DE3228006C2 - Deoxybouvardin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue Deoxybouvardin-Derivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung gemäß den Patentansprüchen.

Einige der neuen Verbindungen mit pharmakologischer Wirkung kommen in den zur Gattung Rubia gehörenden Pflanzen vor. Andere Stoffe der Erfindung sind Derivate davon.

Es wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, antineoplastische Extrakte aus Pflanzen zu gewinnen. Bekannte Beispiele für solche Extrakte sind alkaloidhaltige Stoffe, die aus Colchicum autumnal (J. Chem. Soc., (1940), S. 194) oder Vinca Rosea (J. Am. Chem. Soc., Bd. 86, (1964), S. 1440) extrahiert wurden, eine Art von Lignan aus Podophyllum pellatum (J. Am. Chem. Soc., Bd. 75 (1953), S. 235) und anthamakrolide Stoffe mit ähnlicher Molekülstruktur wie Rifamycin, die aus Celastraceae extrahiert wurden. Unter den Stoffen, die aus niedrigen Pflanzen, wie Pilzen, extrahiert wurden, ist beispielsweise ein Protein und Polysaccaride enthaltender Stoff aus Coriolus versicolor bekannt und im Handel (Ganto Kagakuryoho 1 (1974), S. 251). Trotzdem wurde nur eine geringe Zahl von solchen Extrakten in der Praxis als Arzneimittel benutzt.

Es wurden auch zahlreiche Anstrengungen unternommen, einzelne Stoffe mit hervorragender pharmakologischer Wirkung aus Pflanzen zu gewinnen. Auch diese Versuche haben bisher nur geringe Erfolge gebracht.

Aus der US-PS 4 226 856 ist die Verbindung Desoxybouvardin bekannt. Die Verbindung zeigt zwar eine sehr gute pharmakologische Wirksamkeit, jedoch ist eine noch bessere Wirksamkeit wünschenswert. Auch liefert das Verfahren zur Gewinnung des Desoxybouvardins das in dieser Patentschrift offenbart wird, nur verhältnismäßig geringe Ausbeuten und es besteht ein Bedarf nach Verfahren, mit denen diese und neue Verbindungen leicht und in höheren Ausbeuten zur Verfügung gestellt werden können. Die Verbindung, die in der US-PS 4 226 856 als Desoxybouvardin bezeichnet wird, wird im folgenden als TPC-A bezeichnet.

Schließlich wurden andererseits auch zahlreiche Arbeiten durchgeführt, deren Ziel die Herstellung solcher Arzneimittel auf chemisch synthetischem Weg war. Fast alle diese Arbeiten wurden aber ohne nennenswerten Erfolg wieder abgebrochen. Ein Grund dafür ist die Tatsache, daß derartige synthetisch hergestellte Arzneistoffe bei der Anwendung ernste Nebenwirkungen zeigten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit pharmakologischer Wirkung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Gewinnung bereitzustellen.

Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf Untersuchungen über die medizinische Anwendung von Pflanzen und Arbeiten über die Gewinnung von wertvollen Inhaltstoffen solcher Pflanzen. Heilpflanzen wurden in der Volksmedizin seit langer Zeit eingesetzt und haben auch heute infolge ihrer geringen Toxizität und gemäßigten pharmakologischen Wirkung in der modernen Medizin ihren Platz. Die mit Heilpflanzen erzielbaren Wirkungen werden deshalb wieder in stärkerem Maße beachtet. Es konnte festgestellt werden, daß der rohe Extrakt von Krapp (Rubia spp) hervorragende therapeutische Wirkungen aufweist. Außerdem kann ein einheitlicher Stoff durch Reinigung des Rohextrakts gewonnen werden, der starke antineoplastische Wirkung besitzt.

Die Verbindungen der Erfindung besitzen antineoplastische Aktivität und haben außerdem therapeutische Wirkungen, wie insbesondere Brechreiz erregende, Appetit zügelnde psychotrope, gefäßverengende, Papaverin-, Antiparkinson- und antidiuretische Wirkung.

In der beiliegenden Zeichnung zeigen die Fig. 1 bis 3 die IR-Spektren der in Beispiel 1 erhaltenen Verbindung, das ist der Verbindung TPC-A, des Methylester-Derivates davon und des in Beispiel 22 erhaltenen acetylierten Derivates von TPC-A.

