldehyde (Immunochem. 6 : 53 (1969)) zum Kuppeln eines Liganden oder eines Derivates davon, enthaltend eine Amino gruppe, an das Aminoderivat der Markierung verwendet werden. Es sind auch geeignete Kupplungsreakionen bekannt, bei denen eine Brückengruppe zum Kuppeln eines Amins (z. B. des Aminoderivates der Markierung) an eine Carbonsäure (z. B. den Liganden oder dessen Derivat) verwendet wird. Kupplungsreaktionen dieser Art werden ausführlich in der Literatur beschrieben und zwar beispielsweise in der schon erwähnten Monografie von Koppel, in Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons (New York 1974).

Solche Kupplungsverfahren sind äquivalent zu den vorher erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen bei der Herstellung geeigneter markierter Konjugate. Die Wahl des Kupplungsverfahrens hängt von den für die Kupplung verfügbaren Funktionalitäten in dem Liganden oder dessen Analog zum Kuppeln an das Markierungsderivat und von der Länge der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen besteht das erhaltene markierte Konjugat aus dem markierten Derivat gebunden an den Rest des Konjugates über eine Amidbindung. Ein solcher Rest des Konjugats wird als Rest eines Bindungs analog des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht selbst direkt an das Markierungsderivat gekuppelt ist. In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Abkürzung L(CO den Liganden oder ein Bindungsanalog davon, gekuppelt über eine Amidbindung, worin ein solches Analog ein Derivat des durch Peptidkondensation an das Markierungsderivat gekuppelten Liganden sein kann oder der Ligand oder ein Derivat davon sein kann, das über eine Brückengruppe, die durch Kupplung des Liganden oder dessen Derivates an das Markierungsderivat mit einem bifunktionellen Kupplungsmittel sein kann.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen bis hin zu den chemilumineszent markierten Konjugaten verläuft nach der folgenden allgemeinen Synthesesequenz:

Bei der Umsetzung eines N-(ω-Bromalkyl)-phthalimids (I) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin USA, siehe auch Derscherl und Weingarten, Justus Liebig′s Annalen der Chemie 574 : 131 (1951)) mit Dimethyl-7-aminonaphthalin-1,2- dicarboxylat (Gunderman et al, Justus Liebig′s Annalen der Chemie 684 : 127 (1965)) bildet sich das Zwischenprodukt Dimethyl-7-[ω-(phthalimido)-alkyl]-aminonaphthalin-1,2- dicarboxylat (II)

Durch Alkylierung der Aminogruppe des Zwischenprodukt- Dicarboxylats (II) durch Umsetzung mit einem Dialkylsulfat (III) (Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1, Elsevier Publ. Co. (New York 1951) S. 337)

erhält man das alkylierte Derivat (IV)

worin R′ ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.

Behandelt man das Zwischenprodukt-Docarboxylat (II) oder das alkylierte Derivat (IV) mit Hydrazin, so erhält man das Aminohydrazid (V)

worin R Wasserstoff oder ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Durch Kondensation des Aminohydrazids (V) mit (a) dem zu markierenden Liganden, sofern dieser eine Carboxylsäurefunktion enthält, (b) einem Bindungsanalog des Liganden, wobei das Bindungsanalog ein Carbonsäurederivat des Liganden darstellt, oder (c) dem Liganden oder einem geeigneten Derivat des Liganden in Gegenwart eines bifunktionellen Kupplungsmittels, erhält man das chemilumineszent markierte Konjugat (VI)

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und L(CO den spezifisch bindungsfähigen Liganden oder ein Bindungsanalog davon (durch Ableitung des Liganden und/oder Einführung einer Brücke mittels eines bifunktionellen Kupplungsmittels gebildet), gebunden über eine Amidbindung.

Andere Variationen von markierten Konjugaten, die auf der vorerwähnten Synthese beruhen, liegen auf der Hand. So kann man insbesondere verschiedene ringsubstituierte 7-Aminonaphthalin-1,2-dicarboxylate als Ausgangsmaterialien verwenden unter Bildung von ringsubstituierten markierten Konjugaten, die im wesentlichen die gleichen qualitativen Eigenschaften haben, wie die nach dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschema hergestellten Konjugate.

