DE3323617A1 - Verfahren zum isomerisieren von glucose in fructose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zum Umwandeln von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose).

Die meiste Nahrungsmxttelglucose wird als enzymatisches Hydrolysat von Maisstärke zur Verfügung gestellt, d.h. als handelsüblicher Maissirup. Glucose hat im allgemeinen eine 60- bis 80%ige Süße im Vergleich zu Saccharose und wird deshalb mit einem entsprechend niedrigeren Preis gehandelt. Seit langem ist es bekannt, Glucose zu Fructose

10 (die noch süßer als Saccharose ist) zu isomerisieren

unter Verwendung eines Enzyms mit Glucoseisomeraseaktivität,· vorzugsweise eines solchen, das auf einem inerten Träger, wie Diethylaminoethylcellulose, porösem Glas oder Chitin, immobilisiert wurde. Genauere Beschreibungen über die enzymatische Umwandlung von Glucose und Fructose unter Verwendung von Glucoseisomerase findet man bei Hamilton, et al. "Glucose Isomerase: a Case Study of Enzyme-Catalyzed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et al., Plenum Press, New York, (1974), Seiten 94-106, 112, 115-137; Antrim, et al., "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering,

Band 2, Academic Press (1979); Chen, et al., "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem. (1980), Seiten bis 35; Chen, et al. "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), Seiten 36-41; and Takasaki,

05 "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem.

Abstracts, Band 81, (1974), Abs. Nr. 76474a. Darüber hinaus sind zahlreiche Patente über die Isomerisierung von Glucose bekannt. Typische US-Patentschriften sind: 3 616 221; Reissue 28 885 (ursprünglich 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127 und 4 308 349.

Das Niveau an Fructose, das durch Isomerisierung von Glucosesirup mit Glucoseisomerase erhältlich ist, ist durch das Gleichgewicht der Isomerierungsreaktion begrenzt, Geht man von einem Ausgangssubstrat aus reiner Dextrose aus, so liegt bei 65⁰C das Reaktionsgleichgewicht bei annähernd 51 Gew.-% Fructose. Wird eine raffinierte Dextroseflüssigkeit als Substrat verwendet (enthaltend bis zu 6 Gew.-% an Nicht-Monosacchariden) und läßt diese eine ausreichende Zeit in einem Enzymreaktor verweilen, dann erhält man einen annähernd 48 bis 52 %igen Fructosesirup als höchste Konzentration nach den vorerwähnten Verfahren des Standes der Technik. Um Sirupe mit höherem Fructosegehalt zu erzielen, muß man Fraktioniersysteme anwenden, durch welche die Kosten des Endproduktes erheblich erhöht werden. Bei höheren Temperaturen wird das Gleichgewicht günstiger. Ein Glucoseisomeraseverfahren, das bei einer Temperatur von etwa 90-140⁰C betrieben werden kann, könnte man verwenden, um direkt Maissirupe mit hohem Fructosegehalt von 53-60 Gew.-% zu erzielen, wobei man dann eine Fraktionierung und ein Kreislaufverfahren vermeiden würde. Die Neigung der bekannten Glucoseisomerasesysteme, in der Wärme abgebaut zu werden, wodurch eine scharfe Verminderung der Aktivität eintritt, hat die

Fachwelt bisher davon abgehalten, höhere Temperaturen anzuwenden, um das Gleichgewicht der Isomerisierung zu Gunsten der Fructose zu verschieben.

Darüber hinaus ist Fructose ein außerordentlich labiler Zucker, der leicht in einer Anzahl von unerwünschten Nebenprodukten abgebaut wird, wenn man ihre Lösungen auf hohe Temperaturen, wie sie zur Umwandlung von Glucose zu 53-60 % Fructose erforderlich sind, erhitzt. Psicose, Mannose, Tagatose, Fructosedianhydride, organische Säuren, gefärbte Produkte und Farbstoffvorlaufer sind die häufigsten Nebenprodukte, die man beim scharfen Erhitzen von Fructoselösungen erhält.

15 Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man bei

der Durchführung eines Glucoseisomerisationsverfahrens innerhalb bestimmter pH-Grenzen und Verweilzeiten in einem Enzymreaktor der nachfolgend beschriebenen Art und bei Isomerisationstemperaturen von etwa 90⁰C bis etwa 140⁰C wirksam und direkt HFCS-Sirupe hoher Qualität mit einer tolerierbaren Bildung von Nebenprodukten, mit einem Gehalt von etwa 50 bis etwa 60 Gew.-% Fructose erhalten kann und dadurch kostspielige und verfahrensmäßig komplizierte Fraktionierungen und Kreislaufverfahren vermeiden kann, die bei den bekannten Glucoseisomerisationsverfahren erforderlich sind, um HFCS-Sirupe mit dem vorerwähnten Bereich der Fructosekonzentration zu erhalten.

Erfindungsgemäß wird Glucose zu Fructose-Glucose-Sirupen isomerisiert, indem man eine glucosehaltige Flüssigkeit mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwischen etwa 90 und etwa 140⁰C bei einem pH von etwa 3 bis etwa 8 eine ausreichende Zeit in Berührung bringt bis eine Endkonzentration von wenigstens 53 bis etwa 60 Gew.-% an Fructose, bezogen auf den gesamten Kohlehydratgehalt in Flüssigkeit, erhalten wurde und wobei keine wesentliche

Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zuckern eintritt.

Das vorerwähnte Verfahren ist nicht von der Verwendung einer bestimmten Glucoseisomerase abhängig, sondern kann mit einer Glucoseisomerase durchgeführt werden, die eine ausreichende Stabilität aufweist und bei 90⁰C und höher nicht inaktiviert wird und einen ausreichenden Isomerisationsgrad, wie er anschließend noch definiert wird, ergibt. Eingeschlossen in die Erfindung ist jedoch die Verwendung einer besonders wegen ihrer WärmeStabilität ausgezeichneten Glucoseisomerase, z.B..Glucoseisomerase, die vom Bacillus stearothermophilus gebildet wird (US-PS 3 826 714) und Glucoseisomerase, die von dem Mikroorganismus des Genus Ampullariella gebildet wird (US-PS 4 308 349) . Weiterhin kann man thermisch stabile Glucoseisomerase gewinnen unter Verwendung von Bacillus licheniformis gemäß europäischer Patentanmeldung 41 213 sowie auch unter Verwendung von Thermophilen der Genera

20 Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora

und Pseudonocardia gemäß japanischer Patentveröffentlichung 74 30588 (CA. 8jU 76474a) . Alle diese Druckschriften werden hiermit in die Offenbarung einbezogen.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung in Fructose isomerisierte Glucose kann aus allen bekannten Quellen für diesen Zucker stammen. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen stammt die Glucose im allgemeinen aus den Hydrolysaten von Cellulose oder Stärke unter Verwendung von Säuren und/oder Enzymen, vorzugsweise letzteren, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren. Auf diese Weise erhaltene glucosehaltige Flüssigkeiten enthalten typischerweise kleinere Mengen an Polysacchariden, Zuckeroligomeren etc., in Abhängigkeit von der angewendeten Kohlehydratquelle und der angewendeten Hydrolysemethode. Getreidekörner, wie

Mais, MiIo, Weizen, Roggen und dgl. und stärkehaltige Quellen, wie Kartoffein,Süßkartoffein, Karotten, Tapioka und dgl. sind ausgezeichnete Quellen für Stärke, die in das Glucoseausgangsmaterial gemäß der Erfindung umgewandelt wird. In den USA wird Maisstärke wegen seiner vergleichsweise niedrigen Kosten und leichten Verfügbarkeit besonders bevorzugt. Da man bei der Herstellung von Nahrungsmittelglucose die Verwendung von enzymatischen Stärkehydrolyseverfahren anwendet, werden solche Verfahren hier bevorzugt. Enzymatische Hydrolyseverfahren werden in den US-Patentschriften 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 und 4 284 722 beschrieben, die hiermit in die Offenbarung eingeschlossen werden.