Die als Ausgangsmaterial verwendete Pflanze Rubia akane, aus der die Verbindung TPC-A und das Methyläther-Derivat davon gewonnen wurden, ist eine ganzjährige Pflanze, die auf den Feldern und Bergen der ganzen Welt verbreitet ist. Ihre rotgelbe Wurzel wurde in der orthodoxen chinesischen Medizin zur Blutreinigung, und als Menstruation förderndes und hämostatisches Mittel sowie in der Volksmedizin in Form eines Absudes zur Behandlung von Erkältungen, Herzleiden und Kontusionen verwendet.

Es ist bekannt, daß Rubia spp Anthraquinone, Nepetalactone, Triterpenoide, Saponine und Alkaloide enthält. Ein einzelner Wirkstoff wurde jedoch bisher weder extrahiert noch gewonnen.

Die Verbindung TPC-A mit einer Hydroxylgruppe, die aus Rubia akane und R. cordiforia extrahiert und gewonnen werden kann, weist selbst antineoplastische Wirkung auf und hat vermutlich auch noch andere pharmakologische Aktivitäten. Außerdem ist diese Verbindung ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von Derivaten, die durch chemische Modifikation der freien Hydroxyl- und/oder Iminogruppe erhalten werden können.

Die Verbindung TPC-A kann aus Rubia akane und R. cordiforia extrahiert werden. Dazu wird getrocknete Rubia akane oder R. cordiforia mit Methanol, Äthanol, Chloroform oder Essigsäureäthylester extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird konzentriert und das Rohkonzentrat zur Isolierung des Wirkstoffs nach chromatographischen Verfahren gereinigt.

Das Methyläther-Derivat von TPC-A kann im gleichen Verfahren aus einer anderen Fraktion als das TPC-A ebenfalls aus Rubia akane und R. cordiforia extrahiert werden. Diese Verbindung kann außerdem auch durch Methylierung der Verbindung TPC-A an der freien Hydroxylgruppe in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Auch diese Verbindung kann als Ausgangsstoff für andere Derivate eingesetzt werden.

Bei der Methylierungsreaktion kann je nach der Art des verwendeten Methylierungsmittels ein Alkohol, ein Äther oder ein wäßriges Lösungsmittel als geeignetes Reaktionsmedium eingesetzt werden. Ferner kann ein übliches Methylierungsmittel, wie ein Methylhalogenid, Diazomethan oder Dimethylsulfat verwendet werden. Die Methylierung der Verbindung TPC-A kann wie eine übliche Methylierungsreaktion durchgeführt werden.

Bei der Durchführung der Extraktion als säulenchromatographisches Verfahren an Aktivkohle wird als Laufmittel vorzugsweise ein weniger polares Lösungsmittel als im Extrakt eingesetzt, beispielsweise Benzol, Chloroform, Essigsäureäthylester, Methanol oder Gemische davon. Wenn die Trennung als Flüssigchromatographie durchgeführt wird, ist die Verwendung einer chromatographischen Säule mit reverser Phase, wie C-18 (Waters Associates Inc.), RP-8 oder RP-18 (Merck & Co., Inc.) sowie einer mit ODS behandelten Kieselgel-Säule bevorzugt.

Weitere Derivate von TPC-a und Methyläther davon können nach folgenden Verfahren erhalten werden.

Von den neuen Verbindungen der Erfindung können diejenigen Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R₁ ein Alkyl-, Cycloalkyl- oder ein Carboxyalkylrest oder ein Ester davon ist, leicht durch Umsetzen der aus Krapp gewonnenen Verbindung TPC-A mit einem Alkylierungsmittel, wie einem Alkylhalogenid, einem Methylierungsmittel, einem Cycloalkylhalogenid oder einem Carboxyalkylhalogenid oder einem Äther davon hergestellt werden. Beispiele für geeignete Alkylierungsmittel sind C_1-20-Alkylhalogenide, beispielsweise die Bromide, C_3-6-Cycloalkylhalogenide, beispielsweise die Bromide, und C_1-5-Carboxyalkylhalogenide, ebenfalls beispielsweise die Bromide, oder die niedrigen Alkylester davon.

Die Alkylierung der OH-Gruppe an einem Phenylring ist bekannt. Sie wird im erfindungsgemäßen Verfahren in üblicher Weise durchgeführt.

Die Verbindungen der Formel I, in der R₁ einen Acylrest darstellt, können durch Umsetzung der Verbindung TPC-A mit einem Acylierungsmittel nach einem üblichen Acylierungsverfahren hergestellt werden. Als Acylierungsmittel eignen sich Acylhalogenide oder Säureanhydride, wie die Anhydride von Essigsäure, Propionsäure Buttersäure, Isobuttersäure, Crotonsäure, Valeriansäure, Capronsäure, Enanthansäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Stearinsäure, Benzoesäure, o-, m- und p-Chlorbenzoesäure, m- und p- Nitrobenzoesäure, Zimtsäure und Phenylessigsäure. Ebenso können die Chloride oder Bromide dieser Säuren im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Bei der Verwendung eines Methansulfonsäurehalogenids anstelle der genannten Acylierungsmittel wird in gleicher Weise der Methansulfonsäureester von TPC-A erhalten.

