DE3200391C2 - Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation - Google Patents
Vorrichtung zur Messung der FluoreszenzpolarisationInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein verbessertes optisches System für eine Fluoreszenzpolarisationsvorrichtung, umfassend eine Lichtquelle mit niedrigem Wattverbrauch und niedriger Intensität, und eine Polarisator/Flüssigkristall-Kombination im Anregungsstrahlengang, wodurch Anregungslicht mit alternierenden, zueinander senkrechten Polarisationsebenen auf die fluoreszierende, flüssige Probe fokussiert wird. Das von der fluoreszierenden Probe emittierte Licht wird gefiltert, polarisiert und zur weiteren Verarbeitung auf einen Photomultipler fokussiert. Zur Unterdrückung von Reflexionen ist eine Reihe von nicht-reflektierenden Ablenkblechen um die Probe herum angeordnet. Es sind Überwachungsvorrichtungen vorgesehen, um das Anregungslicht zu überwachen, und ein konstantes Energieniveau, das auf die Probe fokussiert wird, aufrechtzuerhalten. Als Energiequelle mit niedriger Intensität und niedrigem Wattverbrauch wird eine 50-Watt-Wolfram-Halogen-Projektorlampe verwendet.
Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation nach dem Oberbegriff des
Patentanspruches.
Die Anwendung von Vorrichtungen zur Messung der Fluoreszenzpolarisation im klinischen Bereich werden
in »Design, Construction, and Two Applications for an Automated Flow-Cell Polarization Fluorometer with
Digital Read Out: Enzyme-Inhibitor (Antitrypsin) Assay and Antigen-Antibody (Insulin-Insulin Antiserum)
Assay«, R. D. Spencer, F. B. Toledo, B. T. Williams and N. L. Yoss; Clinical Chemistry, 19/8, Seiten 838-844
(1973) besehrieben. Mit solchen Vorrichtungen können so
Körperflüssigkeitsproben, die mit einem fluoreszierenden Material markiert sind, schnell analysiert werden.
Eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation nach dem Oberbegriff des Patentanspruches ist
aus der DE-OS 28 17 334 bekannt. Als Lichtquelle wird dabei ein Laser oder eine nicht näher beschriebene
Glühlampe verwendet. Die eleklrooptische Einrichtung zum Drehen der Polarisationsebene können neben kontinuierlich
rotierenden Analysatoren auch elektrooptische Rotatoren sein, z. B. Rotatoren zur Erzeugung der
Faraday- oder Kerr-Drehung, die in Abhängigkeit von einem angelegten elektrischen Signal eine optische Drehung
bewirken. Diese Einrichtungen zur Drehung der Polarisationsebene können dabei vor oder nach dem
Probenbehälter angeordnet sein, wobei eine Anordnung nach dem Probenbehälter bevorzugt wLd, weil
dadurch der Photomultiplier näher bei der Probe angeordnet werden kann und weil bei der Verwendung einer
Laser-Lichtquelle der Durchmesser des Anregungslichtstrahls kleiner als der des Emissionslichtstrahls ist.
Bei der bekannten Vorrichtung muß zur Erzielung eines erreichenden Signais-Rauschverhältnisses eine Laser-Lichtquelle
oder eine andere leistungsstarke Lichtquelle verwendet werden, die dann spezielle Kühleinrichtungen
erfordert.
Die bei Verwendung eines runden Reagenzglases als Probenbehälter auftretenden Schwierigkeiten sowie deren
Behebung dadurch, daß der Lichtstrahl in das Zentrum des Reagenzglases fokussiert wird, sind aus der
US-PS 41 95 932 bekannt
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung
zur Messung der Fluoreszenzpolarisation zu schaffen, die auch bei einer leistungsschwachen Lichtquelle
noch eine geigende Nachweis-Empfindlichkeit besitzt
Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruches gelöst.
Der Feldeffekt-Fiüssigkristall arbeitet in der Weise,
daß er die Polarisationsebene des Anregungslichtes um 90° dreht, wenn an ihn kein elektrisches Feld angelegt
wird. Bei Anliegen eines elektrischen Feldes erfolgt keine Drehung der Polarisationsebene. Indem der Flüssigkristall
abwechselnd einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wird die Probe abwechselnd Anregungslichr mit
senkrecht zueinanderstehenden Polarisationsebencn ausgesetzt.