Da die erfindungsgemäß gebildete Fructose aus Glucose stammt, ist es vorteilhaft, den Glucosegehalt in jedem Stärkehydrolysat, das zum Isomerisieren verwendet wird, zu maximalisieren. Enzymatische Verfahren zur Herstellung der Glucose werden bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt wird eine Kombination von Enzymen, wie Glucoamylase und einem entzweigenden Enzym, wie es in der UK-Patentanmeldung, GB 2 097 405A, beschrieben wird. Enzymkombinationen, die in der Lage sind, gleichzeitig verflüssigte Stärke in Glucose plus Fructose umzuwandeln, werden besonders

25 bevorzugt, z.B. eine Kombination von Glucoamylase,

Pullulanase und Glucoseisomerase gemäß US-PS 4 111 750. Nach dem letzteren Verfahren kann man isomerisierte Hydrolysate erhalten, die 48 % Fructose und 50 % Glucose, auf Trockenbasis bezogen, enthalten und die ideal für die weitere Umwandlung in 53-60 %ige Fructose gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Man kann auch Membranverfahren verwenden, um Polysaccharide aus den Stärkehydrolysaten zu entfernen, wobei man Fraktionen gewinnt, die. mehr als 99% Glucose enthalten und die ideale Aus-

gangsmaterialien für das erfindungsgemäße Verfahren darstellen. Selbstverständlich sind Glucoselösungen, die man durch Kristallisation von Stärkehydrolysaten gewinnt, als geeignete Rohmaterialien für die Durchführung der Erfindung eingeschlossen.

Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Glucose- und/oder Glucose/Fructose-Lösungen werden vorzugsweise in irgendeinem Herstellungsstadium raffiniert, um nachteilige Wirkungen von Nicht-Kohlehydrat-Verunreinigungen auf die Glucoseisomerase zu vermeiden und um eine Farbbildung während der erfindungsgemäßen Hochtemperaturisomerisierung zu minimieren. Nicht-raffinierte Stärkehydrolysate sind geeignet, wobei jedoch die Herstellungsprinzipien

15 gemäß US-PS 4 376 824 eingehalten werden sollen.

Da man nur Glucose-haltige Lösungen als Substrat für die vorliegende Erfindung verwendet, ist es auch möglich, Glucoselösungen zu verwenden, bei denen ein Teil der Glucose bereits zu Fructose isomerisiert ist. Beispielsweise kann man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Lösung aus isomerisierter Glucose, enthaltend bis zu 52 % Fructose, behandeln, um dadurch die Konzentration an Fructose auf ein höheres erwünschtes Niveau oberhalb 52 % und vorzugsweise auf Niveaus von 55-56 % oder darüber, zu erhöhen.

Glucoselösungen, die Fructose in einer Menge von weniger als- 50 'Gew.-%, bezogen auf das Kohlehydrat enthalten, können nach bekannten Verfahren erhalten werden.

Um eine zu starke Farbbildung während der Hochtemperaturisomer is ierung zu vermeiden, kann man Bisulfit-bildende Substanzen der Glucose/Fructose-Lösung zugeben in Überein-Stimmung mit der Lehre von US-PS 3 623 953 (Reissue 28 885)

Vorzugsweise wird Sauerstoff von allen Lösungen, die in Kontakt mit Glucoseisomerase während der Hochtemperatürisomerisationsreaktxon kommen, ausgeschlossen, um jegliche Oxidation des Enzyms, durch welche eine Inaktivierung erfolgen würde, zu minimieren.

Die hier verwendete Glucoseisomerase kann aus allen bekannten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen isoliert werden, einschließlich Streptomyces, flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxydans, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogehus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hydrophilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, and Paracolobactrum aeroqenoides. Streptomyces sp. ATCC 21,175 ist eine ausgezeichnete Quelle für Glucoseisomerase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann. Wie schon festgestellt, kann man vorteilhaft Glucoseisomerase verwenden, die bei den hier angewandten verhältnismäßig hohen Isomerisierungstemperaturen stabil ist, z.B. Glucoseisomerase, die von Bacillus stearothermophilus, gebildet wird, und insbesondere von Stämmen ausgewählt aus Bacillus stearothermophilus ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 und NRRL B-3682 gemäß US-PS 3 826 714; Glucoseisomerase, die von Mikroorganismen vom Genus Ampullariella gebildet werden, wie Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata und Ampullariella regularis

35 (US-PS 4 308 349) ; Glucoseisomerase, die von Bacillus

licheniformis (europäische Patentanmeldung 41213) gebildet wird sowie Glucosexsomerase, die von Thermophilen der in der japanischen Patentveröffentlichung 74 30588 beschriebenen Genera gebildet wird.

Außer den vorerwähnten Mikroorganismen schließt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Mutanten und Varianten davon sowie von genetisch umgewandelten Mikroorganismen , die durch Einführung von mutierten Glucoseisomerase dienen, in andere Mikroorganismen, einschließlich mesophilen und thermophilen Mikroorganismen, abgeleitet werden, ein. Die mutierten Glucoseisomerasegene, die für einen solchen Zweck ausgewählt werden, sind solche, die Glucosexsomerase ergeben, die bei höheren Temperaturen, insbesondere oberhalb 90⁰C und vorzugsweise bis zu etwa 140⁰C stabil ist. Solche Gene können durch übliche Verfahren, wie sie zum Mutieren von Mikroorganismen verwendet werden, z.B. durch Bestrahlen oder Chemischherstellen. Alternativ kann man isolierte Glucoseisomerasegene, die eine Glucosexsomerase mit einer ausreichenden Wärmestabilität ergeben, und wie sie beispielsweise durch gewisse Streptomyces-Stämme gebildet werden, in vitro mutieren. Die Auswahl von geeigneten mutierten Genen ist begleitet von dem Wiedereinführen des mutierten Gens _y in entweder dem Eltern- oder einem anderen Organismus und anschließendem Wachstum und Vervielfältigen des Organismus und Prüfen der Wärmestabilität der gebildeten Glucosexsomerase.