Die Verbindungen der Formel I, in der R₃ eine Amino- oder Nitrogruppe darstellt, können beispielsweise durch Nitrieren von TPC-A und gegebenenfalls Reduzieren der dabei eingeführten Nitrogruppe gemäß üblichen Nitrier- und Reduktionsverfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel I, in denen mindestens einer der Reste R₂ eine Methylgruppe bedeutet, können durch Methylieren des Methyläther-Derivates von TPC-A mit einem bekannten Methylierungsmittel, wie Diazomethan, Methylhalogeniden, insbesondere Methyljodid, oder Dimethylsulfat in Gegenwart eines Alkalimetallhydroxids, Alkalimetallcarbonats oder von Kaliumfluorid hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel I, in der R₁ einen Glucoserest darstellt, können durch Umsetzung von TPC-A mit einer aktivierten und mit Schutzgruppen versehenen Glucose in Gegenwart eines Katalysators, wie Natriumhydrid, Silberoxid, Silberperhydrochlorid oder einem anderen Silbersalz hergestellt werden. Die Aktivierung der Glucose kann in üblicher Weise vorgenommen werden. Als Schutzgruppen eignen sich z. B. Acetyl-, Benzoyl-, Benzyl- und andere Acylgruppen, die nach der Umsetzung unter milden Bedingungen abgespalten werden können.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

(i) Extraktion: 500 g trockenes Ausgangsmaterial (Wurzeln von Rubia cordiforia) werden mit 1 Liter Methanol versetzt. Die Extraktion wird 3 Stunden unter Erhitzen im heißen Wasserbad durchgeführt. Danach wird der Extrakt vom Rückstand abfiltriert. Der Rückstand wird erneut mit 1 Liter frischem Methanol extrahiert. Nach der Wiederholung des Extraktionsverfahrens werden die erhaltenen Extrakte vereinigt und im Vakuum eingedampft. Es werden 27 g Rohextrakt erhalten.

25 g des erhaltenen Rohextrakts werden in 200 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 250 g Aktivkohle gefüllte Säule zur Chromatographie gegeben (Wako Inc.). Nach dem Waschen der Säule mit Methanol wird die Eluierung mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol sowie mit Chloroform durchgeführt. Die erhaltenen eluierten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden 10 g Öl mit rötlichbrauner Farbe erhalten.

9 g des erhaltenen öligen Produktes werdene in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und auf eine mit 400 g Kieselgel gefüllte Säule aufgebracht. Die Säule wird mit Chloroform, einem Gemisch von Chloroform und Essigsäureethylester sowie mit Essigsäureäthylester in dieser Reihenfolge gewaschen, bevor die Eluierung mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol durchgeführt wird. Das erhaltene Eluat wird gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Ausbeute: 1,4 g Produkt n Form eines Öls.

1,3 g des vorstehend erhaltenen Produktes werden in einer geringen Menge Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 150 g Kieselgel gefüllte Säule aufgebracht. Sodann wird die Säule mit Chloroform und einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis 100 : 1 gewaschen und dann mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis 100 : 3 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden 250 mg festes Produkt erhalten.

Der erhaltene Feststoff wird in einer kleinen Menge eines Gemisches aus Chloroform und Methanol gelöst. Nach dem Entwickeln der Lösung auf einer Dünnschichtplatte (Art 7544 - Merck & Co., Inc.) mit Hilfe eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 100 : 15 werden die erhaltenen Banden mit dunkelblauer Farbe bei Bestrahlung mit UV-Licht von 254 nm, was einem R_f-Wert von 0,60 bis 0,71 bzw. 0,50 bis 0,59 entspricht, in getrennte Säulen gebracht. Die Säulen werden mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol eluiert. Nach dem Eindampfen der Eluate unter vermindertem Druck zur Trockne werden 56 bzw. 24 mg schwach braun gefärbter Feststoff aus den Fraktionen mit hohem bzw. niedrigem R_f-Wert erhalten.