Wie bereits festgestellt, ist der Ligand in dem markierten Konjugat oder dessen Bindungsanalog in dem markierten Konjugat in den meisten Fällen ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper; oder ein Hapten mit einem Molekular gewicht zwischen 100 und 1500. Nachfolgend werden ver schiedene Kupplungsmethoden für solche Liganden und deren Analoge an das Aminoderivat (V) der Markierung über eine Amidbindung beschrieben.

Polypeptide und Proteine

Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere solche der IgG, IgE, IgM und IgA Klasse, z. B. Hepatitis B-Antikörper und antigenische Proteine, wie Insulin, chorionisches Gonadotropin (z. B. HCG), car cinoembrionisches Antigen (CEA).

Da Liganden dieser allgemeinen Kategorie als Peptide zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen aufweisen, kann die Kupplung des Aminoderivates der chemilumineszenten Markierung mittels üblicher Peptid-Kondensationsreaktionen erfolgen, wie durch eine Carbodiimid-Reaktion, der Mischanhydrid-Reaktion und dergleichen, wie sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der Lage sind, eine Carbonsäurefunktion oder eine Aminofunktion an einer Aminogruppe in dem Markierungsderivat zu bewirken, wie bereits erwähnt wurde. Allgemeine Hinweise bezüglich der Kupplung von Proteinen an primäre Amino oder Carbonsäuren wurden bereits vorher gegeben.

Haptene

Haptene stellen eine große Klasse organischer Substanzen dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen Konjugates aus dem Hapten, gekuppelt an ein Trägermolekül, und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Albumin injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungs reaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäure liganden oder deren Bindungsanalogen an die Aminoderivate der chemilumineszenten Markierung.

Weitere Liganden sind die Carbonsäurederivate von
Carbamazepin (gemäß US-PS 40 58 511);
Chinidin (nach dem Verfahren von Cook et al, Pharmacologist 17 : 219 (1975);
Digoxin und Digitoxin (nach dem Verfahren von Oliver et al, J. Clin. Invest. 47 : 1035 (1968);
Theophyllin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 13 : 497 (1976);
Phenobarbital und Primidon (Cook et al, Quantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press (New York 1976), S. 39-58);
Diphenylhydantoin (nach dem Verfahren von Cook et al, Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 5 : 767 (1973));
Morphin (nach dem Verfahren von Spector et al, Science 168 : 1347 (1970));
Nikotin (nach dem Verfahren von Langone et al, Biochem 12 (24): 5025 (1973)),
Androgene; Östrogene und Progesterone (nach dem Verfahren von Bauminger et al, J. Steroid Biochem. 5 : 739 (1974)).

Die hier erwähnte allgemeine Synthese zur Herstellung der unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren chemilumineszent markierten Konjugate wird nachfolgend anhand der Herstellung des markierten Thyroxin-Konjugats 7-/N-Äthyl-N-(4-thyroxinylamido)-butyl/-aminonaphthalin-1,2- dicarbonsäurehydrazid erläutert. Die Reaktionsfolge für diese Synthese wird in der nachfolgenden Tab. 1 gezeigt.

Tabelle 1

(A) Herstellung des markierten Konjugates Dimethyl-7-[4-N-(phthalimido)-butyl]-aminonaphthalin- 1,2-dicarboxylat (3)

Eine Lösung aus 14,1 g (0,05 mol) N-(4-Brombutyl)phthal imid (1) und 25,0 g (0,1 mol) Dimethyl-7-aminonaphthalin- 1,2-dicarboxyalat (2) (Gundermann et al, Justus Liebig′s Annalen der Chemie 684 : 127 (1965)) in 100 ml 2,2,2-Trifluor äthanol wurde unter Argon 16 Stunden unter Rückfluß behandelt. Beim Verdampfen erhielt man einen Rückstand, der zwischen 400 ml Äther und 300 ml Wasser (H₂O) zugeteilt wurde. Die Ätherphase wurde abgetrennt, getrocknet und abgedampft. Der erhaltene dunkelrote Rückstand wurde über eine Säule von 1200 g Kieselgel (E. Merck, Darmstadt, Westdeutschland) chromatografiert und mit einer 19 : 1 Mischung (V/V) Benzol und Methanol eluiert. Die ersten 700 ml des Eluats wurden verworfen und dann wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 219 bis 251 wurden vereint und eingedampft, wobei man 9 g des substituierten Carboxylats (3) als klares rotes Öl erhielt.

