DE3320342A1

DE3320342A1 - Reine einzelne faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von teichomycin a(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3320342A1
Application number: DE3320342A
Authority: DE
Inventors: Angelo Borghi; Giovanni Pavia Cassani; Carolina Milano Coronelli; Rosa Pallanza
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA; Lepetit SpA
Current assignee: Aventis Bulk SpA
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1983-06-04
Publication date: 1983-12-08
Also published as: ES8503689A1; FR2528050A1; JPH0224278B2; SU1318170A3; SG70686G; SE8303211L; JPH0517237B2; JPH0415237B2; GR78267B; DK245883D0; IL68819A0; FI73697B; NO159104B; LU84853A1; JPH02288888A; CH657139A5; FI831660L; ES536770A0; ES522941A0; DK245883A

Description

Reine einzelne Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A₂ und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine einzelne antibiotische Substanz ausgewählt aus Faktor 1 von Teichomycin A₂/ Faktor 2 von Teichomycin A₂, Faktor 3 von Teichomycin A_?, Faktor 4 von Teichomycin A₂ und Faktor 5 von Teichomycin Ao in im wesentlichen reiner Form, sowie das Verfahren j

zu ihrer Herstellung. . j

1 Teichomycin A₂ ist eine von mehreren unterschiedlichen j antibiotischen Substanzen, die durch Kultivierung des J Stammes Actinoplanes Teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze (vgl. BE-PS 839 259) enthält, erhalten werden- Nach'dem in der .vorstehenden Patentschrift beschriebenen Verfahren wird ein antibiotisches Gemisch, das Teichomycin A-, Ap und A, enthält, aus der abgetrennten Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist, und Ausfällung aus dem extrahierenden Lösungsmittel nach üblichen Verfahren gewonnen. Teichomycin A._? wird anschließend aus dem so erhaltenen antibiotischen Gemisch durch Säulen-

(R)

Chromatographie über Sephadex abgetrennt. Teichomycin A₂ ist dann nach weiterer Reinigung durch Hindurchleiten durch ein sulfoniertes Polystyrolharz gekennzeichnet 5 durch eine breite Serie von verschiedenen chemisch-

INSPECTED BAD ORIGINAL

COPY

physikalischen Parametern einschließlich der R^-Werte in einem Satz von papierchromatographischen und dünnschichtchromatographischen Systemen, wo sich diese Verbindung wie ein wahres einheitliches Produkt verhält.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Teichomycin A₂ tatsächlich ein Gemisch aus verschiedenen, gleichzeitig hergestellten, nahe verwandten antibiotischen Stoffen umfaßt, dessen Hauptfaktoren als Faktor 1 von Teichmoycin A₂, Faktor 2 von Teichomycin A₂/ Faktor 3 von Teichomycin A-Faktor 4 von Teichomycin A₂ und Faktor 5 von Teichomycin A₂ bezeichnet werden. Es wurde auch gefunden, daß diese reinen einzelnen Faktoren sich dadurch biologisch von dem Komplex Teichomycin Α.-, unterscheiden, daß sie einen höheren Grad der antibiotischen Wirksamkeit gegen empfängliche Mikroorganismen aufweisen.

Die antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung werden aus Teichomycin A₂, das in der vorstehenden BE-PS beschrieben ist, durch Auftrennung des antibiotischen Komplexes in die einzelnen Faktoren mit Hilfe hoch wirksamer chromatographischer Methoden und Gewinnung der Hauptfaktorer, hergestellt.

Die hier verwendeten Ausdrücke "Teichomycin A₂", "Komplex Teichomycin A₂" oder "antibiotischer Komplex" beziehen sich auf das Gemisch, das die vorstehenden fünf gleichzeitig hergestellten antibiotischen Faktoren enthält, und z.B. nach den Lehren der BE-PS 839 259, auf die hier besonders verwiesen wird, erhältlich ist und dort als Teichomycin A^ ' bezeichnet ist.

Die Auftrennung des Komplexes in die reinen, einzelnen Hauptfaktoren kann durch Umkehrphasenverteilungs- oder 35

^Γ COPV

oder Ionenaustauschchroraatographie erreicht werden. Im ersteren Fall wird in üblicher Weise inaktiviertes Silicagel als Packung für die Säule und eine Gradientenelution aus Acetonitril und wäßrigem Ammoniumformiat als Entwickler verwendet, während im letzteren Fall ein schwacher, gelartiger Anionenaustauscher zweckmäßig als stationäre Phase und wäßrige Puffer oder Gemische aus wäßrigen Puffern und nichtwäßrigen Lösungsmitteln als Eluierungssysteme eingesetzt werden. Im einzelnen wurden optimale Auftrennungsergebnisse erhalten, indem man eine Lösung von Teichomycin A-, in einem Gemisch aus verdünntem wäßrigen Ammoniumformiat und Acetonitril durch eine Säule aus silaniertem Silicagel leitete und die Säule mit einer Gradientenelution in dem gleichen Lösungsmittelsystem entwickelte. j Gute Ergebnisse werden auch durch Anwendung des Diethylaminoethylderivates von Agarose als stationäre Phase und Durchführung der Auftrennung durch progressive Elution mit Pufferlösungen oder Gemischen aus Pufferlösungen und nichtwäßrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln er-

20 halten.

Das Auftrennungsverfahren wird durch Hochleistungsflüssigkeits Chromatographie (HPLC) überwacht. Fraktionen mit gleichem HPLC-Profil werden vereinigt, gegebenenfalls weiter durch präparative HPLC gereinigt und entsalzt. Aus dieser Lösung werden dann die einzelnen Faktoren durch Abdampfen der organischen Lösungsmittel, Abstreifen von Wasser auf ein geringes Volumen und Zusatz eines Überschusses eines organischen Lösungsmittels, in dem die Verbindungen nicht löslich sind, unter Ausfällung der erhaltenen Produkte gewonnen.

ORIGINAL INSPECTED COPY

• · ■

- 17 -

Das folgende spezielle Beispiel wird zur besseren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegeben. Dieses Beispiel soll jedoch die Erfindung nicht auf die besonderen, dort gegebenen Bedingungen beschränken.

Auftrennung in die Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin Ap.