Eine Lösung von 40 mg des genannten Feststoffes mit niedrigem R_f-Wert in einem Gemisch von 45% Acetonitril in Wasser wird unter Verwendung einer Mikro Bondapack®C-18- Säule (Waters Associates Inc.) und mit einer Lösung von 45% Acetonitril in Wasser als Entwickler der präparativen HPLC-Chromatographie unterzogen. Dabei wird die Absorption bei 254 nm als Indikator benutzt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 24 mg TPC-A als farbloses Pulver. Gewünschtenfalls kann die präparative HPLC-Chromatographie zur weiteren Reinigung des Produktes wiederholt werden.

Das gleiche Verfahren wird mit einer Lösung von 20 mg des anderen Feststoffes mit hohem R_f-Wert in einer Lösung von 45% Acetonitril in Wasser wiederholt. Es werden 12 mg Methyläther-Derivat von TPC-A als farbloses Pulver erhalten. Das Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Dabei werden 10 mg farblose nadelförmige Kristalle erhalten.

(ii) Unter Verwendung von 100 g getrockneter Rubia akane wird das vorstehend beschriebene Verfahren (i) wiederholt. Es werden 7,3 mg TPC-A und 4,9 mg Methyläther-Derivat davon erhalten.

(iii) Herstellung des Methyläthers der Verbindung TPC-A.
In einer kleinen Menge Methanol werden 10 mg TPC-A gelöst und mit 5 ml Diazomethan in Diäthyläther versetzt. Die Lösung wird unter Kühlung im Eisbad 1 Stunde stehengelassen und danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Sodann wird das erhaltene farblose Pulver aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 8 mg farblose nadelförmige Kristalle.

Anhand der Daten des NMR- und IR-Spektrums wird das erhaltene Produkt als das Methyläther-Derivat von TPC-A identifiziert.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindungen TPC-A und ihres Methyläthers, die aus der Pflanze Krapp gewonnen wurden, sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Ihre IR-Spektren sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.

Beispiele 2 bis 17

Ein Lösungsmittelgemisch aus 4 ml Tetrahydrofuran, 8 ml Methanol und 2 ml Wasser wird mit 100 mg TPC-A und außerdem mit 20 mg n-Hexylbromid und einem Überschuß an wasserfreiem Kaliumcarbonat versetzt. Sodann wird das Gemisch im Ölbad unter Rückfluß auf 100°C erhitzt. Nach vollständiger Umsetzung wird das Heizen eingestellt, das Reaktionsgemisch mit Wasser versetzt und die erhaltene Lösung mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, danach wird wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Sodann wird der erhaltene Rückstand mit n-Hexan gewaschen und durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Das dabei erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute:
63 mg n-Hexyläther von TPC-A in Form von farblosen Kristallen.

Nach dem gleichen Verfahren werden bei Verwendung der in nachstehender Tabelle II aufgeführten n-Alkylbromide anstelle von n-Hexylbromid die entsprechenden n-Alkyläther- Derivate von TPC-A erhalten.

Die physikalischen Eigenschaften dieser Produkte sind ebenfalls in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Beispiel 18

(i) Beispiel 2 wird mit der Änderung wiederholt, daß Methylbromacetat anstelle von n-Hexylbromid verwendet wird. Es wird der Hydroxy-carbonylmethyläther (1) von TPC-A in Form von farblosen Kristallen erhalten.

(ii) Das vorstehend in (i) erhaltene Produkt (1) wird mit Diazomethan behandelt. Danach wird das Produkt aus Methanol umkristallisiert. Es wird der Methylester (2) des Produktes (1) in Form von farblosen Kristallen erhalten. Die physikalischen Eigenschaften sind in Tabelle III angegeben.

Beispiel 19

(i) Unter Verwendung von Äthylbrombutyrat anstelle von Methylbromacetat wird Stufe (i) von Beispiel 18 wiederholt. Es wird der Hydroxycarbonylpropyläther (1) und der Äthoxycarbonylpropyläther (2) von TPC-A erhalten.

(ii) Das Produkt (1) wird mit Diazomethan behandelt. Danach wird das Umsetzungsprodukt aus Methanol umkristallisiert. Es wird der Methoxycarbonylpropyläther (3) von TPC-A in Form von farblosen Kristallen erhalten. Die physikalischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind ebenfalls in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Beispiel 20

100 mg der Verbindung TPC-A werden in 4 ml eines Lösungsmittelgemisches aus 19 ml wasserfreiem Essigsäureäthylester und 5prozentiger wasserfreier Salzsäure mit einem Gehalt von 1 ml Essigsäureäthylester gelöst und mit 0,4 ml 2,3-Dihydropyran versetzt. Das Reaktionsgefäß wird verschlossen und das Gemisch über Nacht bei -5°C stehengelassen. Nach vollständiger Umsetzung wird Essigsäureäthylester zugesetzt und die Lösung mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wird mit n-Hexan gewaschen und dann durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Das erhaltene kristalline Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 55 mg Tetrahydropyranyläther von TPC-A in Form von farblosen Kristallen vom F. 286 bis 289°C (Zers.), [α] - 157° (CHCl₃).

