DE3126157A1

DE3126157A1 - Enzymmedium, dessen herstellung und reinigung

Info

Publication number: DE3126157A1
Application number: DE19813126157
Authority: DE
Inventors: Andre 74800 Roche-sur-Foron Ayerbe; Christian 1227 Carouge Guillot; Michael 1256 Trionex Schneider
Original assignee: Fisons Ltd
Current assignee: Fisons Ltd
Priority date: 1980-07-05
Filing date: 1981-07-02
Publication date: 1982-04-01
Also published as: CA1178546A; SE8104166L; JPS5747480A; US4399221A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung

eines Polysaccharid-erzeugenden Enzyms und Materialien, ;

die hohe Enzymkonzentrationen enthalten. ;

. Es ist bekannt, daß gewissen Mikroorganismen in solcher \

^; Weise kultiviert werden können, daß man Kulturflüssig- ?

\ keiten erhält, die reich an Polysaccharid-erzeugenden I

! Enzymen sind. Gewisse Enzyme sind fähig, entweder in situ '

MO '.

; in der Fermentationsflüssigkeit oder als solche isoliert

Saccharose in Dextran überzuführen. Bei diesen bekannten \ \ Verfahren, wie sie z. B. in US PS 2 686 147 beschrieben wur-n

: den, werden die Enzym-erzeugenden Organismen in einem *■

ι Zuckermedium kultiviert, wobei die Erzeugung an Dextran I

* 15 :

; selbst auf ein Minimum reduziert, jedoch eine maximale j

{ Erzeugung des Enzyms, z. B» Dextransaccharase, erhalten \

' wird. ;

; Es wurde gefunden, daß die Enzymausbeute durch angemessene \

i 20 ■

) Regelung der Kultivierungsbedingungen, insbesondere des [

■ pH-Wertes, der Saccharosekonzentration (viel geringer als \

■ früher) und des Ausmaßes der Belüftung (viel größer als \ \ früher) beträchtlich gesteigert werden kann« Darüberhinaus \ ; wurde gefunden, daß Enzyme mit beträchtlich größerer ■

25 ■

; Reinheit erzeugt werden . können, daß die Enzyme unter be- \

\ stimmten Umst-"Mden praktisch in Abwesenheit von Dextran j

I erzeugt werden können, daß ein Wachstum mit beschränktem j

ι Saccharosegehalt in der Herstellungslösung vorteilhaft \

I ist (im Gegensatz zum Stand der Technik) und daß Enzyme \

hergestellt werden können, die keine oder nur geringe

Invertase-Aktivität aufweisen und Dextrane mit den gleichen J

chemischen Eigenschaften erzeugen wie dies bei normaler ^; - bakterieller Fermentation der Fall ist.

135 Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines
\ Polysaccharid-erzeugenden Enzyms, z. B. Dextransaccharase,
geschaffen, welches die Fermentation eines geeigneten,
Enzym-erzeugenden Organismus in wässriger Saccharose umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharosekonzen-. trat ion während. d.e.s....gea.aia.tßn„.V-eni!.ahr-eas. *...~au,ßej?-.-.bjei. dem. .

letzten Teil der Fermentation - zwischen 1 und 10 g/l aufrechterhalten wird und daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff geregelt wird. Die bevorzugte Saccharosekon-

; 5 zentration beträgt zwischen 5 und 10 g/l.

Mit der Bezeichnung "letzter Teil der Fermentation" ist der ' Teil gemeint, in welchem kein weiteres Wachstum und keine wesentliche Enzymsynthese mehr erfolgt.

Während des letzten Teils der Fermentation sollte im wesentlichen die gesamte Saccharose, z. B. bis zu einer Menge von weniger als 5 g/l, vorzugsweise weniger als 1g/l, durch Stoffwechsel aufgebraucht werden, um die.Bildung von

,₅ überschüssigem Dextran in situ zu verhindern. Das Vorhandensein einer kleinen Menge an Dextran, ζ. Β. zwischen 0,1 3,0 Gew./Gew.-% in dem Fermentationsprodukt kann jedoch vorteilhaft sein, z. B. bei der nachfolgenden Isolierung des Enzyms. Je mehr Dextran jedoch vorhanden ist, umso viskoser ist das Medium und umso schwieriger kann die Zellabtrennung von dem Medium sein.

