DE3115115A1

DE3115115A1 - Immunologische bestimmungsmethode

Info

Publication number: DE3115115A1
Application number: DE19813115115
Authority: DE
Inventors: Harald Dr. Gallati; Urs Dr. 4143 Dornach Handschin; Theophil Prof. Dr. 4144 Arlesheim Staehelin; Christian Dr. 4059 Basel Stähli
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1980-04-25
Filing date: 1981-04-14
Publication date: 1982-02-04
Also published as: SE460930B; FR2481318A1; ATA186481A; DK151399C; AU542563B2; NL8101860A; IT8121122A0; DK155881A; NL187545B; DE3115115C2; NO159620B; FR2481318B1; AT373398B; AU6981181A; GB2074727A; CA1160566A; NO159620C; NO811407L; SE8102558L; GB2074727B

Description

VDipL-lng. Reiner F. Meyer-Roxlau ·· ·. /":·. -"« -;

; 8000 München 80 - '"." ' : : "Ζ" * :" : : ^ 1 1 R 1 1

Uicile-Grahn-Str. 22, ΓβΙ. (089) 472947 "* " "" " , UIlQM

■ F.Hoffmann-La Roche & Co.Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

if

RAN 4093/51

1 4, April

Immunologische Bestimmungsmethode

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzymimmunverfahren nach dem sogenannten "Sandwich-Prinzip". Nach diesem Prinzip wird die zu bestimmende Substanz, die ein Antigen, ein Antikörper oder ein Hapten sein kann, mit zwei immunologisch aktiven Reaktionspartnern zur Umsetzung gebracht. In der Regel ist einer dieser immunologisch aktiven Reaktionspartner an einen wasserunlöslichen Träger gebunden, während der andere mit einem geeigneten Enzym versehen ist. In der Praxis wird die zu bestimmende Substanz zuerst mit dem an einen Träger gebundenen Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht, worauf nach Phasentrennung und Waschen die inzwischen an den Träger immunologisch gebundene Substanz mit dem zweiten, Enzym-markierten Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht wird. Nach erneuter Phasentrennung erfolgt die enzymatische Reaktion zum quantitativen Nachweis der zu bestimmenden Substanz entweder in der festen oder der flüssigen Phase. . ·

Man war bisher der Meinung, dass bei Enzymimmunverfahren die immunologische Reaktion der zu bestimmenden Substanz mit den beiden entsprechenden immunologisch aktiven Reaktionspartnern nacheinander in einem ersten und in einem zweiten Reaktionsschritt zu erfolgen hat.

Kit/ 9.2.81

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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschend gefunden, dass man entgegen der bisherigen Meinung quasi in einem "Eintopf-Verfahren" arbeiten kann, bei dem die zu bestimmende Substanz gleichzeitig mit beiden immunologisch aktiven Reaktionspartnern während einer einzigen Inkubation zur Umsetzung gebracht wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Enzymimmunverfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen einer Substanz mit einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der mit einem Enzym versehen ist, sowie einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist oder wird, durch Inkubieren der zu bestimmenden Substanz mit den immunologisch aktiven Reaktionspartnern, anschliessende Trennung von fester und flüssiger Phase und Messen des Ausmasses der Enzymmarkierung entweder in der festen oder in der flüssigen Phase als Aus» mass für die Menge der zu bestimmenden Substanz, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass für die immunologische Reaktion die zu bestimmende Substanz sowie die immunologisch aktiven Reaktionspartner von Anfang an und gemeinsam und nur einmal inkubiert werden.

Als zu bestimmende Substanz können all jene Bestandteile in physiologischen Flüssigkeiten, Zeil- oder Gewebeextrakten genannt werden, für die immunologische Reaktionspartner vorhanden sind oder gebildet werden können, und die zwei oder mehrere immunologisch aktive Stellen besitzen. Dazu gehören Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, Alkaloide. Bevorzugte immunologisch aktive Substanzen sind die natürlichen Antigene, wie Hormone, Enzyme, organspezifische Antigene, Bindegewebekomponenten, Blutzellenantigene, Plasmaproteine, pathologische Globuline. Besonders bevorzugte Substanzen sind das carcinoembryonale Antigen (CEA) sowie das menschliche Choriongonadotropin (HCG).

