DE3588199T2

DE3588199T2 - Lymphokin-Herstellung und -Reinigung

Info

Publication number: DE3588199T2
Application number: DE3588199T
Authority: DE
Inventors: Steven C. Winchester Massachusetts 01890 Clark; Randal J. Boston Massachusetts 02116 Kaufman; Elisabeth A. Carlisle Massachusetts 017419 Wang; Gordon G. Cambridge Massachusetts 02138 Wong
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2005-07-05
Also published as: SK505985A3; AU628069B2; FI860308A7; EP0337359B1; DK168709B1; NZ212645A; DK102886D0; EP0188479B1; JPH06199897A; JP2594743B2; AU4545685A; NO943300D0; ES544868A0; ATE67244T1; HK1011709A1; JP2540509B2; DK59493A; ES8701226A1; SA94150015B1; IL75725A0

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Proteins mit der Fähigkeit, das Wachstum und die Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen von Primaten zu stimulieren, insbesondere den Koloniestimulierenden Faktor (CSF). Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des GM-CSF Proteins aus rekombinanten Quellen und das so gereinigte GM-CSF Protein weist einen Reinheitsgrad und einen Aktivitätsspiegel auf, die gut über jedem anderen liegen, die bis jetzt berichtet wurden.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein rekombinantes humanes GM-CSF Protein mit der in Fig. 1 nach dem Pfeil für CSF-Thr oder CSF-Ile gezeigten Aminosäuresequenz, allelische Variationen hiervon oder solche Proteine, die in der Aminosäuresequenz einem natürlich vorkommenden humanen GM-CSF entsprechen, außer daß eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, ersetzt oder entfernt wurden, ohne die humane GM-CSF Aktivität im humanen Knochenmarktest wesentlich zu beeinflussen, das durch eine Expression in prokaryontischen Zellen oder Hefe-, COS oder CHO Zellen erhalten werden kann und eine spezifische Aktivität von mindestens 1 · 107 Einheiten pro mg im humanen Knochenmarktest aufweist.
Die US-A 4 438 032 erwähnt eine Zellinie und die Anreicherung der CSF-Aktivität, aber nicht das rekombinante Protein der vorliegenden Erfindung. Die GB-A 2 092 1S9 erwähnt ein Verfahren zur Herstellung von humanem CSF ("hCSF"), es wird aber kein rekombinantes GM-CSF beschrieben. Urdal et al., 3. International Symposium on HPLC of Proteins, Peptides and Polynucleotides, 14.-16. November 1983 erwähnt die HPLC Reinigung von CSF-2α der Maus, gibt aber keine Hinweise auf humanes rekombinantes GM-CSF. Alle drei Publikationen machen keinen Vorschlag, um humanes GM-CSF mit der oben beschriebenen Aktivität zu erhalten.

Hintergrund der Erfindung

Die vielen verschiedenen Zelltypen, die man im Blut findet, stammen alle von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen. Stammzellen nehmen zwei Funktionen war: (1) Sie reproduzieren sich selbst, wobei sie die Stammzellpopulation im Körper erhalten, und (2) sie liefern Nachkommenzellen, die zur Differenzierung in alle reifen Blutzelltypen bestimmt sind. Die Zelle, die zur Differenzierung entlang eines bestimmten hämatopoetischen Wegs bestimmt ist, wird Vorläuferzelle genannt. Die Vorläuferzellen für T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten, rote Blutkörperchen, Blutplättchen und Eosinophile wie auch frühere Vorläufer, die einzeln zu mehreren der reifen Zelltypen führen können, wurden sowohl in vivo als auch in vitro experimentell untersucht (T. Dexter 1983, J. Pathology, 141, 415-433). Es wurde in vitro bestimmt, daß die Proliferation und/oder Differenzierung jedes Vorläuferzelltyps von spezifischen "Faktoren" abhängt, die aus verschiedenen Quellen stammen. Beispielsweise benötigen die späteren Vorläufer der roten Blutkörperchen einen Faktor, der Erythropoetin genannt wird. Die Faktoren, die zum Überleben, zur Proliferation und Differenzierung der myeloiden Vorläufer erforderlich sind, die zur Bildung von reifen neutrophilen Granulozyten, Monozyten und reifen Makrophagen bestimmt sind, werden Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs) genannt.
Die CSF Aktivität wurde ausgiebig in der Maus untersucht. Die meisten Organe der ausgewachsenen Maus bilden eine CSF Aktivität. Jedoch scheinen die Zusammensetzungen, die eine CSF Aktivität enthalten und von verschiedenen Geweben und durch verschiedene Verfahren erhalten wurden, sich in ihren biochemischen Eigenschaften zu unterscheiden. Daher bleiben die strukturellen Beziehungen zwischen den unterschiedlichen Faktoren unbekannt. Darüberhinaus scheint dis CSF Aktivität bei mehr als einem Schritt der Entwicklung der Granulozyten und Makrophagen zu wirken und es bleibt erneut unsicher, ob ein einzelner Faktor für alle die beob achteten Aktivitäten verantwortlich ist oder ob bei jedem Schritt ein unterschiedlicher Faktor wirkt (A. Burgess und D. Metcalf, 1980, Blood, 56: 947-957).
Die humane GM-CSF Aktivität wurde aus Plazenta, bestimmten fetalen Geweben, Makrophagen und stimulierten T-Zellen erhalten. Eine T-Zellinie (Mo), die eine oder mehrere starke CSF Aktivitäten bildet, wurde aus einem Patienten mit einer T-Zellvariante der Haarzelleukämie (leukämischer Reticuloendotheliose) etabliert (Golde et al., 1978, Blood, 52: 1068-1072).
Die Fähigkeit der CSF Aktivität zur Stimulierung der Granulozyten- und Makrophagenbildung deutet darauf hin, daß pharmzeutische Zusammensetzungen mit CSF Aktivität in Situationen klinisch brauchbar sind, wo die erhöhte Bildung dieser (myeloiden) Zelltypen erforderlich ist. Tatsächlich hat sich bei mehreren Patienten mit extrem hohen Mengen an scheinbar normal zirkulierenden Granulozyten gezeigt, daß sie Tumoren aufweisen, die CSF überproduzieren. In einem Fall fiel nach der operativen Entfernung des Tumors die Anzahl der Granulozyten rapide bis zu einer normalen Menge ab, was stark nahelegte, daß CSF bei der Regulation der Anzahl von zirkulierenden Granulozyten brauchbar sein könnte. (W. Hocking, J. Goodman and D. Golde, Blood, 61: 600 (1983)). Insbesondere sind CSF Zusammensetzungen klinisch für die Behandlung einer Myelosuppression brauchbar, die durch die Behandlung von Krebs mit Chemotherapeutika oder Strahlung verursacht wird. Zusätzlich sind CSF Zusammensetzungen brauchbar bei der Behandlung von schweren Infektionen, da CSF die Anzahl an Granulozyten und/oder Monozyten erhöhen und/oder aktivieren kann.
Es existieren verschiedene unterschiedliche Typen der bekannten CSF Aktivitäten, einschließlich Granulozyten-CSF (G-CSF), Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF) und Multi-CSF. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit GM-CSF. Die CSF-Proteine sind aus verschiedenen Tierquellen bekannt. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich jedoch mit humanem CSF.
Die biologische und biochemische Charakterisierung der Zusammensetzungen mit CSF Aktivität und die Untersuchung dieser Zusammensetzungen in klinischen Tests wurde bisher durch die Seltenheit und Unreinheit von humanen und/oder CSF Zusammensetzungen von anderen Primaten gehemmt. Es wäre daher wünschenswert, das Protein oder die Proteine zu identifizieren, die für die CSF Aktivität verantwortlich sind. Darüberhinaus wäre es wünschenswert, eine humane Quelle für einen solchen CSF zu haben, die diese Proteine leicht in Mengen und in einer Reinheit liefern könnte, die zur biologischen und und biochemischen Charakterisierung und zur Verwendung als therapeutische Mittel ausreichen würde.
Die kürzlich entwickelten Techniken des molekularen Klonierens machen es möglich, eine Nukleotidsequenz zu klonieren, die für ein Protein kodiert und dieses Protein in Mengen mittels eines geeigneten Wirt-Vektor- Systems zu bilden (T. Maniatis, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982). Das Protein kann dann durch bekannte Trenn- und Reinigungstechniken gewonnen werden. Die Klonierungsmethoden, die bisher verwendet wurden, können in drei allgemeine Kategorien eingeteilt werden: (1) Verfahren, die auf der Kenntnis der Proteinstruktur basieren, beispielsweise deren Aminosäuresequenz, (2) Verfahren, die auf der Identifizierung des durch das klonierte Gen exprimierten Proteins mittels eines Antikörpers basieren, der für das Protein spezifisch ist und (3) Verfahren, die auf der Identifizierung eines RNA- Typs basieren, der unter Bildung des Proteins oder der durch das Gen von Interesse kodierten Aktivität translatiert werden kann.
Jede dieser Verfahrensklassen ist schwierig anzuwenden, wenn das Protein von Interesse, wie ein CSF Protein, in einer sehr geringen Menge verfügbar ist. Falls es schwierig ist, eine angemessene Menge an gereinigtem Protein zu erhalten, dann ist es daher auch schwierig, die Aminosäuresequenz oder auch Teilsequenzen des Proteins zu bestimmen. Ähnlich wird die Identifizierung eines exprimierten Proteins durch eine Antikörperbindung vorzugsweise mittels eines monospezifischen polyklonalen Antiserums mit hohem Titer durchgeführt. Ein solches Antiserum kann nicht in Abwesenheit von Mengen des reinen Proteins (Antigens) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper bietet einen alternativen Ansatz an, aber der erforderliche Antikörper kann in Abwesenheit eines geeigneten Antigens auch schwierig zu erhalten sein, und ein solcher monoklonaler Antikörper könnte mit dem Protein in der Form, in der das Protein durch die verfügbaren Wirts-Vektor-Systeme exprimiert wird, nicht reagieren. Schließlich erfordert eine Translation eines RNA-Typs unter Bildung eines identifizierbaren Proteins oder einer identifizierbaren Aktivität, daß die in Frage kommende RNA in der RNA Quelle in ausreichender Menge vorkommt, um ein verläßliches Protein- oder Aktivitätssignal zu ergeben. Die relative Häufigkeit einer RNA, die für ein bestimmtes Protein kodiert, entspricht im allgemeinen der Häufigkeit des Proteins, so daß ein seltenes Protein gewöhnlich von einer seltenen mRNA kodiert wird.
Die Mo Zellinie wird sowohl als Ausgangsmaterial zur Reinigung von humanen CSFs als auch zur Identifizierung der entsprechenden mRNAs verwendet. Jedoch stellte es sich trotz dieser relativ guten Quelle der CSF Aktivität als extrem schwierig heraus, ausreichend Protein für die strukturellen Untersuchungen zu isolieren.
Um diese durch die oben beschriebenen Verfahren zu der Klonierung einer Nukleotidsequenz, die für ein seltenes Protein kodiert, wie CSF, inhärenten Probleme zu überwinden, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Dieses Verfahren erfordert nur, daß das Genprodukt oder dessen Aktivität verläßlich gemessen werden kann. Geeignete Verfahren für den CSF Test sind später in Beispiel 2 beschrieben. Es wurde ein Reinigungsverfahren entwickelt, das es ermöglicht, das CSF Protein entweder aus rekombinanten oder natürlichen Quellen in einem Maß an Reinheit und Aktivität zu isolieren und zu reinigen, das viel höher liegt, als dies vorher möglich war.

Zusammenfassung des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA Verfahrens

Im ersten Aspekt überwindet die vorliegende Erfindung die Probleme des Stands der Technik und liefert eine leicht verfügbare Proteinqueue mit CSF Aktivität mittels der rekombinanten DNA Technologie. Eine neue Klonierungstechnik, die nur einen Test auf CSF Aktivität erfordert, wird zur Klonierung von cDNA verwendet, die für ein Protein mit CSF Aktivität kodiert. Daher beschreibt die vorliegende Erfindung eine cDNA, die für ein Protein mit CSF Aktivität kodiert (das heißt CSF/cDNA), einen Mikroorganismus oder eine Zellinie, wie sie später definiert sind, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert sind, der eine solche CSF/cDNA enthält, und ein Verfahren zur Herstellung des CSF Proteins durch die Expression dieser CSF/cDNA durch die Kultivierung eines Mikroorganismus oder einer Zellinie, wie sie später definiert sind. Da das CSF Protein von einem erfindungsgemäßen Klon gebildet wird, kann man sicher sein, daß es ein Protein ist, das eine CSF Aktivität aufweist. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Transformationsvektors, der die CSF/cDNA enthält, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:
Präparation von RNA aus einer Zellinie, die CSF bildet,
Präparation von polyadenylierter mRNA aus dieser RNA,
Präparation einer einzelsträngigen cDNA aus dieser mRNA,
Umwandlung der einzelsträngigen cDNA in doppelsträngige cDNA,
Einbau der doppelsträngigen cDNA in Transformationsvektoren und Transformation von Bakterien mit diesem Vektor zur Bildung von Kolonien,
Zusammenstellen von Pools mit jeweils 200 bis 500 Kolonien und Isolierung der Plasmid DNA aus jedem Pool,
Transfektion der Plasmid DNA in geeignete Wirtszellen zur Expression des CSF Proteins,
Kultivierung der transfizierten Zellen und Testen des Überstands auf CSF Aktivität, und
Auswahl der CSF positiven Pools und Screenen der zur Herstellung des Pools verwendeten Kolonien, um eine Kolonie mit CSF Aktivität zu identifizieren.
Die humanen GM-CSF Proteine der Erfindung sind Wachstums- und Differenzierungshormone für die Zellen des myeloiden Systems. Sie sind beispielsweise indiziert zur klinischen Verwendung zur Behandlung der Myelosuppression, insbesondere der (symptomatischen) Granulozytopenie nach einer Krebsbehandlung durch Chemotherapie oder Bestrahlung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 erläutert DNA Sequenzen, die für ein erfindungsgemäßes humanes GM-CSF Protein kodieren. Die in voller Länge angegebene DNA Sequenz kodiert für eine Variation des humanen CSF, die als CSF-Thr bezeichnet wird. Ein weiteres Allel kodiert für ein identisches Produkt, außer daß Thr an der mit 100 nummerierten Position durch Ile ersetzt ist (CSF-Ile). Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind ebenfalls gezeigt.
Die Fig. 2 ist ein Schema, das die Herstellung von Plasmid pTPL aus Plasmid pAdD26SVpA (3) erläutert.
Die Fig. 3 ist eine schematische Fortsetzung von Fig. 2 und erläutert die Herstellung von Plasmid p91023 aus Plasmid pTPL.
Die Fig. 4 ist eine schematische Fortsetzung von Fig. 3 und erläutert das Plasmid p91023 (B).
Die Fig. 6 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTALC-185R.
Die Fig. 7 ist eine schematische Darstellung des Vektors AJ-14.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens

Die folgende Definitionen werden angegeben, um das Verständnis dieses Falls zu erleichtern. In dem Ausmaß, in dem die Definitionen von der in der Technik kursierenden Bedeutung abweichen, sind die folgenden Definitionen zu kontrollieren.
Amplifizierung meint ein Verfahren, durch das Zellen Genwiederholungen innnerhalb ihrer chromosomalen DNA bilden.
CSF ist eine biologische Aktivität, die durch die hierin beschriebenen Tests definiert ist.
CSF Protein ist ein Protein aus einer humanen Quelle (siehe Seite 2, dritter Absatz), das eine CSF Aktivität zeigt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck "CSF Protein" modifiziertes CSF Protein, allelische Variationen des CSF Proteins und ein CSF Protein, dem ein Met Rest vorausgeht.
Stromabwärts meint die Richtung, die zum 3'-Ende einer Nukleotidsequenz hingeht.
Ein Enhancer ist eine Nukleotidsequenz, die die Transkription eines Gens unabhängig von der Position des Enhancers in Bezug zum Gen oder der Orientierung der Sequenz potenzieren kann.
Ein Gen ist eine Desoxyribonukleotidsequenz, die für ein gegebenes Protein kodiert. Für die Zwecke hierin sollte das Gen keine untranslatierten flankierenden Regionen umfassen, wie RNA Transkriptionsinitiationssignale, Polyadenylierungssignale, Promotoren oder Enhancer.
Ligution ist das Verfahren der Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen den 5' und 3' Enden zweier DNA Stränge. Dies kann durch mehrere gut bekannte enzymatische Techniken, einschließlich der Ligation stumpfer Enden durch T4 Ligase erreicht werden.
Orientierung bezieht sich auf die Reihenfolge der Nukleotide in einer DNA Sequenz. Eine invertierte Orieiitierung einer DNA Sequenz ist eine, worin die 5' nach 3' Reihenfolge der Sequenz in Bezug zu einer anderen Sequenz umgekehrt ist, wenn sie mit einem Referenzpunkt in der DNA verglichen wird, aus der die Sequenz erhalten wurde. Solche Referenzpunkte können die Transkriptionsrichtung von anderen spezifizierten DNA Sequenzen in der ursprünglichen DNA oder den Replikationsursprung von replizierbaren Vektoren umfassen, die die Sequenz enthalten.
Transkription meint die Synthese von RNA aus einer DNA Matrize.
Transformation meint die Veränderung des Genotyps einer Zelle durch die Aufnähme von exogener DNA. Transformation kann in manchen Fällen durch die Veränderung des Zellphänotyps detektiert werden. Transformierte Zellen werden Transformanden genannt. Zellen vor der Transformation werden Ausgangszellen genannt.
Translation meint die Synthese eines Polypeptids aus der mRNA.
Die Aktivität des Koloniestimulierenden Faktors (CSF) kann aus mehreren Zellquellen stammen, einschließlich konditioniertem Medium von peripheren mononukleären Blutzellen, Lungen- und Plazentagewebe und Knochenmark, Urin aus anämischen Patienten, Serum und normalen neoplastischen Zellen des T-Lymphozyten und der mononukleären Phagozytenlinie. Eine Zellinie, die CSF bildet, ist die Mo Zellinie, die bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 8066 hinterlegt wurde und von dort erhältlich ist. Der durch diese Zellinie gebildete CSF ist als Granulozyten-Makrophagen-CSF (oder GM-CSF) bekannt und ist natürlich ein humaner CSF.
Um einen CSF Klon zu isolieren, wird ein neues Verfahren verwendet, das nur eine Testtechnik für die CSF Aktivität erfordert. Zuerst wird eine Zelle, die CSF bildet, wie T-Lymphozytenzellen (oder andere Quellen, wie sie oben erwähnt wurden) identifiziert. Dann wird die mRNA der Zelle geerntet. Vorzugsweise werden T- Lymphozytenzellen verwendet. In einem solchen Fall wird die membrangebundene mRNA, die die mRNA für Lymphokine enthält, von der freien mRNA in den Zellen abgetrennt. Diese Trennung dürfte die gewonnene mRNA 5-10 fach in Bezug auf Lymphokinsequenzen anreichern und verringert daher den Aufwand, der zur Identifizierung des gewünschten CSF Klons notwendig ist. Die polyadenylierte mRNA wird dann durch Chromatographie auf Oligo dT Cellulose präpariert.
Aus der mRNA wird mittels eines Vektors, der zur Transfektion in einen Wirt zur Expression des gewünschten Proteins mit CSF Aktivität geeignet ist, eine cDNA Bank hergestellt. Es wird die Erststrang cDNA mittels Standardverfahren unter Verwendung der oben präparierten mRNA hergestellt. Das RNA/cDNA Hybrid wird dann in die doppelsträngige cDNA Form umgewandelt. Die cDNA kann dann in einen geeigneten Vektor inseriert werden.
Das bevorzugte Wirt-Vektor-System zur Isolierung eines CSF Klons basiert auf der Expression der CSF cDNA in einem geeigneten Transformationsvektor. Ein geeigneter Transformationsvektor kann auf der vorrübergehenden Einführung von DNA in Säugerzellen beruhen (P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis, 1981 Cell 27 279-288). Um die gewünschten CSF Transformanden zu isolieren, ist es nicht erforderlich, daß alle Zellen der Population stabil exogene Gene enthalten, die das gewünschte CSF Produkt exprimieren. Es ist möglich, vorrübergehend exogene Gene in eine Subpopulation von Zellen einzuführen, so daß die Subpopulation das gewünschte Produkt über einen Zeitraum von mehreren Tagen exprimiert. Da kein Selektionsmarker im Transformationsvektor für das DNA Transfektions- und Expressionssystem erforderlich ist, kann die exogene DNA nach einem Wachstum der Zellen über einen Zeitraum von 1-2 Wochen verloren gehen. Jedoch werden die gewünschten Produkte 2-3 Tage nach der Transfektion von geeigneten Säugerzellen synthetisiert und können detektiert werden.
Das Wirt-Vektor-System der Wahl basiert auf der Entwicklung von CV-1 Affenzellinien, die mit einem, SV40 DNA Molekül mit defektem Replikationsursprung transformiert sind (Y. Gluzman, Cell 23: 175-182, 1981). Die transformierten CV-1 Affenzellen, die eine defekte SV40 DNA enthalten und als COS bezeichnet werden (CV-1, defekter Replikationsursprung, SV40), enthalten keine komplette Kopie des SV40 Genoms, aber bilden große Mengen an großem T-Antigen und sind für die SV40 DNA Replikation permissiv. Sie unterstützen auch effizient die Replikation von SV40 enthaltenden Deletionen in der frühen Region und die von bakteriellen Plasmiden, die den SV40 Replikationsursprung enthalten (R. M. Myers, R. Tjian, 1980, PNAS 77: 6491-6495). Der liefert dieses System ein Mittel zur Amplifizierung der transfizierten exogenen DNA über die SV40 vermittelte DNA Replikation, um die Menge an mRNA und Protein, das von der exogenen DNA exprimiert wird, zu erhöhen. Jedoch sind ähnliche Systeme auch brauchbar.
Vektoren, die für die CSF Expression verwendet werden, enthalten typischerweise verschiedene Elemente, wie Enhancer, Promotoren, Introns, Polyadenylierungsstellen, nicht-kodierende 3' Regionen und Translationsaktivatoren, wie dies später beschrieben ist.
Die Vektoren hierin enthalten Enhancer. Enhancer sind von Promotoren funktionell unterschiedlich, aber scheinen zusammen mit Promotoren zu arbeiten. Ihre Funktion auf zellulärer Ebene ist nicht gut verstanden, aber ihre einzigartige Eigenschaft ist die Fähigkeit, die Transkription zu aktivieren oder potenzieren, ohne positions- oder orientierungsabhängig zu sein. Promotoren müssen stromaufwärts des Gens liegen, während Enhancer stromaufwärts oder 5' vom Promotor, innerhalb des Gens als Intron oder stromabwärts vom Gen zwischen dem Gen und der Polyadenylierungsstelle oder 3' von der Polyadenylierungsstelle liegen können. Umgekehrte Promotoren sind nicht funktionsfähig, aber umgekehrte Enhancer sind dies. Enhancer sind cis-wirkend, das heißt sie haben nur eine Wirkung auf Promotoren, wenn sie auf demselben DNA Strang vorkommen. Für eine allgemeine Diskussion von Enhancern siehe Khoury et al., Cell 33: 313-314 (1983).
Bevorzugte Enhancer zur Verwendung mit Säugerzellen erhält man aus Tierviren, wie dem Simianvirus 40, Polyomavirus, Rinderpapillomavirus, Retrovirus oder Adenovirus. Idealerweise sollte der Enhancer von einem Virus sein, für das die Wirtszelle permissiv ist, das heißt das normalerweise die Zellen des Wirtstyps infiziert. Virale Enhancer können leicht von den frei erhältlichen Viren erhalten werden. Die Enhancerregionen für einige Viren, beispielsweise Rous-Sarcomavirus und Simianvirus 40 sind gut bekannt. Siehe Luciw et al., Cell 33: 705- 716 (1983). Es wäre Routinemolekularbiologie, diese Regionen auf der Grundlage der veröffentlichten Restriktionskarten für das in Frage kommende Virus herauszuschneiden und erforderlichenfalls die Stellen zu modifizieren, um den gewünschten Einbau des Enhancers im Vektor zu ermöglichen. Siehe beispielsweise Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159: 601 = 621 (1982) anti Mol. Cell. Biol. 2 (11): 1304-1319 (1982). Alternativ dazu kann der Enhancer aus den Sequenzdaten synthetisiert werden, wobei die Größen der viralen Enhancer (im allgemeinen weniger als etwa 150 bp) ausreichend klein sind, so daß dies praktisch durchgeführt werden kann.
Ein weiteres Element, das in der Vektorzusammenstellung vorkommen sollte, ist eine Polyadenylierungsspleiß(oder Anfügungs)stelle. Dies ist eine DNA Sequenz, die stromabwärts von den translatierten Regionen eines Gens liegt, von wo kurz stromabwärts wiederum die Transkription stoppt und Adeninribonukleotide unter Bildung eines Polyadeninnukleotidschwanzes am 3' Ende der mRNA angefügt werden. Die Polyadenylierung ist wichtig bei der Stabilisierung der mRNA gegen den Abbau in der Zelle, ein Ereignis, das die Menge an mRNA und somit die Menge an Proteinprodukt verringert.
Eukaryontische Polyadenylierungsstellen sind gut bekannt. Es existiert eine Konsensussequenz unter eukaryontischen Genen: Das Hexanukleotid 5'-AAUAAA-3' findet sich 11-30 Nukleotide von dem Punkt, an dem die Polyadenylierung beginnt. DNA Sequenzen, die Polyadenylierungsstellen aufweisen, können von Viren gemäß veröffentlichten Berichten erhalten werden. Exemplarische Polyadenylierungssequenzen können vom Maus-β- Globin und von den Genen der späten oder frühen Region des Simianvirus 40 erhalten werden, aber die viralen Polyadenylierungsstellen sind bevorzugt. Da diese Sequenzen bekannt sind, können sie auf herkömmliche Weise in vitro synthetisiert und mit den Vektoren ligiert werden.
Die Sequenz, die die Polyadenylierungsstelle von dem Translationsstoppcodon trennt, ist vorzugsweise eine untranslatierte DNA Sequenz, wie ein nicht abgelesenes eukaryontisches Gen. Da solche Sequenzen und Gene nicht mit einem Promotor ausgestattet sind, werden sie nicht exprimiert. Die Sequenz sollte sich über eine beträchtliche Länge erstrecken, die in der Größenordnung von bis zu 1000 Basen vom Stopcodon der Polyadenylierungsstelle entfernt liegt. Diese 3' untranslatierte Sequenz führt im allgemeinen zu einer Erhöhung der Produktausbeuten. Der Vektor kann etwa 30 bp stromabwärts der Konsensuspolyadenylierungssequenz enden, es ist aber bevorzugt, die stromabwärts der Polyadenylierungsstelle gefundenen 3' Sequenzen in der Umgebung des Wildtyps zu belasssen. Diese Sequenzen erstrecken sich typischerweise etwa 200 bis 600 Basenpaare stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle.
Das Vorkommen von Introns im untranslatierten transkribierten Teil des Vektors kann die Produktausbeuten erhöhen. Solche Introns können von anderen Quellen als den Wirtszellen oder den Genquellen erhalten werden. Beispielswiese führt ein Hybridintron, das eine 5' Spleißstelle aus dem zweiten Intron der dreiteiligen Signalsequenz des Adenovirus und eine 3' Spleißstelle aus einem Immunglobulingen stromabwärts von der Transkriptionsstartstelle im späten Hauptpromotor des Adenovirus inseriert enthält, zu einer erhöhten Produktausbeute.
In der bevorzugten Ausführungsform des CSF Klonierungs- und Expressionsvektors befindet sich ein Translationsaktivatorgen. Translationsaktivatoren sind Gene, die entweder Protein- oder RNA-Produkte kodieren, die die Translation einer gewünschten mRNA beeinflussen. Das beste Beispiel ist das Adenovirus-assoziierte (VA) Gen (VAl), das in einen kurzen RNA Typ transkribiert wird, der mit Sequenzen in der 5' untranslatierten Region der hauptsächlichen späten mRNAs des Adenovirus wechselwirkt (Thimmappaya et al., 1982, Cell 3: 543). Die notwendigen Sequenzen zur Translationsaktivierung durch die VA RNA liegen innerhalb der dreiteiligen Signalsequenz der späten Adenovirus mRNA. Die dreiteilige Signalsequenz wird von nicht aufeinanderfolgenden Regionen des Adenovirusgenoms zusammengespleißt und kommt am 5' Ende der späten Haupttranskripte des Adenovirus vor. Die VA RNA kann unter Aktivierung der Translation von mRNAs wechselwirken, die die dreiteilige Signalsequenz enthalten. Daher enthält der bevorzugte cDNA Klonierungs- und Expressionsvektor die gespleißte Form der dreiteiligen Signalsequenz und die Adenovirus VA Gene.
Diese Vektoren können durch Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Komponenten der Vektoren, wie Enhancer, Promotoren und dergleichen, können von natürlichen Quellen erhalten oder wie oben beschrieben synthetisiert werden. Grundsätzlich gilt, falls die Komponenten in DNA gefunden werden, die in großer Menge verfügbar ist, beispielsweise Komponenten, wie virale Funktionen, oder wenn sie synthetisiert werden können, beispielsweise Polyadenylierungsstellen, dann können mit einer geeigneten Verwendung von Restriktionsenzymen große Mengen an Vektor erhalten werden, indem man einfach nur den Quellorganismus kultiviert, dessen DNA mit einer geeigneten Endonuklease verdaut, die DNA Fragmente trennt, die DNA identifiziert, die das Element von Interese enthält, und diese gewinnt. Gewöhnlich wird ein Transformationsvektor in einer kleinen Menge zusammengesetzt und dann in einen geeigneten autonom replizierenden Synthesevektor ligiert, wie einem prokaryontischen Plasmid- oder Phagen. Das Plasmid pBR322 kann in den meisten Fällen verwendet werden. Siehe Kaufman et al., obige Literaturstelle.
Die Synthesevektoren werden verwendet, um die ligierten Transformationsvektoren auf herkömmliche Weise zu klonieren, beispielsweise durch die Transfektion eines permissiven prokaryontischen Organismus, Replikation des Synthesevektors bis zu einer hohen Kopiezahl und Gewinnen des Synthesevektors durch Zellyse und Abtrennung des Synthesevektors vom Zelldebris.
Die Vektoren, die die cDNA enthalten, welche aus einer Zelle präpariert wurde, die eine CSF Aktivität bildet, werden dann in E. coli transfiziert und auf Petrischalen in einer Dichte von etwa 2000 Kolonien pro Platte ausplattiert. Die Kolonien werden auf Nitrozellulosefiltern abgehoben und das Filter wird auf eine neue Platte überführt, die als Vorlage aufbewahrt wird. Nach der Anzucht dieser Kolonien werden Abdrücke gemacht und mit dem Original verglichen, indem man sie sorgfältig so markiert, daß die Sektionen der Abdruckfilter mit dem entsprechenden Teil auf der Ausgangsplatte identifiziert werden können.
Jedes Filter wird in Sektionen geschnitten, die eine vorbestimmte Anzahl an Kolonien pro Sektion enthalten, vorzugsweise etwa 200-500 Kolonien pro Sektion. Die Kolonien aus jeder Sektion werden in ein Medium abgeschabt, wie L-Medium, die Bakterien werden durch Zentrifugation gewonnen und die Plasmid DNA abgetrennt. Die Plasmid DNA von jeder Sektion wird in einen geeigneten Wirt zur Expression des Proteins transfiziert. Der hierin bevorzugte Synthesevektor ist eine Mutante des E. coli Plamsids pBR322, worin die Sequenzen deletiert wurden, die für eukaryontische Zeilen schädlich sind. Siehe Kaufman et al, obige Literaturstelle. Die Verwendung dieser Mutante vermeidet das Erfordernis, den Plasmidrest vor der Transfektion zu deletieren. Nach der Anzucht der transfizierten Zellen wird das Medium auf CSF Aktivität getestet. Ein positiver Test zeigt an, daß sich eine Kolonie, die eine CSF / cDNA enthält, auf einer bestimmten Sektion eines Filters befindet.
Um zu bestimmen, welcher der Klone der Sektion des ursprünglichen Originalfilters die CSF/cDNA enthält, wird jeder Klon der Filtersektion gepickt und angezogen. Die Kulturen werden dann in eine Matrix plaziert. Es werden Pools aus jeder horizontalen Reihe und vertikalen Spalte der Matrix hergestellt. Es werden DNA Proben aus jeder gepoolten Kultur hergestellt und in die Wirtszellen zur Expression transfiziert. Die Überstände aus diesen Pools werden auf CSF Aktivität getestet: Ein Pool einer vertikalen Spalte und ein Pool einer horizonatlen Reihe sollten eine CSF Aktivität bilden. Der Klon, der diesen Pools gemeinsam ist, enthält; die CSF/cDNA. Falls die Matrix mehr als einen positiven Klon enthält, ist mehr als eine Spalte und eine Reihepositiv. In einem solchen Fall kann ein weiteres g einer kleinen Anzahl an Klonen erforderlich sein.
Die CSF/cDNA wird aus den Klonen durch Restriktionsenzyme ausgeschnitten und kann durch bekannte Techniken sequenziert werden. Es ist leicht nachvollziehbar, daß das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann, um eine CSF/cDNA aus jeder Quelle zu erhalten. Die vollständige DNA Sequenz einer erfindungsgemäßen CSF/cDNA ist in Fig. 1 zusammen mit der angegebenen Aminosäuresequenz des translatierten CSF Proteinprodukts angegeben.
Die für ein Protein kodierende DNA Sequenz, welches eine erfindungsgemäße CSF Aktivität aufweist, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, kann durch herkömmliche Techniken zur Herstellung von Variationen im schließlichen CSF Protein modifiziert werden, das in den hierin beschriebenen Tests immer noch eine CSF Aktivität auf weist. Daher können beispielsweise eine, zwei, drei, vier oder fünf Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Die BE-A 0-898 016, die; hiermit eingeführt ist, beschreibt eine solche Technik zum Austausch; von Cystein beispielsweise durch Serin.
Die erfindungsgemäße CSF/cDNA enthält das natürliche CSF/cDNA Gen, dem ein ATG Codon vorausgeht und eine CSF/cDNA, die für allelische Variationen des CSF Proteins kodiert. Ein Allel ist in Fig. 1 gezeigt. Ein weiteres Allel, das gefunden worden ist und in Fig. 1 gezeigt ist, weist an der Postion 365 einen Thymidinrest statt einen Cytosinrest auf. Das erfindungsgemäße CSF Protein umfaßt das 1-Methioninderivat des CSF Proteins (Met-CSF) und allelische Variationen- des CSF Proteins. Das reife CSF Protein, das durch die Sequenz in Fig. 1 gezeigt ist, beginnt mit der Sequenz Ala - Pro - Ala - Arg ....., wobei der Beginn durch einen Pfeil nach der Nukleotidnummer 59 in Fig. 1 gezeigt ist. Das Met-CSF würde mit der Sequenz Met - Ala - Pro - Ala - Arg... beginnen. Die in Fig. 1 gezeigte Allelvariation hat ein Thr am Aminosäurerest Nummer 100 (beginnt bei Ala nach dem Pfeil) und kann als CSF (Thr) bezeichnet werden. Eine weitere Variation hat einen Ile Rest an der Position 100 und kann als CSF (Ile) bezeichnet werden. Das gereinigte erfindungsgemäße GM-CSF Protein zeigt eine spezifische Aktivität von mindestens 10&sup7; Einheiten/mg Protein und vorzugsweise mindestens 4 · 10&sup7; Einheiten/mg, wenn es mit humanen Knochenmarkzeilen getestet wird.
Wirt-Vektor-Systeme zur Expression von CSF können prokaryontisch oder eukaryontisch sein, aber die Komplexität von CSF könnte eines aus Säugerzellen zum bevorzugten Expressionssystem machen. Die Expression wird leicht durch die Transformation von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen mit einem geeigneten CSF Vektor erreicht. Die durch das obige Verfahren erhaltene DNA Sequenz kann direkt in Säugerzellen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert werden. Es können heterologe Promotoren verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Um CSF prokaryontischen oder in Hefezellen zu exprimieren, muß die Signalsequenz (oder Sekretionssequenz) entfernt werden. Die Position des Codons für den N-Terminus des reifen Proteins ist in Fig. 1 gezeigt. Dies kann mittels Standardtechniken ausgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Wenn man den gewünschten CSF/cDNA Klon erhalten hat, werden bekannte und geeignete Mittel verwendet, um das CSF Protein zu exprimieren, beispielsweise die Insertion in einen geeigneten Vektor und die Transfektion des Vektors in eine geeignete Wirtszelle, die Selektion der transformierten Zellen und die Kultivierung dieser Transformanden zur Expression der CSF Aktivität. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, beispielsweise E, coli, Hefezellen, Säugerzellen, beispielsweise CHO und Insektenzellen. Das so gebildete CSF Protein kann eine Methioningruppe am N-Terminus des Proteins aufweisen (hierin Met-CSF genannt). Das reife Protein, das durch prokaryontische und eukaryontische Zellen gebildet wird, ist sonst in der Aminosäuresequenz identisch, aber das eukaryontische Produkt kann in einem unterschiedlichen Maß glykosyliert sein, wie das natürliche Prodükt. Es sind verschiedene Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen CSF Proteins in den späteren Beispielen beschrieben. Andere Verfahren und Materialien, beispielsweise Vektoren, sind für den Fachmann auf der Grundlage der Beispiele und der vorangehenden Beschreibung ersichtlich.
Das in geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen exprimierte CSF Protein kann durch Reinigungs- und Trennungstechniken gewonnen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Jedoch liefert die vorliegende Erfindung wie erwähnt auch ein Reinigungsverfahren, das es ermöglicht, das CSF Protein sowohl aus rekombinanten als auch natürlichen Quellen mit hoher Reinheit und Aktivität zu erhalten.

