DE3200391A1

DE3200391A1 - Optisches geraet fuer eine fluoreszenzpolarisationsvorrichtung

Info

Publication number: DE3200391A1
Application number: DE19823200391
Authority: DE
Inventors: Susan Renee Ing. Illinois Popelka
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1981-01-09
Filing date: 1982-01-08
Publication date: 1982-07-29
Also published as: GB2090971B; FR2497951A1; BE891736A; GB2090971A; IT8219044A0; NZ199413A; DE3200391C2; JPS57136142A; CA1165585A; AU7919482A; JPH0352575B2; AU544788B2; FR2497951B1; IT1149428B

Description

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3841 ' 4 8. Januar 1982

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Fluoreszenzpolarisationsänalysatoren und insbesondere ein verbessertes optisches System für·einen solchen Analysator.

Fluoreszenzpolarisationsvorrichtungen und ihre Anwendung im klinischen Bereich werden beispielsweise beschrieben in "Design, Construction, and Two Applications for an Automated Flow-Cell Polarization Fluorometer with Digital Read Out: etc.,", R.D. Spencer, F.D. Toledo, B.T. Williams und N.L. Yoss; Clinical Chemistry, 19/8, Seiten 838-844 (1973). Mit solchen Vorrichtungen können Körperflüssigkeitsproben, die mit einem fluoreszierenden Material markiert sind, schnell analysiert werden.

In dem obenerwähnten Artikel wird eine Fluoreszenzpolarisationsvorrichtung beschrieben, die eine fluoreszierende Probe umfasst, welche mit zwei Strahlen Anregungslicht bestrahlt werden, welche beide linear polarisiert sind, der eine vertikal, der andere horizontal. Eine andere Anregung einer Probe mit polarisiertem Licht kann mit Hilfe eines in Sektoren unterteilten Zerhackerspiegels erreicht werden, der alternativ das vertikal und horizontal polarisierte Licht zu der Probe hindurchlä'sst. Das Anregungslicht ist monochromatisch, entsprechend dem Peak.des Absorptionsspektrums der Probe. Die bestrahlte, fluoreszierende Probe wird zu einer zweiten Strahlungsquelle und emittiert Licht mit einem Spektrum, • ' dessen Peak bei einer längeren Wellenlänge liegt als der des Anregungslichts. Durch einen vertikalen Polarisator, der im Strahlengang des Emissionslichts angeordnet ist, gelangt vertikal polarisiertes Licht zu einer Photomultiplierröhre, um das von der Probe erzeugte Emissionslicht zu erfassen. Der Signalausgang der Photomultiplierröhre wird dann analysiert, um den Polarisationsgrad ■ P zu erhalten, der anhand der nachstehenden Beziehung bestimmt wird: I(VV)-I(HV)/I(VV)+I(HV), in welcher 1(VV) die gemessene Intensität des erfassten Photomultipliersignals ist, wenn die Probe durch, vertikal polarisiertes Licht angeregt und die vertikale

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Komponente des emittierten Lichts analysiert wird, und I(HV) das erfasste Photomultipliersignal ist, wenn die Probe mit horizontal polarisiertem Licht angeregt und die vertikale Komponente des emittierten Lichts analysiert wird.