Erlaubt man während der Fermentation ein Abfallen der Saccharosekonzentration auf einen zu niedrigen Wert, wurde _?5gefunden, daß ein beträchtliches Absinken der Gesamtausbeute an Enzym auftritt, selbst wenn dieser Wert nach- _: träglich so erhöht wird, daß er innerhalb des gewünschten Bereichs liegt. Es wird daher ein Anwachsen der Enzymaktivität entsprechend einem im wesentlichen parallelen ; Wachstums an Biomasse bevorzugt. :

Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wird vorzugsweise auf einem hohem Niveau, z. B. zwischen 100 und 40 %, vorzugsweise zwischen 80 und 40 % während der gesamten Fermentation gehalten. Insbesondere wird bevorzugt, daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff am Anfang der Fermentation hoch ist und dann während des /Fortschreitens der Fermentation fallen darf. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff kann durch die Geschwindigkeit, mit welcher die Fermentation gerührt wird und/oder die Zugabemenge an Luft oder Sauerstoff

+) Die Angaben beziehen sich auf den prozentualen Anteil_; bezogen auf den Sättigungspunkt.

* A β

6 4 4 » α «

** mti · β

«} » ο Qq

»Ι) ο α<>

geregelt werden.

Die Saccharosemenge in der Fermentationsmischung kann mithilfe einer Vielzahl von Verfahren bestimmt werden, z. B. mit der Hochdruck-Flüssigkeits-chromatographie-Analyse oder durch Relativierung des Saccharoseverbrauchs zur Menge an erforderlichem Alkali, um einen konstanten pH-Wert aufrecht zu erhalten. Das Resultat kann verwendet werden, um die gewünschte weitere Zugabemenge an Saccharose zu bestimmen. Während jeder Fermentation können eine oder mehrere Saccharose-Bestimmungen erforderlich werden.

Die kontinuierliche oder ansatzweise Saccharosezugabe zu dem Fermentationsmedium zur Aufrechterhaltung der Saccharosekonzentration in diesem Medium, z. B. ein "fed-batch" Verfahren, bildet eine spezielle Ausführungsform dieser Erfindung ο Dieses Verfahren ist gegenüber einem kontinuierlichen Verfahren insofern vorteilhaft als es das Risiko der Mutation der Bakterienstämme auf ein Minimum beschränkt.

Die Fermentation wird vorzugsweise über eine Zeitspanne von etwa 5 - 15 Stunden durchgeführt.

Der pH-Wert beträgt im wesentlichen während der gesamten Fermentation zwischen etwa 6,0 und 7_?0, vorzugsweise \ etwa 6,7.

Der pH-Wert kann auf einen Bereich von 6,0 bis 7,0 z. B. mithilfe von Puffern eingestellt werden wie z. B. dem bekannten Puffer vom Phosphat-Typ oder durch Zugabe ausreichender Mengen an wasserlöslichem Alkali, z, B. Natrium - oder Kaliumhydroxyd, um den gewünschten pH-Wert aufrecht zu halten., Das letztere Verfahren, welches bevorzugt wird, kann unter Verwendung einer automatischen ph^Wert-Regelungsvorrichtung durchgeführt werden. Gegebenenfalls können Saccharose und Alkali in angemessenen Anteilen unmittelbar vor Zugabe zur Fermentation vermischt werden, und die Mischung kann zugegeben werden, wenn der pH-Wert der Fer-

mentation ein vorbestimmtes Niveau erreicht. Alternativ j können Saccharose und Alkali auch separat, jedoch simultan, ' zugegeben werden.
\ ⁵
\ Puffer, die zur Erhaltung des pH-Wertes im Bereich von

6 bis 7 verwendet werden können, sind z. B. Phosphatpuffer, ^; Zitratpuffer, Bicarbonatpuffer und dergleichen.

- io Die mineralischen und assimilierbaren Stickstoffquellen für die Fermentation sind im wesentlichen jene wie sie bekanntlich nach dem Stand der TEchnik für die Herstellung von Dextran beschrieben worden sind. Zum Beispiel können Proteine oder porteinartife Stoffe wie Hefeextrakt, Getreideeinweichflüssigkeit, lösliche Anteile bei der Brennerei,⁺⁾ Sojamehlprodukte und dergleichen verwendet werden. Erfindungsgemäß wird jedoch eine hohe Konzentration, z.B. von mehr als 15 g/l Kaliumphosphat bevorzugt.

Die Zellabtrennung am Schluß der Fermentation kann mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden; die Zellen können z. B* von dem Medium abfiltriert oder abzentrifugiert werden.

Die Fermentation erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 20° - 35° C, vorzugsweise 20° - 30° C, insbesondere 23°- 25° C.