10g des Komplexes Teichomycin A₂/ der nach dem in der BE-PS 839 259 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, werden in 1 1 eines Gemisches aus 9 Teilen einer 0,2%igen Ammoniumformiatlösung und 1 Teil Acetonitril gelöst, und die Lösung wird mit 1N NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Diese Lösung wird durch eine Säule geleitet, die j 500 g silaniertes Silicagel 60' (Merck) enthält. ^;

i

I Die Säule wird dann mit einem linearen Gradienten von |

10 % bis 20 % Acetonitril in einer 0,2%igen Ammoniumformiat-

lösung in einem Gesamtvolumen von 10 1 eluiert.

Fraktionen von etwa 20 ml werden gesammelt und mit Hilfe der

20 HPLC geprüft.

In der folgenden Tabelle I sind die Retentionszeiten (t_R) für die Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A₂ in einer repräsentativen HPLC-Auftrennung angegeben (die Verfahrensbedingungen sind unter der Tabelle angegeben)

COPY

Tabelle	I	21 ,2
Teichomycin A₂~Faktor Retentionszeit (Minuten)	22,6
1	23,3
2	25,8
3	26,4
4 ■	8,84.
5
3,5-Dihydroxytoluol (interner Standard)

Cr)
Säule: 5μ Zorbax* ' ODS (DuPont)

Mobile Phase: Linearer Gradient von 0% B bis 50 % B in A in 40 Minuten

A) 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (9:1)

gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH

B) 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (3:7) gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH

Fließgeschwindigkeit: 2 ml/Min. Meßeinrichtung: UV-Photometer bei 254 nm.

Fraktionen mit gleichem HPLC-Profil werden vereinigt, und das organische Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Die zurückgebliebenen wäßrigen Lösungen werden durch eine Säule geleitet, die 10 g silaniertes Silicagel

25 (60) (Merck) enthält, öie Säule wird mit destilliertem Wasser gewaschen, um das Ammoniumformiat zu eliminieren, und dann mit 50%iger wäßriger Acetonitrillösung eluiert. '

Das Eluat wird unter Zusatz von Butanol zwecks Erleichterung 30 der Abdampfung des Wassers auf ein geringes Volumen konzentriert und dann mit einem Gemisch aus 1 Teil Aceton und

ORIGINAL INSPECTED ORIGINAL

• 4 «» i

1 Teil Ethylether zur Ausfällung gebracht. Nach dem vorstehenden Verfahren werden 410mg reiner Faktor 1 von Teichomycin A₂ und 770 mg Faktor 2 von Teichomycin A₂ erhalten.

Ein Gemisch aus 1 Teil Faktor 3 von Teichomycin A₂ und 1 Teil Faktor 2 von Teichomycin A₂ wird weiter durch HPLC an einer halbpräparativen Säule unter den folgenden Verfahrensbedingungen gereinigt:

Säule: Whatman Partisil^v ' ODS M 9 10/50 Mobile Phase: 0,2% Ammoniumformiat in H₂0/Acetonitril

(76:24);

Fließgeschwindigkeit: 4,5 ml/Min. Meßeinrichtung: UV-Photometer bei 254 nm, Belastung: 20 mg.

Auch in diesem Fall wird die Reinigung durch überprüfung aller Fraktionen durch HPLC überwacht.

Fraktionen, die reinen Faktor 2 von Teichomycin A₂ enthalten, sowie Fraktionen, die reinen Faktor 3 von¹ Teichomycin A₂ enthalten, werden vereinigt, entsalzt und wie vorstehend beschrieben ausgefällt. (Ausbeute: 510 mg Faktor 2 von Teichomycin A₂ und 520 mg Faktor 3 von Teichomycin A₂.)

Fraktionen, die die Faktoren 4 und 5 im Verhältnis 1:1 enthalten (etwa 500 mg) und aus der eisten Säule erhalten wurden, werden' mit einem anderen Gemisch von Fraktionen, die ein Gemisch aus Faktoren 4 und 5 enthalten (etwa 4 90 mg) und auf gleiche Weise aus einer zweiten parallelen Auftrennung erhalten wurden, vereinigt und durch halbpräparative HPLC aufgetrennt, wobei die gleichen Verfahrensbedingungen wie vorstehend für die Reinigung von Faktor 3 von Teichomycin A₂ beschrieben wurden, angewendet werden, wobei 350 mg Faktor 4 von Teichomycin A~

und 300 mg Faktor 5 von Teichomycin A₂ erhalten werden. |

Chemisch-physikalische Eigenschaften der reinen einzelnen

Faktoren von Teichomycin A„ 5

Faktor 1 von Teichomycin A_ ist ein weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei etwa 220⁰C anfängt, dunkel

zu werden, und bei 255°C vollständig zersetzt ist,

und hat die folgenden Eigenschaften: '

a) es ist frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert ^7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol bei einem pH-Wert

15 etwas löslich in Methylglykol und Glycerin;

schlecht löslich in Methanol und Ethanol und ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff;

b) es hat ein UV-Absorptionsspektrum, das in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorptions-;

I maxima:

25 - in 0,1N Chlorwasserstoffsäure: * ^{278 nm (E}icm = ⁴⁹'⁵⁾

- in Phosphatpuffer pH 7,4 ^ _mav 278 nm (e]* = 50,0)

IUcIX I CIU

- in 0,1N Natriumhydroxid:

* max²⁹⁷

ORIGINAL INSPECTED COPY

c) es hat ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol, das in Figur 2 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815 und

720 (Nujol);

d) es hat eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (%-dw = 8,5) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,70 %; Wasserstoff 4,90 %; Stickstoff 6,6 5 %; Chlor 3,80 % und Sauerstoff (durch Differenz) 27,95 %;

e) es hat eine Retentionszeit (t_n) von 21,2 Minuten bei

Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer

(R)
5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t 8,84 Minuten);

f) in dem 270 MHz H NMR-Spektrum (das gesamte Spektrum ist in Figur 3 der Zeichnungen gezeigt) aufgetragen in Dimethylsulfoxid-dg (DMSO-dg) mit Zusatz weniger Tropfen an D₂O (Konzentration 25 mg/0,5 ml) (TMS als interner Standard: 0= 0,00 ppm) erscheinen die folgenden Gruppen von Signalen: 0,8-1,5 (m); 1,7-2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); und 6,2-8,1 (m);

g) es hat eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion;

h) es hat eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion; und

i) es hat ein Molekulargewicht von etwa 1875, bestimmt durch massenspektrometrische Analyse unter Anwendung schnellen Atombeschusses (FAB) als Ionenquelle (zur FAB-Massenspektrometrie vgl. z.B. M.Barber u.a., Nature, Bd. 293, Nr. 5830 (1981), S. 270-275).

