DE3320651A1 - Fermentatives verfahren zur herstellung von l-leucin - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die fermentative Herstellung von L-Leucin, L-Valin und anderen Aminosäuren war bereits Gegenstand umfangrei-._Λ eher Forschungsarbeiten. Dabei sind zahlreiche Mikroorganismengattungen zusammen mit verschiedenen Aminosäureanalogen angewandt worden. Aus der US-PS 3 865 690 ist die Herstellung von L-Leucin durch Züchtung eines gegenüber einem Leucinantagonisten resistenten Stammes von Brevibacterium oder Corynebacterium bekannt. Aus der US-PS 3 970 519 ist die Züchtung von Stämmen der gleichen Gattung in Gegenwart verschiedener Aminosäuren zur Herstellung von L-Leucin bekannt. Aus der US-PS 3 893 888 ist bekannt, daß L-jValin von mutanten Stämmen von Brevibacterium gebildet werden kann, die gegenüber a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure . (AHV) resistent sind. Ferner beschreibt die US-PS 3 688 073 die Herstellung von L-Leucin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium in Gegenwart eines "Promotors"

für Isoleucin, Methionin, Phenylalanin oder Valin, wie 25

beispielsweise Azaleucin oder AHV. Azaleucin ist ebenfalls als Analoges für die Herstellung von L-Leucin '*■* verwendet worden, vgl. Wang et al. "Fermentations und ,Enzym-Technologie", John Wiley und Söhne, Inc., 1979, Seiten 18 bis 20. Die US-PS 3 759 789 beschreibt die Verwendung von Arthrobacter alkanicus-Kultüren, welche gegenüber L-Threonin resistent sind. L-Leucin- und L-Isoleucin-precurser können zugegeben werden, um die Ausbeute zu verbessern.

Die nachfolgend genannte Literatur ist relevant:

1. Araki, Kazumi, H. Ueda and S. Saigusa. Fermentative Herstellung von L-Leucin mit auxotrophen Mutanten von Corynebacterium glutamicum. Agr. Biol. Chem. ^8 (3), 565-572 (1974).

2. CaIvo, R.A., and J.M. CaIvo. Fehlen der Endprodukthemmung und Repression bei der Leucinsynthese bei einem Stamm von Salmonella typhimurium. Science, 156, 1107-1109 (1967).

3. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. Leucinakkumulationen bei Isoleucinrevertanten von Serratia marcescens, die resistent gegenüber ot-Aminobuttersäure sind: Fehlen von sowohl Feedbackhemmung als auch Repression. J. Biochem., 7j$, 107-115 (1973).

4. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Kulturbedingungen zur L-Leucinherstellung bei Stamm Nr. 218, einer Mutante von Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. jl£(5), 1149-1153 (1975).

5. Tsuchida, T., and H. Momose. Genetische Veränderungen der Regulationsmechanismen bei Leucin und Valin bildenden Mutanten abgeleitet von Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 3JH¹¹)· 2193-2198 (1975).

6. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Bildung von L-Leucin durch eine Mutante von Brevibacterium lactofermentum 2256.

Agr. Biol. Chem. 38.(¹⁰K 19097-1911 (1974).

7. Freundlich. M. and J.M. Trela. (1969). Steuerung der Isoleucin-, Valin- und Leucinbiosynthese. J. of Bacteriology, 101-106.

8. Izumi, Y., Y. Asano, Y. Tani and K., Ogata. (1977). Bildung von Valin und Leucin durch gegenüber Analogen resistente Mutanten eines obligat methylotrophen Methylomonas aminof aciens.. J. Ferment. Technol., 5_5, 452-458.

.

9. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. (1977) Syntheseweg der Isoleucinbildung aus Pyruvat durch enzymatische Leucinbiosynthese bei Leucin-akkumulierenden Isoleucinrevertanten von Serratia marcescens. J. Biochem., j[2, 95-103.

10. Kisumi, M., J. Kato, S. Komatsubara, I. Chibata. (1973) Bildung von Isoleucin, Valin und Leucin durch Regulations-Mutanten von Serratia marcescens.

"Genetics of Industrial Microorganismus - Bacteria".

11. Rogerson, Α., and M. Freundlich. (19 69)." Steuerung der Isoleucin-, Valin- und Leucinbiosynthese. VIII. Mechanismus der Wachstumshemmung durch Leucin bei Relaxed- und Stringent-Stämmen von Escherichia coli K-12. Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.