Die oben beschriebenen Verfahren können unter gewissen Umständen wässrige Fermentationslösungen hervorbringen, 'lie Enymkonzentrationen von mehr als 150, insbesondere mehr als 200, vorzugsweise mehr als 250 DSU/ml Enzym enthalten. Enzymkonzentrationen von bis zu 400 DSU/ml und höher kann man unter angemessenen Bedingungen enthalten.

Es können alle Organismen der Arten: Leuconostoc, Aerobacter, Streptobacterium, Betabacterium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und dergleichen, die dafür bekannt sind, Polysaccharide, Dextran, Levan oder

+ ) "distillers.¹... so.lub.les-'!™.=__läsliche s.ti,ckst.o ff enthalt ende

Materialien, wie sie bei der Brauerei verwendet werden.

Mischungen von diesen in wässrigen Kulturmedien zu erzeugen, verwendet werden. Insbesondere bevorzugt wird die Verwendung von Leuconostoc mesenteroides.

Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung eines Polysacchariderzeugenden Enzyms geschaffen, welches die Absorption einer Enzym-haltigen Mischung an einem anionischen Harz und das Entfernen des Enzyms von dem Harz mit einem zuckerhaltigen Eluierungsmittel umfaßt.

Als anionisches Harz wird vorzugsweise ein Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-Zelluloseharz verwendet, obgleich auch andere anionische Harze verwendet werden können (z. B. DEAE-Sephadon und DEAE-Sepharose); der im Eluierungsmittel verwendete Zucker kann Saccharose oder ein anderer Zucker sein. Vorzugsweise wird in dem Eluierungsmittel ein anderer Zucker als Saccharose verwendet, nämlich z. B. Fruktose, Maltose oder^-Mehtylglucosid, da die Erzeugung von Dextran an dem Harz dadurch auf ein Minimum beschränkt wird. Die Zuckerkonzentration in dem Eluierungsmittel beträgt vorzugsweise zwischen 0,1 und 8 %, insbesondere 1 - 5 %. Besonders bevorzugt wird eine Mischung von 0,1 - 1 % Saccharose zusammen mit 1 - 5 % .^f-Methylglucosid.

Die Reinigung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als etwa 10°C, insbesondere von weniger als 8 C, beispielsweise bei 4°C. Die Reinigung sollte natürlich bei '30 einer Temperatur erfolgen, bei welcher das Medium flüssig ist

Die Mischung, die das Enzym und Dextran enthält, wird : vorzugsweise durch Ausfällen mit Lösungsmittel, z. .B. . ; Äthanol, aus der Fermentationslösung, in welcher das Enzym (und etwas Dextran) hergestellt wurde, erzeugt.

Bei der Ausfällung des Enzyms mit Äthanol ist der Salzgehalt des Mediums von Bedeutung; je höher der Salzgehalt, desto mehr Äthanol ist zur Ausfällung des Enzyms erforder-

; lieh. Bei dem zur optimalen Enzymherstellung verwendeten j

; Verfahren wird eine große Menge Alkali, z. B. Natrium- j

hydroxyd, zugegeben; daher ist die Salzkonzentration am ,

ί> Ende der Fermentation hoch. 30 Vol/Vol-% flüssiges Äthanol j

wurde als geeignete Menge zur Ausfällung des Enzyms aus j

solch einem Fermentationsmedium ermittelt. Höhere Äthanol- j

konzentrationen (4.0 VoL,/Vol. %) haben eine nachteilige j Wirkung auf die Enzymaktivität. Bei einer Dialyse der Fermentationjsflüssigkeit zur Entfernung der Salze erfolgte eine Ausfällung an Enzymen, die einer Ausbeute von 90 % mit 25 % Äthanol entsprach.

Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Isolierung des Enzyms ,15 ist der Dextrangehalt der Fermentationslösung. Wird der pH-Wert während der Fermentation auf 6,7 eingestellt, beträgt der Dextrangehalt dieser Lösung nahezu Null. Unter diesen Bedingungen konnte das Enzym mit Äthanol nicht wirksam ausgefällt werden. Bei Verwendung von 35 Vol/Vol.% Äthanol erhielt man Ausbeuten von 10 - 15 %. Wurde jedoch etwas Saccharose vor der Ausfällung zu der Lösung zu-' gegeben, bildete sich Dextran in situ und das Enzym konnte wirksam ausgefällt werden. Der bevorzugte Dextrangehalt entspricht jenem, der aus 1 g Saccharose pro 1 - 1,5 χ Io

25 DSU an Enzymen hergestellt wurde.

Fermentationsflüssigkeiten mit hohen Enzymkonzentrationen ergeben nach Äthanolausfällung ein viel reineres Enzym als man das bisher beobachten konnte. Mit den verbesserten Verfahren der vorliegenden Erfindung können Roh-Enzyme mit mehr als 100 bzw. bis zu 300 und mehr DSU/mg Trockengewicht hergestellt werden.