Beispiele 21 bis 39

50 mg TPC-A werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und tropfenweise unter Rühren mit 15 ml Caproylanhydrid versetzt. Die Lösung wird etwa 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit wasserfreiem Toluol versetzt. Hierauf wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wird mit n-Hexan gewaschen. Sodann wird der ausgefallene Niederschlag aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 38 mg Capronsäureester von TPC-A in Form von farblosen Kristallen.

Das beschriebene Verfahren wird unter Verwendung anderer Säuren (Säureanhydride oder Methansulfonylchlorid) wiederholt, die in nachstehender Tabelle IV aufgeführt sind. Es werden die ebenfalls in Tabelle IV aufgeführten Produkte in Form von farblosen Kristallen mit den gezeigten physikalischen Eigenschaften erhalten.

Tabelle IV

Beispiele 40 bis 45

In einen eierpflanzenartigen Kolben werden 40 mg Thalliumäthoxid gegeben und mit 2 mg wasserfreiem Äthanol versetzt. Die erhaltene Lösung wird gerührt und dann mit 110 mg TPC-A und 1 ml wasserfreies Tetrahydrofuran versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Lösung unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Das erhaltene Thalliumsalz von TPC-A wird in 2 ml wasserfreies Tetrahydrofuran suspendiert und tropfenweise unter Rühren mit einer Lösung von 20 mg 4-Methylvalerylchlorid in 1 ml wasserfreies Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird sodann weitere 2 Stunden gerührt und danach zur Entfernung von Feststoffen filtriert. Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit n-Hexan gewaschen und dann durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Das dabei erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 75 mg 4-Methylvalerat von TPC-A in Form von farblosen Kristallen.

Unter Verwendung anderer Säurechloride, die in nachstehender Tabelle V aufgeführt sind, anstelle von 4-Methylvaleriansäurechlorid werden die entsprechenden ebenfalls in Tabelle V aufgeführten Produkte erhalten, deren physikalische Eigenschaften dort ebenfalls angegeben sind.

Tabelle V

Beispiel 46

(i) In 3 ml Essigsäure werden 100 mg TPC-A gelöst und dann unter Rühren mit einer Lösung von 40 mg Kupfernitrat in 3 ml Essigsäure versetzt. Als unter andauerndem Rühren die Farbe der Lösung sich von blau nach grün änderte, wurde zur Beendigung der Umsetzung Wasser zugesetzt und das Produkt mit Essigsäureäthylester extrahiert. Nach dem Waschen des Extraktes mit gesättigter Kochsalzlösung und Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird der Extrakt zur Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck destilliert. Das erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Es wird die Nitroverbindung von TPC-A in α-Stellung zum Phenol in einer Ausbeute von 108 mg in Form von gelben nadelförmigen Kristallen vom F. 244 bis 250°C (Zers.) erhalten, [α] - 232° (CHCl₃).

(ii) Das Umsetzungsprodukt von Stufe (i) wird mit Diazomethan behandelt. Das dabei erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Es wird die Nitroverbindung des Methyläther-Derivates von TPC-A in Form von farblosen Kristallen vom F. 225 bis 232°C (Zers.) erhalten, [α] - 187° (CHCl₃).

Beispiel 47

(i) 5,7 ml Wasser werden unter Rühren mit 90 mg Natriumborhydrid, einer kleinen Menge 5prozentiges Palladium auf Kohlenstoff und dann mit 130 mg des gemäß Beispiel 46 (i) erhaltenen Produktes in 15 ml Methanol tropfenweise versetzt. Nach vollständiger Umsetzung wird Wasser zugesetzt und das Reaktionsprodukt mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels destillert. Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Es wird das in α-Stellung zum Phenol aminierte Derivat von TPC-A in einer Ausbeute von 64 mg vom F. 238 bis 243°C (Zers.) erhalten, [α] - 199° (CHCl₃).

(ii) Das in Beispiel 46 (ii) erhaltene Produkt wird nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren (i) behandelt. Das erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Es wird das aminierte Derivat des Methyläther-Derivats von TPC-A vom F. 225 bis 231°C (Zers.) erhalten, [α] - 198° (CHCl₃).