Zusammenfassung des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens

Das vorliegende Verfahren überwindet die Probleme des Stands der Technik und liefert ein Verfahren zur Reinigung des Protein mit GM-CSF Aktivität. Erfindungsgemäßes humanes GM-CSF Protein weist eine spezifsche Aktivität von mindestens 1 · 10&sup7; Einheiten pro mg Protein, vorzugsweise mindestens 2 · 10&sup7; Einheiten pro mg Protein und noch bevorzugter mindestens 4 · 10&sup7; Einheiten pro mg Protein auf, wenn es im humanen Knochenmarktest getestet wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Reinigung des CSF Proteins: Fällen des Proteins mit Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 80% unter Bildung eines Pellets, das das CSF Protein enthält, Resuspendieren des Pellets in einer gepufferten Lösung bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 8, Auftragen der den CSF enthaltenden gepufferten Lösung auf eine Chromatographiesäule, Eluieren mit der gepufferten Lösung, die Natriumchlorid enthält, und Sammeln der Fraktionen mit CSF Aktivität, Vereinigen der aktiven Fraktionen, Auftragen der Fraktionen auf eine C4 Umkehrphasensäule und Elution mit einem Gradienten aus 0 bis 90% Acetonitril, um die aktive Fraktion zu sammeln.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen, die das Reinigungsverfahren betreffen

Die Fig. 5 zeigt eine SDS-PAGE Analyse des gereinigten CSF Proteins.

Detaillierte Beschreibung des Reinigungsverfahrens

Das CSF Protein kann mittels der hierin beschriebenen rekombinanten DNA Techniken hergestellt werden.
CSFs aus jeder Quelle können durch das Verfahren gereinigt werden. Das konditionierte Medium aus jeder CSF Proteinquelle wird vorzugsweise durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von mindestens etwa 0,1 mg Protein pro ml konzentriert. Das Protein wird dann durch die Zugabe von Ammoniumsulfat bis 80 Sättigung gefällt. Das entstehende Pellet wird in einer wäßrigen Lösung, die bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 gepuffert ist, resuspendiert. Beispiele für geeignete Puffer sind unter anderem Tris-HCl, HEPES, Natriumcitrat und dergleichen.
Die gepufferte Lösung wird durch Säulenchromatographie fraktioniert. Geeignete Materialien zur Verwendung in den Chromatographiesäulen sind Octylsepharose, DEAE-Ultrogel, AcA44-Ultrogel, AcA-54 Ultrogel und dergleichen. Eines oder mehrere dieser Materialien können nacheinander verwendet werden, um eine höhere Reinheit zu erhalten.
Die Fraktionen aus jeder Säule werden gesammelt und auf CSF Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit Trifluoressigsäure (TFA), Heptafluorbuttersäure (HFBA) oder dergleichen verdünnt und auf eine C4 Umkehrphasensäule aufgetragen. Die CSF Aktivität wird dann mittels eines 0-90% Acetonitrilgradienten in TFA oder HFBA, vorzugsweise mit einer Konzentration von jeweils 0,10% oder 0,15% (V/u) in Abhängigkeit von der zur Auftragung der vereinigten Fraktionen verwendeten Säure eluiert.
Die Fraktionen mit CSF Aktivität werden durch SDS Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (13,5 Gel, wie dies von U. Lämmli, Nature, 227, 680 (1970) beschrieben wurde). Zusätzliche Behandlungen mittels der oben erwähnten Chromatographiesäulenmaterialen können das CSF Protein weiter bis zur Homogenität reinigen.
Das gereinigte CSF Protein, das durch SDS-PAGE fraktioniert ist, zeigt ein heterogenes CSF Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von etwa 15000 bis etwa 26000 Dalton. Diese scheinbare Größenheterogenität beruht auf der ausgiebigen Glykosylierung des Proteins und ist ein allgemeines Merkmal von Glykoproteinen. Die Fraktionierung von weniger gereinigten Proben aus durch Mo Zellen konditioniertem Medium durch SDS-PAGE (unter nicht-reduzierenden Bedingungen) und das Testen des aus dem Gel-eluierten Proteins zeigt das Vorkommen eines zweiten Proteins mit CSF Aktivität und einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 28000 bis 30000.
Die CSF Aktivität bindet und eluiert von Octylsepharose, DEAE Ultrogel und der C4 Umkehrphasensäule. Etwa 60% der CSF Aktivität binden an eine Con-A Sepharose (40% laufen durch) und können mit α- Methylmannosid eluiert werden.
Eine Molekulargewichtsanalyse von rekombinantem CSF durch Gelfitration in wenig Salz zeigt, daß etwa 30% der Aktivität mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 19 000 eluieren, aber 70% des Materials sich als Dimer verhalten und bei einer Position eluieren, die einem Molekulargewicht von etwa 38000 entspricht. Falls 1 M NaCl in diese Säule eingearbeitet wird, eluiert die gesamte Aktivität in einem breiten Peak bei etwa 19000 Dalton.
Das gereinigte CSF ist für mindestens 16 Stunden stabil, wenn es bei 4ºC (pH 7,4) in 4 M Guanidinhydrochlorid, in 10 mM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoethanol und in 30% (V/u) Ethanol inkubiert wird. Die CSF Aktivität ist ebenfalls in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) (pH 2,0) und 0,1 % TFA plus 25% (V/V) Acetonitril stabil.
Wie vorher erwähnt ist das erfindungsgemäße CSF Protein zur Verwendung bei der Behandlung der Myelosuppression indiziert, wie der (symptomatischen) Granulozytopenie, die beispielsweise durch eine Krebsbehandlung durch Chemotherapeutika oder Bestrahlung verursacht wird. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen CSF Proteine zur Verwendung bei der Behandlung einer schweren Infektion indiziert. Für eine solche Verwendung ist eine Dosis von etwa 200 bis 1000ug pro Patient indiziert. Das CSF Protein wird dem Patienten vorzugsweise intravenös in einem geeigneten pharmakologischen Träger injiziert. Beispiele für solche Träger sind unter anderem pharmakologische Kochsalzlösung und humanes Serumalbumin in Kochsalzlösung.
Zusätzlich haben die erfindungsgemäßen CSF Proteine andere Aktivitäten und Verwendungen. Beispielsweise wurde gezeigt, daß CSFs von der Maus Neutrophile aktivieren. Daher würde man erwarten, daß die erfindungsgemäßen humanen CSFs auch Neutrophile aktivieren. Daher können die physiologischen Funktionen von CSF vielschichtig sein. Im Knochenmark kann dieses Lymphokin die Proliferation und Differenzierung von Effektorzellen zur Wirtsabwehr stimulieren, während in der Peripherie neue und existierende Zellen aktiviert werden können. In einer lokalen Immunreaktion kann CSF zirkuliererende Neutrophile in oder entfernt von Entzündungen halten. Die unpassende Lokalisierung und/oder Aktivierung von Neutrophilen kann in der Pathophysiologie einer Vielzahl an immunvermittelten Störungen beteiligt sein, wie rheumatoide Arthritis.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden erläuternden Ausführungsformen weiter verstanden werden, die nur exemplarisch sind und nicht als Beschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, wie er in den Ansprüchen beschrieben ist, gesehen werden sollte.
In den Beispielen sind die Temperaturen ºC, falls nichts anderes angegeben ist.
Die Restriktionsendonukleasen werden unter den Bedingungen und in der Weise verwendet, wie sie von ihren kommerziellen Anbietern empfohlen werden. Ligationsreaktionen werden ausgeführt, wie dies von Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle 245-G beschrieben ist, mittels des auf Seite 246 hiervon beschriebenen Puffers und mittels einer DNA Konzentration von 1-100 ug/ml bei einer Temperatur von 23ºC für stumpfendige DNA und 16ºC für DNA mit "klebrigen Enden", wobei die Beschreibung hiermit eingeführt ist. Die Elektrophorese wird in 0,5-1,5% Agarosegelen ausgeführt, die 90 mM Tris-Borat und 10 mM EDTA enthalten. Die gesamte radioaktiv markierte DNA ist mit ³²P markiert, egal was für eine Markierungstechnik verwendet wird.
Mit "Schnellpräparation" ist eine schnelle Herstellung von Bakteriophagen oder Plasmid DNA in kleinem Maßstab gemeint, wie dies beispielsweise von Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle auf Seite 365-373 beschrieben ist.