Faktor 2 von Teichomycin A₂ ist ein weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei 210⁰C anfängt, dunkel zu werden, und"250°C vollständig zersetzt ist, und das die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) es ist frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert >7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol bei einem pH-Wert -£2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin; schlecht löslich in Methanol und Ethanol; und ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff;

b) es hat ein UV-Absorptionsspektrum, das in Figur 4 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorptionsmaxima:

- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure:

/) 278 nm (E^^% = 48) " max 1cm

- in Phosphatpuffer pH 7,4:

λ 278 nm (e]^% = 49,0)

max 1cm '

- in 0,1N Natriumhydroxid:

h 297 nm (e]^% = 70,0);

max 1cm ' ''

ORIGINAL INSPECTED COPY

c) es hat ein IR-Absorptionsspektrum in Mujol, das in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden bemerkbaren Absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2860(NuJoI 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815 und

720 (Nujol); :

d) es hat eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (%j4w=9,8) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,15 %; Wasserstoff 5,15 %; Stickstoff 6,30 %; Chlor 3,90 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 28,50 %;

e) es hat eine Re tent ions ze it (t_,) von 22,6 Minuten bei

Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer

(R)
5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen₍

- Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (9/1), : gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: ^:

25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 ! mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkext von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t_, 8,84 Minuten) ;
25

f) in dem 270 MHz H NMR-Spektrum (das gesamte Spektrum ist

in Figur 6 der Zeichnungen gezeigt), aufgetragen in DMSO-d_fi mit Zusatz weniger Tropfen an D^O (Konzentration 25 mg/0,5 ml) (TMS als interner Standard: 6= 0,00 ppm) erscheinen die folgenden Gruppen von Signalen:

0,7-1,5 (m); 1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); und 6,2-8,1 (m);

BAD ORIGINAL COPY

- in Phosphatpuffer pH 7,4: ³⁰ *max ^{278 nra} <^Eicm ^{= 50}'⁸⁾

- in 0,1N Natriumhydroxid: * max ^{297nm (}i

- 24 -

g) es weist eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion auf; ;

h) es weist eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion

auf; und
5

i) es hat ein Molekulargewicht von etwa 1877, bestimmt durch

FAB-Massenspektrometrie.

Faktor 3 von Teichomycin A₂ ist ein weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei 205⁰C anfängt, sich zuzersetzen, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, und hat die folgenden Eigenschaften:

a) es ist frei löslich in Wasser bei einem pH ^»7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol bei einem pH-Wert <:2,0;
etwas löslich in Methylglykol und Glycerin; schlecht löslich in Methanol und Ethanol; und ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff;

b) es hat ein UV-Absorptionsspektrum, das in Figur 7 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorptions-

25 maxima:

- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure:

* ^{278 nm (E}!cm = ⁴⁹'²⁾ '

COPY

c) es hat ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol, das in Figur 8 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden bemerkbaren Absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2850 (Nujol); 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol); 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890,

845, 820, 800, und 720 (Nujol·);

d) es hat eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (I 4 w = 12,0) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,26 %; Wasserstoff 5,20 %; Stickstoff 6,69 %; Chlor 3,95 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 27,90 %;

e) es hat eine Retentionszeit (t„) von 23,3 Minuten bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer

(R)
5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 4 0 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 in 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol

t_D 8,84 Minuten);
f) in dem 2 70 MHz H NMR-Spektrum (das gesamte Spektrum ist in Figur 9 der Zeichnungen gezeigt), aufgetragen in DMSO-d₆ mit Zusatz weniger Tropfen an D₂O (Konzentra 2 5 mg/0,5 ml) (TMS als interner Standard 6 = 0,0 0 ppm) erscheinen die folgenden Gruppen von Signalen:

0,7-1,5 (m) ; 1,8-2,0 (m) ; 2,7-4,5 (m) ; 4,6-5,7 (m) ; und 6,2-8,0 (m);

ι g) es hat eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion;

h) es hat eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion; und

i) es hat ein Molekulargewicht von etwa 18 77, bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie.

Faktor 4 von Teichomycin A₂ ist ein weißes amorphes Pulver, . das beim Erhitzen bei etwa 210⁰C anfängt, dunkel zu werden, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, und die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) es ist frei löslich in Wasser bei einem pH P>7,0 oder

in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol

bei einem pH <2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin;

schlecht löslich in Methanol und Ethanol; und

ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan,

Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und

Tetrachlorkohlenstoff;

b) es hat ein UV-Absorptionsspektrum, das in Figur 10 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorptionsmaxima :

- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure: ^λ max ²⁷⁸ ™ ^(Elcm ^{= 52}'⁵>

- in Phosphatpuffer pH 7,4:

λ 278 nm (E₁ ^{1 %} = 52,5) max 1cm '

- in 0,1N Natriumhydroxid:

^ max ^{297nm (E}icm^{= 75}'⁵>'

ORIGINAL INSPECTED

COPY

c) es hat ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol, das in Figur 11 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden I Absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815 und

720 (Nujol);

d) es hat eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung ] der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre ι (I 4w = 9,8) mit der folgenden ungefähren prozentualen

Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,50 %; Wasserstoff 5,10 %; Stickstoff 6,50 %; Chlor 3,80 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 28,10 %; ·

j e) es hat eine Retentionszeit (t_,) von 25,8 Minuten bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer j

5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearer; Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A : in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B:

25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 j mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t_, 8,84 Minuten) ;

f) es hat eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion;

g) es hat eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion und

h) es hat ein Molekulargewicht von etwa 1891, bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie.