Man kann gleichfalls rekombinierte DNA-Verfahren anwenden, um Glucosexsomerase mit einer für die vorliegende Erfindung geeigneten verbesserten WärmeStabilität zu erhalten. Argos et al„ (Biochemistry 18(25):5698-5703

(1979)) hat festgestellt, daß gewisse Substitutionen von 35

Alanyl für Glycyl, Seryl, Valyl und Lysyl in Enzymen von mesophilen Organismen in den entsprechenden Enzymen aus thermophilen Organismen gefunden werden. Perutz (Science, ^01_, 1187-91 (1978)) stellt fest, daß die

05 Enzyme von thermophilen Bakterien ihre Extrastabilität

hauptsächlich durch zusätzliche Salzbrücken an der Proteinoberfläche erlangen. Zuber gibt in "Biochemistry of Thermophily", Freidman, S.M., ed., Seiten 267-285, Academic Press, N.Y., 1978) weitere Informationen über den Aufbau thermostabiler Enzyme. Sind die Aminosäuresequenz und die dreidimensionale (tertiäre) Struktur einer Glucoseisomerase bekannt, dann ist es möglich, in den Isomerasegenen eine verbesserte Stabilität durch seitenspezifische Mutationen zu entwickeln unter Ausbildung von Enzymen, die erhöhte Mengen an solchen Aminosäuren enthalten und dadurch stabilere Strukturen aufweisen. Nachdem man die DNA-Sequenz der Glucoseisomerase bestimmt hat, kann ein Gensynthesizer verwendet werden, um eine neue Sequenz zu erzeugen und durch solche künstlich gemachten Gene wird die Wärmestabilität von derart erzeugter Glucoseisomerase erhöht. Man kann erwarten, daß solche manipulierten Enzyme für die Praxis der vorliegenden Erfindung besonders brauchbar sind.

Da Glucoseisomerase typischerweise intrazellulär von diesen und anderen Mikroorganismen gebildet wird, kann man eine Quelle für Glucoseisomerase durch einfaches Ernten dieser Zellen gewinnen. Die Glucoseisomerase kann von-den' Zellen in bekannter^Weise abgetrennt werden, z.B.

durch Beschallung unter Verwendung eines Enzymreaktors bekannter Bauart. Vorzugsweise wird die hier verwendete Glucoseisomerase, unabhängig von ihrer Quelle, auf einem inerten Substrat in üblicher und bekannter Weise immobilisiert. Verfahren und Material, die zum Immobilisieren von Enzymen verwendet werden können, sind bekannt und werden in zahlreichen Publikationen beschrie-

ben einschließlich Wang et al., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1979), Seiten 318-338 und Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York (1980), Band 9, Seiten 148-172, die in die Offenbarung der Erfindung einbezogen werden. Die Gegenwart von geringen Mengen an Kobaltkation und/oder einem wasserlöslichen Salz von schwefeliger Säure, wie Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Magnesiumsulfit und/oder Magnesiumbisulfit gemäß US-Reissue-Patent Nr. 28 885, um die Denaturierung der Glucoseisomerase während des Verfahrens zu vermindern, kann ebenfalls vorgesehen werden.

Es ist wünschenswert, daß die Konzentration an Kohlehydrat in der glucosehaltigen Flüssigkeit im Bereich von etwa 20 bis etwa 85 und vorzugsweise 40 bis etwa 65 Gew.-%, liegt.

Es ist auch erforderlich, daß man die Isomerisierung bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8 und vorzugsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 7 und insbesondere zwischen 5 und 6,5 durchführt. Nimmt man die Isomerisierung erheblich unterhalb oder oberhalb des vorerwähnten pH-Bereiches vor, dann bilden sich sehr große Mengen an unerwünschten Nebenprodukten, wie Psicose, organischen Säuren, gefärbten Produkten, Farbvorläufern, Fructosedianhydriden und dergleichen.

Es-wurde festgestellt, daß der pH für eine optimale Aktivitat der Glucoseisomerase merklich bei hohen Temperaturen abnimmt. Für Glucoseisomerase aus Streptomyces rubingenosus liegt das Aktivitätsoptimum bei pH 8,6-9,2 bei 25⁰C, bei pH 6,9-7,5 bei 75°C und bei pH 5,6-6,2 bei 125⁰C. Wenn, also die Isonarisationstemperatur ansteigt, kann man den pH der Isomerisierung erniedrigen, um eine maxi-

male Enzymaktivität aufrechtzuerhalten und um die Bildung von Nebenprodukten zu vermeiden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Kontaktzeit vorzugsweise auf die Zeit beschränkt, die erforderlich ist, um eine Endkonzentration von wenigstens etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% an Fructose, bezogen auf die gesamten Kohlehydrate in der Reaktionsmischung zu erhalten. Da die glucosehaltige Flüssigkeit im wesentlichen nur Glucose enthalten kann, d.h. wenig oder gar keine Fructose, oder Glucose zusammen mit Fructosemengen von bis zu etwa 52 % enthalten kann, hängt die Reaktionszeit von der Art der verwendeten Flüssigkeit ab. Kontaktzeiten von nur 1 s bis zu mehreren Stunden können wirksam sein, wobei bevorzugte Zeiten im Bereich von etwa 2 bis etwa 30 min liegen.

Die bevorzugte Kontaktzeit zwischen der Glucoseisomerase und der glucosehaltigen Flüssigkeit hängt zu einem großen Teil von dem pH ab, bei dem Isomerisierungsreaktion durchgeführt wird. Am unteren Ende des pH-Bereiches kann man längere Kontaktzeiten tolerieren, ohne daß ein zu großer Glucose- und Fructoseabbau durch Bildung von Psicose und anderen unerwünschten Abbauprodukten eintritt. Am oberen Ende des Bereiches sind kürzere Kontaktzeiten erforderlich, um die Bildung von Psicose und von Farbstoffen zu vermeiden. In der Praxis wird die Gesamtzeit, bei welcher sich der glucosehaltige Sirup bei oder in" der Nähe der Endreaktionstemperatur befindet, als die wirksame Kontaktzeit angesehen, weil die auftretenden Zuckerabbaureaktionen nicht enzymatisch sind und ablaufen unabhängig davon, ob die Flüssigkeit in Berührung mit der Glucoseisomerase ist. Deshalb ist es beim Durchführen von Isomerisierungen oberhalb 90⁰C wichtig, die Zeit, die erforderlich ist, um die Glucoseflüssigkeit auf die gewünschte Isomerisierungstemperatur zu bringen (z.B.

indem man die Flüssigkeit unmittelbar vor oder während des Kontaktes mit Isomerase mit Wasserdampf vermischt) zu minimalisieren und sobald man das gewünschte Fructoseniveau erreicht hat, soll man die Flüssigkeit schnell von der aktiven Isomerase abtrennen und so schnell wie möglich auch unter 90⁰C, vorzugsweise auf weniger als 70⁰C, abkühlen. Wenn eine lösliche Form der Glucoseisomerase verwendet wird, dann ist es erforderlich, diese zu inaktivieren (z.B. indem man den pH auf einen Bereich vermindert, bei welchem die Isomerase inaktiviert wird) bevor man abkühlt, um eine Wiederumwandlung der während der Hochtemperaturisomerisierungsstufe gebildeten Fructose in Glucose zu vermeiden, weil die Isomerisierungsreaktion selbstverständlich reversibel ver-

1 5 läuft.

Der erzielbare maximale Umwandlungsgrad von Glucose in Fructose wird durch das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Glucose und Fructose bestimmt, welches wiederum von der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt wird, abhängig ist. Sehr sorgfältige Untersuchungen über Gleichgewichtsmischungen von Glucose und Fructose haben folgende Beziehung ergeben:

25 F= 100 K/(K+1) (1)

InK = - — + 2.3005

T+273 ' (2)

worin F der Prozentsatz an Fructose beim Gleichgewicht, bezogen auf Gesamtgewicht von Gluc-ose und Fructose, T die Temperatur (⁰C), bei welcher die Isomerisierung durchgeführt wird und K die Glucose-Fructose-Gleichgewichtskonstante darstellen.