Beispiel A

Schritt 1: Kulturen der Mo Zellinie

Mo Zellen (ATCCTRL 8066) werden routinemäßig in Alpha- (6% CO&sub2;) oder Iscove's (10% CO&sub2;) Medium angezogen, das 20% fetales Rinderserum (FCS), 2 mM Glutamin, 100 E/ml Streptomycin und 100 ug/ml Penicillin enthält. Die Zellen sollten alle 4-5 Tage subkultiviert werden. Die Zellen werden gezählt und in Falcon T-175 Kulturflaschen in 100-150 ml Medium in einer Dichte von 3-4 · 10&sup5; Zellen/ml angeimpft. Die Zellen verdoppeln sich in 20% FCS alle 4-7 Tage. Die Wachstumsrate ist nicht konstant und die Zellen scheinen manchmal das Wachstum einzustellen und machen dann Wachstumsausbrüche durch. Mo Zellen können in serumfreiem Medium angezogen werden. Das Überleben ist viel besser, wenn die Zellen bei der Überführung von FCS in serumfreies Medium nicht gewaschen werden. Die optimale Dichte in serumfreiem Medium (SF) beträgt 5 · 10&sup5; Zellen/ml. Die Zellen wachsen langsam (oder halten zumindest eine konstante Anzahl) für 3 Tage in serumfreiem Medium, und sollten dann mit 20% FCS für mindestens 4 Tage gefüttert werden. Dieser Wachstumsplan (3 Tage SF, 4 Tage 20% FCS) kann wöchentlich wiederholt werden, falls SF Medium erforderlich ist, wobei die Zellen für einige Monate keinen erkennbaren Schaden davontragen.

Schritt 2: Test auf CSF Aktivität

A. Knochenmarktest

Man nimmt frisches Knochenmark, trennt die Spekulae ab, indem man durch eine Nadel mit 20, 22 und dann 25 Gauge durchzieht, verdünnt 1 : 1 mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Raumtemperatur) und überschichtet Ficoll-Paque (etwa 30 ml BM-PBS über 6 ml Ficoll), zentrifugiert bei 1500 Upm für 40 Minuten bei Raumtemperatur, entfernt Fett und die PBS Schicht und verwirft diese, pippetiert die Schicht mit der geringen Dichte ab, wäscht zweimal und PBS und zählt, plattiert die Zellen in RPMI (bezogen von GIBCO als RPMI 1640) mit 10% HIFCS (hitzeinaktiviertes FCS) für 3 Stunden, um anhaftende Zellen zu entfernen.
Plattierungsmedium (frisch herzustellen):
20% FCS
0,3% Agar, der in H&sub2;O gelöst ist und auf 40ºC abgekühlt ist.
2 · Iscoves (1 : 1 V/V mit Agar)
1% P/S Endkonzentration von 100 E/ml Streptomycin, 100 ug/ml Penicillin
10&supmin;&sup4; M α-Thioglycerin in 2 · Iscoves aus einer 10&supmin;² M Stammlösung
Man kühlt den Agar auf etwa 40ºC ab, mischt mit den anderen Bestandteilen, kühlt in einem Wasserbad auf 37- 38ºC ab und hält diese Temperatur.
Nach 3 Stunden pippettiert man die nicht anhaftenden Zellen ab, zentrifugiert und zählt, gibt 2 · 10&sup5; Zellen/ml Plattierungsmedium zu und hält dies in einem Wasserbad mit einer kontrollierten Temperatur bei 37- 38ºC. Sodann gibt man Proben (beispielsweise Medium aus transfizierten Zellen, gewöhnlich 10 ul Probe) zur ersten Vertiefungsreihe einer Mikrotiterplatte in zweifacher Ausführung, gibt 100 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung. Man gibt zusätzliche 50 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung der ersten Reihe, mischt sorgfältig und überführt 50 ul Lösung aus der ersten Reihe in die nächste Reihe usw und setzt 1 : 3 Verdünnungen über die Platte fort. Man wickelt die Platte in Parafilm ein, inkubiert 10-14 Tage bei 10% CO&sub2; und 37ºC in einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre und bewertet die Kolonien.
Um die Kolonien zu bewerten, wird die Gesamtzahl an Kolonien, die wachsen, in jeder Vertiefung gezählt. In jedem Test werden mehrere Vertiefungen ohne Einbeziehung einer Probe (Kontrolle) plattiert, um eine Hintergrundkoloniezählung zu erhalten. Die mittlere Anzahl an Kolonien, die in den Kontrollvertiefungen wachsen, wird von der Anzahl an Kolonien abgezogen, die in jeder der Vertiefungen gefunden werden, die Proben enthalten. Eine Einheit an CSF ist die Menge, die die Bildung einer Kolonie über der Hintergrundmenge pro 10&sup5; humanen Knochenmarkzellen (plattiert mit 10&sup5; Zellen pro ml) stimuliert, wenn die CSF Konzentration unterhalb der Sättigung liegt. Die Konzentration unterhalb der Sättigung wird durch Verdünnen und Vergleichen der Anzahl an Kolonien bei verschiedenen Verdünnungen bestimmt, um die Konzentration knapp unterhalb der Sättigungsmenge zu finden.
Für diesen Test werden die Kolonien, die Granulozyten, Monozyten oder beide Zelltypen enthalten, gezählt. Die Zelltypen in den Kolonien werden durch Picken der Kolonien und Färben der einzelnen Zellen bestimmt.

B. KG-1 Zelltest

KG-1 Zellen (Blood, Band 56, Nr. 3 (1980) werden in Iscoves Medium + 10% FCS angezogen, 2 · pro Woche passagiert und bei jeder Passage mit 2 · 10&sup5; Zellen/ml angeimpft. Die Zellen werden nur zwischen der Passage 30-35 für den Test verwendet. Der Test ist derselbe wie dies oben für das Knochenmark beschrieben wurde, außer daß KG-1 Zellen in einem Agargemisch mit 4 · 10³ Zellen/ml plattiert werden.
Die Anzahl an Kolonien, die in jeder Vertiefung wachsen, wird bestimmt und die Hintergrundzählung wird wie im oben beschriebenen Knochenmarktest abgezogen. Eine KG-1 CSF Einheit/ml ist die Konzentration an CSF, die die Hälfte der maximalen Anzahl (Sättigung) von wachsenden KG-1 Kolonien stimuliert. Die maximale Anzahl erhält man, indem man eine sättigende Menge an CSF in mehrere Vertiefungen gibt.

Schritt 3: Konstruktion des Vektors p91023(B)

Der Transformationsvektor ist pAdD26SVpA(3) und wurde von Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 2 (11): 1304-1319 (1982) beschrieben. Er hat die in Fig. 2 gezeigte Struktur. Kurz gesagt enthält dieses Plasmid ein Dihydrofolatreduktase (DHFR) cDNA Gen der Maus, das unter der Transkriptionskontrolle des hauptsächlichen späten Promotors des Adenovirus 2 (Ad2) steht. Eine 5' Spleißstelle ist in der Adenovirus DNA enthalten und eine 3' Spleißstelle, die aus einem Immunglobulingen stammt, kommt zwischen dem hauptsächlichen späten Ad2 Pro motor und der für DHFR kodierenden Sequenz vor. Die frühe SV40 Polyadenylierungsstelle liegt stromabwärts von der für DHFR kodierenden Sequenz. Der aus Prokaryonten stammende Abschnitt von pAdD26SVpA(3) ist aus pSVOd (P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman und T. Maniatis, 1981, Cell 27 : 279-288) und enthält keine pBR322 Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Replikation in Säugerzellen hemmen (M. Lusky und M. Botchan, 1981, Nature (London) 293: 79-81.
pAdD26SVpA(3) wird in das Plasmid pCVSVL2 umgewandelt, wie dies in Fig. 2 erläutert ist. pAdD26SVpA(3) wird in das Plasmid pAdD26SVpA(3) (d) durch die Deletion einer der zwei PstI Schnittstellen in pAdD26SVpA(3) umgewandelt. Dies wird erreicht durch einen Partialverdau mit PstI (mittels eines Unterschusses an Enzymaktivität, so daß eine Subpopulation an linearisierten Plasmiden erhalten werden kann, worin nur eine PstI Schnittstelle gespalten ist), einer anschließenden Behandlung mit Klenow, einer Ligation zur Rezirkularisierung des Plasmids, einer Transformation von E. coli und einem Screening auf Deletion der PstI Schnittstelle, die 3' der SV40 Polyadenylierungssequenz liegt.
Die dreiteilige Signalsequenz des Adenovirus und Adenovirus-assoziierte Gene (VA Gene) werden in pAdD26SVpA(3) (d) inseriert, wie dies in Fig. 2 gezeigt ist. Zuerst wird pAdD26SVpA(3) (d) mit PvuII geschnitten, um ein lineares Molekül herzustellen, das innerhalb des 3' Teils der ersten drei Elemente geöffnet ist, der die dreiteilige Signalsequenz enthält. Dann wird pJAW43 (Zain et al., 1979, Cell 16, 851) mit XhoI verdaut, mit Klenow behandelt, mit PvuII verdaut und das 140 Basenpaar lange Fragment, das den zweiten und dritten Teil der Signalsequenz enthält, wird durch Elektrophorese auf einem Acrylamidgel (6% in Tris-Boratpuffer, Maniatis et al., (1982) siehe obige Literaturstelle) isoliert. Das 140 bp lange Fragment wird dann mit dem mit PvuII verdauten pAdD26SVpA(3) (d) ligiert. Das Ligationsprodukt wird zur Transformation von E. coli zur Tetracyclinresistenz verwendet und Kolonien werden mittels des Grunstein-Hogness Verfahrens mittels einer ³²P markierten Sonde gescreent, die mit dem 140 bp langen Fragment hybridisiert. Die DNA aus positiv hybridisierenden Kolonien wird präpariert, um zu testen, ob die PvuII Schnittstelle 5' oder 3' der inserierten 140 bp langen DNA wiederhergestellt wurde, die für die zweiten und dritten Signalsequenzen des Adenovirus spezifisch ist. Bei der korrekten Orientierung liegt die PvuII Schnittstelle auf der 5' Seite des 140 bp langen Inserts. Dieses Plasmid wird in Fig. 2 pTPL genannt.
Das AvaII D Fragment des SV40, das die SV40 Enhancersequenz enthält, erhält man durch den Verdau der SV40 DNA mit AvaII, Stumpfendigmachen der Enden mit dem Klenowfragment der Pol I, Ligation von XhoI Linkem an die Fragmente, Verdau mit XhoI zur Öffnung der XhoI Schnittstelle und Isolierung des viertlängsten (D) Fragments durch Gelelektrophorese. Dieses Fragment wird dann mit dem XhoI geschnittenen pTPL unter Bildung des Plasmids pCVSVL2-TPL ligiert. Die Orientierung des SV40 D Fragments in pCVSVL2-TPL ist so, daß der späte SV40 Promotor in derselben Orientierung vorliegt, wie der späte hauptsächliche Adenoviruspromotor.
Um die Adenovirus-assoziierten (VA) Gene in pCVSVL2-TPL einzuführen, wird zuerst ein pBR322 Plasmid konstruiert, das das HindIII B Fragment des Adenovirus Typ 2 enthält. Die Adenovirus Typ 2 DNA wird mit HindIII verdaut und das B-Fragment wird nach der Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wird dann in pBR322 inseriert, das vorher mit HindIII verdaut wurde. Nach der Transformation von E. coli zur Ampicillinresistenz, werden Rekombinanten auf die Insertion des Hind III B Fragments gescreent und die Insertionsorientierung wird durch einen Restriktionsverdau bestimmt. pBR322 - Ad HindIII B enthält das HindIII B Fragment vom Adenovirus Typ 2 in der in Fig. 3 gezeigten Orientierung.
Wie in Fig. 3 gezeigt, erhält man die VA Gene bequemerweise aus dem Plasmid pBR322-Ad HindIII B durch einen Verdau mit HpaI, Zugabe von EcoRI Linkem, einen Verdau mit EcoRI und dem Gewinnen des 1,4 kb Fragments. Das Fragment mit klebrigen EcoRI Enden wird dann in die EcoRI Schnittstelle von pTPL inseriert (das vorher mit EcoRI verdaut wurde). Nach der Transformation von E. coli HB101 und der Selektion auf Tetracyclinresistenz werden die Kolonien durch Filterhybridisierung mit einer DNA Sonde gescreent, die für die VA Gene spezifisch ist. Die DNA wird aus positiv hybridisierenden Klonen präpariert und durch Verdau mit Restriktionsendonuklease charakterisiert. Das Plasmidprodukt wird als p91023 bezeichnet.
Die 2 EcoRI 2 EcoRI Schnittstellen p910213 werden entfernt. p91023 wird vollständig unter Bildung von zwei DNA Fragmenten mit EcoRI geschnitten, wobei das eine ein etwa 7 kb und das andere ein etwa 1,3 kb Fragment ist, das die VA Gene enthält. Die Enden beider Fragmente werden mittels des Klenowfragments der Pol I aufgefüllt und dann werden beide Fragmente, nämlich das 1,3 kb und das 7 kb Fragment, miteinander ligiert. Ein Plasmid p91023(A), das die VA Gene enthält und zu p91023 ähnlich ist aber die 2 EcoRI Schnittstellen deletiert hat, wird durch Grunstein-Hogness Screening mit einem VA Genfragment und durch herkömmliche Restriktionsanalyse gescreent.
Dann wird die PstI Einzelschnittstelle in p91023(A) entfernt und durch eine EcoRI Schnittstelle ersetzt. p91023(A) wird vollständig mit PstI geschnitten und dann mit dem Klenowfragment der PolI unter Bildung von glatten Enden behandelt. Die EcoRI Linker werden mit der stumpfendigen PstI Schnittstelle von p91023(A) ligiert. Das lineare p91023(A) wird mit den an die stumpfendige PstI Schnittstelle angehängten EcoRI Linkem von den nicht ligierten Linkem abgetrennt und vollständig mit EcoRI verdaut und dann religiert. Ein Plasmid p91023(B) wird gewonnen und als ähnliche Struktur zu p91023(A) identifiziert, außer daß eine EcoRI Schnittstelle an der vorherigen PstI Schnittstelle sitzt.