Erfindungsgemäß wird auch ein gereinigtes, Polysacchariderzeugendes Enzym geschaffen, das mehr als 800, vorzugsweise mehr als 3.000 DSU/mg Protein enthält.'

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben.

β β 6« · *

Beispiel 1

ι Zur Herstellung des Impfstoffes wurde ein Dreistufenver-■ fahren angewendet. Die Zusammensetzung des Mediums wie sie für den Impfstoff verwendet wurde, war wie folgt;

- Saccharose

- Melasse

- Na₂HPO₄

- Hefeextrakt (Difco)

- Wasser

40 g
20 g
0,4 g Medium A

5 g 1 1

Der pH-Wert wurde mit 0,1 g NaOH auf 7.5 eingestellt.

Dieses Medium wurde 20 Minuten lang bei 115 C sterilisiert»

Schritt 1:

100 ml des sterilen Mediums A wurden in einen für die Kultur bestimmten Kolben eingeführt und mit einer Ampulle gefriergetrockneten Leuconostoc mesenteroides (Ref. Fisons C31 NC1B 8710) geimpft. Dieser Kulturkolben wurde 14 Stunden bei 27° C geschüttelt.

Schritt 2:

Gleiche Teile von 10 ml der Primär-Kultur wurden in 6 Erlenmeyerkolben geleitet, wovon jeder 100 ml des sterilen Mediums A enthielt. Diese Kolben wurden unter

Schütteln bei 27 unterzogen.

C einer Inkubationszeit von 10 Stunden

Schritt 3: '

Die Fermentiervorrichtung wurdemit 10 1 des folgenden

Mediums gefüllt:

- Saccharose

- Hefeextrakt

(dieser enthielt 10 % Stickstoff, wovon 50 % des Stickstoffs als oC -Amino-Stickstoff zur Verfügung stand)

40 g/l

40 g/l 20 g/l

Medium B

- ίο -

- R Salze 0,5 Volumen-%

- Antischaummittel

(Silicone SAG 120) 1 -.1

4,0 g 0,2 g 0,2 g

to MnSO₄.H_?0 " 0,2 g

100 ml

Dieses Medium wurde sterilisiert (20 Min, 115⁰C), auf 23° C abgekühlt und der pH-Wert auf 7,2 eingestellt. Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 2 vvm⁺zugegeben und man begann zu rühren.

R-SaI	~-e	sind:
MgSo₄	.7H	2°
NaCl
FeSO₄	.7H	2°
MnSO₄	.H₂	0
HpO

Es wurden 600 ml der Sekundär-Kultur in die Fermentiervorrichtung eingeführt und dort 13 Stunden bei 23° C belassen. Der pH-Wert wurde nicht geregelt.·

- Unter diesen Bedingungen betrug die Biomasse-Konzentration, die man im endgültigen Impfstoff.erhielt, 3 g/l bei einem Versuch Pp und 4 g/l bei einem Versuch P_. Sechs ?f> Liter Impfstoff bei Versuch P₂ und 4,5 1 bei Versuch Ρ- wurden wurden in die Haupt-Fermentiervorrichtung ge-

■ leitet (300 1), wobei man eine anfängliche Biomasse-Konzentration von 0,06 g/l erhielt.

30 Fermentationsmedium

Bei den 2 Versuchen würde das folgende Ausgangsmedium verwendet:

- Saccharose 10 g/l

- Hefeextrakt 40 g/l

35 - K₂HPO₄ 20 g/l Medium C

- R-Salze 0,5 Vol.-%

- Antischaummittel

(Silicone SAG 12o) 0,1 Vol.-%

Alle diese Bestandteile wurden in einer kleinen Menge. ^ +) Volumenteile pro Volumenteil pro Minute

- 11 -

Leitungswasser gelöst und dann in die Fermentiervorrichtung geleitet. Dann wurde Leitungswasser bis zu einem endgültigen Volumen von 300 1 aufgefüllt und der pH-Wert auf .7,1 - 7,2 eingestellt.