COPY

Faktor 5 von Teichomycin A2 ist ein weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei 210⁰C anfängt, dunkel zu werden, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, und das die folgenden Eigenschaften aufweist: 5

a) es ist frei löslich in Wasser bei pH >7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol

bei pH <2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin; 10 schlecht löslich in Methanol und Ethanol; und

ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan,

Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff;

b) es hat ein UV-Absorptionsspektrum, das in Figur 12 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden Absorption smaxima :

- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure: ²⁰ *max ²⁷⁸ ™ ^(Eicm ^{= 49}'⁶⁾

- in Phosphatpuffer pH 7,4: ^ ²⁷⁸ i

max

25 - in 0,1N Natriumhydroxid: ^ ^{297 nm (E}'" = ⁷⁸'⁸⁾

max

c) es hat ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol, das in Figur 13 der Zeichnungen gezeigt ist, mit den folgenden bemerkbaren Absorptionsmaxima: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815 und 720 (Nujol);

ORIGINAL INSPECTED COPY

- 29 -

d) es hat eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung dor Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (% Aw = 10,1) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,60 %; Wasserstoff 5,05%; Stickstoff 6,6 3 %; Chlor 3,8 5 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 27,87 %;

e) es hat eine Retentionszeit (t ) von 26,4 Minuten bei

SS.

Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer 5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 4 0 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert j bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t 8,84 Minuten);

f) es hat eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion; 20

g) es hat eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion; und

Jeder der Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A_? enthält eine saure Funktion, die zur Salzbildung befähigt ist. Die Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und pharmazeutisch vet:L Täglichen Ammoniumsalze der Faktoren 1, J., 3, 4 und b

weitere von Teichomycin A_? stellen eine^besondere Ausführungsform

der vorliegenden Erfindung dar.

COPY

BAD ORIGINAL

Zu den repräsentativen Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalzen gehören die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu den Ammoniumsalzen gehören das Ammoniumsalz, die primären, sekundären oder tertiären (C₁-C.)-Alkylammoniumsalze und die Hydroxy-(C₁-C,)-alkylammoniumsalze.

Die Alkali- und Erdalkalimetallsalze werden nach üblichen Verfahren, wie sie gewöhnlich zur Herstellung von Metallsalzen angewendet werden, hergestellt- Beispielsweise können die Faktoren 1, 2, 3, 4 oder 5 von Teichomycin Ay in der freien sauren Form in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Propylenglykql, gelöst werden, und sodann kann die erhaltene Lösung nach und nach mit etwa der stöchiometrischen Menge einer geeigneten, ausgewählten Mineralbase versetzt werden.

Das sich bildende Alkali- oder Erdalkalimetallsalz wird dann durch Ausfällung mit einem Nichtlösungsmittel und Filtration gewonnen.

Diese Salze können auch in einer im wesentlichen wasserfreien Form durch Lyophilisation gebildet werden; in diesem Fall werden wäßrige Lösungen, die die gewünschten 5 Salze enthalten und aus der Salzbildung der freien sauren Form mit einem geeigneten, ausgewählten Alkali- oder Erdalkalimetallcarbonat oder -hydroxid in solcher Menge, daß ein pH-Wert zwischen 7 und 8 erreicht wird,ν von irgendwelchen unlöslichen Bestandteilen abfiltrj crt und dann

30 lyophilisiert.

Die organischen Ammoniumsalze können entweder durch Zusatz des zweckmäßig ausgewählten Amins zu einer Lösung der

ORIGINAL INSPECTED COPY

freien sauren Form des Faktors 1, 2, 3, 4 oder 5 von Teichomycin A-, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Propylenglykol, und anschließendes Abdampfen des Lösungsmittels und des Überschusses des als Reaktionsmittel eingesetzten Amins oder auch durch Inberührungbringen der beiden Reaktionsmittel in der minimalen Wassermenge und anschließendes Ausfällen der erhaltenen Salze durch Zusatz eines Nichtlösungsmittels hergestellt werden.

Wie bereits ausgeführt wurde, enthält jeder der Faktoren 1,2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A- auch eine basische Funktion, die zur Salzbildung befähigt ist. Ihre pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze, die auf an sich bekannte Weise durch Zusammenbringen der reinen einzelnen Faktoren mit einer ziemlich starken Säure, vorzugsweise mit einer Mineralsäure, hergestellt werden können, stellen eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Herstellung des Natriumsalzes von Faktor 2 von Teichomycin A-

Eine wäßrige Lösung von 150 mg Faktor 2 von Teichomycin

A₂ in 15 ml Wasser wird durch tropfenweise Zugabe von 0,1N NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht. Die erhaltene Lösung wird filtriert, in die Kammer eines Gefriertrocknungssystems gebracht und gefroren. Nachdem das Gefrieren abgeschlossen ist, wird die Kammer auf einen Druck von 0,133 mbar evakuiert, und Eis wird sublimiert, indem man die Heizplatte auf 0°C bringt. Das Verfahren wird fortgesetzt, bis das Produkt fast trocken (etwa 1 % Feuchtigkeit) ist. Eine Titration einer Lösung des so erhaltenen Natriumsalzes von Faktor 2

COPY

von Teichomycin A~ in 2 5 ml eines Gemiches aus 3 Teilen Methylglykol und 1 Teil H₂O mit 0,1N HCl ergab die Gegenwart von zwei titrierbaren Funktionen, die durch die folgenden pK-Werte gekennzeichnet waren: pK = 7,03 und pK = 4,78.

Nach dem vorstehenden Verfahren, wobei jedoch von den Faktoren 1, 3, 4 und 5 von Teichomycin A- ausgegangen wurde, wurden die entsprechenden Natriumsalze erhalten. Eine Bestimmung der Natriummenge in den als Endprodukte erhaltenen Salzen bestätigte die Bildung eines Mononatriumsalzes.

Die antibakterielle in vitro-Wirksamkeit der Faktoren

15 1, 2, 3, 4, und 5 von Teichomycin A₂, die sich als

hauptsächlich wirksam gegenüber grampositiven Bakterien erwiesen, wurde gegen klinische Isolate von Staphylococcen und Streptococcen unter Anwendung der zweifachen Verdünnungsmethode im Mikrotitersystem bestimmt. Für Staphylococcen wurde Penassay-Brühe (Difco) verwendet, und für Streptococcen wurde Todd-Hewitt-Brühe (Difco) verwendet. Über Nacht wurden die Brühenkulturen derart · verdünnt, daß das endgültige Inokulum etwa 10 Kolon ien bildende Einheiten pro ml enthielt. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) wurde als die geringste Konzentration bestimmt, die nach einer Inkubation bei 37°C für die Dauer von 18 bis 24 Stunden kein sichtbares Wachstum zeigte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt:

ORIGINAL INSPECTED BAD

Tabelle II

Antibakterielle Wirksamkeit der Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A in vitro

CO CO KJ O CO

Mikroorganismus

Anzahl der getesteten Stämme

Teichomycin A,

Faktor

MHK

Teichomycin A,

Faktor 2

Teichomycin A.