Schritt 4: Herstellung einer cDNA Bank

Die Mo Zellen werden für 16-20 Stunden mit PHA und PMA induziert, um ihre Lymphokinproduktion zu fördern. Die Zellen werden mit 5 · 10&sup5; Zellen/ml in Iscoves Medium mit 20% FCS, 0,3% (V/V) PHA und 5 ng/ml TPA plattiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt. Die pelletierten Zellen werden in 20 ml eiskaltem hypotonischen Lysepuffer resuspendiert (RSB Puffer: 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01 M KCl, 0,0015 M MgCl&sub2;, 1 ug/ml Cycloheximid, 50 Einheiten/ml RNAsin und 5 mM Dithiothreit). Die Zellen können auf Eis für fünf Minuten anschwellen und werden dann mechanisch mit 10 Schlägen eines dicht schließenden Dounce- Glashomogenisators zerstört. Das Homogenat wird bei niedriger Geschwindigkeit (2000 Upm in einer Beckman J6 Zentrifuge) unter Entfernung der Kerne und nicht lysierten Zellen zentrifugiert. Der Überstand wird auf Eis gehalten, während das Kernpellet in 10 ml RSB resuspendiert und erneut bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert wird. Dieser zweite Überstand wird mit dem ersten vereinigt und die vereinigten Überstände werden bei niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung der restlichen Kontamination mit Kernen und nicht lysierten Zellen zentrifugiert. Der Überstand ans dieser Zentrifugation wird durch die Zugabe von 2 M KCl auf 0,15 M KCl gebracht und dann bei hoher Geschwindigkeit (25 000 Upm, Beckman SW 28 Rotor für 30 Minuten) zentrifugiert, um die Membranen zu pelletieren. Das Membranpellet wird sorgfältig mit kaltem RSB gewaschen, dann in 12 ml RSB resuspendiert, worin 2 M Saccharose und 0,15 M KCl enthalten sind. Zwei diskontinuierliche Gradienten werden in Beckman SW41 Zentrifugenröhrchen durch Überschichten von 6 ml der Membranlösung in 2 M Saccharose über 2 ml RSB mit 2,5 M Saccharose und 0,15 M KCl hergestellt. Die Röhrchen werden bis oben hin durch Überschichten mit 2,5 ml RSB gefüllt, worin 1,3 M Saccharose und 0,15 M KCl enthalten sind. Diese Gradienten werden für 4 Stunden bei 27 000 Upm (Beckman SW41 Rotor) bei 4ºC zentrifugiert. Die Membranschicht (an der Interphase zwischen der 2,0 M und der 1,3 M Saccharose) wird sorgfältig von der Seite her mit einer 18 Gauge Nadel und einer Spritze entfernt. Die Membranfraktionen aus den zwei Gradienten werden vereinigt und mit 1 Volumen destilliertem H&sub2;O verdünnt, dann auf 0,5% Triton X-100 und 0,5% Natriumdesoxycholat gebracht und dann mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit einem 1 : 1 Gemisch aus Phenol und Chlorofom und schließlich einem gleichen Volumen Chlorofom reextrahiert. Schließlich wird die membrangebundene RNA durch die Zugabe von NaCl auf 0,25 M und 2,5 Volumina kaltem Ethanol gefällt und über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die gefällte RNA wird durch Zentrifugation (4000 Upm für 10 Minuten in der Beckman J-6 Zentrifuge) gesammelt und wird in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Aus 2 · 109 Zellen erhält man etwa 1 mg RNA. Die Boten-RNA (mRNA) wird aus der gesamten RNA durch Chromatographie auf einer 0,5 ml Oligo-dT- Cellulosesäule isoliert. Kurz gesagt wird die RNA für 5 Minuten auf 70ºC erhitzt, schnell auf Eis abgekühlt und dann 5 fach mit Bindungspuffer mit Raumtemperatur verdünnt (0,5 M LiCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 M EDTA und 0,1% SDS). Die RNA im Bindungspuffer wird über die Oligo-dT-Cellulosesäule gegeben, die mit dem Bindungspuffer bei Raumtemperatur äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 5 ml Bindungspuffer, dann mit 5 ml 0,15 M LiCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,4, 0,002 M EDTA und 0,1% SDS gewaschen. Schließlich wird die mRNA mit 2 ml 0,01 M Tris-HCl pH 7,4, 0,002 M EDTA und 0,1% SDS eluiert. Die mRNA wird durch die Zugabe von NaCl auf 0,25 M und von 2,5 Volumina Ethanol gefällt und über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die gefällte mRNA wird durch Zentrifugation gesammelt (30 000 Upm für 30 Minuten in einem Beckman SW55 Rotor). Das Röhrchen wird sorgfältig getrocknet und das mRNA Pellet wird in 50 ml H&sub2;O resuspendiert. Die resuspendierte mRNA wird auf 0,25 M NaCl gebracht und dann einmal mit einem 1 : 1 Gemisch aus Phenol und Chlorofom und dann dreimal mit Chloroform extrahiert. Die mRNA wird durch die Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol gefällt. Das Gemisch wird mehrere Male in einem Trockeneis / Ethanolbad eingefroren und aufgetaut und dann in einer Eppendorfzentrifuge für 15 Minuten zentrifugiert und das mRNA Pellet wird in 20 ul destilliertem H&sub2;O resuspendiert. Die schließliche Ausbeute beträgt etwa 30 ug mRNA.
Man stellt eine Erststrang cDNA mittels Standardtechniken her. Kurz gesagt werden 10 ug Membran mKNA in einem 100ul Reaktionsgemisch zur cDNA Synthese verdünnnt, das 300 mM Tris pH 8,4, 140 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, jeweils 500 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 5 ug Oligo-dT (phosphoryliert und mit einer mittleren Länge von 12-18) als Primer, 150 uCi ³²P dCTP (400 Cl/mmol) und 20 Einheiten des Ribonukleaseinhibitors RNAsin enthält. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 100 Einheiten reverser Transkriptase gestartet und für 30 Minuten bei 42ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA auf 40 mM gestoppt und die RNA wird durch die Inkubation für 20 Minuten bei 65ºC in 0,2 M NaOH abgebaut. Die Base wird durch die Zugabe von 20 ul 2 M Tris pH 7,4 neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Phenol / Chlorofom extrahiert, mit 50 ul 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) rückextrahiert und die wäßrigen Phasen werden vereinigt. Die Erststrang cDNA wird durch die Inkubation für 12 Stunden bei 16ºC mit 40 Einheiten Klenowfragment der DNA Polymerase I in einem 100 ul Reaktionsgemisch in doppelsträngige cDNA umgewandelt, das 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 2,3 mM DTT, 2-Mercaptoethanol, 10 mM MgCl&sub2;, 150 uM jedes der 4 Desoxynukleotidtriphosphate und 25 -uCi ³²P dCTP enthält. Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und die nichteingebauten Triphosphate werden durch die Passage einer wäßrigen Phase über eine 1 ml Sephadex G-50 Säule entfernt. Die Ausschlußfraktionen werden vereinigt und mit Ethanol gefällt.
Das cDNA Pellet wird mit kaltem Ethanol gewaschen, dann in 200 ul 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 80 uM S-Adenosylmethionin und 300 Einheiten EcoRI Methylase für 60 Minuten bei 37ºC resuspendiert. Die Reaktion wird durch die Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und die methylierte cDNA wird durch Ethanolfällung gesammelt.
Das cDNA Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und dann in 200 ul 51 Puffer (Maniatis et al.) resuspendiert und mit 200 Einheiten S1-Nuklease bei 30ºC 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und die cDNA wird durch Ethanolfällung gesammelt.
Die doppelsträngige cDNA wird durch eine Inkubation in 100 ul 20 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 500 uM aller vier Desoxynukleotidtriphosphate mit 25 Einheiten Klenow bei Raumtemperatur für 30 Minuten stumpfendig gemacht. Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und die cDNA wird durch Ethanolfällung gesammelt.
Die cDNA wird in 50 ul T4 Ligasepuffer (Maniatis et al) mit 500 umol R1 Linkem mittels 2000 Einheiten T4 Ligase über Nacht bei 16ºC ligiert, die von New England Biolabs bezogen werden (Sequenz: pCGGAATTCCG). Die Reaktion wird durch eine Inkubation bei 70ºC für 20 Minuten gestoppt und dann in 300 ul so verdünnt, daß die schließliche Salzkonzentration 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 beträgt. Die cDNA wird dann für 2 Minuten bei 37ºC mit 700 Einheiten EcoRI verdaut. Die Reaktion wird durch eine Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und die cDNA wird durch Etanolfällung gesammelt. Das Pellet wird in 50 ul TE resuspendiert und über eine 5 ml C1-4B Säule gegeben. Die Ausschlußfraktionen werden vereinigt und mit Ethanol gefällt. Die gefällte cDNA wird durch ein 1% Agarosegel in Tris-Acetatpuffer in Gegenwart von 1 ug/ml Ethidiumbromid einer Elektrophorese unterzogen. Die cDNA in der Größe von 500-4000 Basenpaaren wird aus dem Gel mittels des Standardglaspulververfahrens isoliert. Die eluierte cDNA wird mit Phenol / Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und das Pellet (nach einem Ethanolwaschschritt) wird in 50 ul TE resuspendiert. Die schließliche Ausbeute beträgt 100-500 ng cDNA.
Die Herstellung des Expressionsvektors p91023(B) ist oben beschrieben. Der mit EcoRI verdaute und mit Phosphatase behandelte Vektor (500 ng)wird mit 100 ng cDNA in einer 100 ul Reaktion (Standard T4 Ligasereaktion) über Nacht bei 16ºC ligiert. Die Reaktion wird durch eine Extraktion mit Phenol / Chloroform gestoppt und dann wird die ligierte cDNA durch Ethanolfällung nach der Zugabe von 5 ug tRNA als Träger ligiert.
Die mit Ethanol gefällte DNA wird mit 70% Ethanol gewaschen und dann in 100 ul TE resuspendiert. Diese DNA wird in 4 ul Aliquots zur Transformation von E. coli MC1061 verwendet (4 ul in einer 100 ul Transformation). Jede der 25 Transformationen wird auf eine 150 mm Petrischale mit 1% Agar, L-Medium und 10 ug/ml Tetracyclin (Tet Platte) ausgebracht und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Etwa 2000 Kolonien wachsen auf jeder Platte, was zu einer Gesamtzahl von etwa 50000 Kolonien führt. Nachdem die Kolonien einen Durchmesser von etwa 0,5 mm erreicht haben, werden die Kolonien auf Nitrocellulosescheiben (137 mm) durch sorgfältiges Plazieren des trockenen Filters auf die Oberfläche der Platte und ein vorsichtiges Abziehen des Filters überführt. Alle Kolonien auf der Platte werden auf das Filter überführt, das dann (mit der Kolonieseite nach oben) auf eine frische Tetplatte gelegt wird. Nach dem die Kolonien für mehrere Stunden wachsen konnten, wird ein Abdruck von jedem Filter gemacht, indem man ein frisches angefeuchtetes Filter exakt über das Originalfilter legt, sie zusammenpreßt, sie auseinanderzieht und jedes Filter auf eine frische Tet-Platte zurücklegt und die Platten über Nacht bei 37ºC inkubiert. Jeder Abdruck wird sorgfältig markiert, so daß er mit dem Originalfilter passend übereinandergelegt werden kann.

Schritt 5: Herstellung eines Plasmidpools

Jedes der 25 Abdruckfilter wird vorsichtig in Achtel mittels eines Skalpels aufgeteilt und die Orientierung wird auf jedem der Achtel relativ zum ursprünglichen Originalfilter vermerkt. Die Kolonien werden aus jeder Sektion in 10 ml L-Medium abgekratzt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation gesammelt (3000 Upm, 10 Minuten, Beckman J-6 Zentrifuge), in 0,6 ml 25% Saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 resuspendiert und durch die Zugabe von 0,12 ml 5 mg/ml Lysozym und einer Inkubation auf Eis für 5-10 Minuten in Protoplasten überführt. Die Protoplasten werden dann als nächstes bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, wonach eine Zugabe von 0,125 ml 0,5 M EDTA erfolgt und sie dann durch die Zugabe von 0,12 ml 10% SDS in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 lysiert werden. Das Lysat wird vorsichtig gemischt, bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und dann wird Protein und die chromosomale DNA durch die Zugabe von 0,3 ml 5 M NaCl gefällt. Nach der Inkubation auf Eis für 15 Minuten wird das Lysat in einer Eppendorfzentrifuge für 30 Minuten in der Kälte zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig entfernt, läßt das viskose DNA / Proteinpellet zurück und wird durch die Zugabe von 2,5 ml H&sub2;O verdünnt. Das Gemisch wird mit 1 ml Phenol extrahiert, die Phasen werden durch Zentrifugation getrennt (10 000 Upm für 10 Minuten im Sorvall SS-34 Rotor) und die wäßrige Phase wird in ein frisches Röhrchen entfernt. Die DNA wird durch die Zugabe von 0,5 ml 5 M NaCl und 7,5 ml kaltem Ethanol und Einfrieren des Gemisches einigemale in einem Trockeneisethanolbad gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation (10 000 Upm, 15 Minuten im Sorvall SS-34) gesammelt, in 0,3 ml 0,3 M Natriumacetat resuspendiert und (in einem Eppendorfröhrchen) durch die Zugabe von 1 ml Ethanol erneut gefällt. Nach 10-15 Minuten in einem Trockeneisethanolbad wird die gefällte DNA durch Zentrifugation (5 Minuten im Eppendorfröhrchen) gesammelt und das schließliche Pellet wird in 100 ul sterilem TE (10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA) resuspendiert. Aus einer typischen Präparation erhält man 5-10 ug Plasmid DNA. Jede Präparation enthält die DNA aus 200-500 Kolonien auf dem urprünglichen Filter. Es wird eine Gesamtmenge von 200 DNA Proben von den 25 Filtern hergestellt.

Schritt 6: Isolierung des CSF Klons

Jede der DNA Proben aus Schritt 5 werden getrennt in M6 COS Affenzellen transfiziert, wie dies später beschrieben ist.
Die M6 Zellen werden routinemäßig in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DME erhältlich von Gibco) angezogen, das 10% hitzeinaktiviertes Kälberserum (HIFCS) enthält und zweimal in der Woche mit einer 1 : 6 Verdünnung aufgeteilt. Vierundzwanzig Stunden nach der 1 : 6 Aufteilung sind die M6 Zellen zur Transfektion bereit. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion werden 1, 2 · 10&sup8; M6 Zellen (Aufteilung 1 : 6) in eine Cell Factory (erhältlich von Nung) in 1,5 Litern DME + 10% HIFCS geimpft. Unmittelbar vor der Transfektion werden die Platten abgesaugt und zweimal mit 7 ml serumfreien (SF) DME gewaschen. Die DNA wird in 0,1 M Tris (pH 7,3) gelöst und zum DME Medium gegeben, das 2 mM Glutamin, 100 ug/ml Streptomycin, 100 E/ml Penicillin und 0,25 mg/ml DEAE-Dextran enthält und zusammen mit der Tris-DNA Lösung 4 ml ausmacht. Die 4 ml des die gelöste DNA enthaltenden Mediums werden zur Platte gegeben, die die M6 COS Zellen enthält und für 12 Stunden inkubiert.
Nach der Inkubation werden die Zellen ein oder zweimal mit 7 ml SF DME gewaschen. Dann werden 5 ml DME mit 10% HIFCS, 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin und 0,1 mM Chloroquin zugegeben und die Zellen werden für 2,5 Stunden inkubiert.
Nach 2,5 Stunden wird einmal mit SF DME gewaschen und 10 ml DME + 10% HIFCS werden pro Platte zugegeben. Nach 30 Stunden wird das Medium abgesaugt und 4 ml pro Platte DME + 10% HIFCS werden zugegeben. Der Erntevorgang entfernt das konditionierte Medium nach 24-26 Stunden weiterer Inkubation.
Das konditionierte Medium aus jeder Transformation wird auf CSF Aktivität mittels des KG-1 Tests getestet. Für jede Probe, die im CSF Testpositiv ist, muß der Klon auf der ursprünglichen Originalplatte identifiziert. werden, der für die CSF Aktivität verantwortlich ist. Beispielsweise müssen für eine transfektionspositive CSF Aktivität alle Kolonien der Sektion des ursprünglichen Originalfilters, von der die Transfektions DNA Probe stammt, gepickt werden. Es werden etwa 320 dieser Kolonien in 3 ml L-Medium plus 10 ug/ml Tetracyclin gepickt. Die Kulturen läßt man über Nacht wachsen. Die 320 Kolonien werden in einer 18 · 18 Matrix angeordnet. Es werden Pools aus jeder horizontalen Reihe und vertikalen Spalte der Matrix hergestellt (insgesamt 36 Pools). (Anmerkung: Die letzte horizontale Reihe hat nur 14 Klone). Die DNA Proben werden aus jeder vereinigten Kultur präpariert und dann zur Transfektion von COS Zellen verwendet. Die Überstände dieser Transfektionen werden mittels des KG-1 Kolonietests getestet. Man erhält zwei Positive aus diesen Transfektionsansätzen: Einer in einer vertikalen Spalte, der andere in einer horizontalen Reihe. Die Kultur, die diesen Pools gemeinsam ist, enthält den CSF Klon.
Zwölf einzelne Klone aus dieser Kultur werden isoliert und es wird eine Minipräparations DNA aus 10 ml Kulturen in L-Medium präpariert, wie dies oben beschrieben ist. 10 ul DNA Proben aus diesen Präparationen werden mit EcoRI geschnitten und die entstehenden DNA Fragmente werden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Neun von den zwölf Klonen haben ein etwa 750 bp langes Insert gemeinsam. Die DNAs aus vier dieser Klone und der verbleibenden drei Klone werden in M6 COS Zellen wie oben beschrieben eingeführt. Die Überstände aus diesen Transfektionen werden mittels des KG-1 Tests wie auch des Knochenmarkstests für CSF getestet. Die vier Klone, die alle das 750 bp Fragment enthalten, steuern alle die Expression von hohen Mengen an CSF Aktivität durch die M6 COS Zellen, wie dies in beiden Tests detektiert wird, wobei die anderen drei Klone dies nicht tun. Daher muß die kodierende Region für CSF innerhalb des 750 bp Inserts liegen.
Die für CSF kodierende DNA Sequenz wird aus dem Transformationsvektor im positiven Klon durch den Verdau mit EcoRI entfernt und mittels Standarddidesoxysequenzierungsverfahren nach der Subklonierung der Fragmente in M13 Vektoren sequenziert, um die in Fig. 1 angegebene Sequenz zu erhalten. Das Plasmid p91023(B)-CSF, von dem zuerst gezeigt wurde, daß es die CSF Expression in COS Zellen steuert, wurde als pCSF-1 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection in dem E. coli Stamm MC1061 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39754 am 2. Juli 1984 hinterlegt.