Durch die Anordnung des ersten Polarisator und des Feldeffekt-Flüssigkristalls im Anreguiigslichlstrahl wird
eine besondere Nachweis-Genauigkeit erreicht Im Emissionsstrahlengang würde der Flüssigkristall einem
Spektrum von Polarisationskomponcnten ausgesetzt, was zu Drehfehlern der Polarisationsebene und damit
zu ungenauen Polarisationswerten führen würde. Derartige Drehfehler der Polarisationsebene können nur
durch aufwendige Kompensationsrechnungen ausgeglichen werden. Durch den vorgeschalteten ersten Polarisator
wird bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Feldeffekt-Flüssigkristall nur Anregungslicht mit einer
bestimmten Polarisationsebene ausgesetzt, so daß eine Drehung der Polarisationsebene mit großer Genauigkeit
erfolgen kann.
Ein Reflektor fokussiert zweckmäßig das Licht einer 50-Watt-Wolfram-Halogen-Lampe, auf eine öffnung,
die in ihrer Größe so bemessen ist, daß ausreichend viel Licht für die jeweilige Menge der flüssigen Probe durchgelassen
wird. In dem Anregungslichtstrahl kann eine Wärmeabsorptionseinrichtung vorgesehen sein, um die
von der Lampe abgegebene Infrarotstrahlung zu absorbieren und damit die Temperaturbelastung der Probe
und der Bauteile im Anregungslichtstrahl auf einem Minimum zu halten. Eine Reihe von Abschirmplatten, aus
dünnen, scharzen Metallstreifen, sind um die Probe herum angeordnet, um die Oberflächenreflexioncn des Anregungslichts
zu verringern, die sonst in den Emissionsstrahlengang gelangen könnten.
Ein Ausführungsbeispiel wird nachfolgend unhand
32 OO
der Zeichnung erläutert
Die Figur zeigt schematisch das optische System für eine Fluoreszenzpolarisationsvorrichtung.
Ein Reflektor 12 fokussiert das von einer Wolfram-Halogen-Lampe 10 mit niedriger Intensität ausgehende
Licht auf eine öffnung 14 einer Blende 16. Der Reflektor
12 hai die Form eines elliptischen Spiegels. Die Blende
16 ist eine dünne Metallplatte mit einer Dicke von etwa 3A mm, die auf beiden Seiten eine schwarze, nicht reflektierende
Oberfläche aufweist Die öffnung 14 hat einen Durchmesser von etwa 3 mm. der ausreichend viel Licht
für eine flüssige, fluoreszierende Probe 18 von 1 ml, die sich in einem runden Reagenzglas 20 befindet, durchläßt
Die Lampe 10 kann eine handelsübliche 50-Watt-Wolfram-Haiogen-Projektorlampe
sein.
Auf beiden Seiten der Blende 16 sind ein Wärmereflektor 22 und ein Wärmeabsorber 24 angeordnet, um
die von der Lampe 10 erzeugte Infrarotstrahlung zu reflektieren bzw. zu absorbieren und um damit die Temperaturbelastung
der Probe und der in dem Anregungslichtstrahl befindlichen Bauteile klein zu halten. Der
Wärmereflektor 22 kann ein zweifarbiger FolierjTiehrschichtreflektor
sein. Als Wärmeabsorber 24 kann ein im Handel erhältliches gefärbtes Absorberglas verwendet
werden.