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Bei der erfxndungsgemassen Methode dient der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einem Enzym versehen ist, als Indikator der immunologischen Reaktion. Bevorzugte Enzyme sind die alkalische Phosphatase, die Malat-Dehydrogenase, die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, die Glucose-Oxidase, die Glucoamylase, die Galaktosidase und die Acetylcholinesterase. Ein besonders bevorzugter Enzym-Label ist die Peroxidase aus Meerrettich.

Das Enzym als Indikator der immunologischen Reaktion wird in der flüssigen ,vorzugsweise aber in der festen Phase nach bekannten Methoden gemessen und ist ein Ausmass für die Menge der zu bestimmenden Substanz. Bei der Peroxidase aus Meerrettich als Label wird vorzugsweise die Enzymmenge auf Grund der vorhandenen katalytischen Aktivität gemessen, die mit Hilfe von H-O- und o-Phenylendiamin als Redoxindikator bestimmt wird. Dabei wird nach einer 30-minütigen katalytischen Reaktion die Farbintensität des oxidierten Redoxindikators photometrisch gemessen.

Der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner dient der Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Analysenprobe. Für diesen Trennschritt kann der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner von Anfang an an einen wasserunlöslichen Träger gebunden sein oder dann während oder nach der immunologischen Reaktion an einen entsprechenden Träger gebunden werden.

Als wasserunlösliche Träger für den zweiten immunologisch aktiven Reaktionspartner sind geeignet: organische und anorganische Polymere (Amylase, Dextrane, native oder modifizierte Cellulose, Polyacrylamid, Agarose, Magnetit, poröses Glaspulver, Polyvinylidenfluorid (Kynar) und Latex), die Innenwand von Testgefässen (Teströhrchen, Titrierplatten oder Küvetten aus Glas oder Kunststoff) sowie die Oberfläche von festen Körpern (Glas- und Kunststoffstab, Stab mit endständiger Verdickung, Stab mit endständigen Flügeln oder Lamellen). Besonders geeignete Träger für die

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erfindungsgemässe Methode sind Glas- und Kunststoffkugeln.

Der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner kann an den wasserunlöslichen Träger physikalisch (adsorptiv) oder chemisch gebunden sein oder mit Hilfe eines weiteren Reaktionspartners, der seinerseits an einen Träger gebunden ist, während oder nach der Reaktion gebunden werden.

Wesentlich für die erfindungsgemässe Methode ist, dass die zu bestimmende Substanz mindestens zwei immunologisch aktive Stellen (Epitope) besitzt, die von den beiden immunologisch aktiven Reaktionspartnern, dem an einen Träger gebundenen und dem mit einem Enzym versehenen Reaktionspartner, erkannt und zur Reaktion gebracht werden können. Als immunologisch aktive Reaktionspartner werden vorzugsweise zwei verschiedene Komponenten benützt, die zwar beide mit der zu bestimmenden Substanz reagieren, aber je auf verschiedene immunologisch aktive Stellen gerichtet sind. Zur Bestimmung von Antigenen ganz besonders geeignet sind zwei Antikörper für dieses Antigen, die in zwei verschiedenen Tierspezies produziert wurden und die gegen verschiedene Epitope dieses Antigens gerichtet sind. Vorzüglich geeignet ist die Kombination von Antikörpern von verschiedenen Klons oder von monoklonalen Antikörpern und Antikörpern aus einer unterschiedlichen Tierspezies.

Für die immunologische Reaktion kann die Probe mit der zu bestimmenden Substanz direkt oder vorverdünnt oder in einer geeigneten Weise vorbehandelt eingesetzt werden. Zur Vorbehandlung kann die zu bestimmende Substanz isoliert, angereichert oder von störenden Bestandteilen befreit werden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die zu bestimmende Substanz gleichzeitig mit dem Enzym-markierten sowie dem Träger-gebundenen immunologisch aktiven Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht. Die Reihenfolge der Reagenzienzugabe richtet sich nach der Art des gewählten

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Trägersystems. Beim Arbeiten mit einer sensibilisierten Plastikkugel werden vorerst in einem geeigneten Teströhrchen der Enzym-markierte Reaktionspartner mit der zu bestimmenden Substanz zusammengegeben und anschliessend die mit dem anderen Reaktionspartner sensibilisierte Kugel zugesetzt.

Die immunologische Reaktion wird zur Einhaltung eines optimalen pH-Wertes, der zwischen 4 und 9 liegen kann, in einem geeigneten Puffersystem durchgeführt. Bevorzugte Puffer sind beispielsweise Acetatpuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Triathanolaminpuffer, Boratpuffer oder Glycinpuffer. Es können auch Puffermischungen eingesetzt werden.