Das Medium wurde 30 Min. bei 115-118° C sterilisiert und dann abgekühlt. Während des Abkühlens wurde sterile Luft zugeführt, um einen geringen überdruck (o,2 at) in der Fermentiervorrichtung aufrecht zu erhalten. Die Temperatur in der Fermentiervorrichtung wurde dann auf 23°C eingestellt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit ν · 1 vvm zugeführt. Es wurde weitergerührt. Zur Einstellung des pH-Wertes wurde Industrie-reine Natriumhydroxydlösung (32 %) verwendet. Zusätzliche Saccharose wurde als eine 60 %ige Lösung in Leitungswasser bereitet und sterilisiert.

Der pH-Wert, die Konzentration an gelöstem Sauerstoff und die Temperatur wurden fortlaufend aufgezeichnet. Zusätzlich wurden stündlich Muster entnommen und der Wachstumsgrad (bestimmt durch optische Dichte bei 590 mn), der Zuckergehalt (Saccharose und Fruktose) sowie die Enzymaktivität bestimmt. Der stündliche Verbrauch an Sachcarose und NaOH wurde aufgezeichnet,

Verlauf der Fermentation

100 1 einer Saccharoselösung (600 g/l) wurden hergestellt und in einem Autoclaven (115°C, 20 Min.) sterilisiert.

Der Impfstoff wurde zugegeben» Bald nach der Impfung begann der pH-Wert zu sinken; hatte er den Wert 6,7 erreicht »wurde er durch Zugabe einer 32 %igen Natriumhydroxydlösung automatisch auf diesen Wert eingestellt. Nach 3,5 Stunden erreichte bei Versuch Pp (4 Std. bei P₃) die optische Dichte₅g₀ (°^Dggo) ⁰^"¹? ^{und der} Saccharosegehalt in der Fermentiervor*richtung betrug 6,5 g/l bei Pp und 6,3 g/l bei P-. Dann wurde mit einer Geschwindigkeit von 800 g pro Stunden Saccharose zugegeben.

* C ·β·«

- 12 -

Nach einer Stunde wurde die Zugabegeschwindigkeit der Saccharose auf 1400 g/Std. erhöht. Diese Zugabegeschwindigkeit wurde dann stündlich während der gesamten Fermentation modifiziert. Da während jeder Stunde der Saccharosegehalt in der Fermentiervqrrichtung bekannt war (mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) sowie auch die zugegebene Saccharosemenge, konnte der Saccharoseverbrauch während jeder vergangenen Stunde bestimmt werden. Aufgrund dieses Vertes konnte der Verbrauch für die nächste Stunde vorausgesagt werden, so daß die Zugabemenge an Saccharose entsprechend angeglichen wurde.

'. Während der Fermentation wurde der Sauerstoffgehalt in der I'ermentiervorrichtung durch Anpassung der Rühi'geschwindigkeit

; angeglichen, uir einen Sauerstoffgehalt zu erhalten, der \

sich regelmäßig verringerte, und zwar von ursprünglich 100 % j

bis zu etwa 40 - 70 % am Ende der Fermentation. j

Während des gesamten Fermentiervorganges wurde in der Fer- !

mentiervorrichtung ein geringer Überdruck aufrecht erhalten. ■

Nach 14-stündiger Fermentation, als sich die optische Dichtern,, bei Versuch P„ bei 0,91 und bei Versuch P_Q bei 1,19 einpendelte, wurde die Saccharosezugabe gestoppt, jedoch wurde die Regulierung des pH-Wertes eine weitere Stunde lang vorgenommen. Während dieser Zeitspanne wurde die in der Fermentiervorrichtung noch vorhandene Saccharose aufgebraucht. Nach 15 Stunden wurde die Regulierung des pH-Wertes gestoppt. Die Fermentiervorrichtung wurde sodann auf 8° C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen. Die Luftzufuhr mit 1 win unter Rühren wurde fortgesetzt.

Am nächsten Tag berug der pH-Wert in der Fermentiervorrichtung zwischen 5,4 und 5,8; die Konzentration der Biomasse betrug 7,2 g/l bei P₂ und 9,6 g/l bei P₃.

Ergebnisse

Die bei den Versuchen P sind in Tabelle I aufgeführt.