Bekannte Vorrichtungen dieser Art haben einen hohen Wattverbrauch und erfordern intensive Lichtquellen, wie beispielsweise 200 bis 250 Watt Quecksilber- oder Xenongasentladungslampen, um die von der Probe ausgehende gewünschte Emissionsstrahlung, bei einem Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, das ausreichend ist, um zur Erfassung und Verstärkung einer Photomultiplierröhre mit niedrigem Rauschpegel und der dazu gehörigen Elektronik dienen zu können. Solche hellen Lampen mit hohem Wattverbrauch erfordern auch eine beträchtliche Kühlung, um die Integrität des optischen Systems zu bewahren. Es ist daher wünschenswert, ein verbessertes optisches System für Fluoreszenzpolarisationsvorrichtungen zu· finden', das einen niedrigeren Wattverbrauch hat und weniger intensive Lampen erfordert und das dennoch eine Empfindlichkeit aufweist, die, verglichen mit bekannten Vorrichtungen, gleich oder besser ist.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes optisches System für eine Fluoreszenzpolarisationsvorrichtung, die eine fokussierte Lichtquelle mit niedriger Intensität und niedrigem Wattverbrauch, einen Filter mit enger Bandbreite, einen Polarisator und einen FeIdeffekt-Flüssigkristall im Anregungsstrahiengang umfasst, wobei das Anregungslicht auf die fluoreszierende, flüssige Probe fokus-³^ siert wird. Wenn an den Flüssigkristall kein elektrisches Feld angelegt wird, dreht der Flüssigkristall die Polarisationsebene des Anregungslichts um 90°, während die Polarisationsebene bei angelegtem elektrischem Feld nicht um 90° gedreht wird. Wenn der Flüssigkristall daher alternierend einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wird die Probe alternierend einem Anregungslicht unter Polarisationswinkeln ausgesetzt, die senkrecht zueinander stehen. Das von der Probe abgegebene Licht wird filtriert,

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polarisiert und für die Verarbeitung auf einen Photomulti plier fokussiert.

Die Lichtquelle mit niedriger Intensität und niedrigem Wattver-5

brauch ist eine 50-Watt-Wolfram-Halogen-Lampe mit einem Reflektor, der das Licht auf eine.öffnung fokussiert, die in ihrer Grosse so bemessen ist, dass ausreichend viel Licht in Abhängigkeit von der Menge der flüssigen Probe zur Verfügung gestellt wird. In dem Anregungsstrahlengang ist eine Wärmeabsorptionsvorrichtung vorgesehen, um die von der Lampe herrührende und die Öffnung gelangte Infrarotstrahlung zu absorbieren und damit die Temperaturempfindlichkeit der Probe und Bauteile im Anregungsstrahlengang auf einem Minimum zu halten. Eine Reihe von Prall- bzw. Ablenkplatten,

. _ aus dünnen,schwarzen Metallstreifen, sind um die Probe herum ange-ο

ordnet, um die Oberflächenreaktionen des Anregungslichts zu verringern, die sonst unerwünschterweise in den Emissionstrahlengang gelangen könnten. Es sind auch Vorrichtungen vorgesehen, um das Anregungslicht zu überwachen und die Energiezufuhr zur Lampe ein-„_n zustellen bzw. zu regeln, um auf diese Weise ein im wesentlichen konstantes Niveau der An'regungslichtintensität aufrechtzuerhalten.

Die Figur zeigt ein' schematisches Blockdiagramm, das ein verbessertes optisches System für eine Fluoreszenz'polarisationsvorrichtung nc gemäss den Prinzipien der vorliegenden Erfindung erläutert.

In der Figur ist eine Wolfram-Halogen-Lampe 10 mit niedriger Inr ■ tensität und niedrigem Wattverbrauch dargestellt, die einen Reflektor 12 umfasst, um das von der Lampe ausgehende Licht auf eine öffnung 14 zu fokussieren, die in einem Lichtabschirmungselement 16 ausgebildet ist. Der Reflektor 12 hat die Form eines elliptischen Spiegels. Das Lichtabschirmungselement 16 umfasst eine dünne Metallplatte mit einer Dicke von etwa 3/4 mm, die auf beiden Seiten eine schwarze, nicht reflektierende Oberfläche aufweist. Die Öffnung 14 hat einen Durchmesser von etwa 3 mm, der ausreichend viel Licht für eine ca. 1-ml-flussige, fluoreszierende Probe 18, die sich in einem runden Reagenzglas 20 befindet, zur Verfügung stellt.

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Die Lampe 10 und der elliptische Spiegel 12 können mit einer herkömmlichen 50-Watt-Wolfram-Halogen-Projektoriampe ausgerüstet sein, die im Handel erhältlich ist.