Die tatsächliche Kontaktzeit zwischen dem glucosehaltigen Sirup und der Isomerase in dem Reaktor kann unter Bezug auf die nachfolgende Gleichung errechnet werden, wenn man einen Reaktor, der Isomerase in immobilisierter Form enthält, verwendet,

(3)

Darin bedeuten: 15 t = die tatsächliche Kontaktzeit C = Konzentration an Glucose und Fructose

V = das freie Flüssigkeitsvolumen in dem gepackten Bett (Bettvolumen minus dem von den immobilisierten Enzymteilchen eingenommenen Volumen) F = Fructosefraktion in der Glucose/Fructosemischung beim Gleichgewicht bei der Isomerisierungstemperatur

F = Fraktion von Fructose (bezogen auf G + F) am Eingang des gepackten Bettes

F = Fraktion an Fructose (bezogen auf G + F) in der aus dem gepackten Bett austretenden Lösung

k = Reaktionkonstante für die Isomerisierung unter Isomer is ierungsbedingungen

A = Isomeraseaktivität in dem gepackten Bett.

Werte für k für die in den Beispielen hergestellte immobilisierte Isomerase liegen im Bereich von etwa 0,07 bis etwa 5 gh" IGIü" bei Temperaturen von 90⁰C bzw. 140⁰C. Diese Beziehung zeigt die Notwendigkeit, die Kontaktzeit bei hohen Temperaturen bei Verwendung von gepackten Betten mit hoher Aktivität pro Volumeneinheit zu minimieren. Die nach den in den folgenden Beispielen beschriebenen

Verfahren hergestellten gepackten Betten können bis zu 2000 IGIU/ml erhalten, wodurch man in weniger als 1 min in einem Hochtemperaturreaktor einen Gleichgewichts-Fructosegehalt von 99,5 % erzielt, wenn man Stufenreaktoren, die bei unterschiedlichen Temperaturen betrieben werden, verwendet und die Zufuhr zu einem ersten Reaktor bei einer niedrigen Temperatur isomerisiert wird, bevor man in einem zweiten Reaktor bei einer höheren Temperatur isomerisiert. Wendet man ein Stufenreaktorsystem an, dann ist es vorteilhaft, ein Verfahren zum enzymatischen Umwandeln von Glucose in Fructose anzuwenden, bei man eine glucosehaltige Flüssigkeit, enthaltend etwa 20 bis etwa 85 Gew.-% Kohlehydrate, mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von etwa 20⁰C bis etwa 80⁰C und einem pH von etwa 6,0 bis 9,0 bei einer Kontaktzeit von etwa 0,5 bis etwa 2 h in Berührung bringt, um etwa 52 Gew.-% der Fructose, bezogen auf den gesamten, in der Flüssigkeit enthaltenen Kohlehydratgehalt zu erzielen, worauf man dann die Temperatur in dem Isomerisierungsmedium auf etwa 90⁰C bis etwa 14O⁰C erhöht und den pH im Isomerisierungsmedium auf einen Bereich von etwa 3 bis etwa 8, je nachdem, wie es erforderlich ist, einstellt und dann die fructosehaltige Flüssigkeit mit der Glucoseisomerase eine weitere Zeit zwischen etwa 1 s bis etwa 5 h in Berührung bringt, um dadurch das Umwandlungsniveau auf etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% der in der ursprünglichen glucosehaltigen Lösung enthaltenen Glucose zu bringen, wobei sich dann im wesentlichen keine Psicose oder andere Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zucker bilden. Die Verwendung von hochaktiven gepackten Betten kann somit zu sehr niedrigen wirksamen Kontaktzeiten führen, wodurch wiederum ein Abbau der Fructose, der bei den erfindungsgemäß erforderlichen hohen Temperaturen eintritt, minimiert werden kann.

Bei der Auswahl der Inimobilisierungstechnik, für die Glucoseisomerase werden Methoden bevorzugt, die in der Lage sind, kleine im wesentlichen nicht-komprimierbare poröse Katalysatorteilchen zu ergeben, so daß eine Limitierung der Isomerisierungsrate durch Diffusionseffekte minimiert wird. Alternativ kann man die Isomerase in den Poren einer Membran immobilisieren, durch welche die Glucoselösung während der Hochtemperaturisomerisierung hindurchgezwängt wird, so daß ein guter Kontakt zwischen dem Enzym und dem Substrat vorliegt und Diffusionseinschränkungen minimiert werden. Der zum Immobilisieren verwendete Träger ist vorzugsweise vollkommen unlöslich und inert, um eine unzulässige Verunreinigung oder einen Abbau der Glucose/Fructosekomponenten in den Substratlö-

15 sungen zu vermeiden.

In der Praxis werden jedoch fructosehaltige Sirupe nicht aus reiner Glucose hergestellt. Vielmehr verwendet man Stärkehydrolysate, die nach den vorerwähnten Druckschriften hergestellt werden, als Glucoseguelle und diese enthalten immer'Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Saccharide (nachfolgend als Polysaccharide bezeichnet), die sich von einer unvollständigen Stärkehydrolyse- ableiten und die Umwandlungsprodukte von Glucose. Typischerweise macheri diese 3 bis 8 % des Gesamttrockengewichts von den durch die Stärkehydrolyse erhaltenen Sacchariden aus. Deshalb ist es erforderlich, unter Berücksichtigung der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt werden soll, daß alle in der Glucoseflüssigkeit enthaltenen Polysaccharide sowie auch die anderen Faktoren, wie der Gesamtfructosegehalt auf Trockenbasis, die Bildung von Psicose und von anderen Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Produkten während der effektiven Kontaktzeit der Glucoseflüssigkeit und der Isomerase berücksichtigt werden. Die Beziehungen zur Berechnung der Isomerisationstemperatur werden nachfolgend gezeigt:

_{T =}

-20-

255₂₇₃ (4)

2

2.3005-InK

100-F

10,000 (M+C) (6)

^F " Q(IOO-P)

T = Isomerisierungstemperatur (⁰C)

F = Gleichgewichtsfructosegehalt (%, bezogen auf Gesamt-

glucose + Fructose) bei der Temperatur T M = % Fructosetrockengehalt, erforderlich in dem isomerisierten Produkt

C = Psicose und andere Abbauprodukte, die sich während

der effektiven Isomerisierungskontaktzeit bilden Q = % des Gleichgewichts, das sich während der Isomeri-

sierungsreaktion einstellt
15 P = % Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.

Typischerweise bilden sich weniger als 1 % und vorzugswei se weniger als 0,5 % Psicose und andere Abbauprodukte und man kann ein 99,5 %iges Gleichgewicht erzielen. Um deshalb Sirupe mit 55,5 % Fructose (Trockengehalt) herzustellen, benötigt man die nachfolgenden Isomerisierungstemperaturen für Glucoseflüssigkeiten-mit den angegebenen Polysaccharidgehalten.