Ferner wurden allgemeine Artikel über Biosynthesewege für L-Leucin ebenso wie für andere Aminosäuren veröffentlicht, vgl.:

12. Szentirmai, A. and I. Horvath. (1976). Regulation der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 23, 137-149.

13. Umbarger, H. E. (1974). Die bei der multivalenten Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin und Valin bei Enterobacteriaceaen beteiligten Elemente. Proceedings of the 1st. Intersectional Congress of IAMS, ^L, Tokyo.

14. umbarger, H.E. (1973). Genetische und physiologische Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin, Valin und Leucin bei Enterobacteria-

^O ceaen. "Genetics of Industrial Microorganisms."

15. Umbarger, H.E. (1978). Aminosäurebiosynthese und ihre Regulation. Ann. Rev. Biochem., AT_, 533-606, 563.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin durch Züchtung eines gegenüber einem Analogen von L-Leucin resistenten Stammes von Brevibacterium thiogenitalis unter aeroben Bedingungen.

Für die Mutation ausgewählte Wildstämme von Brevibacterium thiogenitalis (beispielsweise ATCC 19240) sind durch eine Überproduktion von Glutaminsäure gekennzeichnet. Der Biosyntheseweg, auf dem Mikroorganismen L-Leuein bilden ist allgemein bekannt, vgl. Umbarger, "Aminosäurebiosynthese und ihre Regulation", Ann. Rev. Biochem. 1978, 47, 563-565. Wie in dieser Literaturstelle angegeben ist, nimmt man an, daß die Synthese über folgende Stufen verläuft: Pyruvat, a-Acetolactat,

₃q α,ß-Dihydroxyisovaleriat, a-Ketoisovaleriat, a-Isopropylmalat, ß-Isopropylmalat, a-Ketoisocapronat, L-Leucin.

Bestimmte Analoge der natürlich auftretenden Aminosäuren eignen sich zur Isolierung der erfindungsgemäßen oc mutanten Stämme. Diese Analogen sind für Stämme

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toxisch, welche keine Überproduktion von L-I,ruc.in haben. Beispiele für derartige Analoge sind α-Ami no-ß-hydroxyvaleriansäure, Methally!glycin, ß-Hydroxyleucin.

ί Die gegenüber Leucinanalogen resistente Mutante kann durch ultraviolette Bestrahlung eines Wi ldtypstarnmes von Brevibacterium thiogenitalis oder durch Behandlung des Wildstammes mit einer mutagenen Substanz wie beispielsweise Ethylmethansulf onat, N-Methyl-N, -ni tro-N-nitrosogüanidin usw. erhalten werden. Anschließend kann der- Stamm in Gegenwart des Analogen angezogen werden, um die Kolonien mit L-Leucin-Überproduktion zu isolieren .

Beispielsweise kann der Stamm bei 30 C für 2 bis 7 Tage auf Agar-Platten der folgenden Zusarnmenset zung angezogen werden: Gelatinehydrolysat-Pepton 5,0 g/l, Rindfleischextrakte 3,0 g/l, Agar 15 g/l, Na-SaIz der a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure 25 g/l.

Eine lebensfähige Kultur einer L-Leucin erzeugenden Mutante von Brevibacterium thiogenitalis, die gegenüber a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (Produkt aus Beispiel 2) resistent ist, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Nr. ATCC 39104 hinterlegt.

Die Fermentation der isolierten Mutanten von Brevibdcterium thiogenitalis kann durch Schüttelkultivierung oder submerse Fermentation unter aeroben Bedingungen bewirkt werden. Die Fermentation wird bei 25 bis 40° C und einem pH-Wert von 5 bis 8 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) durchgeführt ο Für die Einstellung des pH-Wert es

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des Mediums können Calciumcarbonat und/oder Ammoniak verwendet werden. Das Fermentationsmedium enthält eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie weitere Elemente. Zur Fermentation geeignete Kohlenstoffquellen schließen fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate und Proteine ein. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von organischen Säuren (beispielsweise Ammoniumacetat und Amoniumoxalat) und Ammoniumsalze anorganischer Säuren (beispielsweise Ammo-

-10 niumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumchlorid). Die Mengen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in dem Medium betragen von 0,001 bis 20 % (Gew./VoI). Auch organische Nährstoffe (beispielsweise Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakte, Sojabohnenextrakte) und/oder anor-

-j 5 ganische Elemente (beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Vitamine wie Biotin und Thiamin und Aminosäuren, z.B. Valin) können dem Medium zugefügt werden. Die Fermentation ist innerhalb von 16 bis 176 Stunden beendet, wobei L-Leucin in der Fermentationsbrü^ne angereichert wird.