Auf den beiden Seiten des Abschirmungslochelements 16 sind eine Wärmereflektor oder Infrarotunterdrücker 22 und eine Wärmeabsorbiervorrichtung 24 angeordnet, um die von der Lampe herrührende Infrarotstrahlung zu reflektieren bzw. zu absorbieren und um damit die Temperaturempfindlichkeit der Probe und der in dem Anregungsstrahlengang befindlichen Bauteile auf einem Minimum zu halten. Der Wärmereflektor kann ein zweifarbiger FoIienmehrschichtreflektor sein. Als Wärmeabsorptionsvorrichtung kann ein im Handel, beispielsweise von der Firma Corion Corporation, erhältliches gefärbtes Absorberglas vom Typ BG-38 verwendet werden.

Eine plankonvexe Linse 26 kollimatisiert das von der öffnung kommende Licht. Das kollimatisierte Licht gelangt dann durch einen Filter 28 mit enger Bandbreite, entsprechend nahezu dem Absorptionspeak der fluoreszierenden Probe. Ein transparenter Strahl aufspalter 30 aus Glas reflektiert etwa 4 % des einfallenden Lichtes auf eine plankonvexe Linse 32, die ihrerseits das Licht auf einen Vergleichsdetektor 34 fokussiert. Der Signalausgang des Vergleichsdetektors wird zur überwachung und Regulierung der Intensität der Lampe durch die Energiezufuhr 36 zur Lampe verwendet. Der Glühfaden wird in Abhängigkeit von dem von dem Vergleichsdetektor 34 herrührenden Vergleichssignal über die Energiezufuhr 36 zur Lampe reguliert, unreine konstante, auf die Probe 18 gerichtete Anregungslichtintensität aufrechtzuerhalten. Als Strahlspalter 30 kann ein Mikroskop-Deckglas verwendet, das transparent ist und 96 % des einfallenden Lichts hindurchlässt und etwa 4 % des einfallenden Lichts reflektiert.

Das durch den Strahl Spalter hindurchgetretene Licht fällt dann auf eine Kombination aus einem Polarisator 38 und einem Flüssigkristall 40, welche die Polarisationsebene drehen kann. Der Polarisator 38 hat eine festgelegte Polarisationsebene, die bei-

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spielsweise die horizontale Ebene H sein kann. Der Flüssigkristall 40 vom Durchlassverschluss-Typ dreht auffallendes Licht um 90°, wenn kein elektrisches Feld an den Flüssigkristall angelegt ist., und dreht die Polarisationsebene von auffallendem Licht nicht, wenn ein elektrisches Feld an den Flüssigkristall angelegt ist. Das selektive.Anlegen eines elektrischen Felds an den Kristall 40 ist in der Figur schematisch durch das Schliessen des Schalters 42 \ dargestellt, wodurch eine Spannung und damit ein elektrisches Feld an den Flüssigkristall angelegt werden.

Bei der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsform wird die horizontale Polarisator/Flüssigkristall-Kombination dazu verwendet, um die fluoreszierende Probe 18 alternierend mit vertikal und

.15 · horizontal polarisiertem Licht zu bestrahlen, indem man den Schalter 42 zunächst geöffnet lässt, so dass der Flüssigkristall das auffallende Licht um 90° dreht und damit die Probe durch vertikales Licht angeregt wird, und indem man anschliessend den Schalter 42 schliesst, so dass keine Drehung erfolgt und die Probe durch horizontales Licht angeregt wird. Das polarisierte, kollimatisierte Anregungslicht wird dann durch eine plankonvexe Linse 44 auf das Zentrum der fluoreszierenden Probe' 18, die sich in einem runden Reagenzglas 20 befindet, fokussiert. Durch die an den Luft-Glas- und Glas-FTüssigkeit-Zwischenflächen auftretenden Reflektionen

25/ kann Streulicht in die Emissionsoptik geraten. Um diesen Effekt auf einem Minimum zu halten, wird der Glühfaden der Lampe 10 im Zentrum des Kulturröhrchens 20 fokussiert, damit alle Strahlen (einfallende und reflektierte) senkrecht zu der Oberfläche des Kulturröhrchens in dieses ein- und aus diesem austreten können.

