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DE2021465B2 - Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der 3beta-Stellung des Cholesterins dehydriert - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der 3beta-Stellung des Cholesterins dehydriert

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DE2021465B2
DE2021465B2 DE2021465A DE2021465A DE2021465B2 DE 2021465 B2 DE2021465 B2 DE 2021465B2 DE 2021465 A DE2021465 A DE 2021465A DE 2021465 A DE2021465 A DE 2021465A DE 2021465 B2 DE2021465 B2 DE 2021465B2
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DE
Germany
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cholesterol
enzyme preparation
group
production
dehydrates
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DE2021465A
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DE2021465C3 (de
DE2021465A1 (de
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Tokio Machida
Shizuko Nakamura
Osamu Terada
Hitoshi Shiroyama Kanagawa Yagi
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Publication date
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Publication of DE2021465B2 publication Critical patent/DE2021465B2/de
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der 3 /J-Stellung des Cholesterins dehydriert, durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus.
Bei einem bekannten Verfahren der genannten Gattung (vgl. »Journil of Biological Chemistry« 206, [1954], S. 511 bis 523) wurde als Mikroorganismus ein Mycobacterium-Stamm verwendet, der von Schwarz et al. (vgl. »Journal of bacteriology« 58, [1949], S. 117 bis 125) isoliert wurde. Dieser spezielle Mycobacterium-Stamm ist der Öffentlichkeit nicht zugänglich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Mikroorganismus zu finden, mittels welchem ein Enzympräparat, welches die OH-Gruppe in der 3 Zustellung des Cholesterins dehydriert. in lohnenswerter Ausbeute hergestellt werden kann.
Die Erfindung besteht darin, daß man bei dem Verfahren der eingangs genannten Art Brevibauerium sterolicum ATCC 21 387 in einem Kulturmedium mit oder ohne Cholesterin-Zusatz züchtet und da= Enzympräparat aus den Zellen und/oder der Fermentationsflüssigkeit nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
Die Gewinnung des Enzyms aus dem Nährmedium wird man im allgemeinen durch Aussalzung mit Ammoniumsulfat und durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel vornehmen. Da das E; zym relativ stabil ist, kann es auch ohne Inaktivierung mittels bekannter Methoden in hoher Ausbeute gewonnen werden.
Die enzymologischen Eigenschaften des erfindungsgemäß erhaltenen Enzympräparates sind folgende:
1. pH-Optimum: pH 7 bis 8.
2. pH-Stabilität: stabil bei pH 3 bis 10, insbesondere 6 bis 10.
3. Hitzebeständigkeit: stabil bis 50 C, bei mehr als 60 C schnelle Inaktivierung.
Das erfindungsgemäß gewonnene Enzympräparat dehydriert die OH-Gruppe in der 3 /i-Stcllung des Cholesterins. Es kann zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin in der Freiform oder Esterform verwendet werden. 6"
Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert".
Beispiel 1
Ein Nährmedium (pH 7.0), welches Pepton (l"„), Hefeextrakt (0,5';,,), Cholesterin (1 ■);,), Glukose (1"„) und Calciumcarbonat (0.5",/,) enthielt, wurde mit Brevibacterium sterolicum ATCC 21 387 beimpft und unter Schütteln oder Belüften bei 37X gezüchtet. Nach 72 Stunden wurden die festen Teile der Fermentationsbrühe durch Abfiltrieren entfernt; das Flltrat wurde bei nicht mehr als 35 C nuter reduziertem Druck konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat wurde auf nicht mehr als 5 C abgekühlt; unter Rühren wurde allmählich etwa die doppelte Volumenmenge kaltes Aceton (-10 bis - 15 C) zugefügt. Nach 30 Minuten wurde der Niederschlag unter Einhaltung der Temperatur des Materials (nicht mehr als 10 C) durch Filtrieren abgetrennt. Nach dem Waschen mit kaltem Aceton wurde das Aceton bei niedriger Temperatur entfernt, wobei man ein Enzympräparat als hellbraunes Pulver mit hoher Aktivität (1000 E/mg) bezüglich der Dehydrierung der OH-Gruppe in der 3 /i-Stellung des Cholesterins erhielt. Die Ausbeute aus 100 1 Fermentationsbrühe betrug 50 bis 400 g.