Faktor

Teichomycin A,

Faktor

Teichomycin A,

Faktor

Staphylococcus	aureus
Staphylococcus	epidermidis
Streptococcus	pyogenes
Streptococcus	pneumoniae
!treptococcus	faecalis
Streptococcus	mitis
Streptococcus	salivarius
Streptococcus	sanguis
Streptococcus	bovis
!treptococcus	agalactiae

5 4 7 6 5 1 1 1 1 1

0,8-1

0,2-1,6 0,05-0,1 0,1-0,2 0,2-0,4

0,025

0,2

0,1 0,4 0,1

0,8-1j6
0,1-1,6
O_rO25-O,1
0,05-0_f1
0_f1-0j4
0,025

0,2

0,1

0,4

0,1

0,4-0,8 0,2-0,8

0,025-0,05 0_r05-0,1 0,1-0,2 0,0125 0_t1 0,1 0,2 0,05

0,2-0,8

O_?2-O_t8

0,006-0,05 0,05-0,1 0,1-0,4

0,025

0,05

0,05 0,4

0,1

0,2-0,8

0,006-0,05

0,05-0,1

0,1-0,4

0,025

0,05

0,05 ··"

♦ » ι

Das Verhältnis der mikrobiologischen Wirksamkeit der einzelnen Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 wurde nach der Agar-Diffusionsmethode unter Anwendung von S.aureus ATCC 6538 als Keimtest und des Komplexes Teichomycin A-als Standard bestimmt. Im einzelnen wird eine angemessene Menge von Faktor 1 von Teichomycin A2/ Faktor 2 von Teichomycin A₂* Faktor 3 von Teichomycin A_?, Faktor 4 von Teichomycin A2, Faktor 5 von Teichomycin A₂ und von dem Komplex Teichomycin A-/ der als Standard eingesetzt wird, in einer Konzentration von 2000 ug/ml in Dimethylformamid gelöst. Diese Lösungen werden weiter unter Anwendung von Phosphatpuffer 0,067M pH 7,4, ergänzt durch 1 % Rinderserum, verdünnt, um die folgenden Konzentrationen bereitzustellen: 2,5, 5,

15 10 und 20 μg/ml.

Dann werden Filterpapierscheiben mit den Probenlösungen getränkt und in regelmäßigen Abständen auf die Oberfläche von Agarplatten, die mit einer Suspension des Test-Mikroorganismus beimpft sind, gelegt. Die Platten werden 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert, und dann werden die Durchmesser der Inhibierungszonen gemessen. Die erhaltenen

Daten werden in einen Computer eingegeben, um die Wirksamkeit '

der einzelnen Faktoren im Verhältnis zum Komplex zu | berechnen. ^!

Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Faktor 1 von Teichomycin A₂ 841 E/mg

30 Faktor 2 von Teichomycin A- 1086 E/mg

Faktor 3 von Teichomycin A- 1131 E/mg

Faktor 4 von Teichomycin A- 1066 E/mg

Faktor 5 von Teichomycin A- 954 E/mg

Komplex Teichomycin A- 1000 E/mg

ORIGINAL INSPECTED COPY

Die Faktoren 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A~ wurden auch in durch S.pneumoniae und durch S.pyogenes in Mäusen verursachten experimentellen Infektionen getestet. Die Versuche wurden im Vergleich mit dem Komplex Teichomycin Ä2 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt:

Tabelle III Antibakterielle Wirksamkeit in vivo

Verbindung	ED₅₀ (mg/kg/Tag) s.c.	S.pyogenes L 49
Faktor 2 von Teichomycin A_	S.pneumoniae L 44
Faktor 3 von Teichomycin A_		0jl5 (0_;13-0,18)
Faktor 4 von Teichomycin A_	O_?28 (0,22-0,34)	0.13 (0.11-0.16)
Faktor 5 von Teichomycin A₂	0,27 (Ο_}23-Ο_?32)	0_;098-(0,073-0_Λ11)
Komplex Teichomycin A„	0jl2 (0,98-0^14)	0,10 (0j098-0_;13)
Ojl3 (OjIO-O,15)	0,18 (-)
O_}35 (0,28-0^44)

Die ungefähre akute Toxizität in Mäusen (i.p.) für die Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A-ist in der nachstehenden Tabelle IV angegeben:

COPY

Tabelle IV Akute Toxizität in Mäusen (i.p.)

Verbindung ungefähre LDc₀ (mg/kg)

Faktor 1 von Teichomycin A₂ > 1 500 < 2 000

Faktor 2 von Teichomycin A₂ > 1 500 <2 000

Faktor 3 von Teichomycin A₂ >1 000 < 1 500

Faktor 4 von Teichomycin A₂ J 500 < 1 000

Faktor 5 von Teichomycin A₂ > 500 C1 000

Nach den vorstehenden Ergebnissen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, d.h. Faktor 1 von Teichomycin A₂, Faktor 2 von Teichomycin A₂/ Faktor 3 von Teichomycin A₂ , Faktor 4 von Teichomycin A₂ und Faktor 5 von Teichomycin A₂, wirksam als wirksame Bestandteile von antimikrobiellen Zubereitungen in der Humanmedizin und Veterinärmedizin für die Bekämpfung und Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch pathogene Bakterien verursacht werden, welche jempfindlich gegenüber den wirksamen Bestandteilen sind, eingesetzt werden. In derartigen Behandlungen können diese Verbindungen als solche eingesetzt oder als einzelne Faktoren verwendet oder auch - unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit ihres Wirksamkeitsmusters - in Form von Gemischen von zwei oder mehreren der fünf Faktoren in jedem Verhältnis