Da die nächfolgend beschriebene Emissionsoptik den zentralen Bereich der fluoreszierenden Probe 18 mit optimaler Wirksamkeit abbildet, erhöht die Fokussierung des Glühfadens im Zentrum des Kulturröhrchens die Wirksamkeit des Systems und maximiert daher den Durchsatz des gesamten Systems. Es ist daher der Durchsatz des vorliegenden Systems, der die Verwendung einer Wolfram-Halogen-Lampe mit niedrigem Wattverbrauch und niedriger Intensität als

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Lichtquelle gestattet. In diesem Zusammenhang wird auf die US-PS 4 195 932 verwiesen, in welcher ein Absorptionsphotometer beschrieben wird, bei welchem das Licht im Zentrum eines runden Reagenzröhrchens fokussiert wird, um die Fehler beträchtlich zu unterdrücken., die auf die Abweichungen des Reagenzröhrchens zurückzuführen sind.

Die Kombination aus dem Polarisator 38 und dem Flüssigkristall 40 in dem Anregungslichtstrahlengang ist ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung. Von anderen Autoren ist die Verwendung von elektrooptischen Vorrichtungen im Anregungsstrahlengang vorgeschlagen worden. Es wurde jedoch festgestellt, dass inhärente Drehfehler, die dadurch erhalten wurden, dass der Flüssigkristall einem Spektrum von Polarisationskomponenten im Emissionsstrahlengang ausgesetzt wurde, zu gemessenen Polarisationswerten führen, die nicht genau sind. Es wurde dabei vorgeschlagen, dass die inhärenten Drehfehler bei Verwendung eines Flüssigkristdlls im · Emissionsstrahlengang beträchtlich verringert werden können, wenn geeignete Anfangsvergleichswerte verwendet werden, um die später gemessenen Polarisationsdrehfehler zu kompensieren. Die vorgeschlagene Kompensation erfordert jedoch zusätzliche Datenspeicher und ausserdem ein zeitraubendes anfängliches Eichverfahren-, um die Kompensationswerte zu erhalten.

Im Gegensatz hierzu werden die im Stand der Technik beobachteten Fehler erfindungsgemäss dadurch ausgeschaltet, dass man den Flüssigkristall im Anregungsstrahlengang anordnet, und indem man· einen Polarisator mit festgelegter Ebene vor dem Flüssigkristall anordnet, so dass nur Licht mit einer Polarisationsebene auf den Flüssigkristall fällt. Deshalb dreht der Flüssigkristall die einzelne Ebene der Polarisationskomponente ohne wesentlichen Fehler.

Eine Reihe von Prall- oder Ablenkblechen 46 aus dünnen Kunststoff- oder Metallstreifen mit schwarzen, im wesentlichen nicht reflektierenden Oberflächen sind um die Probe 18 herum angeordnet, um zu

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verhindern, dass durch das Reagenzröhrchen 20 und die umgebenden Bereiche verursachte umfangreiche Reflektionen in die Emissionsoptik als Streulicht eintreten können. Wie in der Figur dargestellt sind der Anregungsstrahlengang und der Emissionsstrahlen-5

gang senkrecht zueinander angeordnet, so dass die Möglichkeit des unerwünschten Eintritts von Anregungslicht in den Emissionsstrahlen-. gang verringert .wird. Da die Menge an von der fluoreszierten Probe emittierter Strahlung sehr gering ist, ist es wünschenswert, die Anwesenheit von Anregungsstreulicht im Emissionsstrahlengang so weit wie möglich zu unterdrücken. Es wurde festgestellt, dass ohne die Ablenkbleche 46, die die fluoreszierende Probe einfassen, das Anregungsstreulicht einen merklichen Beitrag zu dem gemessenen Polarisationswert leistet, indem es sowohl den absoluten Wert erhöht als auch die Reproduzierbarkeit verschlechtert, während diese

unerwünschten Effekte im wesentlichen unterdrückt werden, wenn diese Ablenkbleche eingesetzt werden.