Analyse:
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 1,7 (m, 4H), 3,9 (s, 3H), 4,0 (s, 3H)
IR-Spektrum (CDCl₃): 1720 cm^-1 (Carbonyl)
Massenspektrum (70 eV) m : e : 461 [MH⁺], 460 [M⁺], 429 [M⁺ minus OCH₃]

Dimethyl-7-{-Äthyl-N-[4-(N-phthalimido)-butyl]-amino}- naphthalin-1,2-dicarboxylat (4)

Eine Mischung aus 9 g (0,02 mol) des substituierten Carboxylats (3) und 20 ml Diäthylsulfat wurde 2 Stunden unter Argon auf 830°C erhitzt. Die dunkle Lösung wurde in ein Becherglas mit zerstossenem Eis, enthaltend 200 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, gegossen. Nachdem das gesamte Eis geschmolzen war, wurde die Mischung mit 3 250 ml Volumina Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereint, getrocknet und eingedampft, wobei man ein rotes Öl erhielt. Das Öl wurde über eine Säule von 600 g Kieselgel mit einer 9 : 1 (V/V) Mischung Benzol und Methanol eluiert und die hellgelben Fraktionen wurden vereint und eingedampft. Überschüssiges Diäthylsulfat wurde durch Sublimation bei 50°C und einem verminderten Druck von 0,01 mm Quecksilber abgedampft, wobei ein Rück stand von 4 g N-Äthyl-substituierten Carboxylat (4) als hellgelbes Öl zurückblieb.

Analyse:
NMR-Spektrum (CDCl₃): δ 3,9 (s, 3H), 4,1 (s, 3H)
Massenspektrum (70 eV) m/e: 489 [MH⁺], 488 [M⁺], 457 [M⁺ minus OCH₃]

7-[N-(4-Aminobutyl)-N-äthyl]-aminonaphthalin-1,2-dicarbonsäure- hydrazid (5)

Eine Mischung aus 4 g (0,008 mol) des N-äthylierten substituierten Carboxylats (4), 15 ml 85%igem Hydrazin und 50 Methanol wurde 3 Stunden unter Rückfluß gehalten.

Nach dem Abkühlen wurde die Mischung auf einem Drehverdampfer zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand abgeschabt und über Nacht bei 80°C im Hochvakuum getrocknet. Der entstandene dunkle Feststoff wurde über eine Säule aus 200 g Kieselgel (Merck, Darmstadt, Westdeutschland) mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung aus Äthanol und 1m Trimethylammoniumbicarbonat eluiert und 20 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 25 bis 75 wurden vereint und eingedampft, wobei man einen gelben Feststoff erhielt. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Pyridin erhielt man 1,1 g Aminohydrazid (5) in Form von feinen gelben Kristallen mit dem Schmelzpunkt 246 bis 247°C.

Analyse für C₁₈H₂₂N₄O₂:
Berechnet:C 66,24 H 6,80 N 17,17 Gefunden:C 66,05 H 6,69 N 17,65 NMR-Spektrum (d₆-DMSO): δ 1,1 (m, 3H), 1,5 (m, 4H)
IR-Spektrum (KCl): 1615 cm^-1 (Carbonyl)

Zur Bestimmung der Effizienz wurde das Markierungsderivat und Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalizin-1,4-dion) individuell mit verschiedenen Niveaus im pikomolaren Bereich oxidiert und verglichen mit den Peak-Lichtintensitätenmittels einer grafischen Aufzeichnung. Lineare Anteile der entstandenen Kurve ermöglichten eine Berechnung der Veränderung der Peak-Lichtintensität pro Konzentrationseinheit für das Markierungsderivat und für Luminol. Die Effizienz des Markierungsderivats wurde als Prozentsatz der Luminol-gebildeten Steigung ausgedrückt.