Nach Abschluß der Fermentation, d.h. nachdem sich 0,1 bis 6 % (Gew./Vol.) L-Leucin in der Brühe gesammelt haben, werden die Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur nach herkömmlichen Verfahren aus der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Zur Gewinnung und/oder Reinigung des L-Leucins aus dem Filtrat oder dem Überstand können bekannte Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem starken Kationenaustauscherharz behandelt werden. Das Harz wird anschließend mit einer verdünnten alkalischen Lösung, z.B. wäßrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Leucin enthaltenden Eluate werden vereinigt und eingeengt. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Alkanol wie Methanol oder

Ethanol gegeben. Die ausgefällten Kristalle können aus einem wäßrigen Alkanol wie wäßrigem Methanol oder wäßrigem Ethanol umkristallisiert werden, um reine Kristalle von L-Leucin zu erhalten.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert. Die Bezeichnung "Difco" bezieht sich auf das "Difco Handbuch für wasserfreie Kulturmedien und Reagenzien für mikrobiologische und klinische Laborverfahren", 9. Aufl., Difco Laboratories Incorporated, Detroit, Michigan (1953).

Beispiel 1

Eine Sehrägagarkultür von ATCC 19240, Brevibacterium thiogenitalis auf Nähragar (Difco), 2 Tage bei 30 C angezogen, wurde mit 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, gewaschen= Die gebildete Zellsuspension wurde in ein steriles Röhrchen dekantiert, dem ein Mutagen, nämlich Ethylmethansulfonat (EMS), in ausreichender Menge zugegeben wurde, um eine 0,008 molare Konzentration zu erzielen. Die mit EMS behandelten Zellen wurden anschließend 18 Stunden bei 30° C inkubiert, um das Mutagen einwirken zu lassen.

Nach der Inkubation wurde die Zeilsuspension zentrifugiert, der Überstand dekantiert und die Zellen in frischem Puffer resuspendiert.

Nach zweimaligem Waschen zur Entfernung jeglichen restlichen Mutagens wurden die Zellen auf Nähragargradientenplatten ausplattiert, welche am oberen Ende des Gradienten 25 g/l a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV) .enthielten.

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Am oberen Ende der Platte auftretende resistente Mutanten wurden auf frische Nähragarplatten überführt. Nach Inkubation bei 30° C für 24 Stunden wurden die isolierten Kulturen in 1 ml-Röhrchen mit Isoleucinmedium 1 überimpft.

Isoleucinmedium 1

Glucose KH₂PO₄ MgSO. · 7H„< FeSO₄ · 7H₂< MnSO _A · H„0

Biotin Thiamin HCl Bacto-sytone—'(Difco) CaCO₃

—DI = entionisiert

2/

— Enzymatisches Hydrolysat

"Difco," Seite 264.

2/

Je Liter DI-^/H₂<

g 3 g 0,4 g 0,01 g 0,0075 g g μg

1 mg

0,63 g g

von

Soj abohnenmehl.

Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren bei 112 C für 15 Minuten mit NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die Röhrchen wurden 4 Tage bei 30° C und 300 üpm inkubiert. Wie nachfolgend beschrieben, wurde eine Bioanalyse unter Verwendung von Pediococcus cerevisiae(ATCC 8042) durchgeführt, um die vorhandene L-Leucinmenge zu

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bestimmen. Für eine resistente isolierte Kultur mit der • Bezeichnung 19240-31 wurden 2,6 g/l L-Leucin bestimmt.

Reaktionsmechanismus:

Pediococcus cerevisiae benötigt sämtliche Aminosäuren in ihrer L-Form zum Wachstum. Es ist daher möglich, die Menge einer bestimmten vorhandenen Aminosäure in einer Fermentation'sbrühe zu bestimmen, indem man einen Pedio-

-|0 coccusjrasen auf einem Agarmedium ausbreitet, welches sämtliche notwendigen Nährstoffe mit Ausnahme der zu analysierenden Aminosäure enthält. Wird eine sterile Filterscheibe, getränkt mit durch Milliporen filtrierter Fermentationsbrühe, auf die Oberfläche des Mediums gebracht, so kann die Wachstumszone von Pediococcus um die Scheibe herum gemessen und mit einer Standardkurve verglichen werden. Diese Kurve wird hergestellt, indem Pediococcus in Gegenwart von Filterscheiben mit bekanntem Gehalt der zu analysierenden Aminosäure angezogen wird.