Beispiel 2
Die festen Teile, die durch Filtrieren oder Zentrifugieren einer gemäß Beispiel 1 produzierten Fermentationsbrühe erhalten wurde, wurden in eine etwa zehnfache Volumenmenge einer '/äomo'aren (M/50) Phosphatpufferlösung suspendiert. Man fügte eine kleinere Menge Äthylacetat zu und ließ die Mischung über Nacht bei 30 C stehen. Die Feststoffe wurden durch Zentrifugieren entfernt; die überstehende Flüssigkeil wurde in gleicher Weise - wie im Beispiel 1 beschrieben - behandelt, wobei ein Enzympräparat als gelblich-braunes Pulver mit hoher Aktivität (1200 E/mg) bezüglich der Dehydrierung der OH-Ciruppe in der 3 /(-Stellung dec Cholesterins erhalten wurde. Die Ausbeute lag für 100 1 Fermentationsbrühe bei 100 bis
1 50 g. Obgleich das so erhaltene Pulver leicht hygroskopisch ist, kann es beträchtliche Zeit bei Zimmertemperatur in getrocknetem Zustand aufbewahrt werden.
Beispiel 3
Es wurde in ähnlicher wie in den Beispielen 1 und 2 beschriebener Weise verfahren, jedoch mit der Ausnahme, daß kein Cholesterin im Nährmedium verwendet wurde. Die Ausbeute an dem Enzympräparat, welches die OH-Gruppe in der 3 /i-Stellung des Cholesterins dehydriert, aus der Fermentationsflüssigkeit bzw. aus den Zellen betrug 6 bis 40 g bzw. 10 bis 16 g bei einem Fermentationsansat? von 100 1.
Anhang
Die in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Aktivitäten der Enzympräparate wurden auf die nachstehend wiedergegebene Weise bestimmt:
Das jeweils gewonnene Rohenzympräparat wurde in einer geeigneten Menge einer '/loo010'31"611 Phosphatpufferlösung (pH 7,5) gelöst. 1 ml dieser 1 nzymlösung,
2 ml einer M/K)-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und 1 ml einer 5','„igen Cholesterin/Tolunllösung wurden miteinander vereinigt und unter Schütteln bei 37'C für eine Stunde /ur Reaktion gebracht. Danach wurde die Reaktionsmischung mit 1 ml einer 2 N-Natronlauge versetzt, bis zu 10 ml mit Wasser verdünnt und abermals durch Schütteln gut gemischt. Alsdann wurde I ml der verdünnten Reaktionsmischung mit 1 ml n-Propanol und dann bis zu 10 ml mit Petroläther versetzt und nach ausreichendem Schütteln das gebildete Cholestcnon extrahiert. 0,5 ml des Petrolätherextraktes wurden in ein Meßröhrchcn eingegeben, bis
zur vollständigen Entfernung des Pctroläthers und des Toluols in siedendem Wasser erhitzt, mit 5 ml n-Propanol versetzt und durch Schütteln gut vermischt. Danach wurde zur Bestimmung der Cholestenonmenge das Absorptionsspektrum gemessen.
Die bei den Aktivitätswerten verwendete Dimension »1 E« gibt an, welche Menge des Enzympräparates bei 37 C innerhalb einer Stunde 1 ml Cholesterin bezüglich der OH-Gruppe in der 3 /»'-Stellung dehydriert.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der 3 /^-Stellung des Cholesterins dehydriert, durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium sterolicutn ATCC 21 387 in einem Kulturmedium mit oder ohne Cholesterin-Zusatz züchtet und das Enzympräparat aus den Zellen und/oder der Fermentationsflüssigkeit nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
DE2021465A 1969-05-06 1970-05-02 Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der ibeta-Stellung des Cholesterin« dehydriert Expired DE2021465C3 (de)

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JP3403469 1969-05-06

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DE2021465A1 DE2021465A1 (de) 1970-11-12
DE2021465B2 true DE2021465B2 (de) 1974-05-16
DE2021465C3 DE2021465C3 (de) 1979-12-13

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DE2021465A Expired DE2021465C3 (de) 1969-05-06 1970-05-02 Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der ibeta-Stellung des Cholesterin« dehydriert

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GB (1) GB1291183A (de)

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