Die immunologische Reaktion erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 0 bis 55"C. Normalerweise nimmt die immunologische Reaktionsgeschwindigkeit mit höheren Temperaturen zu, wodurch unter sonst gleichen Testbedingungen das Gleichgewicht schneller erreicht wird.

Die Inkubation der zu bestimmenden Substanz mit dem Enzym-markierten Reaktionspartner und dem Träger-gebundenen Reaktionspartner kann bis zum Erreichen des Gleichgewichtes erfolgen. Die immunologische Reaktion kann aber auch zu einem früheren Zeitpunkt abgestoppt werden, indem nach einer bestimmten Inkubationsdauer die feste und die flüssige Phase getrennt und das Ausmass der Enzymmarkierung entweder in der flüssigen oder in der feston Phase bestimmt wird.

Bei der immunologischen Reaktion können Massnahmen zur Stabilisierung der immunologischen Aktivität der Reaktionspartner und der zu bestimmenden Substanz sowie des Enzyms getroffen werden. Weiter können der Inkubationslösung Bestandteile, wie Proteine und Detergenzien, zur Ausschaltung unspezifischer Reaktionen, zur Verminderung

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von hemmenden Einflüssen oder zur Aktivierung zugegeben

werden.

Die neue Methode gemäss vorliegender Erfindung ist 5 ausserordentlich empfindlich und zeichnet sich durch ihre Einfachheit in der Handhabung aus.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 10

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Beispiel 1

Quantitative Bestimmung von CEA in Patientenplasmen mit einem monoklonalen CEA-Antikörper und einem gebräuchlichen CEA-Antikörper (Ziegen)

In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10 χ 75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,2 mol/1 NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄, pH 6,5 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, 20% normales Ziegenserum und 0,2 ug/ml Ziegen-Anti-CEA-Peroxidase-Konjugat) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der CEA-Standards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA und 20 ng/ml CEA) und des CEA-Kontrollserums (5,0 ng/ml CEA + 1,0 ng/ml) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus Anti-CEA-sensibilisierte Polystyrolkugel (0 = 6,5 mm) zugefügt und bei 37⁰C während 16 Stunden inkubiert. Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1 Kaliumeitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/1 H~O~ und 20 mmol/1 o-Phenylendiamin) transferiert und während 3 0 Minuten bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml IN HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle I sind die Werte einer CEA-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit dem Radioimmunoassay von ROCHE erhalten wurden.

Die Herstellung des monoklonalen Maus Anti-CEA erfolgt in Analogie zu der in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, beschriebenen Methode, wobei als Ausgangszellinie für die Fusion die Myelomlinie Sp 2/01-AG verwendet wird, welche unter der Nr. CRL 8006 bei ATCC hinterlegt ist. Die Fusion erfolgt mit Milzzellen von Mäusen, die mit CEA immunisiert wurden. Die Immunisierung der Mäuse erfolgte in Analogie zu Tabelle 1 der erwähnten

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Publikation, wobei die ersten beiden Immunisierungen mit je 50 ug CEA erfolgten, die Immunisierungen 3 und 4 weggelassen wurden, Immunisierung 5 mit 50 ug CEA und die Immunisierungen 6-8 mit je 200 ug CEA erfolgten.

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"ir

Tabelle I

Probematerial	ng/ml CEA	0 ng/ml CEA	7212	ROCHE-RIA-Test	ng/ml	492 nm/RT/3 0 Min.
CEA-Standard	5 ng/ml CEA	Patientenplasmen	7188		ng/ml
0	0 ng/ml CEA		7220	0,6	ng/ml	0,103
2,	0 ng/ml CEA	No.	7218	2,2	ng/ml	0,330
10,	CEA- Kontrollseruir	No.	7234	1,2	ng/ml	0,978
20,	5,	No.	7249	1,2	ng/ml	1,850
No.	7203	2,5	ng/ml	0,540
No.	7223	2,4	ng/ml	erfindungsgemasses
No.	7247	2,3	ng/ml	Verfahren
No.	7258	3,0	ng/ml	1,2 ng/ml
No.	7215	3,1	ng/ml	1,0 ng/ml
No.	7219	4,6	ng/ml	1,4 ng/ml
No.	8180	4,9	ng/ml	1,3 ng/ml
No.	7248	5,0	ng/ml	2,7 ng/ml
No.	7262	8,6	ng/ml	2,0 ng/ml
No.	7201	11,2	ng/ml	2,0 ng/ml
No.		14,2	3,3 ng/ml
No.		15,6	2,8 ng/ml
No.			4,3 ng/ml
		5,5 ng/ml
	5,9 ng/ml
	8,5 ng/ml
	10,7 ng/ml
	14,3 ng/ml
	15,3 ng/ml