2 ^{und P}3

erhaltenen Ergebnisse

Tabelle I Ausgangsbedingungen

w i\) no O Ol O	3	Ol	Versuch P	kg
Versuch Pp	12	kg
Saccharose	6	kg
Hefeextrakt	1 j	5 1
K₂HPO₄	30	ml
R-Salze	auf 300	1
Antischaummittel
Leitungswasser

Zugaben während der Fermentation ^

Saccharose 31,8 kg 20,7 kg

(= 63,6 kg (53 1) einer 60 G£w/Vol.~% (= 41,4 kg (34,5 1) einer 60 Gew./

wässrigen Saccharoselösung) Vol.-% wässrigen Saccharoselösung

32 Gew./Vol.-% wässrige NaOH-Lösung 18,8 kg 17,2 kg

(= 13,9 1, = 150,2 Mol NaOH) (= 12,7 1, = 137,5 Mol NaOH)

ν ö et

Endergebnisse

Enzymaktivität

Biomassekonzentration

Endvolumen (geschätzt)

290 DSU/ml

OD₅₉₀= 0,95 ( 7,2 g/l) 366,9 1

260 DSU/ml

OD₅₉₀ = 1,20 ( 9,6 g/l)

347,2 1

NJ CO *

Bei beiden Versuchen wurde der Saccharosegehalt in der Fer- ;

inentiervorrichtung innerhalb angemessener Grenzen reguliert i

■ (zwischen 6 und 9 g/l bei P„ und zwischen 2 und 7 g/l bei P₃)J ;

Der Sauerstoffgehalt in der Fermentiervorrichtung wurde bei I

Versuch P₂ über AO % gehalten, indem allmählich die Rühr- ^;

geschwindigkeit erhöht wurde» ;

ίο In beiden Fällen wurde zum Schluß der Exponentialwachstums- } phase eine zweite Wachstumsphase beobachtet, die 10 Stunden
nach Beginn der Fermentation begann und etwa 2 Stunden währte*

Beispiel 2 '■ υ, Es wurden 800 ml einer Saccharoselösung (600 g/l) hergestellt und sterilisiert (115°C, 20 Min.). ;

' j

Das Fermentationsmedium wurde unter Verwendung von 10 g/l {

Saccharose so hergestellt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben}

wurde. Mach dem Sterilisieren, Abkühlen und Einstellen auf \

23°C wurde, der pH-Wert auf 7,1 eingestellt und unter Rühren (

A vvm Luft zugegeben. In das Medium wurde der Impf- \

stoff aus 3 Erlenmeyer-Kolben (300 ml für 5 1), der wie

nach Beispiel 1 hergestellt worden war, eingeimpft. }

; Bald nach der Impfung begann der pH-Wert zu sinken. Als > dieser 6,7 erreichte, wurde er durch Zugabe von 5 η NaOH ! auf diesen Wert eingestellt. Nach 5 Stunden erreichte die
OD 0,1; die in der Fermentiervorrichtung verbliebene
Saccharosekonzentration betrug 5-6 g/l. Es wurde dann

unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe mit variabler \ Fließgeschwindigkeit Saccharose zugegeben. Die Anfangsgeschwindigkeit der Saccharosezugabe war 15 g/h. Nach einer
Stunde wurde diese auf 30 g/h erhöht. Nach 7-stündiger
Fermentation wurde die Geschwindigkeit auf 50 g/h erhöht,

nach 8 Stunden auf 70 g/h und nach 9 Stunden auf 90 g/h.
Die Saccharosezugabemenge wurde dann bei diesem Wert gehalten, bis die optische Dichte 1,1 - 1,2 erreichte.
Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Reduzierung des NaOH-Verbrauchä

festgestellt. Die Saccharosezugabe wurde gestoppt, die Regulierung des pH-Wertes wurde jedoch noch 0,5-1 Stunde lang aufrecht erhalten. Während dieser Zeitspanne wurde die 5 noch in der Fermentiervorrichtung verbliebene Saccharose aufgebraucht. Dann wurde die pH-Wert-Regulierung gestoppt. Der pH-Wert sank rasch auf 5,2 - 5,0 und die Fermentationslösung wurde zur Enzymgewinnung weiterverarbeitet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II dargestellt,

Tabelle II

	Saccharose Hefeextrakt KH₂PO₄ R-Salze ursprüngliches Volumen	50 g 100 g 100 g 25 ml 5 1
Ausgangsbedingungen	Saccharose NaOH 5n	480 g (800 ml) 450 ml
Zugaben während der Fermentation	Enzymaktivität Endvolumen	230 DSU/ml 6,25 1
Endergebnisse	Beispiel 3 (Abtrennung des Enzyms)

Zu der vorher zentrifugieren Fermentationslösung wurde Äthanol mit einer Temperatur von 0 - 5° C bis zu einer Endkonzentration von 25 % zugegeben. Diese Behandlung ergibt eine wesentliche Reduzierung des zu behandelnden Materialvolumens und eine hohe Gewinnung an Enzymaktivität (etwa 85 %).