Schritt 7: Expression des CSF Proteins

M6 COS Affenzellen, die mit dem Vektor p91023(B) transformiert sind, das die CSF/cDNA enthält und wie in Schritt 6 isoliert wurden, werden wie in Schritt 6 beschrieben unter Bildung des CSF Proteins im Kulturmedium angezogen.
Ein mg dieser DNA (pCSF-1) wird in 1 ml 0,1 M Tris pH 7,3 gelöst und zu 600 ml DME gegeben, worin 2 mM Glutamin, 100 E/ml Streptomycin, 100 ug/ml Penicillin (P/S) und 0,25 mg/ml DEAE Dextran (Molekulargewicht 500000 von Pharmacia) enthalten sind. Die 600 ml der DNA DEAE Dextranlösung werden zu den M6 COS Zellen in der Cellfactory gegeben und bei 37ºC für 12 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 900 ml SF DME gewaschen und dann für 2,5 Stunden mit 600 ml DME inkubiert, worin 0,1 mM Chloroquin, 10% HIFCS, 2 mM Glutamin und P/S enthalten sind. Nach dem Absaugen des Chloroquin enthaltenden Mediums werden die Zellen mit SF DME gewaschen und mit 1500 ml DME mit 10% HIFCS versorgt. Nach 30 Stunden werden die Zellen mit SF DME gewaschen, das Medium wird durch 800 ml SF DME ersetzt und die transfizierten Zellen können das Medium für 24 Stunden bei 37ºC konditionieren. Das konditionierte Medium wird abgesaugt und mit weiteren 800 ml SF DME ersetzt. Die Zellen können dieses Medium für 24 Stunden konditionieren und dann wird das konditionierte Medium gewonnen. So bald wie möglich werden die konditionierten Medienproben nach dem Ernten durch eine Druckultrafiltration mittels der Amicon 2,5 Liter Kammer mit der YM5 Membran (5000 MG Ausschlußgrenze) 20 fach konzentriert.

Schritt 8: Reinigung des rekombinanten CSF

Zweihundert ml des konzentrierten konditionierten Mediums (aus 4 Litern Ausgangsmaterial von Schritt 7) werden durch die Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 30% Ammoniumsulfatsättigung gebracht und das präzipitierte Protein wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird durch die Zugabe von mehr festem Ammoniumsulfat auf 80% Ammoniumsulfatsättigung gebracht und das präzipitierte Protein wird durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wird in 5 ml 20 mM Natriumcitrat pH 6,1 resuspendiert, worin 1 M NaCl enthalten ist. Das gelöste Protein wird auf eine 1,6 · 100 cm Säule aus Ultrogel AcA54 aufgetragen, die im selben Puffer äquilibriert ist. Die CSF Aktivität wird von der Säule mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 19 kDa oder nach 90 ml eluiert. Es wurde beobachtet, daß wenn die Gelfiltration bei niedriger Ionenstärke durchgeführt wird, die CSF Aktivität in zwei Positionen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 19 kDa und 38 kDa von der Säule eluiert, was nahelegt, daß GM-CSF leicht Dimere bilden kann. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 0,15% TFA (durch die Zugabe von 10% TFA) gebracht und auf eine Vydac C4 Säule (0,46 · 25 cm) aufgetragen, die in 0,1% TFA äquilibriert ist. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0-90% Acetonitril (1 ml/min. 340 ml gesamt) in 0,1% TFA gefahren. Die CSF Aktivität eluiert zwischen 39 und 43% Acetonitril (Fraktionen 16-20). Eine 20 ul Probe der Fraktion 19 wird durch SDS Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (13,5% Gel, wie dies von Lämmli, Nature 227, 680 (1970) beschrieben wurde). Eine einzelne breite Proteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 18-26 kDa wird beobachtet. Der ziemlich breite Größenbereich für CSF ist ein gemeinsames Merkmal von Glycoproteinen und dürfte die ausgiebige aber unterschiedliche Anfügung von Kohlenhydrat widerspiegeln. Das Protein von der Fraktion 10 wird einem Edman Abbau mittels des Gasphasenmikrosequenziergeräts von Applied Biosystems unterzogen. Von etwa 20 ug aufgetragenem Protein erhält man die Sequenz der ersten 16 Aminosäuren (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H). Die hohe Ausbeute dieser einzelnen Proteinsequenz legt stark nahe, daß das CSF Protein zur Homogenität gereinigt wurde. Ein Biotest zeigt, daß die Fraktion 19 3 · 10&sup7; Einheiten pro A&sub2;&sub8;&sub0; Absorptionseinheiten aufweist. Da typische Proteine in wäßriger Lösung einen Bereich an Extinktionskoeffizienten von 0,8 bis 1,2 A&sub2;&sub8;&sub0; Absoptionseinheiten pro Milligramm Protein auf weisen, liegt die spezifische Aktivität des gereinigten CSF zwischen etwa 1 · 10&sup7; und etwa 4 · 10&sup7; Einheiten/mg, wenn es im humanen Knochenmarkzelltest getestet wird.

Beispiel B (Referenzbeispiel)

Klonierung des CSF vom Gibbon

Schritt 1: Präparation der mRNA von Gibbon T-Zellen

Eine Probe der Gibbon T-Zellinie, die als UCD-MLA 144 bezeichnet wird, wird für mehrere Wochen in RPMI 1640 (bezogen von Gibco) und 20% fetalem Kälberserum (FCS) kultiviert, bis man insgesamt 1 · 10&sup9; Zellen erhält. Die Zellen werden induziert, um große Menge an CSF durch die Aktivierung in Gegenwart von 10 Nanogramm pro ml 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) in RPMI 1640 mit 1% FCS für 24 Stunden zu bilden. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet (1000 Upm. 5 Minuten), einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und schließlich durch Zentrifugation gesammelt.
mRNA des membrangebundenen Polysoms (MBP) wird aus diesen Zellen mittels desselben Verfahren präpariert, das in Beispiel A für die Präparation der RNA aus Mo Zellen beschrieben ist.

Schritt 2: Erststrang cDNA Reaktion

6 ug der MBP mRNA (aus Schritt 1) werden in 50 ul eines cDNA Synthesereaktionsgemisches (siehe Beispiel A - Schritt 4) verdünnt und die Reaktion wird durch die Zugabe der reversen Transkriptase gestartet. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 42ºC wird die Reaktion durch die Zugabe von EDTA auf 50 mM gestoppt und mit H&sub2;O auf 100 ul verdünnt. Das Gemisch wird mit Phenol / Chloroform und ferner mit Chloroform extrahiert. Die cDNA/RNA Hybride werden von den nicht eingebauten Triphosphaten durch eine Chromatographie auf einer 2 ml Sepharose CL-4B Säule abgetrennt. Die Ausschlußfraktionen werden vereinigt und die Hybride werden durch Ethanolfällungen gesammelt. Die schließliche Ausbeute beträgt 570 ng.

Schritt 3: Zweitstrang cDNA Reaktion

Das Erststrang cDNA Pellet (Schritt 2) wird in 50 ml H&sub2;O resuspendiert und die Synthese des Zweitstrangs wird in einem Standardreaktionsgemisch mit E. coli Polymerase I, E. coli Ligase und RNAse H durchgeführt. Die Reaktion wird über Nacht bei 16ºC und dann für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA gestoppt und mit Phenol / Chloroform extrahiert. Die cDNA wird aus den nicht eingebauten Triphosphaten durch eine Chromatographie auf einer Sepharose CL-4B Säule abgetrennt, die Ausschlußfraktionen werden vereinigt und die cDNA wird durch Ethanolfällung gesammelt.

Schritt 4: Rekombinante cDNA Herstellung

Das cDNA Pellet (Schritt 3) wird in 75 ul H&sub2;O resuspendiert. Homopolymere C "Schwänze" werden an die Enden der cDNA durch die Zugabe von 10 ul der cDNA Lösung zu einem 25 ul umfassenden Standardreaktionsgemisch mit terminaler Transferase und einer Inkubation bei 30ºC für 5 Minuten angebracht. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA auf 40 mM und einer Hitzeinaktivierung bei 68ºC für 10 Minuten gestoppt. 10 ng dieser cDNA mit Schwänzen werden mit 50 ng pBR322 mit G-Schwänzen (bezogen von NEN) in 10 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und 100 mM NaCl aneliert. Die Anelierungsreaktion wird für 10 Minuten bei 68ºC und dann für 2 Stunden bei 57ºC inkubiert.

Schritt 5: Bakterientransformation

Der E. coli Stamm MC 1061 wird in L-Medium angezogen, auf Eis gekühlt, durch Zentrifugation geerntet und mit CaCl&sub2; behandelt, um ihn zur Transformation zu präparieren. 5 ul der cDNA Anelierungsreaktion werden dann mit 200 ul der CaCl&sub2; behandelten Bakterien inkubiert. Fünfzehn solche Transformationen werden unter Verwendung der gesamten anelierten cDNA durchgeführt und auf 15 cm L-Mediumplatten mit 1% Agar verteilt, die 10 ug/ml Tetracyclin enthalten. Etwa 1000 Kolonien wachsen auf jeder Platte.

Schritt 6: Abdruckplattierung

10000 Kolonien aus der Transformation werden mit einem Zahnstocher gepickt, auf frische Platten (500 pro Platte in einem Muster) überführt und dann über Nacht bei 37ºC angezogen. Die Kolonien werden dann von jeder Platte durch festes Pressen eines trockenen Nitrocellulosefilters auf die Oberfläche der Platte abgenommen. Zwei Abdruckfilter werden von jedem dieser Originalfilter hergestellt. Die Originalfilter werden bei 4ºC gelagert und die Abdruckfilter werden mit Base behandelt und gebacken, um sie für die Hybridisierung zu präparieren.

Schritt 7: Herstellung der ³²P markierten Hybridisierungssonden

Das cDNA Insert von pCSF-1 wird durch einen Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI und einer Elektrophorese in einem Agarosegel mit Trisacetat und Ethidiumbromid isoliert. Die Bande, die das cDNA Fragment enthält, wird aus dem Gel ausgeschnitten und durch Glaspulvertechnik gereinigt.
300 ng des cDNA Fragments werden dann zu 1 ul 10 fach T4 DNA Polymerasepuffer (0,33 M Trisacetat, pH 7,9, 0,66 M Kaliumacetat, 0,1 M Magnesiumacetat und 10 mM Dithiothreit) und 3 Einheiten T4 DNA Poylmerasae (New England Biolabs) gegeben und mit Wasser auf 10 ul verdünnt. Nach der Inkubation für 5-10 Minuten bei 37ºC wird dieses Gemisch mit 1 ul 10 fach T4 DNA Polymerasepuffer, 1 ul einer Lösung aus jeweils 2 mM dCTP, dTTP, dGTP, 10 ul ³²P dATP (10 uCi/ul, 3000 Ci/mmol) und 3 Einheiten T4 DNA Polymerase vereinigt. Die Reaktion wird für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wird 1 ul 2 mM dATP zugegeben und die Reaktion wird für weitere 10 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Die nicht eingebauten Triphosphate werden von der markierten cDNA durch Chromatographie auf einer Sephadex G 100 Säule abgetrennt. Eine zweite Sonde wird aus einem synthetischen Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz hergestellt:
ATC TGG CTG CAC AG
das zum Aminoterminus der für CSF kodierenden Region komplementär ist. Dieses Oligonukleotid wird mit ³²P ATP am 5' Ende mittels einer Standardpolynukleotidkinasereaktion markiert.

Schritt 8: Isolierung der CSF cDNA Klone

In einem Standardhybridisierungsscreeningverfahren werden etwa 45 Klone mit der T4 markierten pCSF- 1 cDNA hybridisiert. Von diesen hybridisieren etwa 20 auch mit der markierten Oligonukleotidsonde. Die kodierende Region einer dieser Klone wird sequenziert und die Sequenzdaten zeigen mehrere Basenaustausche, wobei manche in einem Aminosäureunterschied im exprimierten Protein resultieren. Diese Unterschiede sind in der Fig. 1 über der DNA Sequenz für das humane CSF Gen gezeigt, das in Beispiel A kloniert wurde.

Beispiel C

Klonierung von CSF aus mRNA aus peripheren Blutlymphozyten

Schritt 1: mRNA Präparation aus peripheren Blutlymphozyten

Es werden periphere Blutlymphozyten aus vier Plasmapherese Nebenprodukten (bezogen von Roten Kreuz) durch die Fraktionierung auf einem Ficol-Hypaque Gradienten präpariert. Die Phase mit der leichten Dichte wird in RPMI 1640 in Gegenwart von 5% fetalem Kälberserum, 0,17% Phytohämaglutinin und 10 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) in einer Dichte von 2 · 106 Zellen/ml kultiviert (man erhält eine Gesamtzahl von 6 · 10&sup9; Zellen). Die Zellen werden durch Zentrifugation (1000 Upm, 5 Minuten) geerntet, einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und schließlich durch Zentrifugation gesammelt. Die cytoplasmatische RNA wird durch ein sanftes Lyseverfahren präpariert, worin die Zellen in 50 ml kaltem Tritonlysepuffer (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris, pH 8,6, 0,5% Triton X-100) mit 10 mM Dithiothreit (DTT) und 50 Einheiten/ml RNAsin (bezogen von Biotec) resuspendiert werden. Dieses Lysat wird in zwei gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil wird über ein 10 ml Kissen aus Lysepuffer geschichtet, der 20% Saccharose enthält. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation im Kalten (4ºC, 400 Upm für 5 Minuten) entfernt. Die obere Schicht (cytoplasmatischer Extrakt) wird sorgfältig entfernt und Natriumdodecylsulfat (SDS) wird bis zu einer Endkonzentration von 1 zugegeben. Diese Lösung wird zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol / Chloroform (1 : 1 Gemisch) extrahiert und die RNA wird durch die Zugabe von 2,5 Volumina kaltem Ethanol gefällt. Die gefällte RNA wird durch Zentrifugation (15 Minuten bei 4000 Upm) gesammelt und in 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,025 M NaCl (TE Puffer plus 0,25 M NaCl) resuspendiert und erneut durch die Zugabe von 2,5 Volumina kaltem Ethanol gefällt. Schließlich wird die RNA durch Zentrifugation gesammelt und in 5 ml H&sub2;O resuspendiert. Die schließliche Ausbeute beträgt 7,5 mg.
Die Boten RNA wird aus der gesamten cytoplasmatischen RNA durch eine Selektion auf Oligo-dT Cellulose isoliert. 2,5 mg der gesamten RNA werden für 5 Minuten auf 65ºC erhitzt. NaCl wird bis 0,5 M zugegeben und die RNA kann sich auf Raumtemperatur abkühlen. Diese RNA passiert eine ein 1 ml Säule aus Oligo dT Cellulose, die in TE + 0,5 M NaCl äquilibriert ist (Bindungspuffer). Ungebundene RNA wird durch ausgiebiges Waschen der Säule mit Bindungspuffer entfernt. Gebundene Boten RNA wird mit 3 ml H&sub2;O eluiert und durch Zugabe von 0,2 ml 4 M NaCl und 2,5 Volumina kaltem Ethanol gefällt. Die gefällte mRNA wird durch Zentrifugation gesammelt (30 Minuten bei 25000 Upm). Das schließliche Pellet (etwa 100 ug) wird in 50 ul H&sub2;O resuspendiert.