Polysaccharid in	Isomerisierungs-	95,7
der Glucoseflüssig-	temperatur	99.1
keit		104,3
(% Trockenbasis)	(0C)	113*. 8
0	124,3
1	136,1
2 3
4
6
8

Für den Handel geeignete Produkte enthalten durchschnittlich 55,5 % Fructose auf Trockenbasis. Dies beruht darauf,

daß bei einem solchen Fructosegehalt ein Maissirup mit hohen Fructosegehalt (HFCS) die gleiche Süße entwickelt, wie Saccharose, jeweils auf das gleiche Trockengewicht bezogen. Weiterhin ist ein HFCS mit 55,5 % Fructosegehalt ein im Handel eingeführter Artikel, den man ganz oder zum Teil als Ersatz für Saccharose in zahlreichen Nahrungsmitteln und insbesondere in kohlensäurehaltigen Säften und Getränken verwendet. Der Verbrauch von HFCS in den USA beträgt erwartungsgemäß 1,31*10 kg (2,9 billion pounds)

10 in 1982 und wächst 1983 auf 1,8-1O⁶ kg (4,0 billion

pounds). Aufgrund der Schwierigkeiten, die beim Liefern, Lagern, Abmessen und Formulieren von HFCS in Nahrungsmitteln auftreten, besteht ein großer Bedarf an gleichmäßigen Produkten, unabhängig von den HFCS-Herstellern, so daß man Produkte aus unterschiedlichen Quellen austauschbar und gleichzeitig verwenden kann. Deshalb haben Fructoseniveaus von 55 - 56 % auf Trockengewichtbasis eine besondere Bedeutung bei den HFCS-Herstellern erlangt.

20 Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt Fructoseniveaus von wenigstens 53 % und vorzugsweise wenigstens 54 % und insbesondere wenigstens 55 %.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte zeichnen sich durch eine annehmbare Farbe aus, die selbstverständlich besonders erwünscht ist, weil man die Kosten für eine Reinigung minimieren kann. Im allgemeinen beträgt der Anstieg in der Färbung weniger als etwa 55 (CIRFX100), vorzugsweise weniger als 20 und ganz besonders bevorzugt weniger als 10. 30

Unter Berücksichtigung der vorerwähnten Erfordernisse des pH-Wertes und der Kontaktzeit kann man bekannte Glucoseisomerisierungsverfahren in geeigneter Weise so anpassen, daß sie bei etwa 90⁰C bis etwa 140⁰C und vorzugsweise bei etwa 100⁰C bis etwa 110⁰C betrieben werden unter Erhalt der erfindungsgemäßen Hoch-Glucose-Fructose-Sirupe.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung. Beispiel 1

In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung von Glucose bei hohen Temperaturen unter Erhalt einer Zusammensetzung, die 55,5 % Fructose auf Trockenbasis enthält, und wobei ein zweistufiges Isomerisierungssystem angewendet wird, beschrieben.

Lösliche Glucoseisomerase wurde nach dem in US-PS 3 788 945 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Eine Spezies von Streptomyces rubigenosus, erhalten von 15 S. rubigenosus ATCC 21175 wurde in einer aeroben Tauchfermentation auf dnem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

	Gew.-%
Dextrose	9,0
Maismeische	1,6
Diammoniumphosphat	0,08
Mangansulfat	0,06
Antischaummittel
(Pluronic PL-61)	0,003

Das Medium wurde 45 min bei 121⁰C sterilisiert, abgekühlt und auf den pH 6,8-7,0 eingestellt. Dann wurde es mit 14 % (V/V) eines Inokulums aus dem Gehalt eines Impfgutfermenters, hergestellt mit der S. Rubigenosus-Variante

30 der oben erwähnten Art, inokuliert. Die Fermentierung wurde unter aseptischen Bedingungen bei 30⁰C während etwa 60 h unter Belüftung mit 0,65 vvm. durchgeführt. S. rubigenosus ATCC ^1175 kann auch zum Inokulieren und zur Herstellung von Isomerase verwendet werden, wobei in

35 diesem Fall ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet wird.

	Gew.-%
Dextrose	0,24
Maismeische (Feststoffe)	1,5
Sorbit	1,6
CoCl2	0,02
Diammoniumphosphat	0,56
Xylose	1/0
seisomerase wurde aus dem S.	rubigenosus

durch Zugabe von 0,35 % Maquat MC 1412 (Mason Chemical Co.) und 10 ppm Hühnereilysozym und 5-stündigem Schütteln bei 4O⁰C und einem pH von 6,3-6,6. Das Gemisch wurde dann filtriert, wobei man eine Lösung von roher, ungereinigter Glucoseisomerase erhielt.

Die rohe Isomerase wurde dann Absorption auf DEAE-Cellulose (hergestellt gemäß ÜS-PS 3 823 133) gereinigt, filtriert und das adsorbierte Produkt wurde mit 0,1 M NaCl-Lösung gewaschen unter Entfernung der Verunreinigungen und dann durch Kontaktieren, mit 0,45 M NaCl-Lösung desorbiert. Während der Reinigungsstufen wurde der pH-Wert aller Lösungen auf 7,5 gehalten. Die Lösung der partiell gereinigten Isomerase wurde mit 3 Volumina 95%igem "Ethanol bei 0⁰C zum Ausfällen der Isomerase vermischt. Perlite-Filterhilfe wurde zugegeben und der gewonnene Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen und an der Luft getrocknet, wobei man eine lösliche Isomerasezubereitung erhielt, die 2500 IGIU/g enthielt. Die spezifische Aktivität der Isomerasezubereitung betrug 40 IGIU/mg Protein.

Ein Niedrigtemperatur (7O⁰C)-Isomerasereaktor wurde hergestellt, indem man immobilisierte Isomerase, hergestellt gemäß US-PS 3 788 945, in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 2,54 cm unter Ausbildung eines Bettes von 5 cm Höhe mit einem Gehalt von 20.000 IGIU Aktivität füllte.

Der Kopfraum über dem gepackten Bett enthielt ein Thermometer und Glasperlen, um das tote Volumen so klein wie möglich zu halten. Die Säule war ausgerüstet mit einem Einlaß und einem Auslaß und war zum Zirkulieren von Wasser aus einem Thermostaten ummantelt.

Ein Hochtemperatur (93⁰C)-Reaktor wurde in gleicher Weise hergestellt unter Verwendung einer immobilisierten Isomerase, die erhalten worden war durch Adsorption der gereinigten oben beschriebenen Isomerase auf DEAE-Cellulose. Das gepackte Bett enthielt 97.000 IGIU und hatte eine Höhe von 15 cm.

Die Aktivität der löslichen Isomerasezubereitung wurde bestimmt nach der Methode von Lloyd et al. in Cereal Chemistry, 49, Nr.5, Seiten 544-553 (1972). Ein IGIU ist die Menge an Isomerase, die pro min 1 μΜοΙ Glucose in Fructose umwandelt, und'zwar in einer Lösung, enthaltend 2 Mol Glucose pro 1, 0,02 Mol MgSO₄ pro 1 und 0,001 Mol CoCl₂ pro 1 bei einem pH-Wert von 6,85 (0,2 M Natriummaleat) und einer Temperatur von 6O⁰C, wobei die oben erwähnte Methode zur Bestimmung verwendet wird.

Eine glucosehaltige Lösung wurde hergestellt, indem man kristalline Glucose (Glintose Α-Granulation, Clinton Corn Processing Co.) in demineralisertem Wasser unter Erhalt einer 48 gew.-%igen (Trockensubstanz) Lösung. Aktivator-und Stabilisator-Substanzen wurden in der Glucoselösung gelöst unter Erhalt von 25 mM Natriummetabisulfit, 5 mM Magnesiumsulfat und 0,1 mM Kobaltchlorid. Die Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf pH 6,8 eingestellt.