30 . angewendet werden.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können oral örtlich oder parenteral verabreicht werden, wobei jedoch

die parenterale Verabreichung am meisten bevorzugt wird. Je nach dem Verabreichungsweg können diese Verbindungen zu zahlreichen Dosierungsformen formuliert werden. Zubereitungen für die orale Verabreichung können in Form von Kapseln, Tabletten, flüssigen Lösungen oder Suspensione vorliegen. Die Kapseln und Tabletten können in bekannter Weise zusätzlich zu dem wirksamen Bestandteil übliche Träger, wie Verdünnungsmittel, z.B. Lactose, Calciumphospha Sorbit und dgl., Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyethylenglykol, Bindemittel, z.B. Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Sorbit, Traganthgummi, Arkaziengummi, Geschmacksstoffe, sowie verträgliche Spreng- und Befeuchtungsmittel enthalten. Die flüssigen Zubereitungen, die im allgemeinen in Form von wäßrigen oder öligen Lösunge.

oder Suspensionen vorliegen, können übliche Zusatzmittel, z.B. Suspendiermittel, enthalten. Für die örtliche Anwendung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch in geeigneten Formen für die Absorption durch die Haut, die Schleimhäute der Nase und Zunge oder die Bronchialgewebe hergestellt werden und können zweckmäßig in Form von flüssigen Sprühpräparaten oder Inhaliermitteln, Pastillen oder Mitteln zum Bepinseln der Zunge vorliegen. Für die medizinische Behandlung der Augen und Ohren kann die Zubere itung in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen. Anwendungsformen für die örtliche Anwendung können in hydrophoben oder hydrophilen Grundlagen als Salben, Cremes, Lotionen, Anstreichmittel oder Pulver formuliert werden.

0 Zubereitungen für die Injektion können in Formen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Formulierungsmittel, wie z.B. Suspendiermittel, Stabilisatoren und/oder

COPY

- 3β -·

Dispergiermittel, enthalten. Es kann auch der wirksame |

Bestandteil in Pulverform vorliegen, um zur Zeit der Abgabe mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem Wasser, |

erneut formuliert zu werden. I

Die zu verabreichende Menge des wirksamen Bestandteils hängt von zahlreichen Faktoren, z.B. der Größe und dem Zustand des zu behandelnden Lebewesens, dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung und dem Grund

10 für die Verabreichung, ab.

Die Faktoren 1, 2, 3, 4 und 5 von Teichomycin A~ sind im allgemeinen wirksam in einer täglichen Dosis zwischen etwa 0,1 und etwa 20 mg des wirksamen Bestandteils pro kg Körpergewicht, die gegebenenfalls in zwei Verabreichungen pro Tag unterteilt werden kann. Besonders erwünschte Zubereitungen sind diejenigen, die in Form von Dosierungseinheiten mit einem Gehalt von etwa 50 bis etwa 2 50 mg/Einheit hergestellt sind.

Nachfolgend werden repräsentative Beispiele für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen gegeben:

,Eine parenterale Lösung wird hergestellt mit

100 mg des Natriumsalzes von Faktor 2 von Teichomycin A2 '

gelöst in 2 ml sterilem Wasser zur Injektion.

Eine parenterale Lösung wird hergestellt mit

250 mg des Natriumsalzes von Faktor 3 von Teichomycin A₂

gelöst in 3 ml sterilem Wasser zur Injektion.

Eine Salbe zur örtlichen Anwendung wird hergestellt mit

ORIGINAL !NSPECTED COPY

332G3A2

200 mg Faktor 2 von Teichomycin A₂ 6 00 mg Polyethylenglykol 4 000 U.S.P. 1,2 g Polyethylenglykol 400 U.S.P.

5 Neben ihrer Wirksamkeit als Medikamente können die

erfindungsgemäßen Verbindungen auch als wachstumsförderndes Mittel für Tiere eingesetzt werden. Für diesen Zweck wird eine oder werden mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen oral in einem geeigneten Futter verabreicht. ; Die genaue Konzentration, die angewendet wird, ist diejenige, die erforderlich ist, um eine das Wachstum fördernde wirksame Menge des wirksamen Mittels bereitzustellen,, wenn übliche Mengen des Futters verbraucht werden.

Der Zusatz der wirksamen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zum Tierfutter wird vorzugsweise so vorgenommen, daß zunächst ein geeignetes Futtervorgemisch hergestellt wird, das die wirksamen Verbindungen in einer wirksamen Menge enthält, und dieses Vorgemisch dann in die vollständige

20 Ration eingearbeitet wird.

Es kann auch ein Zwischenkonzentrat oder Futterzusatz, der den wirksamen Bestandteil enthält, in das Futter eingemischt werden.

Die Art und Weise, in der derartige Futtervorgemische und vollständige Rationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in der Literatur, z.B. in "Applied Animal Nutrition" von W.H. Freedman und Co., S. Francisco, USA, 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding" von O. und B.Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977, auf die hier besonders verwiesen wird, beschrieben.

COPY

BAD ORIGINAL

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Im wesentlichen reine, einzelne antibiotische Verbindung ausgewählt aus Faktor 1 von Teichomycin A₂/ Faktor 2 von Teichomycin A₂, Faktor 3 von Teichomycin A₂, Faktor 4 von Teichomycin A₂ und Faktor 5 von Teichomycin A₂, die jeweils durch die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften identifizierbar sind:

Faktor 1 von Teichomycin A₂: ein weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei etwa 220⁰C anfängt, dunkel zu werden, und bei 255°C vollständig zersetzt ist, welches

a) frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert >7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol bei einem pH-Wert <2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin; 20

schlecht löslich in Methanol und Ethanol und

ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, η-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetate und j Tetrachlorkohlenstoff ist; :

b^ ein UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorption smaxima auf v/eist:
- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure: »_max 278 nm (E¹^ = 49,5)

- in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4: ²⁷⁸ ™ <^Eicm = ⁵⁰'⁰⁾

- in O,1N Natriumhydroxid: ²⁹⁷ ™ (^Eicm= ⁷²'^Ί)

⁵ λ max

c) ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890,

845, 815, 720 (Nujol);

d) eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (% Aw = 8,5) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 56,70%; Wasserstoff 4,90 %; Stickstoff 6,65 %; Chlor 3,80%; und Sauerstoff (durch Differenz) 27,95% aufweist;

20 e) eine Retentionszeit (t ) von 21,2 Minuten bei

XV

Analyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(HPLC) mit Umkehrphase unter Verwendung einer . ·

(R)
5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 %an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0

mit 0,1N NaOH;