Schritt 2: Erststrang cDNA Reaktion

20 ug der PBL mRNA werden in einer 50 ul umfassenden cDNA Synthesereaktion verdünnt, die 100 mM Tris, pH 8,4, 140 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 400 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 5 ug Oligo-dT (mittlere Länge 12-18) als Primer, 25 uCl ³²P dCTP (400 uCi/mmol) und 20 Einheiten des Ribonukleaseinhibitors RNAsin enthält. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 60 Einheiten reverser Transkriptase bei 37ºC gestartet und wird für 30 Minuten bei 42ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA bis 40 mM gestoppt und mit einem gleichen Volumen WO gesättigtem Phenol extrahiert. Die Phenolphase wird mit 50 ul TE Puffer rückextrahiert. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt. Die cDNA/RNA Hybride werden von nicht eingebauten Tripnosphaten durch eine Passage der vereinigten wäßrigen Phase über eine 5 ml Sepharose CL-4B Säule (bezogen von Sigma) abgetrennt, die mit TE äquilibriert ist. Die Fraktionen, die von der Säule ausgeschlossen werden, werden vereinigt, auf 250 mM NaCl gebracht und die Nukleinsäuren werden durch die Zugabe von 2,5 Volumina kaltem Ethanol gefällt. Die Hybride werden für 30 Minuten bei 40000 Upm durch Zentrifugation gesammelt. Das schließliche Pellet (2,5 ug cDNA) wird in 50 ul H&sub2;O resuspendiert.

Schritt 3: Zweitstrang cDNA Reaktion

Die Zweitstrang cDNA wird durch die vereinigte Wirkung der Enzyme E. coli DNA Polymerase I, E. coli DNA Ligase und E. coli RNAse H synthetisiert. Das Reaktionsgemisch (50 ul) enthält 20 mM Tris, pH 8,0, 4 mM MgCl&sub2;, 1,2 mM EDTA, 25 uM NAD, jeweils 100 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 50 uCl ³²P dCTP (3000 Cl/mmol). Die Reaktion wird durch die Zugabe von 3 Einheiten DNA Polymerase I, 0,5 Einheiten DNA Ligase und 0,75 Einheiten RNAse H und einer Inkubation bei 16ºC für 18 Stunden und dann bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt und dann durch die Zugabe von EDTA bis 40 mM gestoppt und mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Die Phenolphase wird mit 50 ul TE rückextrahiert, die wäßrigen Phasen werden vereinigt, und die cDNA wird von den nicht eingebauten Triphosphaten durch die Chromatographie auf einer Sepharose CL-4B Säule abgetrennt, wie dies oben für den ersten Strang beschrieben wurde. Auf der Grundlage des ³²P Einbaus wird die Erststrang cDNA quantitativ in die doppelsträngige Form umgewandelt.

Schritt 4: Rekombinante cDNA Herstellung

Homopolymere C "Schwänze" werden an die Enden der cDNA angefügt, indem man 400 ng der cDNA in einem 50 ul Reaktionsgemisch bei 30ºC für 5 Minuten vorsichtig erwärmt, worin 1 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM CoCl&sub2; und 9 Einheiten terminale Desoxynukleotidyltransferase enthalten sind. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA auf 40 mM und einem Erhitzen auf 68ºC für 10 Minuten gestoppt. 200 ng dieser cDNA mit Schwänzen wird mit 500 ng pAT153 mit G-Schwänzen (bezogen von Amersham) in 100 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und 100 mM NaCl aneliert. Die Anelierungsreaktion wird bei 57ºC für 2 Stunden nach einer Präinkubation für 5 Minuten bei 68ºC durchgeführt.

Schritt 5: Bakterientransformation

Das cDNA Produkt aus der Anelierungsreaktion wird direkt zur Transformation des E. coli Stamms MC1061 verwendet. Eine frische Kolonie an Bakterienzellen wird zum Beimpfen von 50 ml L-Medium verwendet und für mehrere Stunden angezogen, bis die optische Dichte bei 550 nm 0,25 beträgt. Die Zellen werden auf Eis gekühlt und durch Zentrifugation geerntet (2000 Upm für 10 Minuten). Das Pellet wird in 10 ml kaltem 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert und kann für 10 Minuten auf Eis stehen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (2000 Upm für 5 Minuten) gesammelt und in 2,5 ml 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert. 10 ul der cDNA Anelierungsreaktion werden dann mit 200 ul CaCl&sub2;-behandelten Bakterien für 30 Minuten auf Eis und dann für 2 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach 0,8 ml L-Medium zugegeben werden und schließlich für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Zwanzig dieser Transformationen werden mit der gesamten anelierten cDNA durchgeführt. Jedes Transformationsgemisch wird auf L-Mediumplatten mit 1% Agar (15 cm Durchmesser) verteilt, die 10 ug/ml Tetracyclin enthalten. Aus den zwanzig Transformationen werden insgesamt 20 solche Platten angelegt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Im Mittel wachsen etwa 1500 Bakterienkolonien auf jeder Platte, was insgesamt 30000 Klone ausmacht.

Schritt 6: Replikaplattierung

Die ursprünglichen Kolonien, die auf jeder Platte wachsen, werden auf 137 mm Nitrocellulosefilter überführt, indem man ein trockenes Filter auf die Kolonien preßt und sie von der Platte abzieht. Es werden zwei identische Abdrücke von jedem ursprünglichen Filter durch Standardabdruckplattierungsverfahren hergestellt, wobei jedes ursprüngliche Filter mit der Kolonieseite nach oben vorsichtig auf ein steriles Filterpapierquadrat (Whatman 3MM) gelegt wird, das auf einem quadratischen Glasstück liegt. Ein neues vorbenetztes Nitrocellulosefilter wird vorsichtig auf dem Originalfilter plaziert, mit einem zweiten sterilen Filterpapierquadrat bedeckt und das komplette Sandwich wird dann mit einem zweiten Glasstück fest zusammengepreßt. Die aufeinanderliegenden Filter werden nummeriert und 3 Nadellöcher werden asymmetrisch durch sie durchgestoßen, so daß sie in Zukunft erneut exakt übereinandergelegt werden können. Der Abdruck wird dann vom Original entfernt und mit der Kolonieseite nach oben auf eine neue Tetracyclin-haltige L-Mediumagarplatte gelegt. Ein zweiter Abdruck wird sofort auf gleiche Weise hergestellt. Jedes Originalfilter wird auf eine Platte zurückgelegt und alle Platten werden bei 37ºC für einige Stunden inkubiert, bis die Bakterienkolonien etwa 1 mm Durchmesser erreicht haben. Die ursprünglichen Originalfilter werden bei 4ºC gelagert und die Abdrücke werden wie im folgenden beschrieben für die Hybridisierung präpariert.

Schritt 7: Präparation der Filter für die Hybridisierung

Jedes Abdruckfilter (Schritt 6) wird mit der Kolonieseite nach oben auf ein Filterpapier für 7 Minuten gelegt (Whatman 3 mm), das mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl getränkt ist. Die Filter werden dann auf Neutralisationsfilterpapiere für 2 Minuten gelegt, die mit 1 M Tris, pH 7,5, 1,5 M NaCl getränkt sind, und dann auf einen zweiten Satz Neutralisationsfilter für 5-10 Minuten überführt. Schließlich werden die Filter auf Filter für 5 Minuten gelegt, die mit SSC Puffer (0,015 M Natriumcitrat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) getränkt sind, luftgetrocknet und im Vakuum bei 80ºC für 1-2 Stunden gebacken.

Schritt 8: Isolierung der CSF cDNA Klone

Zweifach angelegte Filter werden mit dem radioaktiv markierten pCSF-1 cDNA Insert sondiert, die wie oben in Beispiel B hergestellt wurden. Es hybridisieren etwa 20 Kolonien mit der cDNA. Zwölf von diesen werden vom Originalfilter gepickt und über Nacht in L-Medium zur weiteren Analyse angezogen. Restriktionsenzymverdaus (PstI) von DNA Proben (Schnellpräparation) dieser Klone, zeigen an, daß 3 fast die volle Länge aufweisen. Einer davon wird sequenziert. Die Sequenz der für CSF kodierenden Region dieses Klons ist mit der entsprechenden Sequenz von pCSF-1 identisch (das heißt weist an der Position 365-CSF(Ile) ein T auf).

Beispiel D (Referenzbeispiel)

Reinigung von CSF aus der Mo Zellinie

Serumfreies durch Mo Zellen konditioniertes Medium (40 Liter) wird bei 55ºC für 30 Minuten inkubiert, um das mit der Zellinie assoziierte HTLV-II Virus zu inaktivieren. Dieses Medium wird durch Druckultrafiltration mittels der Pellicon Kassette mit der Membran PTGC (1,5 Quadratfuß) konzentriert, die eine Molekulargewichtsausschlußgrenze von 10000 aufweist. Das Protein wird weiter durch Ammoniumsulfatfällung konzentriert (80 Sättigung). Das schließliche Proteinpellet (800 mg) wird in 100 ml 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) pH 7,4 resuspendiert und gegen denselben Puffer dialysiert (dreimal gegen jeweils ge wechselte 4 Liter). Das dialysierte Protein wird auf eine 2,5 · 10 cm Säule aus DEAE (Diethylaminoethyl)- Ultrogel aufgetragen die im selben Puffer äquilibriert ist. Die Säule wird mit 800 ml 20 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen und dann wird die CSF Aktivität mit 800 ml 20 mM Tris-HCl pH 7,4 eluiert, worin 0,12 M NaCl enthalten sind. Es werden 10 ml Fraktionen gesammelt und auf CSF getestet. Die aktiven Fraktionen (3) werden vereinigt und sechsfach (auf 5 ml) durch Druckultrafiltration konzentriert (Amicon YM5 Membran, Molekulargewichtsausschlußgrenze 5 000). Die konzentrierte Probe aus der DEAE Säule wird auf eine 1,6 · 100 cm AcA44 Ultrogelsäule aufgetragen (ein Acrylamidagaroseultrogel mit einer Fraktionierung von 10 bis 130 kDa), die mit 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (IEPES) pH 7,4, 50 mM NaCl und 0,01% Polyethylenglykol (PEG 8000) äquilibriert ist. Die CSF Aktivität eluiert von der Säule mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30 kDa. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 0,15% (V/V) Trifluoressigsäure (TFA) durch die Zugabe von 10% TFA gebracht und auf eine Vydac C&sub4; Umkehrphasensäule (1 · 25 cm) aufgetragen. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0-90% Acetonitril in 0,1% TFA (V/u) mit 4 ml/min gefahren (insgesamt 1000 ml). Die CSF Aktivität eluiert bei etwa 47% (VIV) Acetonitril. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden auf 0,05% (VIV) Heptafluorbuttersäure (HFBA) durch die Zugabe von einem halben Volumen 0,15% (V/V) HFBA gebracht und auf eine Vydac C4 Säule (0,46 · 25 cm) aufgetragen, die mit 0,15% (V/V) HFBA äquilibriert ist. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0-90% (V/V) Acetonitril in 0,15% (V/V) HFBA mit 1 ml/min gefahren (insgesamt 340 ml). Die CSF Aktivität eluiert bei etwa 53% (V/V) Acetonitril. Die Fraktionen 37-44 (jeweils 1 ml) sind aktiv. 0,15 ml der Fraktion 40 werden vierfach konzentriert (mittels des SA- VANT Speed Vac Concentrator) und 40 ul 2 · SDS Gelprobenpuffer werden zugegeben (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerin und 0,004% Bromphenolblau). Die Proben werden für 2 Minuten gekocht und auf ein 13,5% SDS Gel nach U. Lämmli, Nature 227, 680 (1970) aufgetragen (siehe Fig. 2). Die Fraktion Nr. 40 weist 110000 Knochenmark CSF Einheiten/ml auf. Dies entspricht etwa 3,0 · 10&sup7; Einheiten pro A280 Absorptionseinheit. Da typische Proteine Extinktionskoeffizienten aufweisen, die von 0,8 bis 1,2 A&sub2;&sub8;&sub0; Absorptionseinheiten pro Milligramm reichen, weist das gereinigte CSF eine spezifische Aktivität zwischen etwa 1 · 10&sup7; und etwa 4 · 10&sup7; Einheiten pro mg im Knochenmarktest auf. Eine 1 ug Probe des gereinigten GM-CSF wird einem Edman Abbau mittels des Gasphasenmikrosequenators von Applied Biosystems unterzogen. Die Sequenz der Reste 3 bis 5 wird mit Ala-Arg-Ser bestimmt.