35 Werte unter 2,5 ng/ml CEA liegen im Normalbereich, während Werte über 2,5 ng/ml im pathologischen Bereich liegen.

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Beispiel 2

Quantitative Bestimmung von CEA in Patientenplasmen mit CEA-Äntikorpernvon zwei verschiedenen Tierarten (Ziegen und Meerschwein)

In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10 χ 75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,2 mol/1 NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄, pH 6,5 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, 20% normales Ziegenserum und 0,2 ug/ml Ziegen-Anti-CEA-Peroxidase-Konjugat) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der CEA-Standards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA und 20 ng/ml CEA) und des CEA-Kontrollserums (5,0 ng/ml CEA + 1,0 ng/ml) zugemischt, je eine mit Meerschwein-Anti-CEA-sensibilisierte Polystyrolkugel [0 = 6,5 mm) zugefügt und bei 37^eC während 16 Stunden inkubiert. Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1

Kaliumeitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/1 H₃O₂ und 20

mmol/1 o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (22⁶C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml IN HCl zugemischt und inner-

halb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle II sind die Werte einer CEA-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit dem Radioimmunoassay von ROCHE

erhalten wurden.
30

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IH

Tabelle II

	Probematerial	ROCHE-RIA-Test	^AE492 nm/RT/30 Min.
5
		1,2 ng/ml
	CEA-Standard	1,2 ng/ml
	0 ng/ml CEA	2,5 ng/ml	0,098
	2,5 ng/ml CEA	2,4 ng/ml	0,270
10	10,0 ng/ml CEA	2,3 ng/ml	0,830
	20,0 ng/ml CEA	3,0 ng/ml	1,515
		3,1 ng/ml	0,470
		4,6 ng/ml	erfindungsgemässes
ΊΟ		4,9 ng/ml	Verfahren
		5,0 ng/ml	1,3 ng/ml
		8,6 ng/ml	1,3 ng/ml
		11,2 ng/ml	2,4 ng/ml
20		14,2 ng/ml	2,2 ng/ml
		15,6 ng/ml	2,2 ng/ml
	CEA- Kontrollserum	3,0 ng/ml
	5,0 ng/ml CEA	3,2 ng/ml
	Patientenplasmen	4,5 ng/ml
25		5,3 ng/ml
	No. 7220	5,6 ng/ml
	No. 7218	8,5 ng/ml
	No. 7234	10,9 ng/ml
	No. 7249	14,2 ng/ml
30	No. 7203	15,0 ng/ml
No. 7223
No. 7247
No. 7258
No. 7215
NO. 7219
No. 8180
No. 7248
No. 7262
No. 7201

Werte unter 2,5 ng/ml CEA liegen im Normalbereich, während Werte über 2,5 ng/ml im pathologischen Bereich liegen.

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung von CEA in Patientenplasmen mit mit monoklonalen CEA-Antikörpern von zwei verschiedenen Cl ons

In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10 χ 75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,2 mol/1 NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄, pH 6,5 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, 20% normales Ziegenserum und 0,15 ug/ml monoklonales Maus-Anti-CEA-Peroxidase-

*
Konjugat ) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der CEA-Standards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA und 2 0 ng/ml CEA) und des CEA-Kontrollserums (5,0 ng/ml CEA + 1,0 ng/ml) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus Anti-CEA-sensibilisierte Polystyrolkugel (0 = 6,5 mm) zugefügt und bei 37°C während 16 Stunden inkubiert. Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1 Kaliumeitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/1 H₂O₂ und 20 mmol/1 o-Phenylendiamin) transferiert und wahrend 30 Minuten bei Raumtemperatur (22⁰C ) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml IN HCl zuge-

^ÄO mischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle III sind die Werte einer CEA-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit dem Radio-

immunoassay von ROCHE erhalten wurden. 30

Die Herstellung des monoklonalen Maus Anti-CEA erfolgt in Analogie zu der in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, beschriebenen Methode, wobei als Ausgangszelllinie für die Fusion die Myelomlinie ^⁵ Sp 2/01-Ag verwendet wird, welche unter der Nr. CRL 8006 bei ATCC hinterlegt ist. Die Fusion erfolgt mit Milzzellen von Mäusen, die mit CEA immunisiert wurden. Die Immunisierung der Mäuse erfolgte in Analogie zu Tabelle 1 der er-