Lösung B: 25 rrJA NaH₃PO₄/Acetonitril (3/7) , gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxy-

toluol t_n 8,84 Minuten) aufweist;

f) in dem 2 70 MHz H NMR-Spektrum aufgezeichnet in Dimethylsulfoxid-dg mit Zusatz einiger Tropfen an D₂O (Konzentration 25 mg/0,5 ml) (TMS als interner Standard: S = 0,00 ppm) die folgenden

5 Gruppen von Signalen aufweist: 0,8-1,5 (m) ;

1,7-2,3 (m) ; 2,7-4,0 (m) ; 4,0-4,7 (m); • 4,8-5,8 (m); und 6,2-8,1 (m) ; \

g) eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion aufweist; 10

h) eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion aufweist; und

i) ein Molekulargewicht von etwa 1875, bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie, aufweist;

Faktor 2 von Teichomycin A-: weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen auf 210⁰C anfängt, dunkel zu werden, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, welches 20

a) frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert >7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylengiykol bei einem pH-Wert von £.2;

2 5 etwas löslich in Methylglykol und Glycerin;

schlecht löslich in Methanol und Ethanol; und

ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat

und Tetrachlorkohlenstoff ist;

COPV

b) ein UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:

- in 0,1 N Chlorwasserstoffsäure:

λ 278 nm (e]^% = 48) /imax 1cm

- in Phosphatpuffer pH 7,4:

^{278 nm (E}icm = ⁴⁹'⁰⁾

- in 0,1N Natriumhydroxid: ¹⁰ *max ^{297 nm} <^Eicrn = ⁷⁰'⁰⁾

c) ein IR-AbsorptionsSpektrum in Nujol mit den folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima aufweist: 3700-3100, 2960-2860 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1300, 1260, 1230, .

1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (Nujol);

d) eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (%Aw = 9,8) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt) aufweist: Kohlenstoff 56,15 %; Wasserstoff 5,15 %; Stickstoff 6,30 %; Chlor 3,90 % und Sauerstoff (durch Differenz) ' 28,50 %;

e) eine Retentionszeit (t_n) von 22,6 Minuten bei

Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer

(R)
5 μ Zorbax ODS-Säule und Eluieruny mil·, einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 S an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₂PO₄/ Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₉PO₄ / Ac α ton .i tril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließ-

ORIGJNAL INSPECTED COPY

geschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t_D 8,84 Minuten) aufweist;

f) in dem 270 MHz H NMR-Spektrum aufgezeichnet in Dimethylsulfoxid-dg mit Zusatz weniger Tropfen

an D₂O (Konzentration 25 rag/0,5 ml) (TMS als interner Standard: o= 0,00 ppm) die folgenden Gruppen von Signalen zeigt: 0,7-1,5 (m); 1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m) ; 4,6-5,7 (m); und 6,2-8,1 (m) ;
10

g) eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion aufweist;

h) eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion

aufweist; und
15

i) ein Molekulargewicht von etwa 1877, bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie, aufweist;

Faktor 3 von Teichomycin A₂: weißes amorphes Pulver, 20 das beim Erhitzen auf 205⁰C anfängt, sich zu zersetzen, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, welches

a) frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert von >7,0

oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylen-25 glykol bei einem pH-Wert von <2;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin;

schlecht löslich in Methanol und Ethanol und 30

ziemlich unlöslich in Chloroform, Benzol, η-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff ist;

b) ein UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:

in O,1N Chlorwasserstoffsäure ^{278 nm (E}icm ^{= 49}'²⁾

⁵ * max

- in Phosphatpuffer pH 7,4:

Ä 278 nm (e]^% = 50,8)

max '1cm '

- in 0,1N Natriumhydroxid: ^h max ^{297nra (E}icm^{= 72}'⁷⁾'·

c) ein IR-AbsorptionsSpektrum in Nujol mit den folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima aufweist: 3700-3100, 2960-2850 (Nujol); 1645, 1590; 1510; 1460 (Nujol), 1375 (Nujol); 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (Nujol);

d) eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der

Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre

=12,0) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt) aufweist: Kohlenstoff 56,26 %, Wasserstoff 5,20 %; Stickstoff 6,6 9 %; Chlor 3,9 5 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 27,90 %;

e) eine Retentionszeit (t ) von 23,3 Minuten bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer 5μ Zorbax ODS-Säule und Eluieren mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 τηΜ NaH₉PO./Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1 NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (3/7) , gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit von

ORIGINAL INSPECTED COPY

2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxytoluol t_D 8,84 Minuten) aufweist;

f) in dem 270 MHz H NMR-Spektrum aufgezeichnet in DMSO-d,- mit Zusatz weniger Tropfen von D-O

(Konzentration 25 mg/O,5 ml) (TMS als interner Standard: £ = 0,00 ppm) die folgenden Gruppen von Signalen zeigt: 0,7-1,5 (m); 1,8-2,0 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); und 6,2-8,0 (m) ; 10

g) eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion aufweist;

h) eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion

aufweist; und
15

i) ein Molekulargewicht von etwa 18 77, bestimmt durch

FAB-Massenspektrometrie aufweist;

Faktor 4 von Teichomycin A-: weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei etwa 210⁰C anfängt, dunkel zu werden/ und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, welches

a) frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert >7,0 oder in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylenglykol bei einem pH-Wert von <2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin;

schlecht löslich in Methanol und Ethanol und 30

COPY

332034Z

b) ein UV-AbsorptionsSpektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:
- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure:

^ ²⁷⁸ ™ ^{Eicm = ⁵²'⁵⁾

- in Phosphatpuffer pH 7,4; ^ ^{278 nm {E}lcm^{= 52}'⁵⁾

- in 0,1N Natriumhydroxid: ¹⁰ ^max ²⁹⁷ ™ <^Εί1= ⁷⁵'⁵>'"

c) ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510,- 1460 (Nujol), 1375 (Nujol·),. 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815 und 720 (Nujol);

d) eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (? 4w = 9,8) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt) aufweist: Kohlenstoff 56,50 %; Wasserstoff 5,10 %; Stickstoff 6,50 %; Chlor 3,80 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 28,10 %;

e) eine Retentionszeit (t ) von 25,8 Minuten bei

Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer (R)

5μ Zorbax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH₃PO₄/Acetonitril (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; Lösung B: 25 mM NaH₂PO₄/Acetonitril (3/7), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer F Ließgeschwindigkeit von 2 ml/Min.; (interner Standard:· 3,5-Dihydroxy-