Reaktionsmischungen (150 µl) der folgenden Zusammensetzung wurden in 6×50 mm Reagenzgläser gefüllt und in einen Dupont 760 Luminiszenz-Biometer mit einer Empfindlichkeits einstellung von 820 gegeben. Die Mischungen hatten folgende Zusammensetzung: 50 mmol Natriumhydroxid, 57,5 mmol Barbital, eingestellt auf pH 8,6, 0,27µm Mikroperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri USA) und entweder das Aminoderivat der Markierung oder Luminol in variierenden Konzentrationen im pikomolaren (pM) Bereich (verdünnt mit H₂O aus einer Vorratslösung von 1 mmol in 0,1M Natriumcarbonat, pH 10,5). Der End-pH der Reaktionsmischung betrug 12,6. Jede Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zum Einleiten der Chemilumineszenz-Reaktion wurden 10 µl 90 mmol Wasserstoffperoxid in 10 mmol Tris-HCl-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan-hydrochlorid], pH 7,4, zugegeben. Die Peak-Lichtintensitätswerte wurden anhand der Instrumentablesungen aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und der Durchschnitt wurde genommen. Die Effizienz des Markierungsderivates (5) betrug 420%.

Die Nachweisgrenze wurde als die Konzentration des Markierungsderivates bestimmt, welche eine Peak-Lichtintensität vom 1,5fach Wert der Hintergrund-Chemilumineszenz in dem Reaktionsgemisch ergab. Die Nachweisgrenze für das Markierungsderivat (5) betrug 0,1 pM.

N-Trifluoracetylthyroxin (6)

Eine Lösung aus 20 g (25,6 mmol) L-Thyroxin in 240 ml trockenem Äthylacetat, enthaltend 46 ml Trifluoressigsäure und 7,6 ml Trifluoressigsäureanhydrid, wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und Zugabe von 200 ml H₂O bildete sich eine Suspension, die mit Natriumchlorid gesättigt wurde. Die organische Phase der Mischung wurde abgetrennt, mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei man 21,3 g N-geschütztes Thyroxinderivat (6) erhielt. Eine Probe wurde aus Äther-Pentan umkristallisiert, wobei man feine Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₁₇H₁₀F₃J₄NO₅:
Berechnet:C 23,39 H 1,15 N 1,60 Gefunden:C 23,23 H 1,12 N 1,56 IR-Spektrum (KCl): 1700 cm^-1 (Carbonyl)
optische Drehung [α]=-14,97°C (c 1,0, Dimethylsulfoxid)

7-[N-Äthyl-N-(4-thyroxinylamido)-butyl]-aminonaphthalin- 1,2-dicarbonsäure-hydrazid (7)

Eine Lösung aus 1,746 g (2 mmol) N-Trifluoracetylthyroxin (6) in 20 ml trockenem Pyridin wurde unter Argon und unter Rühren auf -10°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 450 mg (2,2 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und 45 Minuten später 980 mg (3 mmol) des Aminohydrazids (5). Nach 3stündigem Rühren bei -10°C ließ man das Reaktionsgemisch über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 ml Pyridin verdünnt, 10 g Kieselgel wurden zugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft. Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine Säule aus 200 g Kieselgel, die mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung aus Äthanol und 1 M Triäthylammoniumbicarbonat behandelt worden war, gegeben und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Die ersten 400 ml des Eluats wurden verworfen und dann wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 19 bis 30 wurden vereint und eingedampft, wobei man einen gelben kristallinen Rückstand erhielt. Dieses Produkt wurde 3 Stunden in 300 ml 1 m Triäthylamminiumbicarbonat rückflußbehandelt, um die Trifluoracetyl- Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Die Lösung wurde dann noch heiß filtriert. Nach dem Abkühlen wurden 15 g Kieselgel zugegeben und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der imprägnierte Kieselgel wurde auf eine 200g Säule aus Kieselgel gegeben und mit einer 7 : 3 (V/V) Mischung Äthanol und 1 m Triäthylammoniumbicarbonat eluiert und es wurden 20 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 30 bis 50 wurden vereint und eingedampft, wobei man 910 mg des markierten Thyroxin-Konjugats (7) als gelben Feststoff erhielt. Eine 110 mg Probe wurde auf einer 45×3,2 cm Säule aus Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) mit Methanol eluiert. Die Fraktionen mit einem Volumen von 7 ml wurden gesammelt und die Fraktionen 64 bis 76 wurden vereint und eingedampft, wobei man 60 mg des markierten Konjugats (7) als gelben Feststoff mit dem Schmelzpunkt 218°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₃₃H₃₁J₄N₅O₅:
Berechnet:C 36,52 H 2,88 J 46,77 N 6,45 Gefunden:C 35,61 H 3,02 J 44,60 N 6,25