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wähnten Publikation, wobei die ersten beiden Immunisierungen mit je 50 ug CEA erfolgten, die Immunisierungen 3 und weggelassen wurden, Immunisierung 5 mit 50 \iq CEA und die Immunisierungen 6-8 mit je 200 ug CEA erfolgten. Es werden zwei verschiedene, geeignete monoklonale Antikörper verwendet, die gegen unterschiedliche Epitope des CEA Antigens gerichtet sind.

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-At* -Tabelle III

Probematerial	ng/ml CEA	,0 ng/ml CEA	. 7220	ROCHE-RIA-Test	ΛΡ 4 92 nm/RT/3 0 Min.
CEA-Standard	,5 ng/ml CEA	Patientenplasmen	. 7234
0	,0 ng/ml CEA		. 7223	1,2 ng/ml	0,390
2	,0 ng/ml CEA	No	. 7247	2,5 ng/ml	0,440
10	CEA- Kontroll .«serum	No	. 7258	3,0 ng/ml	0,620
20	5	No	. 7215	3,1 ng/ml	0,860
No	. 7219	4,6 ng/ml	0,510
No	. 8180	4,9 ng/ml	erfindungsgemässes
No	. 7248	5,0 ng/ml	Verfahren
No	. 7262	8,6 ng/ml	0,8 ng/ml
No	. 7201	11,2 ng/ml	3,0 ng/ml
No		14,2 ng/ml	3,5 ng/ml
No		15,6 ng/ml	3,2 ng/ml
No		4,4 ng/ml
		5,0 ng/ml
	5,4 ng/ml
	8,6 ng/ml
	11,0 ng/ml
	14.0 ng/ml
	16,0 ng/ml

30 Werte unter 2,5 ng/ml CEA liegen im Normalbereich, während Werte über 2,5 ng/ml im pathologischen Bereich liegen.

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Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von HCG in Serum/Plasma/Urin:

in die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10 χ 75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,1 mol/1 NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄, pH 7,0 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, und 1,0 ug/ml mono-

* klonales Maus-Anti-HCG-Peroxidase-Konjugat ) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der HCG-Standards (0, 25, 50, 100 und 250 miu/ml HCG) zugemischt, je eine mit Kaninchen-Anti-HCG-sensibilisierte Polystryrolkugel (0 = 6,5 mm) zugefügt und bei Raumtempera tur während 16 Stunden in wassergesättigter Atmosphäre inkubiert. Anschliessend werden die Polystryrolkugeln drei mal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1 Kaliumeitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/1 H_?O_ und 20 mmol/1 o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (16-30⁰C) inkubiert.

<® Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität v/erden 2,0 ml IN HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte einer HCG-Bestimmung in Serum

*° und in Urin aufgeführt.

Die Herstellung des monoklonalen Anti-HCG kann nach

einer der in Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297-304 beschriebenen Methode erfolgen.

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/3

HCG Bestimmung in Serum und in Urin

1. Standardkurven

	^ΔΕ492 ηπ/^{30 Min}-^/RT	Urin
mlU HCG/ml	Serum	0,385
0	0,185	0,525
25	0,385	0,720
50	0,530	1,05
100	0,830	1,59
250	0,185

2. Patientenproben

Probe	Nr.	^ΔΕ492 nm^/3° ^Min'^/RT	- ml-U HCG/ml Probe	* Verdünnung der Probe
Urin	N-1032 E	0,375	0
Il	58-418	0,5 75 (x 50) *	1500
Il	58414	0,775 (x 100) *	5500
Il	58416	0,810 (x 500) *	32000
Serum	2559	0,155	0
Il	2560	0,125	0
Il	1543	0,195	1,5
Il	2673	0,505	44
Il	1167	1,085	181
Il	1492	0,98 (x 10) *	1370
Il	2793	0,77 (x 20) *	1740
Il	924	0,69 (x 100) *	7300

Umrechnung: 1 ng reines HCG entspricht ca. 10 mlU HCG

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- yr -

Beispiel 5

Quantitative Bestimmung von HCG in Serum mit monoklonal.en HCG-Antikörpern von zwei verschiedenen Klons 5

In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10 χ 75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,1 mol/1 NaH₂PO./Na₂HPO₄, pH 7,0 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, und 1,0 ug/ml mono-

* klonales Maus-Anti-HCG-Peroxidase-Konjugat ) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der HCG-Standards (0, 25, 50, 100 und 200 ml U/ml HCG) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus-Anti-HCG-sensibilisierte Polystyrolkugel ) (0 = 6,5 mm) zugefügt und z„B. bei 37°c während 2 Stunden inkubiert. Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0/5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1 Kaliumeitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 ramol/1 H„0_ und 20 mmol/1 o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (16-30⁰C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 1,0 ml 2N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte von HCG-Bestimmungen in Serum aufgeführt.

