DE3523649A1

DE3523649A1 - Antihelmintikum und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3523649A1
Application number: DE19853523649
Authority: DE
Inventors: Evgeni Evgeniev Gabev; Tufik Hussein Sofia/Sofija Hassan; Ivan Vassilev Ivanov; Olga Todorova Polyakova-Kresteva; Detchko Kirilov Svilenov
Original assignee: TS LAB HELMINTOLOGIA
Current assignee: TS LAB HELMINTOLOGIA
Priority date: 1984-07-02
Filing date: 1985-07-02
Publication date: 1986-01-23
Also published as: FR2566663A1; FR2566663B1; GB2184013A; HUT38534A; JPS6183115A; BG40180A1; GB8530637D0; CH665354A5; BE902788A; GB2184013B

Description

Antihelmintikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Antihelmintikum, insbesondere zur Behandlung von Echinococcen- und Alveococcenerkrankungen und ein Verfahren zu seiner Herstellung, welches in der Human- und Veterinärmedizin Anwendung finden soll.

Bekannt ist die Applikation des Mebendazols (Methyl-5-benzoyl-2-benz-imidazol-Carbamat) zur Behandlung von Echinococcen- und Alveococcenerkrankungen in Form von Tabletten.

Die Nachteile des Mebendazols als Antiechinococcenmittei bestehen in seiner schwachen Wirkung bei Menschen als auch bei Tieren, sogar bei täglicher Einnahme während 1 bis 5 Jahren. Es weist eine Toxizitat gegenüber dem Organismus des Rezeptors auf. In den letzten Monaten einer Schwangerschaft werden durch das Präparat verursachte Nebenwirkungen beobachtet.

Die bekannten Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Stoffen enthaltende Liposomen bestehen im Auflösen der Phospholipide in einem organischen, bestimmte Konzentrationen aufweisenden Lösungsmittel, Verdampfen, Zufügen von Wasser oder eines Puffers und nachfolgende Behandlung mit Ultraschall.

(Francis Szoka, Jr., Demetrios Papahadjopoulis, Ann. Rev. Biaphys. Bioeng., 1980, 9:467-508)

(Liposomi ν biologitscheskih sistemah, P/r G. Gregoriadisa, A. Alisona, M. "Medizina", 1983, S. 384)

Die nach diesem Verfahren hergestellten Liposome mit einer einlarnel lösen Struktur besitzen eine kleine

Effektivität beim Einschließen optimaler Mengen hydrophober Arzneistoffe, wovon ein treffendes Beispiel das Mebendazol ist.

Aufgabe der Erfindung war es nun, ein Antihelmintikum bereitzustellen, insbesondere zur Behandlung der Echinococcen- und Alveococcenerkrankungen, auf Mebendazol-Basis, sowie auch ein Verfahren zu seiner Herstellung, das eine venöse Applikation erlaubt. Das Antihelmintikum soll eine hohe Wirksamkeit sowie niedrige Toxizität gegenüber dem Rezeptor besitzen.

Diese Aufgabe wurde durch ein Antinelmintikum gelöst, das eine Liposomform darstellt, welche Mebendazol (Methyl-ö-Benzoyl^-benz-imidazol-Carbamat) von 0,5 bis 2,0 g, allgemeine Eigelblipide von 0,2 bis 0,6 g und 0,9% wässrige Natriumchlorid-Lösung enthält.

Die erfindungsgemäßen Liposome sind in Bezug auf den durchschnittlichen Durchmesser homogen, welcher elektromikroskopisch bestimmt durchschnittlich 0,4 Mikron beträgt. Es wurden auch Liposome mit einem Durchmesser von 0,3 und 0,5 festgestellt. Die Liposome sind multilamellös, d.h., daß sie aus einigen bimolekularen Schichten aufgebaut sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Antihelmintikums wird folgendermaßen verfahren: Zu einer Chloroform/Methanol-Lösung allgemeiner Eilipidenwird Methyl-5-benzoyl-2-benz-imidazol-Carbamat gegeben. Das Gemisch wird gerührt und bei einer Temperatur von 20 bis 4O⁰C bis zur Trockne eingedampft. Danach wird eine 0,9%ige wässrige Natriumchlorid-Lösung bei Zimmertemperatur und ständigem Rühren zugefügt