35 toluol t_D 8,84 Min.) aufweist;

^R BAD ORIGINAL

COPY

— Q —

f) eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion aufweist,

g) eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion aufweist und

h) ein Molekulargewicht von etwa 1891, bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie, aufweist;

Faktor 5 von Teichomycin A₂: weißes amorphes Pulver, das beim Erhitzen bei 210⁰C anfängt, dunkel zu werden, und bei 250⁰C vollständig zersetzt ist, welches

a) frei löslich in Wasser bei einem pH-Wert <>7,0 oder | in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Propylen- j glykol bei einem pH-Wert<£2,0;

etwas löslich in Methylglykol und Glycerin; schlecht löslich in Methanol und Äthanol und

ziemlich in unlöslich in Chloroform, Benzol, n-Hexan, Acetonitril, Ethylether, Aceton, Ethylacetat und Tetrachlorkohlenstoff ist;

b) ein UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:

- in 0,1N Chlorwasserstoffsäure: 30

ft 278 nm (e]^%
max 1 cm

- in Phosphatpuffer pH 7,4:
»max ^{278 nm (E}icm = ⁵¹'⁸⁾

- in 0,1N Natriumhydroxid:
*_max 297 nm (E^ = 78,8);

COPY

332034;;

c) ein IR-Absorptionsspektrum in Nujol mit den folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima aufweist: 3700-3100, 2960-2840 (Nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (Nujol), 1375 (Nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815 und 720 (Nujol);

d) eine Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 140⁰C unter inerter Atmosphäre (% Aw = 10,1) mit der folgenden ungefähren prozentualen Zusammensetzung (Durchschnitt) aufweist:

Kohlenstoff 56,60 %, Wasserstoff 5,05 %; Stickstoff 6,63 %; Chlor 3,85 %; und Sauerstoff (durch Differenz) 27,87 %;

e) eine Retentionszeit (t„) von 26,4 Minuten bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung einer 5μ Zor-

(R)

bax ODS-Säule und Eluierung mit einem linearen

Gradienten von 0 % bis 50 % an Lösung B in Lösung A i

in 40 Minuten (Lösung A: 25 mM NaH^PO₄/Acetonitril j

.20 (9/1), gepuffert bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH; j

Lösung B: 25 mM NaH^PO./Acetonitril (3/7), gepuffert j bei pH 6,0 mit 0,1N NaOH) mit einer Fließgeschwindigkeit;

von 2 ml/Min.; (interner Standard: 3,5-Dihydroxy- ! toluol t_D 8,84 Minuten) aufweist;

f) eine zur Salzbildung befähigte saure Funktion aufweist;

g) eine zur Salzbildung befähigte basische Funktion aufweist; und

h) ein Molekulargewicht von etwa 1891 , bestimmt durch FAB-Massenspektrometrie, aufweist;

und deren pharmazeutisch verträgliche Salze. 3 5

COPY

2. Eine im wesentlichen reine, einzelne antibiotische Verbindung ausgewählt aus Faktor 1 von Teichomycin A₂, Faktor 2 von Teichomycin A₃ und Faktor 3 von Teichomycin A₂, identifizierbar durch die in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften, sowie deren Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und pharmazeutisch verträglichen Ammoniumsalze.

3. Im wesentlichen reine, einzelne antibiotische Verbindung, ausgewählt aus Faktor 2 von Teichomycin A₂ und dessen

10 pharmazeutisch verträglichen Salzen.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch dadurch gekennzeichnet, daß man Teichomycin A₂ in an sich bekannter Weise durch Umkehrphasenverteilungs- oder Ionenaustauschchromatographie in die einzelnen Faktoren auftrennt und gegebenenfalls die erhaltenen Verbindungen in die entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Salze umwandelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß I man die Auftrennung durch Säulenchromatographie unter ! Anwendung einer Säule aus silaniertem Silikagel und einer Gradienten-Elution von Acetonitril in verdünnter wäßriger Ammoniumformiatlösung als Entwickler durchführt. |

5 '

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säule in einem linearen Gradienten von 10 % bis 20 % Acetonitril in einer 0,2%igen Ammoniumformiatlösung entwickelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Gewinnung von Gemischen aus zwei Faktoren aus der Säule diese durch Umkehrphasen-säulenchromatographie

COPY

unter Anwendung einer Säule aus Octadecylsilan und eines Gemisches aus Acetonitril zu 0,2 %iger wäßriger Ammoniumformiatlösung im Verhältnis 24:76 als Entwickler in die einzelnen Faktoren auftrennt. 5

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Faktor 2 von Teichomycin A~ den Komplex von Teichomycin A- in einem Gemisch aus 9 Teilen 0,2%iger Ammoniumformiatlösung und 1 Teil Acetonitril unter Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7,5 durch Zusatz von NaOH löst, die erhaltene Lösung durch eine Säule aus silaniertem Silikagel leitet, die Säule in einem linearen Gradienten von 10 bis 20 % Acetonitril in einer 0,2%igen Ammoniumformiatlösung entwickelt, die Fraktionen mit der gleichen HPLC-Profileigenschaft von Faktor 2 von Teichomycin A2 sammelt, das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampf, die zurückgebliebene wäßrige Lösung entsalzt, indem man sie durch eine Säule aus silaniertem Silikagel leitet, die Säule mit Wasser wäscht, sie dann mit einer 50%igen wäßrigen Acetonitrillösung eluiert, das Eluat auf ein geringes Volumen konzentriert und daraus durch Zusatz eines Nichtlösungsmittels den reinen Faktor 2 von Teichomycin A2 ausfällt.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung durch Säulenchromatographie unter Anwendung des Diethylaminoethylderivater? von Agarose als stationäre Phase und Puffcrlösungen oder Gemischen von Pufferlösungen und nichtwäßrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln als Eluenten durchführt.

ORIGINÄC^INSPECTED BAD ORIGINAL ^C0PY

* * fl κ * mm

- 13 -

10. Antibiotisches Gemisch, enthaltend 2, 3, 4 oder alle 5 einzelne Faktoren gemäß Anspruch 1 in jedem Verhältnis.

5

11. Pharmazeutische Zubereitung zur Bekämpfung von Bakterien, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil.

COPY