*
Die Herstellung der monoklonalen Maus HCG-Äntikörper

erfolgt nach der in Journal of Immunological Methods, 3 2 (1980) 29 7-304, beschriebenen Methode. Es werden zwei verschiedene, geeignete monoklonale Antikörper verwendet, die gegen unterschiedliche Epitope des HCG-Antigens gerichtet sind.

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HCG Bestimmung in Humanserum (Mittelwerte aus Doppel-

bestimmungen)

Standardkurven

	1) Serum	ΛΕ	492 nm/30	Min./RT	4) Puffer
m 3ü/ml HCG	0.038	2)	Plasma	3) Urin	0.180
0	0.226	0	.054	0.158	-
25	0.475		-	-	0.716
50	0.905	0	.544	0.557	1.40
100	1.75	0	.955	0.970	2.44
200	1	.55	1.90

Die HCG Werte der unten angeführten Beispiele von Patientenseren wurden aus der Standardkurve 1) abgelesen. Die Standardkurven 2), 3) und 4) wurden an einem andern Tag mit neuen HCG Standards ermittelt.

2. Patientenseren

	091080	ΔΕ492/30	Min/RT	mlU/ml HCG
	2801	gemessen		aus Kurve 1)
Serum	3881	0.041		0
Pool	2673	0.025		0
Nr.	1167	0.450		47
Nr.	4891	1,13		127
Nr.	3240	2.12 (1:	2).	470
Mr.	4418	0.975 (1	:50)	5'450
Nr.	1.06 (1:	20)	2'280
Hr.	1.475 (1	:1000)	167¹OOO
Mr,

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Claims

Patentansprüche

IJ Immunologisches Verfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen einer Substanz mit einem immunologisch aktiven

Reaktionspartnor, der mit einem Enzym versehen ist, sowie einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist oder wird, durch
Inkubieren der zu bestimmenden Substanz mit den immunologisch aktiven Reaktionspartnern, anschliessende Trennung

von fester und flüssiger Phase und Messen des Ausmasses
der Enzymmarkierung entweder in der festen oder in der
flüssigen Phase als Ausmass für die Menge der zu bestimmenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass für die immunologische Reaktion die zu bestimmende Substanz sowie die immunologisch aktiven Reaktionspartner von Anfang an
und gemeinsam und nur einmal inkubiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist.
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3. Verfahren nach Anspruch 1 oder:2, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologisch aktiven Reaktionspartner verschiedene Antikörper sind, die gegen das gleiche Antigen aber gegen verschiedene Epitope dieses Antigens gerichtet sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 2 verschiedene ntonoklonale Antikörper

handelt.
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5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Substanz CEA ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch aktive Reaktionspartner, der an

einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist, monoklonales Maus-anti-CEA ist.

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7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes, anderes monoklonales Maus-anti-CEA ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes Ziegen-anti-CEA ist.
9. Verfahren nach Anpruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Peroxidase ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen HCG ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch aktive Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist, Kaninchenanti-HCG ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes monoklonales Maus-anti-HCG ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Peroxidase ist.
14. Immunologisches Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen einer Substanz mit einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, sowie einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist oder wird, durch Inkubieren der zu bestimmenden Substanz mit den immunologisch aktiven Reaktionspartnern, anschliessende Trennung von fester und flüssiger Phase und Messen des Ausmasses der Markierung entweder in der festen oder in

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der flüssigen Phase als Ausmass für die Menge 'der zu bestimmenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass für die immunologische Reaktion die zu bestimmende Substanz sowie die immunologisch aktiven Reaktionspartner von Anfang an und gemeinsam und nur einmal inkubiert werden und dass die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist und die immunologisch aktiven Reaktionspartner Antikörper von verschiedenen Klons sind, die gegen verschiedene Epitope dieses Antigens gerichtet sind.

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