Zunächst wurde eine Niedrigtemperaturisomerisierung durchgeführt, indem mc*; bei 70⁰C die obige Glucoselösung durch den Niedrigtemperaturreaktor mit 3,7 ml/min pumpte. Die ersten 2500 ml der den Reaktor verlassenden Lösung wurden verworfen und die anschließend aus dem Reaktor heraustre-

C \J \J I /

tende Lösung wurde zur Verwendung in der zweiten Hochtemperatur isomerisierung gesammelt. Bei der Hochtemperaturisomerisierung wurde die bei der Isomerisierung bei 70⁰C erhaltene Lösung durch den Hochtemperaturreaktor, der in der obigen Weise hergestellt worden war, mit 5 ml/min gepumpt, wobei die Reaktortemperatur bei 93⁰C gehalten wurde. Die Kontaktzeit der Lösung in dem Hochtemperaturreaktor mit dem immobilisierten Enzym betrug etwa 12 min. Die Gesamtzeit/ während welcher die Lösung bei 93⁰C im Reaktor war, betrug etwa 18 min. Die Lösung wurde unmittelbar, nachdem sie aus dem Hochtemperaturreaktor heraustrat, in einem Eis·: bad gekühlt und der pH wurde auf 4,0 eingestellt. Die aus dem Hochtemperaturreaktor während der ersten Stünde heraustretenden Abflüsse wurden verworfen.

Die aus dem 70°C-Reaktor und 93°C-Reaktor erhaltenen isomerisierten Glucoselösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe analysiert und die Ergebnisse werden mit gleichen Analysen, die mit der unisomerisierten Glucoselösung erhalten wurden, in der Tabelle 1 verglichen.

Tabelle 1

Zusammensetzung von bei 70⁰C und bei 93°C isomerisierten Glucoselosungen

Lösungsbehandlung

unisomerisiert

bei 70⁰C isomerisiert

bei 93°C isomerisiert

Kohlehydratzusammensetzung (Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis) Fructose Glucose Psicose Polysaccharid

0	,3	99	,6
52	,5	47	,3
55	43	,7

0,1

0,4

0,4 0,4 0,4

Farbe (CIRFX100)

0,6
2,1
4,8

to

OOZOD I /

Die Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,5 %ige Fructose erhält, wobei der Gehalt an Psicose unterhalb 0,5 Gew.-% (Trockenbasis) lag. Die Erhöhung der Farbe betrug weniger als 5 (CIRF X 100).

Der Kohlehydratgehalt wurde nach der Methode E-61 und die Farbe nach der Methode F-14 der Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Corn Refiners Association, Inc.? 1001 Connecticut Avenue, Washington, D.C, 20036, bestimmt. Die nach der Methode F-14 erhaltene Farbzahl wurde mit 100 multipliziert und als (CIRF X 100) aufgezeichnet.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die Herstellung eines Fructoseenthaltenen Produktes mit 55,2 %iger Fructose, erhalten aus einer Glucose-enthaltenden Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem Maisstärkehydrolysat bestand, be-

20 schrieben.

Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach dem in US-PS 3 644 126 (Verflüssigung) und US-PS 3 280 006 (Saccharifizierung) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 3 834 gereinigt, wobei man ein Produkt erhielt, das 95,3 % Glucose' (Trockenbasis) bei 50 % Gesamttrockensubstanz enthielt. Es wurde ausreichend kristalline Glucose zugegeben, um den Gesamtglucosegehalt auf 97,1 % (Trok-

30 kenbasis) zu bringen. Daraus wurde eine Lösung folgender Zusammensetzung hergestellt:

Gesamttrockensubstanz (%) 42,4

Glucose (% Trockenbasis) 97,1

Fructose (% Trockenbasis) 0,1

Polysaccharid (% Trockenbasis) 2,8 05 Psicose (% Trockenbasis) 0,0

NaHSO₃ (mM) 50,0

MgSO₄ (mM) 5,0

CoCl₂ (mM) 0,1

pH 6,8

Gemäß Beispiel 1 wurde ein Hochtemperaturreaktor hergestellt, der 147.500 IGIU in einem Bett von 16,5 cm Höhe enthielt. Die Temperatur wurde auf 97,4⁰C eingestellt. Die obige Lösung wurde durch das gepackte Bett mit 2,2 ml/min gepumpt. Die ersten 50 ml des Ausflusses aus dem Reaktor wurden verworfen und der anschließend aus der Säule heraustretende Abfluß wurde zur Analyse gesammelt. Die Ergebnisse wurden im Vergleich zur Zusammensetzung der unisomerisierten Glucoselösung aufgezeichnet.

Tabelle 2

Zusammensetzung von Glucoselosungen, isomerisiert bei

97,4°C

Kohlehydratzusammensetzung Farbe

(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis (CIRF

X100)

Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid ι

unisomerisiert 0,1 97,1 0 2,8 0,6 ■

isomerisiert bei 97,4°C 55,2 42,4 0,2 2,2 12,4

Die Ergebnisse zeigen, daß mehr als 55 % Fructose erhalten wurden unter Bildung von nur 0,2 % Psicose. Die in diesem Beispiel erhaltene höhere Farbzahl ist dadurch begründet, daß die gesamte Isomerisierung bei einer hohen Temperatur (97,4⁰C) durchgeführt wurde, im Gegensatz zu dem Zweistufenverfahren des Beispiels 1, bei welchem der größte Teil der Fructose bei einer niedrigeren Temperatur (nämlich 70⁰C) gebildet wurde. Die höhere Farbzahl hätte deshalb unter Anwendung eines Zweistufenreaktors vermieden werden können. Dennoch betrug die Farbzahl weniger als 13 (CIRF X 100).

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird die Herstellung eines Fructoseenthaltenen Produktes mit 55,3 % Fructose auf Trockenbasis aus einer glucosehaltigen Lösung beschrieben, die aus einem raffinierten Maisstärkehydrolysat plus kristalliner Glucose bestand und wobei ein zweistufiges Isomerisierungssystem angewendet wird und in der zweiten Stufe eine handelsübliche immobilisierte Glucoseisomerase verwendet wird.

Die in dem Reaktor der ersten Stufe verwendete lösliche Glucoseisomerase wurde nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug 40,9 IGIU/mg Protein. Insgesamt wurden 25.000 IGIU des Enzyms durch Adsorption auf 10 g Whatman DE-23-DEAE-Cellulose immobilisiert. Dieses immobilisierte Enzym wurde verwendet, um einen 70°C-Reaktor mit einem Durchmesser von 2,54 cm, der aus einem ummantelten Glasrohr bestand, wie im Beispiel, herzustellen. Die Bettiefe betrug 13 cm.

00Δ3Ό I /

Das Substrat für den Reaktor wurde im wesentlichen wie im Beispiel 2 hergestellt und hatte folgende Zusammensetzung:

05 Gesamttrockensubstanz (%) 50,2

Glucose (% Trockenbasis) 97,6

Fructose (% Trockenbasis) 0,0

Polysaccharid (% Trockenbasis) 2,4

Psicose 0,0

10 NaHSO₃ (MM) 50,0

MgSO₄ (mM) 5,0

CoCl₂ (mM) 0,1

pH 6,8

15 Die Niedrigtemperatur-Isomerisierung wurde bei 7O⁰C

durchgeführt, indem man die obige Substratlösung durch den Niedrigtemperaturreaktor mit einer Fließrate von 3,2 ml/min hindurchpumpte. Die ersten 1000 ml der aus dem Reaktor heraustretenden Flüssigkeit wurden verworfen.