Bestimmungsverfahren für Leucin:

Pediococcus cerevisiae ATCC 8042 wurde etwa 44 Stunden bei 37 C in 4 χ 10 ml Mikroinoculumbrühe (Difco) angezogen. Die Zellen wurden dreimal mit sterilem entionisierten Wasser gewaschen und anschließend vereinigt und in 12 ml sterilem entionisiertem Wasser resuspendiert. Platten mit Leucinanalysenmedium (Difco), hergestellt durch Vermischen von 2,6 g Leucinanalysenmedium und 1,5 g Noble-Agar mit 100 ml entionisiertem Wasser wurden mit einem Zeilsuspensionsrasen (0,3 ml) bedeckt. (Anmerkung: Mikroinoculumbrühe ist ein im Handel erhältliches Kulturmedium, welches Pepton, Hefeextrakt, Dextrose, KH₂PO^ und einen Sorbitanmonooleatkomplex

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enthält. Es ist in "Difco", Seite 213 beschrieben. Leucinanalysenmedium ist gleichfalls im Handel erhältlich und in "Difco", Seiten 230 bis 231 beschrieben).

Nachdem der Feuchtigkeitsüberschuß von den Platten verdampft war, wurden sterile, absorbierende Scheiben von 0,63 5 cm (im Handel erhältlich) zum Herstellen der Standardkurve mit bekannten Mengen L-Leucin sowie den zu analysierenden filtrierten Fermentationsbrühen getränkt.

Die Platten wurden 24 Stunden bei 37° C inkubiert, anschließend der Durchmesser der Wachstumszonen gemessen und in mm, wiedergegeben. Es wurde eine Standardkurve angefertigt, mit der die unbekannten Proben zur Bestimmung der L-Leucinherstellung verglichen wurden.

Da sich dieses Verfahren auf einen mikrobiologischen Indikator stützt, liefert es eher qualitative als streng quantitavie Messungen der Aminosäureproduktion.

Beispiel 2

Es stellte sich heraus, daß die isolierte Kultur 1924 0-31 auf Nähragar eine Mischpopulation aus großen und kleinen Kolonien bildete. Wurde sie 3 Tage bei 30° C und 300 Upm in Isoleucinmedium 1 angezogen, so wurde festgestellt, daß die großen Kolonien mehr Valin als Leucin und Isoleucin produzierten, während das Umgekehrte für die kleinen Kolonien galt. Mit Pediococcus cerevisiae wurde eine Bioanalyse durchgeführt. Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung 19240-31-1 produzierte 0,5 g/l Leucin. Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung 19240-31-K produziete 1,5 g/l Leucin und wurde dementsprechend bei der ATCC hinterlegt und mit der

31-) Nummer ATCC 39104 versehen.

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Beispiel 3

Um den Einfluß des Ausgangs-pH-Wertes des Wachstumsmediums, der Kolbengröße und der Inkubationszeit zu bestimmen, wurde Isoleucinmedium 1 hergestellt und verschiedene Teilmengen des Mediums mit NaOH auf unterschiedliche pH-Werte (d.h. 5,8 bis 8,2 vor Autoklavieren) eingestellt.

Die isolierte Kultur 19240-31-K wurde unterschiedlich lange (d.h. 3 bis 5 Tage) in nicht-gekerbten 500 ml Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml Medium enthielten sowie im gekerbten und nicht-gekerbten 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium enthielten, angezogen. Nach 4-tä-

giger Anzucht bei 30° C und 300 üpm in einem 250 ml gekerbten Erlenmeyer-Kolben, der vor dem Autoklavieren auf pH 7,9 eingestelltes Medium enthielt, wurde bei dem isolierten Stamm 1924 0-31-K mit der Pediococcusbioanalyse ein Titer von 3,2 g/l L-Leucin bestimmt.

Claims (1)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante von Brevibacterium thiogenitalis, die resistent gegenüber Analogen von L-Leucin ist, unter aeroben Bedingungen züchtet, um eine Fermentationsbrühe zu erhalten und das angereicherte L-Leucin aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Brevibacterium thiogenitalis ATCC 39104 verwendet.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 20 bis 45° C für 16 bis 176 Stunden durchführt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einem pH-Wert des Fermentationsmediums von 5 bis 8 durchführt.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Brevibacterium thiogenitalis ATCC 39104 verwendet und die Fermentation bei 25 bis 40° C für 16 bis 176 Stunden bei einem pH-Wert von 5 bis 9 durchführt.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Analoge a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, Methallylglycin und ß-Hydroxyleucin ist.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Analoge a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure ist.