Zwei Ansätze von in dieser Weise abgetrenntem Enzym zeigten die folgenden Eigenschaften:

• * * •f · tr φ it a	- 16 -	Enzym Nr. 1	3126157
		331
	(DSU/mg Protein)	r> η o/ J, ( /o	Enzym Nr. 2
spezifische Aktivität		14,5 %	162
reduzierende Zucker		20,0 %	3,1 %
Salzgehalt (geschätzt)		14,0 %
Dextrangehalt		42,0 %

Beide Enzyme waren unter den gleichen Bedingungen hergestellt worden.

₁₅ Beispiel 4 (Variation an gelöstem Op)

Fünf Versuche wurden in einer Labor-Fermentiervorrichtung unter Verwendung des gleichen Mediums wie nach Beispiel 1 durchgeführt. Die Temperatur betrug 23 ⁰C, der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt und Saccharose kontinuierlich zugegeben. Bei den Versuchen A, B und C sank der Geahlt an gelöstem Sauerstoff langsam von ursprünglich 100 % auf etwa 40 % am Schluß der Fermentation. Bei Versuch D sank der Gehalt an gelöstem 0„ auf halbem Wege der Fermentation auf Null. Bei Versuch E wurde während des gesamten Verlaufs gelöster Sauerstoff in Überschuß zur erforderlichen Menge zur Verfügung gehalten⁺und bei Versuch F wurde während der Fermentation keine Luft zugeführt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Gehalt an gelöstem Sauerstoff max. Enzymausbeute 100 % - 40 % A . 280 DSU/ml

B 260 DSU/ml

C 400 DSU/ml

100 % - 0 % D 105 DSU/ml

100 % E 180 DSJJ/ml

35 keiner 150 DSU/ml

+) d.h. der Wert wurde so nahe wie möglich an 100 % (Sättigung! gehalten. \

Beispiel 5 (Reinigung)

Das Rohenzym (10 000 DSU) wurde in 0,3 m Acetatpuffer
mit einem pH-Wert von 5,0 auf eine 45 ml Säule des
anionisches Harzes DEAE A 25 (Pharmacia) gegeben und
mit dem gleichen Puffer eluiert. Es wurde keine Enzymaktivität freigesetzt. Nach Zugabe von 72 ml wurde
die Pufferlösung geändert in: 1. m NaCl, 0,3'tn Acetat,
pH-Wert 5,0. Fast die gesamten Fremdstoffe, die in
dem Rohenzympräparat vorhanden waren,wurden so freigesetzt. Schließlich wurde das Enzym mit dem gleichen Puffer
: eluiert, zu welchem 1 % Saccharose und 1 % Maltosehydrat
zugegeben worden waren.

:¹⁵ Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden gesammelt und
; dann durch Ultrafiltrieren unter Verwendung einer
\ XM 50-Membrane(Amicon) konzentriert und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Enzympräparat besaß eine spezifische
Aktivität von 3250 DSU/mg Protein, welches ein wesentlich
.20 höherer Wert ist als bei allen früher beschriebenen Enzym- \ S präparaten. Die Enzymausbeute betrug 67 %. '

\ Die Eluierung des gereinigten Enzyms kann auch bei

Verwendung von 0,5 % Saccharose oder auch weniger, zusammen
;25 mit 1 - 5 % «G-Methylglucosid erfolgen.

: Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse, die man ; mit einer Enzymprobe und verschiedenen Eluierungsmedien
erhielt.Diese Versuche wurden an 2 ml-Säulen ausgeführt.

; · Tabelle

f Bedingungen: - Absorption des Rohenzyms (200 DSU) ;^:

■ in 0,3 m Acetatpufferlösung, *

pH-Wert 5,0, an einem DEAE A 25 Harz ( 2ml) ]

- Waschen der Säule mit 1 mNaCl, 0,3 in Acetatpuffer

- Eluieren mit 1m NaCl, 0,3 mAcetatpufferlösung, die verschiedene Zuckerkonzentrationeh

enthielt, (siehe nachstehend)

Zuckerkonzentrationen in dem Eluierungsruedium

Wiedergewinnung des Enzyms

Ί % Saccharose, 5 % e4-Methylglucosid 1 % Saccharose, 1 % cC-Methylglucosid 0,5 % Saccharose, 5 % ^-Methylglucosid 0,5 % Saccharose, 1 % ö(-Methylglucosid 0,2 % Saccharose, 5 % ^O-Methylglucosid 0,1 % Saccharose, 5 % (Λ-Methylglucosid

5 % ^-rMethylglucosid

69 %

100 %

76 %

81 %

79 %

0 %

Beispiel 6

Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde für kontinuierlichen Betrieb mit zufriedenstellenden Ergebnissen angewendet.