(B) Bindungstest für Thyroxin

Kompetitive Bindungsreaktionsmischungen (200 µl) wurden dreifach angesetzt durch Kombination der folgenden Reagentien: 50 µl 10 nM markiertes Konjugat (7) in 75 ml Barbital-Puffer (pH 8,6), 50 µl einer Zubereitung eines Antikörpers für Thyroxid im gleichen Puffer, variierenden Volumina von 54,8 nM Thyroxin im gleichen Puffer mit einem ausreichenden Volumen an Puffer, um das Endvolumen auf 200 µl zu bringen. Nach 10minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurden die freie und die gebundene Spezies des markierten Konjugats aus jeder Reaktionsmischung durch Aufbringen eines 150 µl aliquoten Teils auf kleine Sephadex G-25 Kolonnen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) getrennt. Die Kolonnen hatten ein Bettvolumen von 1,5 µl und waren zuvor hintereinander mit 3 ml Volumina 7%iger Essigsäure (3 mal), H₂O, 0,1 N Natriumhydroxid (3mal) und 75 mmol des Barbital-Puffers gewaschen worden. Die gebundene Spezies des markierten Konjugats wurde aus der Säule mit 1,5 ml des Barbital-Puffers eluiert, so daß die freie Spezies in der Säule verblieb.

Ein aliquoter Teil (95 µl) des Abflusses aus jeder Säule wurde zu 55 µl einer Lösung aus 134 mmol Natriumhydroxid, 0,73 µmol Mikroperoxidase und 27 mmol Barbital in ein 6×50 mm Reagenzglas gegeben. Nach 10minütiger Inkubierung bei Raumtemperatur wurde jedes Reagenzglas in ein Dupont 760 Biometer gegeben und dazu wurden 10 µl von 90 mM Wasserstoffperoxid in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) zugegeben. Die auftretende Peak-Intensität des bei der Chemilumineszenz-Reaktion erzeugten Lichtes wurde von den Instrumentenablesungen aufgezeichnet. Jede Bindungsmischung wurde 3fach ausgewertet, so daß man insgesamt neun individuelle Peak-Lichtintensitätswerte maß, von denen man für jedes unterschiedliche Volumen an zugegebenem Thyroxin zu der Anfangsreaktionsmischung den Durchschnitt nahm.

Die Peak-Intensitätswerte wurden auch in bezug gesetzt als Prozentsatz des gesamten markierten Konjugats in der gebundenen Spezies, indem man das Verhältnis solcher Werte zu den Peak-Lichtintensitätswerten, die in der Chemilumineszenz-Reaktion unter Verwendung von 95 µl von 0,25 nM markiertem Konjugat anstelle des Säulenausflusses gemessen hatte. Die Hintergrund-Chemilumineszenz bei der Überwachungsreaktion betrug 0,3 Peak-Intensitätseinheiten.

Die Beziehung der Menge an Thyroxin bei der Bindungsreaktion zu den Peak-Lichtintensitäten und der Prozentsatz des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies werden in der Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Die Ergebnisse zeigen, daß die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren markierten Konjugate geeignet sind, in Bindungsversuchen zum Bestimmen eines Liganden in einem flüssigen Medium verwendet zu werden.

Claims

1. Eine Verbindung der allgemeinen Formel worin R einen geradkettigen Alkyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und n=2 bis 6 bedeutet.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin n=4 ist.

3. 7-N-Äthyl-N-(4-aminobutyl)-aminonaphthalin-1,2-carbon säure-hydrazid.

4. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Chemilumineszenzmarkierung.