Die Probe 18 kann beispielsweise eine Körperflüssigkeit enthalten,

2Q der eine Substanz zugesetzt worden ist, die mit reinem fluoreszierendem Markierungsmittel, wie z.B. Natriumfluorescein, markiert worden ist. Die markierten biologischen Moleküle werden dann durch das aus dem Anregungsliditstrahlengang einfallende Licht angeregt und emittieren Licht einer längeren Wellenlänge. Eine plankonvexe Linse 48 kollimatisiert das emittierte Licht, welches dann einen Emissionsinterferenzfilter 50 mit grosser Bandbreite durchläuft, die nahezu dem-Emissionspeak der fluoreszierenden Probe entspricht, und an-schliessend einen vertikalen Polarisator 52 durchläuft, der eine festgelegte Ebene vertikaler Polarisation aufweist. Das kollimatisierte, vertikal' polarisierte Emissionslicht wird dann mit einer plankonvexen Linse 54 auf die Öffnung 56 in einem im wesentlichen nicht-reflektierenden Lichtabschirmelement 58 am Eingang einer Photomultiplierröhre 60 fokussiert, um dann gemäss herkömmlicher Techniken weiterverarbeitet zu werden. Die Emissionsöffnung 56 hat Abmessungen von 3,0 χ 8,0 mm, was im Einklang mit dem Betrachtungsvolumen in dem Probebehälter 20 steht.

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Bei einem Prototyp des erfindungsgemässen Geräts, bei dem die Probe mit Natriumfluoresceiη markiert wurde, wies der Anregungsfilter 28 eineZentrumwellenlänge von 485 nm bei einer Halbem energie-Bandbreite von 10 nm auf. Der Emissionsfilter 50 wies • eine Zentrumwellenlänge von 540 nm bei. einer Halbenergie-Bandbreite von 30 nm auf. Alle in der Zeichnung dargestellten Linsen wiesen einen anti reflektierenden überzug, eine Brennweite von 16,7 mm, einen Durchmesser von 15 mm, einen.Abstand des Brenri- IQ punktes von der Rückseite der Linse, wenn diese auf ein entferntes' Objekt fokussiert ist, von 14,4 mm und einen Brechungsindex von 1,785 auf. Die Empfindlichkeit bei dem Prototyp lag in der Grössenordnung von 10~ Mol Natriumfluoresceiη.

Die vorangegangene, detaillierte Beschreibung dient der Erläuterung und dem Verständnis der Erfindung und stellt keine irgendwie geartete Beschränkung der Erfindung dar, da zahlreiche Modifizierungen und Änderungen der Erfindung möglich sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

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Claims

Patentanwälte

Dr.-ing. Walter Abftz ⁸· Januar 1982

Dr. Dieter F. Morf

Dipl.-Phys. M. Grifschneder

Dr. Ä. Freiherr von Wittgenstein

SOOQ München So, Poschingerstr. 6 3841

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois 60064, V.St.A.

Optisches Gerät für eine Fluoreszenzpolarisationsvorrichtung

Patentansprüche

1/ Optisches Gerät für einen Fluoreszenzpolarisationsanalysator, bei welchem eine fluoreszierende flüssige Probe (18) mit Anregungslicht bestrahlt wird, und ein Emissionslicht abstrahlt, von dem die Polarisation P anhand der nachfolgenden Beziehung: I(Z)-I(Y)/I(Z)+I(Y) bestimmt wird, wobei I(Z) die gemessene Intensität einer Polarisationskomponente des emittierten Lichts bei einem ersten Polarisationswinkel ist, wenn die flüssige Probe mit polarisiertem Anregungslicht bei dem ersten Polarisationswinkel bestrahlt wird, und I(Y) die gemessene Intensität der Polarisationskomponente des emittierten Lichts bei dem ersten Polarisationswinkel ist, wenn die flüssige Probe mit polarisiertem Anregungslicht bei einem zweiten Polarisationswinkel bestrahlt wird, der in bezug auf den genannten ersten Polarisationswinkel senkrecht ist, wobei das optische Gerät folgende Bestandteile umfasst:

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eine fokussierte Lichtquelle zum Bestrahlen der flüssigen Probe (18) mit Anregungslicht, das im wesentlichen auf das Zentrum der genannten Probe (18) fokussiert ist, wobei die fokussierte Lichtquelle eine Wolfram-Halogen-Lampe (10) mit niedrigem Watt-Verbrauch und niedriger Intensität umfasst;· einen Filter (28) mit enger Bandbreite, der zwischen der genannten fokussierten Lichtquelle und der Probe (18) angeordnet ist und Anregungslicht hindurchlässt, das im wesentlichen der Absorptionsbande der fluoreszierenden Probe entspricht;, einen ersten Polarisator (38), der zwischen dem Filter (28) mit enger Bandbreite und der Probe (18) angeordnet ist und eine festgelegte Polarisationsebene bei dem genannten ersten Polarisationswinkel aufweist;

einen Feldeffekt-Flüssigkristall (40), der zwischen dem Polarisator (38) und. der Probe (18) angeordnet ist und eine Vorrichtung umfasst, um den Flüssigkristall einem alternierenden elektrischen Feld auszusetzen und damit die flüssige Probe (18) einem alternierenden Anregungslicht auszusetzen, das in dem ersten oder zweiten Polarisationswinkel polarisiert ist; einen Photomultiplier (60), umfassend eine Einlassöffnung (56), ■ die das Emissionslicht, das von dem Photomultiplier (60) aufgenommen wird, begrenzt;

. das Emissionslicht fokussierende Linsen (48, 54), die zwischen der Probe (18) und dem Photomultiplier (60) angeordnet sind und das emittierte Licht in diePhotomultiplier-Einiassöffnung (56) fokussieren;
einen zweiten Polarisator (52), der zwischen der Probe (18) und

³^ dem Photomultiplier (60) angeordnet ist und eine festgelegte Polarisationsebene bei dem ersten Polarisationswinkel aufweist; und

einen Filter (50) mit grosser Bandbreite, der zwischen der Probe

(18) und dem Photomultiplier (60) angeordnet ist und emittiertes Licht hindurchlässt, das im wesentlichen dem Emissionsband der fluoreszierenden Probe (18) entspricht.

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2. Optisches Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der ersteund zweite Polarisator (38, 52) einen vertikalen Polarisator umfasst.
3. Optisches Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass

es Prallbleche (46) umfasst, die der flüssigen Probe (18) benachbart sind und im wesentlichen verhindern, dass Reflektionen des Anregungslichts in den Strahlengang des Emissionslichtes zu der Photomultiplier-Einlassöffnung (56) gelangen. ■
4. Optisches Gerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die fokussierte Lichtquelle weiterhin umfasst:

einen Reflektor (12) for die Wolfram-Halogen-Lampe (10);

ein Lichtabschirmelement (16) mit einer Öffnung zur Aufnahme von lb

Anregungslicht, das von der Lampe (10) reflektiert wird; und

das Anregungslicht fokussierende Linsen (26, 44), die zwischen der Öffnung (16) und der Probe (18) angeordnet sind und das Anregungslicht auf das Zentrum der Probe (18) fokussieren.
5. Optisches Gerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Infrarotabsorptionselement (24) umfasst, das zwischen der Öffnung (16) und den das Anregungslicht fokussierenden

2g Linsen (26, 44) angeordnet ist.
6. Optisches Gerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass

es eine Anregungslicht-Monitorvorrichtung umfasst, um die Intensität des Anregungs'lichts zu überwachen und im wesentlichen konstant zu halten.