zum Hydratisieren des Lipiös bis zur endgültigen Bildung der Liposome. Die letzteren werden 1 bis 12 mal Einfrier- und Auftauzyklen bei einer Temperatur von -196⁰C und +35⁰C ausgesetzt. Das Verhältnis wässrige Phase:Mebendazol:Lipid muß von 15:0,6:0,1 bis 25:0,5:0,2 sein. Es wird sodann eine Liposomform des Antihelmintikums erhalten, welche seine venöse Applikation erlaubt.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Antihelmintikums zur Behandlung der Echinococcen- und Alveococcenerkrankungen bestehen in seiner hohen Wirksamkeit, kurzfristigen Behandlungsdauer und Unschädlichkeit. Es wird ein Depot-Effekt erreicht, was zur Vergrößerung der Verabreichungsintervalle und Verminderung der gesamten Dosis führt. Das Antihelmintikum ist biologisch abbaubar.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind: Es sind keine spezielle Apparatur und Rohstoffe erforderlich,

das Verfahren ist schnell und leicht durchführbar, es sichert die Herstellung stabiler Liposome.

Beispiel 1:

Das erfindungsgemäße Antihelmintikum weist folgende Zusammensetzung auf:

wässrige Phase (0,9 % wässrige Natriumchlorid-Lösung}, 40 ml, Mebendazol (Substanz) 1 g, Lipidphase (allgemeine Eigelblipide) 0,4 g.

Die Elektronenmikroskopie ermöglicht eine äußerst präzise Charakteristik der Liposome. Die hergestellten Liposome besitzen vesikuläre, multilamellöse, zweischichtige lipide Membranstrukturen (Fig. 1). Die vielen Lamellen, aus denen das Liposom aufgebaut ist, sind deutlich zu sehen. Jede einzelne Lamelle stellt eine bimolekulare Lipidschicht mit einer Dicke von etwa 50 8 dar, was der Dicke der natürlichen biologischen Membranen entspricht.

Beispiel 2

Das erfindungsgemäße Antihelmintikum wird folgendermaßen hergestellt:

In einen Kolben mit rundem Bogen wird mit einer Pipette bei sterilen Bedingungen 3,2 Milliliter Lösung von allgemeinen Eigelb-Lipiden abgemessen, welche in destilliertem Chloroform und Methanol (1 %) gelöst sind. Die Ausgangs-Lipidlösung weist eine Konzentration von 129 mg/ml auf. Es werden noch 10 Milliliter Chloroform zugegeben und gut geschüttelt (Vortex). Danach wird zum Lipid 1,0 g Mebendazol-Substanz zugefügt und zwar allmählich unter ständigem Rühren. Es wird dann auf einem Rotorverdampfer während 5 bis 6 Minuten bei Zimmertemperatur eingedampft. Dann wird noch 5 ml Chloroform zugegeben und erneut auf einem Rotorverdämpfer während 1,5 Stunden bei einer Temperatur von 35°-2°C (Wasserbad) eingedampft. Eventuelle Chloroform-Spuren werden mittels Durchblasen mit Stickstoff während 5 Minuten entfernt. Zu der auf diese Weise getrockneten Substanz wird 40 ml steriles physiologisches Serum (0,9 % wässrige Natriumchlorid-Lösung) zugegeben. Es wird mit Stickstoff für 5 Minuten durchblasen, wonach es während 1 Stunde bei Zimmertemperatur und ständigem Rühren (Vortex) inkubiert wird, um das Lipid zu hydratisieren. Es folgt ein schnelles zwei- bis dreiminütiges

Einfrieren mit flüssigem Stickstoff und ein nachfolgendes Auftauen in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 5O⁰C während 2 bis 3 Minuten unter ständigem und intensivem Schütteln, wobei kontrolliert wird, daß d
übersteigt.

wird, daß die T⁰ des Gemisches im Kolben 4O⁰C nicht

Beispiel 3

Das vorgeschlagene Antiechinococcenmittel wurde auf experimentell mit Echinococcen angesteckten Tieren geprüft. Die Behandlung der Tiere (Schafe A und B) begann 20 Monate nach der Ansteckung. Um die Behandlungswirkung verfolgen zu können, wurde vor jeder Injektion Blut für die Untersuchung der Dynamik der Antikörper nach dem Verfahren - Reaktion der passiven Hämoglutination entnommen (Fig. 2).