Bei den obigen Beispielen wurden das Bakterienwachstum und die Enzymaktivität sowie DSU wie folgt bestimmt.

(a) Bestimmung des Bakterienwachstums (Biomasse) Das Wachstum wurde durch Bestimmung der optischen Dichte (O.D.) bei 590 nm einer Probe gemessen,die .25-fach mit einer Salzlösung (NaCl, 0,9 %) verdünnt war. Bei 0D-Werten über 0,6 waren die Proben 50-fach verdünnt und die gemessene optische Dichte war mit zwei multipliziert worden.

Messungen der optischen Dichte geben rasche Information über das Bakterienwachstum. Die OD-Werte sind proportional der Konzentration an trockenen Zellen. Die Konzentration an trockenen Zellen wird durch Filtrieren einer gleichen Menge mit einem vorgewogenen Millipore-Filter (0,22 μ) und wiegen des Filters nach dem Trocknen (20 Min., 60 C) bestimmt.

- 19 (b) Bestimmung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wird durch Bestimmung der freigesetzten Fruktose mit dem Hostettler-Verfahren? (Helv,Chim.Acta, 3.4., .2132, : 1-951) gemessen.

te) Ein DSU (Dextransaccharose-Einheit) ist die Menge

an Enzym, die 1 mg Saccharose in einer Stunde bei 25° C

in Dextran umwandelt (unter Freisetzung von 0,52 mg Fruktose) j.

Der Versuch wurde mit einer 5 %igen Saccharoselösung in 0,1 _tn Acetatpufferlösung bei einem pH-Wert von 5,2 durchgeführt.

Claims

—2Θ-- Patentansprüche

1. Wässriges Enzymmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es mehr als 150 DSU/ml eines Polysaccharose-erzeugenden Enzyms enthält.

2. Gereinigtes, Polysaccharose-erzeugendes Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es mehr als 800 DSU/mg Protein enthält.

3c Gereinigtes, Polysaccharose-erzeugendes Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es mehr als 100 DSU/rag'Trockengewicht umfaßt.

4.)Verfahren zur Herstellung eins Polysaccharose-erzeugenden Enzyms, welches die Fermentierung eines geeigneten, Enzym-erzeugenden Organismus in wässriger Saccharose umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharosekonzentration während des gesamten Verfahrens, außer bei dem letzten Teil der Fermentation, zwischen 1 und 10 g/l aufrechterhalten wird und daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei der Fermentation geregelt wird.

\ ²⁵

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

ein Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen 100 und 40 % : während der gesamten Fermentation aufrechterhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4-5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Fermentationsmediums auf einen Bereich zwischen 6,0 bis 7*0 durch Zugabe von wasserlöslichem Alkali eingestellt wird, daß zu dem Fermentationsmedium während der Fermentation Saccharose zugegeben wird und die Fermentation bei ei "er Temperatur zwischen 20 bis 30° ( :³⁵ durchgeführt wird.

7. Verfahren zur Reinigung eines Polysaccharid-erzeugenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß es die Absorption einer das Enzym enthaltenden Mischung an einem anionischen

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Harz und das Entfernen des Enzyms aus dem Harz mit einem
zuckerhaltigen Eluxerungsmxttel umfaßt. \

Ϊ

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß j ein anderer Zucker als Saccharose verwendet wird und die j Reinigung bei einer Temperatur unter 10: C durchgeführt wird, j

ίο 9. Verfahren nach Anspruch 7-8, dadurch gekennzeichnet, ι daß die Ausgangsmischüng durch Ausfällen mit Lösungsmittel S aus der Fermentationslösung, in welcher das Enzym hergestellt
wurde, erzeugt worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß \ die Mischung Dextran bis zu einer Menge enthält, wie sie
aus 1 g Saccharose ι
stellt werden kann.

aus 1 g Saccharose durch 1 - 1,5 x 10 DSU an Enzym herge-