Beispiel E

Für die Cotransformation und Amplifizierung der CSF Sequenz in CHO Zellen wird das Plasmid p91023(B)-CSF in CHO DHFR defiziente Zellen DUKX-B11 (Chasin und Urlaub, PNAS 77: 4216, 1980) durch Protoplastenfusion eingeführt, wie dies beschrieben ist (Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Biol. 1, 743-752, 1981). Das Wachstum und die Erhaltung der CHO Zellen wurde beschrieben (Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 150, 601-621, 1981). Für die Protoplastenfusion wird das Plasmid p91023(B)-CSF-1 in E. coli HB101 eingeführt und die Bakterien läßt man in 50 ml M9 Salze bis zu einer Absorption von 0,6 bei 600 nm wachsen, worin 0,5% Casaminosäuren, 0,4% Glucose, 0,012% MgSO&sub4;, 5 ug/ml Thiamin und 10 ug/ml Tetracyclin enthalten sind. Es wird Chloramphenicol bis auf 250 ug/ml zugegeben und die Kultur wird bei 37ºC für weitere 16 Stunden inkubiert, um die Plasmidkopiezahl zu erhöhen. Die Zellen werden bei 3000 · g für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und in 2,5 ml gekühlter 20% Saccharose in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 suspendiert. Man gibt Lysozym zu (0,5 ml einer 5 mg/ml Lösung in 0,25 M Tris-HCl pH 8,0), das Gemisch wird für 5 Minuten auf Eis gehalten, EDTA (1 ml 0,25 M EDTA pH 8,0) wird während weiteren 5 Minuten auf Eis zugegeben, und dann werden 1,0 ml 0,05 M Tris-HCl pH 8,0 langsam zugegeben. Die Suspension wird für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert bis die Baktieren in Protoplasten umgewandelt sind. Die Suspension wird dann langsam mit 20 ml eines vorgewärmten Mediums verdünnt, das 10% Saccharose und 10 mM MgCl&sub2; enthält, und für 15 Minuten auf 37ºC gehalten. Die Lösung der Protoplasten (etwa 109/ml) wird zu CHO Zellen, nämlich DHFR defizienten DUKX-B11 Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen (etwa 1 · 106 Zellen/Vertiefung) in einem Verhältnis von etwa 1-2 · 10&sup4; Protoplasten/Zelle gegeben und die Protoplasten werden auf die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 Upm für 8 Minuten in einem ausschwingenden Mikrotiterplattenrotor einer IEC Modell K Zentrifuge pelletiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand durch Absaugen entfernt. Eine 2 ml Menge einer Polyethylenglycollösung aus 50 g PEO-1450 (Baker Chem. Co.) in 50 ml Medium wird zu jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen gegeben. Die Zellen werden erneut bei 2000 Upm für 90 Sekunden zentrifugiert, die Polyethylengylcollösung wird entfernt und die Platten werden dreimal mit 4 ml Medium/Vertiefung gewaschen. Die Zellen werden dann trypsinbehandelt, in 10 ml Medium suspendiert, das 10% fetales Kälberserum enthält, und in ein konisches Röhrchen bei 500 Upm in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Die pelletierten Zellen aus 3 Vertiefungen werden vereinigt und in eine 10 cm Gewebekulturschale ausplattiert. Frisches Medium, das 100 ug/ml Kanamycin, Thymidin, Adenosin, Desoxyadenosin, Penicillin, Streptomycin und 10% dialysiertes fetales Kälberserum enthält, wird zu jeder Platte gegeben. Das Kanamycin wird miteinbezogen, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern, die der Umwandlung zu Protoplasten entkommen sind.
Zwei Tage später werden die Zellen 1 : 15 in α-Medium mit 10% dialysiertem fetalem Kälberserum, Penicillin und Streptomycin subkultiviert, dem aber die Nukleoside fehlen. Die Zellen werden erneut mit denselben selektiven Medien (denen Nukleoside fehlen) nach 4-5 Tagen versorgt.
Nachdem man in selektive Medien subkultiviert hat, erscheinen nach 10-12 Tagen Kolonien. Zwei Schemata für Methotrexatselektion (MIX) und Amplifizierung werden befolgt. Im ersten Schema werden einzelne unabhängig klonierte Transformanden auf der Grundlage der DHFR Expression isoliert und anschließend wird jeder Klon unter Bedingungen vermehrt, um die Kopiezahl der Fremd-DNA zu amplifizieren, das heißt durch Wachstum in ansteigenden Konzentrationen Methotrexat. Im zweiten Schema wird ein Pool aus mehreren unabhängigen Transformanden auf der Grundlage der DHFR Expression isoliert und zusammen unter Bedingungen vermehrt, um die Fremd-DNA zu amplifizieren, das heißt Wachstum in ansteigenden Konzentrationen Metothrexat. Dann werden einzelne Klone aus der selektierten Massenpopulation isoliert und auf GM-CSF Expression analysiert. Die Klone, die die höchsten Mengen an GM-CSF Expression zeigen, werden erneut unter Bedingungen angezogen, um die Fremd-DNA weiter zu amplifizieren (das heißt Wachstum in ansteigenden Methotrexatkonzentration im Kulturmedium).
In einem Experiment werden sieben DHFR&spplus; Transformanden in α-Medium vereinigt, dem Nukleoside fehlen. Diese Zellen werden anschließend in schrittweise ansteigenden Konzentrationen von MTX ausgehend von 0,02 uM und dann mit Schritten auf 0,1, 0,5 und 2,0 uM MTX angezogen. Wenn sie auf GM-CSF Aktivität im KG-1 Zelltest getestet werden, bilden diese Zellen 3000 bis 12000 Einheiten pro ml. Die ausgewählte Population wird in 0,5 uM MTX und in 2,0 uM MTX kloniert. Klone, die in 0,5 uM MTX erhalten werden (010, D2 und B6) werden anschließend auf Wachstum in 2,0 uM MTX selektiert. Wenn sie auf GM-CSF Aktivität im KG-1 Zelltest getestet werden, bilden die klonierten Zellinien 15000 bis 300000 Einheiten pro ml an GM-CSF Aktivität. Die gemäß diesem Beispiel gebildete GM-CSF Aktivität hat die für CSF-Thr in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz.

Beispiel F

Expression von GM-CSF in E. coli

GM-CSF wird in E. coli vom Vektor pTALC-185R exprimiert, von dem eine diagrammartige Beschreibung in Fig. 6 bereitgestellt wird. Die für GM-CSF kodierende Sequenz beginnt mit der synthetischen Sequenz ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, die die ersten 11 Aminosäurereste von reifen GM- CSF bestimmt. Der Rest der für GM-CSF kodierenden Sequenz in pTALC-185R ist zu der von pCSF-1 identisch, nämlich die Nukleotide 97-447, worauf die Sequenz TAR TAR TAG folgt. Unmittelbar nach dem dreifachen Terminator liegt ein pUC-18 Polylinker. Das Tetracyclinresistenzgen von pBR322 wird in der entgegengesetzten Orientierung zum CSF Gen 100 Basen stromabwärts vom pUC-18 Polylinker inseriert. Das Tetracyclinresistenzgen trägt seinen eingenen Promotor. Wenn man gegen den Uhrzeigersinn fortsetzt, kommt als nächstes das Gen für die β-Lactamase gefolgt vom pUC-18 Replikationsursprung (ColE1).
Das letzte Strukturmerkmal des Plasmids, bevor man zu den CSF Sequenzen zurückkommt, ist der PL Promotor. Dieser Promotor ist im wesentlichen so, wie er von A. Skatzman und M. Rosenberg beschrieben ist (in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 419). Die CSF Expression wird durch den PL Promotor nach der Temperaturinduktion eines geeigneten E. coli Wirtsstamms gesteuert. Der Ausgangsstamm, der für alle Stammkonstruktionen verwendet wird, ist W3110 lacI&sup0;L8 (R. Brent und M. Ptashne, PNAS, 78 (1981), 4204-4208).
Ein Fragment der λ DNA (λ Nukleotide 34499 bis 38214) wird in das Chromosom von W3110 lacI&sup0;L8 am lacZ Genort integriert. Die Integration wird mittels eines Integrationsvektors durchgeführt, der sich aus pBR325 Sequenzen zusammensetzt, die die Gene für Chloramphenicol- und Ampicillinresistenz wie auch den pBR322 Replikationsursprung tragen (F. Bolivar, Gene,4 (1978), 121-136). Das λ DNA Fragment wird in das lacZ Gen eingesetzt, das wiederum auf dem Plasmid als Fragment vorkommt, das sich von der BstEII Schnittstelle in lacI bis zu einer Tt111I Schnittstelle stromabwärts von lacZ erstreckt.
Die Integration der λ DNA in die chromosomale Kopie von lacZ wird durch homologe Rekombination erreicht und man findet lac&spplus;, Ampicillin-sensitive, Chloramphenicol-resistente Kolonien. Auf ein zweites Rekombinationsereignis, das zur Entfernung der gesamten zusätzlichen Plasmidsequenzen führt, aber das λ DNA Fragment integriert läßt, wird auf Lactose-MacConkey Platten gescreent. Der anfängliche lac&spplus;, ampS, camR Phänotyp wechselt zu einem lac&supmin;, ampS, camS Phänotyp nach dem zweiten Rekombinationsereignis. Der entstehende Stamm wird GL400 genannt und ist bei 30ºC λR und bei 42ºC λS. Dieser Phänotyp zeigt das Vorkommen einer funktionsfähigen chromosomalen Kopie des cI&sup8;&sup5;&sup7; Allels.
GL400 wird durch PL Transduktion von einem Lysat lon&supmin; gemacht, das auf Stamm SG20252 (lacΔ u169, araΔ139, rpsL, lonΔ100::Tn10) angezogen wurde. Das TnlO wird durch Screening auf TetS auf Selektivmedien kuriert (S. Maloy, W. Nunn, J. Bacteriol. 145 (1981), 1110-1112).
Der schließliche Wirtsstamm wird GI413 genannt (lacI&sup0;L8, lacZ(ΔλcI, Rex, N), lonΔ 100).
pTALC-185R wird in GI413 transformiert. Eine Übernachtkultur dieses Stamms wird bei 30ºC in 5 ml Induktionsmedium angezogen, das 7 ug/ml Tetracyclin enthält. Das Induktionsmedium enthält pro Liter:
20 g Casaminosäuren
6 g Na&sub2;HPO&sub4; · 7 H&sub2;O
3 g KH&sub2;PO&sub4;
0,5 g NaCl
1 g NH&sub4;Cl
1% Glycerin
2 mg Vitamin B1
2 mg CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O
0,2 g MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O
Dieses Medium (25 ml), das 7 ug/ml Tetracyclin enthält, wird mit 125 ul der Übernachtkultur beimpft und bei 30ºC in einem Wasserbad geschüttelt, bis die Kultur eine Dichte von A&sub5;&sub5;&sub0; 0,5 erreicht. Sie wird dann schnell in ein 40ºC Wasserbad gestellt und für weitere 2 Stunden geschüttelt, um die Synthese von GM-CSF zu erlauben. Die Zellen werden geerntet und auf ihren Gehalt an CSF durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht. Unter diesen Bedingungen häuft sich GM-CSF bis zu etwa 5% des zellulären Proteins an.

Beispiel 6

Expression von GM-CSF in Saccharomyces cerevisiae

A. Vektorkonstruktion

Es wird ein Plasmid konstruiert, das das Gen für ein Enzym im Uracilbiosyntheseweg (ura3) als Selektionsgen und den 2 u Replikationsursprung enthält. Dieses Plasmid stammt von Y1p5 (Botstein et al., Gene 8, Seiten 17-24 (1979)) durch die Zugabe eines Fragments, das den Replikationsursprung des 2 u Plasmids der Hefe enthält.

B. Isolierung des Gens für Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (GPDH)

Zwei Gene für GPDH wurden aus der Hefe isoliert (Holland und Holland, Journal of Biological Chemistry, 255, Seiten 2596-2605 (1980)). Eine Oligonukleotidsonde, die gemäß der veröffentlichten Sequenz synthetsiert wurde, wird zur Isolierung des GPDH Gens aus einer Plasmidgenbank der genomischen Hefe DNA durch Standardverfahren verwendet. Ein Plasmid, das das gesamte GAP491 Gen enthält, wurde kürzlich hinterlegt (ATCC Nr. 39777).

C. Präparation des Glycerinaldehydphosphatdehydrogenasepromotors zur heterologen Genexpression

Es wird ein Plasmid konstruiert, das den natürlichen Abstand des GPDH Promotors vom Start des gewünschten heterologen Strukturgens erlaubt. Dies wird durch die Einführung einer KpnI Schnittstelle unmittelbar benachbart zum Startmethionincodon des GPDH Strukturgens erreicht. Die "Promotorkassette" wird dann in den Hefeexpressionsvektor YOp1 inseriert.

D. Isolierung des Gens für den α-Faktor

Es wurde ein Gen für das α-Faktorpaarungspheromon aus Hefe isoliert (Kurjan und Herskowitz, Cell, Band 30, Seiten 933-943 (1982)). Eine Oligonukleotidsonde, die aus dieser Sequenz synthetisiert wurde, wird zur Isolierung des Gens aus einer Plasmidgenbank der genomischen Hefe DNA durch Standardverfahren verwendet.

E. Herstellung des CSF Expressionsplasmids

Aus den oben beschriebenen Elementen und dem humanen CSF Gen wird ein Expressionsvektor (AJ14, Fig. 7) durch Standardverfahren konstruiert. In diesem Vektor wird die natürliche Signalsequenz von CSF entfernt und die für reifes CSF kodierende Sequenz wird benachbart der Präprosequenz des a-Faktors inseriert. Die Verbindungen zwischen dem GPDH-Promotor, der Präprosequenz des a-Faktors und der Sequenz des reifen CSF werden angegeben (unten) und wurden durch Didesoxynukleotidsequenzierung bestätigt. AAATAAA- CAAAATG.CGTTTTCCTTCA......AAA AGA GAG GCG GAA GCT. GCA CCC GCC CGC TCG

F. Expression von GM-CSF

Das Plasmid AJ14 wird in einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae transformiert. Die Zellen werden unter Bildung von CSF kultiviert.
Gemäß dem oben erwähnten werden die folgenden spezifischen Ausführungsformen der Erfindung unter anderem angegangen:
(a) Ein Verfahren zur Herstellung eines humanen koloniestimulierenden Faktorproteins (GM-CSF) gemäß der Erfindung, das gekennzeichnet ist durch die Insertion eines Gens, das für ein solches Protein kodiert, in einen geeigneten Vektor, Transformation dieses Vektors, der das Gen enthält, in Hefe, COS oder CHO oder prokaryontische Wirtszellen und Expression und Isolierung dieses CSF Proteins ist ein bevorzugtes Verfahren.
(b) Noch bevorzugter ist ein Verfahren gemäß (a), worin das GM-CSF Protein ein Protein ist, das in seiner Aminosäuresequenz der von natürlich vorkommenden GM-CSF entspricht, außer daß eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, ausgetauscht oder entfernt wurden, ohne die biologische Aktivität des natürlichen CSF wesentlich zu beeinflussen.

Claims

1. Rekombinantes humanes GM-CSF Protein mit der in Fig. 1 nach dem Pfeil für CSF-Thr oder CSF-Ile gezeigten Aminosäuresequenz, allelische Variationen hiervon oder solche Proteine, die in der Aminosäuresequenz einem natürlich vorkommenden humanen GM-CSF entsprechen, außer daß eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, ersetzt oder entfernt wurden, ohne die humane GM-CSF Aktivität im humanen Knochenmarktest wesentlich zu beeinflussen, das durch eine Expression in prokaryontischen Zellen oder Hefe-, COS oder CHO Zellen erhalten werden kann und eine spezifische Aktivität von mindestens 1 · 10&sup7; Einheiten pro mg im humanen Knochenmarktest aufweist.

2. Protein nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2 · 10&sup7; Einheiten pro mg in diesem Test.

3. Protein nach Anspruch 2 oder 3 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens etwa 4 · 10&sup7; Einheiten pro mg in diesem Test.

4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das durch rekombinante Expression in prokaryontischen Zellen erhalten werden kann.

5. Protein nach Anspruch 4, das durch eine rekombinante Expression in E. coli erhalten werden kann.

6. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das durch eine rekombinante Expression in COS oder CHO Zellen erhalten werden kann.

7. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das durch eine rekombinante Expression in Hefe erhalten werden kann.

8. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das humane GM-CSF Protein von der Mo Zellinie stammt.

9. Protein nach Anspruch 8, worin das humane GM-CSF Protein CSF-Thr ist, das die nach dem Pfeil in Fig. 1 für CSF-Thr gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt, oder eine Variation hiervon, worin eine, zwei, drei, vier oder fünf Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind, ohne die GM-CSF Aktivität im humanen Knochenmarktest wesentlich zu beeinflussen.

10. Protein nach Anspruch 8, das in der Aminosäuresequenz der von CSF-Thr entspricht, die nach dem Pfeil in Fig. 1 für CSF-Thr gezeigt ist.

11. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das humane GM-CSF Protein CSF-IIe ist, das die nach dem Pfeil in Fig. 1 für CSF-Ile gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt, oder eine Variation hiervon, worin eine, zwei, drei, vier oder fünf Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind, ohne die GM-CSF Aktivität im humanen Knochenmarktest wesentlich zu beeinflussen.

12. Protein nach Anspruch 11, das in der Aminosäuresequenz der von CSF-Ile entspricht, die nach dem Pfeil in Fig. 1 für CSF-Ile gezeigt ist.

13. Injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung, die ein GM-CSF Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem geeigneten pharmakologischen Träger enthält.