Beispiel 48

In 10 ml wasserfreies 1,2-Dimethoxyäthan werden 100 mg Methyläther-Derivat von TPC-A gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 240 mg des Kaliumfluorid-aluminiumoxid und einer überschüssigen Menge von Methyljodid versetzt. Sodann wird das Gemisch unter weiterem Rühren bei Raumtemperatur für 15 Stunden vom Licht abgeschirmt. Nach vollständiger Umsetzung wird die Lösung abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungmittels destilliert. Der erhaltene Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt und anschließend aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 98 mg N-Methyl-Derivat des Methyläthers von TPC-A in Form von farblosen Kristallen vom F. 285 bis 292°C (Zers.), [α] - 166° (CHCl₃).

Beispiel 49

In 5 ml wasserfreies Dimethylformamid werden 225 mg TPC-A gelöst und unter Eiskühlung und Rühren mit 11 mg Natriumhydrid versetzt. In üblicher Weise werden sodann 187 mg Bromid von Acetyl D-Glucose, das von Acetyl D-Glucose abgeleitet ist, zu der Lösung zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung werden 50 ml Essigsäureäthylester zugesetzt und die Lösung zweimal mit je 20 ml Eiswasser und dann zweimal mit je 20 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Sodann wird die Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und hierauf unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Es werden etwa 300 mg Produkt als farbloses oder leicht gelbes hartes Öl erhalten.

Das erhaltene Öl wird mit 10 ml 5prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung und 10 ml Methanol versetzt. Das dabei erhaltene Gemisch wird unter Rühren 1 Stunde unter Rückfluß gekocht, danach mit 30 ml Eiswasser versetzt und dreimal mit 30 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit 50 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Es werden etwa 200 mg farbloser Feststoff erhalten. Das Produkt wird an Kieselgel säulenchromatographisch gereinigt und mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis 10 : 0,5 zur Entfernung des löslichen Teils und dann mit dem gleichen Lösungsgemisch im Verhältnis 10 : 2 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden gesammelt. Ausbeute: 53 mg Glucosid von TPC-A vom F. 210 bis 216°C (Zers.), [α] - 203° (ETOH).

Tierversuch

Im Tierversuch wird die antineoplastische Wirkung der Verbindungen der Erfindung in vivo an CDF1-Mäusen an implantierten Tumoren geprüft.

Die Mäuse werden in Gruppen von sechs Tieren eingeteilt. In die Bauchhöhle der Tiere werden 10⁶/0,1 ml P-388 Zellen oder 10⁵/0,1 ml L-1210-Zellen implantiert. 24 Stunden bis 5 Tage nach der Implantation der Zellen werden die Verbindungen der Erfindung in der gewünschten Menge intraperitoneal in Dosen von 0,05, 0,5, 2, 4 oder 10 mg/kg verabreicht. Der Kontrollgruppe von CDF1-Mäusen werden P-388 und L-1210- Zellen in der gleichen Weise implantiert. Die Verbindungen der Erfindung werden ihnen jedoch nicht verabreicht. Der Unterschied im Maß der Apothanasie zwischen ihnen wird beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Als Überprüfungstest zur Bestätigung der antineoplastischen Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung bestehen grundsätzlich zwei Arten von Prüfungen, von denen die eine ein "in vitro"-Test ist, bei dem in Vermehrung befindliche Krebszellen in einem Teströhrchen verwendet werden, und der andere ein "in vivo"-Test ist, wobei Tiere mit implantierten Krebszellen verwendet werden. In Japan wird der "in vivo"-Test gewöhnlich unter Verwendung von Ehrlich- Tumor, L-1210 Zellen, Sarcoma 180 Zellen, Yoshida Sarcoma oder Ascites-Lebertumor als Ascites-Tumor und immobilisierte Carcinome wie vorstehend erwähnt als fixierte Carcinome verwendet. In jüngerer Zeit wurde ein neues Verfahren zur Bestätigung der antineoplastischen Wirkung entwickelt, bei dem lymphozytische Leukämie-Zellen P-388 verwendet werden. Bekanntermaßen haben P-388 Zellen eine stärkere Sensitivität als L-1210. Als fixiertes Carcinom kann beispielsweise Lewis Lungenkrebs, B 16 Melanom, MM2, MOPC 104 E, Colon 26, MH 134 und C-1498 erwähnt werden.