Es wurde der allgemeine Zustand der Tiere während der Behandlung, das makroskopische Bild, die pathohystologischen Veränderungen im Parasit und in den inneren Organen des Rezeptors, sowie auch die ultrastrukturellen Veränderungen im Parasit und den betreffenden Organen festgestellt und markiert. Unmittelbar nach der Zubereitung der Liposome mit eingeschlossenem Mebendazol, welche eine milchweiße Suspension mit spezifischem Geruch und salzigem Geschmack darstellten, wurden sie einmal in der Woche intravenös (Vena ugularis) in einem Volumen von 20 ml und Dosis gegenüber dem Mebendazol 10 mg/kg injiziert. Die Geschwindigkeit der Einführung von 4-5 Minuten bis 5-6 Sekunden weist keine Wirkung gegenüber der Verträglichkeit des Präparates auf. Es wurden auch keine Nebenwirkungen während der ganzen Behandlungsperiode beobachtet. Die ganze Behandlung schließt 6 Injektionen ein. Die behandelten Tiere wurden

3 Wochen nach der letzten injektion getötet, wobei 1 Stunde davor die Tiere injiziert wurden, um die Lokalisierung der Liposome in den einzelnen Organen elektronenmikroskopisch verfolgen zu können. Die Kontrolltiergruppe, angesteckt mit demselben Parasit und nicht behandelt, wurde ebenso histologisehen und elektronenmik~GSkopischen Untersuchungen ausgesetzt. Am Ende des Experiments waren die behandelten Tiere in einem sehr guten allgemeinen Zustand und hatten auch zugenommen. Der Titer der Antikörper (Fig. 2) fiel progressiv nach der zweiten Injektion bis zu der sechsten Behandlung ab, wonach er sich stabilisiert hat und blieb bis zum Ende der Untersuchungsperiode (9 Wochen) konstant. Bei den Kontrolltieren wurden makroskopisch Zysten mit einer Größe von 10 bis 20 mm und einem charakteristischen makroskopischen Bild und Ultrastruktur festgestellt. Bei den behandelten Tieren wiesen die Zysten 1 bis 5 mm auf und pdtohistologisch wurde eine völlige Destruktion der germinativen Schicht und wesentliche Veränderungen in der kutikularen Membrane beobachtet. Auf der Wand; perizysiös, und in einigen fällen auch in der EcIiIr.ococcenbld.se., wurden Calci umabiagerungen festgestellt. Die inneren Organe der behandelten Tiere haben keine Abweichung von der Norm gezeigt. Ultrastruktureil wurde ein gut erhaltenes Parenchym festgestellt. Es wurde eine Mehrzahl sekundärer Liposome mit einer Charakteristik von Autophagosornen und restlichen Körperchen beobachtet. In einem Teil davon wurden Reste von einer Destruktion und Phagozytose ausgesetzten Liposomen entdeckt. Dia gerrr.inative Membrane zeigt eine völlige Destruktion, wobei Rests in Form von Biascnen, mernbranöse Dilcungen, osmlopnyle Granalien und andere festgestellt wurden (Fig. 4}. In den nekrotischen Zonen wurden Einschlüsse mit einer Charakteristik von einem Zerfall ausgesetzter. Liposomen festgestellt.

BAD ORIGINAL

Claims

FÜNER EBBINGHAUS FINCK

PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

MARIAHILFPLATZ 2*3, MDNCHEN BO POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MDNCHEN 95
2. Juli 1985

Zentralna Laboratoria DEAA - 32962.4

po Helmintologia

Antihelmintikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Patentansprüche :

1. Antihelmintikum, insbesondere zur Behandlung von Echinococcen- und Alveococcenerkrankungen auf Basis von Methyl-5-benzoyl-2-benzimidazolcarbamat, daaurch gekennzeichnet, daß es eine Liposomform darstellt, welche allgemeine Eigelblipide und eine 0,9 %-ige wässrige Natriumchlorid-Lösung in folgenden quantitativen Verhältnissen enthält:

Methyl-5-benzoyl-2-benzimidazolcarbamat von 0,5 bis 2,0 g allgemeine Eigelblipide von 0,2 bis 0,6 g

0,9% wässrige Natriumchlorid-Lösung von 20 bis 80 ml

2. Verfahren zur Herstellung des.Antihelmintikum nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzei chnet, daß man in eine Chloroform-Methanol-Lösung von allgemeinen Eigelblipiden Methyl-5-benzoyl-2-benzimidazolcarbamat einschließt, bis

zur Trockne bei 20° bis 40°ceindampft, zum trockenen Rest

eine 0,9$ige Natriumchlorid-Lösung unter ständigem Rühren bis zur Bildung der Liposome zugibt, wonach man 1 bis 12 mal einfriert und auftaut bei einer Temperatur von -196⁰C und +35⁰C.