Der anschließend gewonnene Abfluß wurde zur Verwendung bei der zweiten Hochtemperaturisomerisierung verwendet.

Das für die Herstellung des Hochtemperaturreaktors verwendete Enzym war eine im Handel erhältliche immobilisierte Isomerase, erhalten von der Enzyme Development Corporation. Dieses Enzym, Maxazyme GI immob., batch K-12467, wurde zunächst in einem Mörser mit einem Pistill zerkleinert. Das zerkleinerte Enzym ging durch ein Standard 20 mesh-Sieb (0,841 mm lichte Maschenweite) hindurch und der Anteil, der von einem 60 mesh-Sieb (0,250 mm) zurückerhalten wurde, wurde im Substrat suspendiert und in einem Laboratoriumvakuum bei 60⁰C während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5 χ 39 cm Bettes in einem ummantelten Glasrohr verwendet,

Das gepackte Bett enthielt 5200 IGIU.

Das in der ersten bei 70⁰C durchgeführten Isomerisierung erhaltene Substrat wurde auf pH 6,5 eingestellt und auf 42,6 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Säule mit einer Fließrate von 6 ml/min bei einer Temperatur von 60⁰C während 30 min hindurchgepumpt. Die Temperatur im Inneren der Säule wurde mit einem Thermometer, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und das von 0,5 cm großen Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen so klein wie möglich zu halten, überwacht. Dann wurde die Säulentemperatur schnell durch durch die Ummantelung zirkulierendes Wasser aus einem auf 97,8⁰C thermostatisierten Bad erhöht. Nachdem die Säulentemperatür 97⁰C erreicht hatte, wurde die Fließrate des Substrats auf 2,0 ml/min verringert. Bei dieser Fließrate betrug die Kontaktzeit des Substrats mit dem immobilisierten Enzym etwa 22 min und die Gesamtzeit, während welcher die Lösung 97⁰C im Inneren des Reaktors ausgesetzt war, betrug

20 etwa 35 min.

Der aus der Säule austretende Abfluß wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter, das für eine Abbildung von 50-58 % Fructose kalibriert war, gemessen. Nachdem der Fructosegehalt im Abfluß das erwünschte Niveau erreicht hatte, wurde der Abfluß gesammelt und unmittelbar darauf in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde durch Zugabe von 1 M Zitronensäure auf 4,0 eingestellt. Der Abfluß wurde gesammelt bis das Fructoseniveau unterhalb 55 % absank.

Die isomerisierten Lösungen, die aus dem 70°C-Reaktor und dem 97°C-Reaktor erhalten worden war, wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe analysiert und die Ergebnirse wurden mit unisomerisierter Substrat-

35 lösung verglichen.

Tabelle 3

Zusammensetzung der Substratlösungen, isomerisiert

bei 70⁰C und 97°C

Lösungsbehandlung

KohlehydratZusammensetzung (Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis) Fructose Glucose Psicose Polysaccharid

unisomerisiert 0 isomerisiert bei 70⁰C 51,3 isomerisiert bei 97⁰C 55,3

97	,6	0	,3	2	,4
46	,4	0	2	,3
41	,8	0	2	,6

Farbe (CIRFX100)

0,5

0,7

35,2

-34-

Die Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,3%ige Fructose erhält, wobei der Gehalt an Psicose unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) gehalten werden konnte.

05 Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die direkte Isomerisierung von Glucose bei hoher Temperatur unter Erhalt einer Zusammensetzung, enthaltend 55,8 % Fructose beschrieben, wobei die Isomerisierung in der zweiten Stufe mit einer durch Arthrobacter sp. hergestellten immobilisierten Isomerase durchgeführt wurde.

Ein Stamm von Arthrobacter citreus wurde in einer aerobisehen Tauchfermentation auf einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet.

	Gew.-%
Xylose	1,5
BHI (Gehirn-Herz-Infusions-
Medium)	4,2
Hefeextrakt	0,1
Natriumchlorid	0,2_
Kasein-aminosäure	0,5
Magnesiumsulfat	0,024
PH	6,9-7,2

Die Fermentierung wurde unter aseptischen Bedingungen bei 30⁰C während 44 h durchgeführt. Die Zellmasse wurde durch Zentrifugieren geerntet, mit 0,85 % Natriumchlorid gewaschen und dann nochmals zentrifugiert. 76 g der Zellmasse mit einer Gesamtisomeraseaktivität von 10.260 IGIU wurden erhalten. Glucoseisomerase wurde aus 45 g der Zellmasse extrahiert, indem man die Zellen in 250 ml Wasser, enthaltend 900 mg Hühnereilysozym und 250 mg d.b. des oberflächen-

aktiven Mittels BTC-835 (Onyx Chemical Co.), eingestellt auf einen pH von 7,0,suspendierte und 16 h bei 45⁰C inkubierte. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen. Das unlösliehe Material wurde noch einmal in 250 ml 0,1 % Triton X-100 (Sigma Chemical Co.), pH 7,0, suspendiert und 8 h bei 45⁰C inkubiert. Diese Suspension wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde mit der aus der ersten Zentrifugxerung gewonnenen kombiniert.

Die vereinten Extrakte wurden konzentriert und durch Ultrafiltration in einer mit Amicon 401 gerührten Zelle unter Verwendung einer YM-30-Membran (Amicon Corporation) gereinigt. Das Retentat wurde diafiltriert mit zwei 5-Volumenanteilen aus 0,2 mM CoCl₂-, 1 mM MgSO₄-Lösung bei einem pH 7,0. Das letzte Retentat nach der Ultrafiltration enthielt insgesamt 3115 IGIU. Dieses Enzym wurde zur Herstellung einer immobilisierten Isomerase verwendet, indem man auf DEAE-Cellulose nach dem Verfahren gemäß US-PS 3 788 adsorbierte.. Insgesamt 4,0 g Whatman DE-23 wurden zu dieser Lösung gegeben, der pH wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene unlösliche Enzym wurde durch Filtrieren gesammelt und mit Wasser gewaschen. Ein Teil des gewaschenen immobilisierten Enzyms wurde im Substrat suspendiert, 60 min bei 6O⁰C entlüftet und dann zur Herstellung eines 1,5 χ 13 cm-Bettes in dem Hochtemperaturreaktor verwendet.

Das Substrat für den Reaktor wurde im wesentlichen wie im Beispiel 1 durch eine 70°C-Isomerisierung in einer ersten Stufe hergestellt. Dieses Substrat hatte folgende Zusammensetzung:

Gesamttrockensubstanz (%) 42,6

Glucose (% Trockenbasis) 46,9

Fructose (% Trockenbasis) 52,3

Polysaccharid (% Trockenbasis) 0,8 05 Psicose 0,0

NaHSO₃ (mM) 50,0

MgSO₄ (mM) 5,0

CoCl₂ (mM) 0,1

pH 6,7

Das Substrat wurde 30 min mit einer Fließrate von 6 ml/min durch den Reaktor bei 60⁰C gepumpt. Die Säulentemperatur wurde dann schnell auf 97,8⁰C erhöht und die Fließrate auf 2 ml/min verringert und der Abfluß wurde wie im vorhergehenden Beispiel überwacht. Der Abfluß wurde in einem Eisbad gesammelt und mit 1 M Zitronensäure auf pH 4,0 eingestellt.