Nach den Ergebnissen des vorstehend beschriebenen Tests können die Verbindungen der Erfindung als wirksam gegen P-388 Zellen bezeichnet werden. Ferner wurde festgestellt, daß die Äther- und Ester-Derivate von TPC-A auch gegen andere Asciten-Tumoren als P-388 wirksam sind, und zwar insbesondere der Acetylester, Caprinsäureester und das n-Hexyläther-Derivat von TPC-A. Diese Verbindungen zeigen auch Wirksamkeit gegen B-16 Melanom und MM2; vgl. Tabelle VII.

Toxizitätsprüfung

Die letale Dosis der Verbindungen der Erfindung wurde folgendermaßen bestimmt:
Unter Verwendung von männlichen vier Wochen alten CD-1 (ICR) Mäusen aus fünf bis zehn Mäusen pro Gruppe wurde die gewünschte Menge der Verbindung der Erfindung in 0,5% CMC-Lösung suspendiert. Die erhaltenen Suspensionen werden den Mäusen intraperitoneal der intravenös gegeben. Durch Beobachtung von Weiterleben oder Sterben sowie des allgemeinen Befindens im Verlaufe von 7 Tagen nach Verabreichung der Verbindungen wird der Wert für LD₅₀ für jede Verbindung aus der letalen Population geschätzt, die auf der Basis der Litchfield-Wilcoxon-Methode beobachtet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VIII

Die Ergebnisse in Tabelle VIII zeigen, daß die LD₅₀-Werte der vorstehend aufgeführten Verbindungen bei intraperitonealer Verabreichung niedriger sind als bei intravenöser. Dieses Verhalten unterscheidet sich deutlich von dem üblicher Arzneistoffe.

Prüfung auf andere pharmokologische Wirkungen

In den vorstehend beschriebenen Tierversuchen wurde die antineoplastische Wirkung aller Verbindungen der Erfindung beschrieben. Weitere pharmakologische Wirkungen der Verbindungen sind in der folgenden Prüfung angegeben.

Die Verbindungen der Erfindung werden intraperitoneal an vier Wochen alte CD-1 (IRC)-Mäuse (Nippon Charles Liver K. K.) in einer Dosis von 1 bis 20 mg/kg verabreicht, wobei die Mäuse in Gruppen von drei Tieren eingeteilt sind. Die an den Mäusen feststellbaren Symptome werden alle 30 Minuten nach der Verabreichung der Verbindung 180 Minuten lang festgestellt. Dies geschieht nach der modifizierten Arwin-Methode und Smith-Methode, d. h. der neuropharmakologischen mehrdimensionalen Beobachtungsmethode.

Durch Vergleich zwischen den beobachteten Symptomen und dem Profil der pharmakologischen Wirkung, das bekannten Arzneimitteln eigen ist, wurden die in Tabelle IX aufgeführten pharmakologischen Wirkungen festgestellt.

Verbindung
Pharmakologische Wirkung
TPC-A
Brechreiz erregend, appetitzügelnd, psychotrope und gefäßverengende Wirkung, Papaverinwirkung, Antiperkinsonwirkung
Methyläther von TPC-A	Brechreiz erregende und appetitzügelnde Wirkung
Essigsäureester von TPC-A	Brechreiz erregende, psychotrope und antidiuretische Wirkung

Vergleichsversuch I. Antineoplastische Aktivität

Die antineoplastische Aktivität von folgenden Verbindungen wurde untersucht.

Dabei wurde die Wirkung gegenüber Leukämiezellen und MM2- Zellen von Mäusen, d. h. zwei repräsentativen Krebszellenarten, festgestellt. Die Ergebnisse sind als IL₅₀-Werte (µg/ml) in folgender Tabelle X angegeben.

Es zeigt sich, daß die Wirksamkeit von TPC-C und von TPC-B gegen P388-Zellen das 1,7- bzw. 6,5fache des Werts von Desoxybouvardin und das 5,5- bzw. 21fache des Werts von Mitomycin, das ein anerkanntes Cytostatikum darstellt, beträgt.

Die Wirksamkeit von TPC-C und TPC-B gegenüber MM2-Zellen ist 1,5- bzw. 4mal so groß wie die von Desoxybouvardin und 3- bzw. 7,7mal so groß wie die von Mitomycin.

In entsprechender Weise zeigen die Verbindungen der Erfindung eine deutlich stärkere Wirkung als das bekannte TPC-A.

Es zeigt sich somit, daß die Verbindungen der Erfindung im Vergleich zu bekannten Cytostatica eine erheblich stärkere Wirkung besitzen.