Eine plankonvexe Linse 26 kollimiert das von der öffnung 14 kommende Licht. Das kollimierte Licht gelangt
dann durch einen ersten Filter 28 mit enger Bandbreite, entsprechend dem Absorptionsmaximum der
fluoreszierenden Probe 18. Ein transparenter Strahlenteiler 30 aus Glas reflektiert etwa 4% des einfallenden
Lichtes auf eine plankonvexe Linse 32, die ihrerseits das Licht auf einen Vergleichsdetektor 34 fokussiert Der
Signalausgang des Vergleichsdetektors 34 wird zur Überwachung und Regelung der Intensität der Lampe
10 durch die Stromversorgung 36 verwendet, um eine konstante, auf die Probe 18 gerichtete Anregungslichtintensität
aufrechtzuerhalten. Als Strahlenteiler 30 kann ein Mikroskop-Deckglas verwendet werden, das transparent
ist und 9υ% des einfallenden Lichts hindurchläßt
und etwa 4% des einfallenden Lichts reflektiert
Das durch den Strahlenteiler 30 hindurchgetretene Licht fällt dann auf eine Kombination aus einem ersten
Polarisator 38 und einem Flüssigkristall 40, der die Polarisationsebene drehen kann. Der erste Polarisator 38 hat
eine festgelegte Polarisationsebene, die beispielsweise die horizontale Ebene H sein kann. Der Flüssigkristall
40 dreht auffallendes Licht um 90°, wenn kein elektrisches Feld an den Flüssigkristall 40 angelegt ist, und
dreht die Polarisationsebene von auffallendem Licht so nicht, wenn ein elektrisches Feld an den Flüssigkristall
40 angelegt ist Das selektive Anlegen eines elektrischen Felds an den Flüssigkristall 40 ist in der Figur schematisch
durch das Schließen des Schalters 42 dargestellt, wodurch eine Spannung und damit ein elektrisches Feld
an den Flüssigkristall angelegt werden.
Bei der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsform werden der erste, horizontale Polarisator 38 und
der Flüssigkristall 40 dazu verwendet, die fluoreszierende Probe 18 alternierend mit vertikal und horizontal
polarisiertem Licht zu bestrahlen, indem man den Schaller 42 zunächst geöffnet läßt, so daß der Flüssigkristall
40 das auffallende Licht um 90° dreht und damit die Probe 18 durch vertikales Licht angeregt wird, und indem
man anschließend den Schalter 42 schließt, so daß keine Drehung erfolgt und die Probe 18 durch horizontales
Licht angeregt wird. L?as polarisierte, kollimierte Anregungslicht wird dann durch eine plankonvexe Linse
44 auf das Zentrum der fluoreszierenden Probe 18, die sich in einem runden Reagenzglas 20 befindet, fokussiert
Durch die an den Luft-Glas- und Glas-Flüssigkeit-Zwischenflächen auftretenden Reflexionen kann Streulicht
in die Emissionsoptik geraten. Um diesen Effekt klein zu halten, wird der Glühfaden der Lampe 10 im
Zentrum des Reagenzglases 20 fokussiert, damit alle Strahlen (einfallende und reflektierte) senkrecht zu der
Oberfläche des Reagenzglases 20 in dieses ein- und aus diesem austreten können. Da die nachfolgend beschriebene
Emissionsoptik den zentralen Bereich der fluoreszierenden Probe 18 scharf abbildet, erhöht die Fokussierung
des Glühfadens auf das Zentrum des Reagenzglases 20 die Wirksamkeit des Systems.