Der Abfluß aus dem 97,8°C-Reaktor, das in der ersten Stufe bei der 70°C-Isomerisierung gewonnene Substrat und die ursprüngliche Dextroselösung, die als Substrat in dem 70°C-Reaktor verwendet worden war, wurden auf Kohlehydratzusammensetzung und Farbe analysiert und die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
25

Tabelle 4

Zusammensetzung von bei 7O⁰C und bei 97,8⁰C isomerisierten

Glucoselösungen

Lösungsbehandlung

unisomerisiert
isomerisiert bei 70⁰C
isomerisiert bei 97,8⁰C

	-% auf	Kohlehydratzusammensetzung	0	Trockenbasis)	Farbe	I ω «j l	ι » t
(Gew.	aschefreier	0	Polysaccharid	(CIRFX100)
Fructose	Glucose Psicose	0,2	0,8
0	99,2	0,8	0,6
52,3	46,9	0,2	0,7
55,8	43,8	5,7

Ca: CT

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,8%ige Fructose erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 % und die Farbzahl unterhalb 6 (CIRF χ 100) gehalten werden kann.

05 Beispiel 5

In diesem Beispiel wird die Verwendung eines zweistufigen Isomerisierungssystems gezeigt, wobei der Reaktor
in der zweiten Stufe oberhalb 100⁰C betrieben wird und
man ein Fructose-enthaltendes Produkt mit 55,5 %
Fructose erhält.

Das Substrat für den Reaktor in der zweiten Stufe wurde hergestellt in einem Reaktor für die erste Stufe genau
entsprechend dem Beispiel 3 und wurde dann auf pH 6,6 eingestellt.

Die in dem Reaktor der zweiten Stufe verwendete immobilisierte Isomerase Maxazyme GI immob. wurde wie im Beispiel 3 beschrieben, zerkleinert und gesiebt. Dieses
Enzym wurde in dem Substrat suspendiert, bei 60⁰C entlüftet und dann verwendet zur Herstellung eines 1,5 χ 40,5 cm Bettes in dem Hochtemperaturreaktor. Die Gesamtisomeraseaktivität betrug 5820 IGIU. Das Substrat wurde durch

den Reaktor mit einer Fließrate von 6 ml/min während

insgesamt 90 min unter Aufrechterhaltung der Temperatur auf 60⁰C gepumpt. Dann wurde die Säulentemperatur auf
102⁰C erhöht und die Fließrate des Substrates wurde auf 3 ml/min verringert. Unter diesen Bedingungen betrug

die Substratkontaktzeit mit dem Enzymbett etwa 60 min und die gesamte Verweilzeit bei 102⁰C betrug etwa 24 min.
Der Abfluß aus der Säule wurde gesammelt und wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben analysiert und die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Zusammensetzung von bei 70⁰C und 102⁰C isomerisierten Glucoselösungen

Kohlehydratzusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid

Farbe

(CIRF X 100)

unisomerisiert 0

isomerisiert bei 70⁰C 51,3
isomerisiert bei 102⁰C 55,5

0
0
0,2

2,4
2,3
2,3

0,5

0,7

53,6

ω vo ι

Ein Produkt mit einem Gehalt von 55,5 % Fructose, das nur 0,2 % Psicose enthielt, wurde erhalten.

Claims (21)

Patentansprüche

1. Verfahren zum Isomerisieren von Glucose zu Fructose, dadurch gekennzeichnet , daß man eine glucosehaltige Flüssigkeit mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwischen etwa 90⁰C bis etwa 140⁰C

05 bei einem pH-Wert von etwa 3 bis etwa 8 und einer

Kontaktzeit, die ausreicht, um eine Endkonzentration von wenigstens etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% Fructose, bezogen auf den Gesamtkohlehydratgehalt in der Flüssigkeity zu erhalten und unter im wesentlichen keiner Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zuckern in Berührung bringt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

zeichnet, daß die glucosehaltige Flüssigkeit durch Hydrolyse von Maisstärke gewonnen wurde.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltige Flüssigkeit durch Isomerisierung von Maisstärkehydrolysat bis zu einem Fructosegehalt von bis zu etwa 52 %, bezogen auf den Gesamtkohlehydratgehalt, erhalten wurde.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomerase erhalten wurde aus einem Mikroorganismus der Gruppe Streptomyces-Spezies, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomerase erhalten wurde aus einem Mikroorganismus der Gruppe Streptomyces sp. ATCC 21175, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomera·

15 se erhalten wurde aus einem Mikroorganismus, in

welchem mutierte Glucoseisomerase unter Ausbildung von mutierten Genen, die eine Glucoseisomerase mit hoher Wärmestabilität ergeben, eingeführt wurden.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase eine thermisch stabile Glucoseisomerase ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η - zeichnet, daß die wärmestabile Glucoseisomerase aus Bacillus stearothermophilus erhalten wurde.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η h zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus Bacillus licheniformis erhalten wurde.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus einem Thermophilen der

Genera Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora oder Pseudonocardia erhalten wurde.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η -

zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus vom Genus Ampullarieila gewonnen wurde.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,, daß man eine Enzymdenaturisierung inhibierende Menge eines wasserlöslichen Salzes von schwefeliger Säure dem Isomerisierungsmedium zugibt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltige Flüssigkeit etwa 40 bis etwa 65 Gew.-% Kohlehydrate enthält.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltig ge Flüssigkeit mit Glucoseisomerase bei etwa 100⁰C bis etwa 110⁰C behandelt wird.

25

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14,

dadurch gekennzeichnet , daß der pH der Isomerisierungsmischung bei etwa 5 bis etwa 6,5 gehalten wird.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Kontaktzeit etwa 2 min bis etwa 30 min beträgt.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase in immobilisierter Form verwendet wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomerase auf Diethylaminoethylcellulose immobilisiert wird.

19. \ferfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß in einer ersten Stufe die glucosehaltige Flüssigkeit mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von etwa 20⁰C bis etwa 80⁰C, einem pH-Wert von etwa 6 bis und bei' einer Kontaktzeit von etwa 0,5 bis etwa 2 h in Berührung gebracht wird bis man eine etwa 52 gew.-%ige, bezogen auf den Gesamtkohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, enthaltende Fructose erhält und daß in einer zweiten Stufe die Temperatur des Isomerisierungsmediums auf etwa 9O⁰C bis etwa 140⁰C erhöht wird, wobei der pH im erforderlichen Maße auf einen Bereich von etwa 3 bis etwa 8 eingestellt wird und daß man die fructosehaltige Flüssigkeit mit der Glucoseisomerase während einer weiteren

20 ausreichenden Zeit in Berührung bringt, um den

Fructosegehalt auf etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% zu erhöhen.

.20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet , daß der erhaltene Fructose-Glucose-Sirup auf eine Temperatur unterhalb etwa 80⁰C gekühlt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Entfernung des Enzyms aus der Isomerisierungsmischung die Temperatur in der Isomerisierungsmischung auf etwa 20⁰C bis etwa 8O⁰C senkt.