II. Konzentration in Blutplasma und Geweben

Es wurden die Arzneistoffkonzentrationen in Blutplasma, Geweben und Tumorzellen bestimmt. TPC-A, TPC-B und RA-NCH₃ (N-Methylderivat von TPC-B) wurden an mit Krebs infizierte Mäuse (BDF₁-Mäuse, denen am Rücken Lewis-Lungenkrebszellen transplantiert worden waren) verabreicht. Die zu untersuchenden Arzneistoffe wurden den Tieren intravenös in einer Dosis von 10 mg/kg durch die Schwanzvene verabreicht. 5, 15, 30, 60, 120, 240 bzw. 360 Minuten nach der Verabreichung wurde den Tieren Blut aus dem Herzen entnommen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XI und in Fig. 4 und 5 zusammengestellt.

Tabelle XI

Konzentrationen von TPC-A, TPC-B und RA-NCH₃ in Blutplasma (A) und im Tumor (B)

Es zeigt sich, daß die Konzentration von TPC-B in Blutplasma wesentlich höher als die von TPC-A ist (ausgenommen der Wert nach 5 Minuten). Auch im Tumor erreicht TPC-B im Vergleich zu TPC-A im Durchschnitt wesentlich höhere Konzentrationen. Dies bedeutet, daß TPC-B besonders rasch in das Tumorgewebe gelangt und dort langsamer als TPC-A abgebaut wird. Somit ist mit TPC-B eine im Vergleich zu TPC-A wesentlich wirksamere Tumorbekämpfung möglich.

Claims (4)

1. Deoxybouvardin-Derivate der allgemeinen Formel I in der R₁ einen Acylrest der Formel -COA, wobei A einen verzweigten oder unverzweigten, gesättigten oder ungesättigten C_1-20-Alkylrest, eine gegebenenfalls durch ein Halogenatom oder Nitrogruppe substituierte Phenylgruppe, eine Benzyl- oder Styrylgruppe bedeutet, einen verzweigten oder unverzweigten C_1-20-Alkylrest, einen C_3-6-Cycloalkylrest, einen Carboxylalkylrest mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder einen Ester davon mit 1-5 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, einen Glucoserest, einen Rest der Formel -SO₂CH₃ oder ein Wasserstoffatom bedeutet, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und R₃ ein Wasserstoffatom, eine Aminogruppe oder eine Nitrogruppe bedeutet, ausgenommen die Verbindung, in der R₁, R₂ und R₃ gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten.

2. Verfahren zur Herstellung der Deoxybouvardin-Derivate nach Anspruch 1 und der Verbindung der Formel I, in der die Reste R₁, R₂ und R₃ gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet, Rubia spp mit Methanol, Äthanol, Chloroform oder Essigsäureäthyl extrahiert, den Extrakt konzentriert und den erhaltenen Rohextrakt chromatographisch reinigt;
• b) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₅ einen C_1-20-Alkylrest, einen C_3-6-Cycloalkyl- oder einen Carboxyalkylrest mit 1-5 C-Atomen oder einen Ester davon mit 1-5 C-Atomen im Alkoholrest bedeutet und R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Amino- oder Nitrogruppe ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel in der R₁₀ ein Wasserstoffatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, mit einem Alkylierungsmittel umsetzt und danach gegebenenfalls das alkylierte Produkt reduziert, wenn R₁₀ eine Nitrogruppe bedeutet;
• c) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₆ einen _COA-Rest bedeutet, worin A die vorstehende Bedeutung hat, eine Verbindung der Formel mit einem Acylierungsmittel umsetzt;
• d) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₇ eine Amino- oder Nitrogruppe darstellt, eine Verbindung der Formel nitriert und gegebenenfalls das nitrierte Produkt reduziert;
• e) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₅ einen C_1-20-Alkyl-, C_3-6-Cycloalkyl- oder C_1-5- Carboxyalkylrest oder einen Ester davon mit 1-5 C-Atomen im Alkoholrest bedeutet und mindestens einer der Reste R₈ eine Methylgruppe darstellt und die anderen Wasserstoffatome bedeuten, eine Verbindung der allgemeinen Formel mit einem Methylierungsmittel umsetzt;
• f) zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel in der R₉ einen Glucoserest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel unter Verwendung von Schutzgruppen mit einem aktivierten Glucoserest umsetzt und die Schutzgruppe abspaltet;

wobei die Verfahrensvarianten b) bis f) in an sich bekannter Weise erfolgen.

3. Verwendung der Deoxybouvardin-Derivate gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Neoplasmen, zur Erzeugung von Brechreiz, als Appetitzügler, als psychotroper oder gefäßverengender Wirkstoff, als Papaverin-Wirkstoff, zur Behandlung von Parkinsonismus und/oder als antidiuretischer Wirkstoff.