Eine Reihe von Abschirmblechen 46 aus dünnen Kunststoff- oder Metallstreifen mit schwarzen, im wesentlichen
nicht reflektierenden Oberflächen sind um die Probe 18 herum angeordnet, um zu verhindern, daß
durch das Reagenzröhrchen 20 und die umgebenden Bereiche verursachte Reflexionen den Photomuitiplier
als Streulicht erreichen können. Wie in cte;· Figur dargestellt
sind der Anregungslichtstrahl und der tmissionslichtstrahl senkrecht zueinander angeordnet, so daß die
Möglichkeit des unerwünschten Eintritts von Antcgungslicht
in den Photomuitiplier verringert wird. Es wurde festgestellt, daß ohne die Abschirmbleche 46, die
die fluoreszierende Probe 18 umgeben, das Anregungsstreulicht einen merklichen Beitrag zu dem gemessenen
Polarisationswert leistet indem es sowohl den absoluten Wert erhöht als auch die Reproduzierbarkeit verschlechtert
Die Probe 18 kann beispielsweise eine Körperflüssigkeit enthalten, der eine Substanz zugesetzt worden ist
die mit reinem fluoreszierendem Markierungsmittel, wie z. B. Natriumfluorescein, markiert worden ist. Die
markierten biologischen Moleküle werden dann durch den Anregungslichtstrahl angeregt und emittieren Licht
einer größeren Wellenlänge. Eine plankonvexe Linse 48 koilimiert das emittierte Licht, welches dann als zweiten
Filter einen Emissionsinterferenzfilter 50 mit großer Bandbi site durchläuft die dem Emissionsmaximum der
fluoreszierenden Probe 18 entspricht und anschließend einen vertikalen, zweiten Polarisator 52 durchläuft, der
eine festgelegte Ebene vertikaler Polarisation aufweist. Das kollimierte, vertikal polarisierte Emissioiislicht wird
dann mit einer plankonvexen Linse 54 auf die Öffnung 56 einer Blende 58 am Eingang einer Photomultipliers
60 fokussiert, um dann gemäß herkömmlicher Techniken weiterverarbeitet zu werden. Die Öffnung 56 hat
Abmessungen von 3,0 χ 8,0 mm, was im Einklang mit dem Betrachtungsvolumen in dem Reagenzglas 20 steht.
Bei einem Prototyp der dargestellten Vorrichtung, bei dem die Probe mit Natriumlluorescein markiert wurde,
wies der Anregungsfilter 28 eine Wellenlänge von 485 nm bei einer Haibwertsbreite von 10 nm auf. Der
Emissionsfilter 50 wies eine Wellenlänge von 540 nm bei einer Halbwertsbreite von 30 nm auf. Alle in der Zeichnung
dargestellten Linsen wiesen eine antireflektierende Beschichtung, eine Brennweite von 16,7 mm, einen
Durchmesser von 15 mm, einen Abstand des Brennpunktes von der Rückseite der Linse, wenn diese auf ein
entferntes Objekt fokussiert ist, von 14,4 mm und .einen
Brechungsindex von 1,785 auf. Die Empfindlichkeit bei dem Prototyp lag in der Größenordnung von 10-" Mol
Natriumfluorescein.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- 32 OOPatentanspruch:Vorrichtung zur Messung der F.uoreszenzpolarisation mit einer Lichtquelle zum Bestrahlen einer flüssigen Probe mit fokussiertem Licht,
einem ersten Filter enger Bandbreite entsprechend der Anregungswellenlänge, das zwischen der LichtquelleundderProbe angeordnet ist, ι οeinem ersten Polarisator zwischen dem ersten Filter und der Probe mit festgelegter Polarisationsebene,
einer elektrooptischen Einrichtung zum Drehen der Polarisationsebene zwischen dem ersten Polarisator und der Probe, einem Probenbehälter mit darum herum angeordneten Einrichtungen zum Verhindern von Streulicht,
einem Photomultiplier zur Messung des von der Probe emittierten Fluoreszenzlichts,
einem zweiten Polarisator zwischen der Probe und dem Photomultipüer mit festgelegter Polarisationsebene,einem zweiten Filter großer Bandbreite zwischen der Probe und dem Photomultiplier zum Hindurchlassen des von der Probe emittierten Fluoreszenzlichts undeiner Auswerteeinrichtung,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Lichtquelle eine Wolfram-Halogen-Lampe (10) niedriger Leistung ist, zwischen dem ersten Filter (28) und dem ersten Polarisator (38) ein Strahlenteiler (¥J) angeordnet ist, der einen Teil des Anregungelichts auf eine Einrichtung zum Konstanthalten der Intensi ät des Anregungslichts richtet, der Probenbehälter ein rundes Reagenzglas (20) ist unddie elektrooptische Einrichtung zum Drehen der Polarisationsebene ein Feldeffekt-Flüssigkristall (40) ist und Einrichtungen vorgesehen sind, um den Feldeffekt-Flüssigkristall (40) abwechselnd einem elektrischen Feld auszusetzen und damit die Probe (18) mit Antregungslicht zu bestrahlen, das unterschiedliche Polarisationswinkel aufweist.45
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