DE3110559A1

DE3110559A1 - "vollsynthetisches zellkulturmedium"

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Publication number: DE3110559A1
Application number: DE19813110559
Authority: DE
Inventors: Joseph H. Dipl.-Chem. Dr. 6350 Bad Nauheim Wissler
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1981-03-18
Filing date: 1981-03-18
Publication date: 1982-09-30
Also published as: DE3110559C2; DE3271820D1; ATE20540T1; JPS57170186A; EP0060565A2; EP0060565A3; EP0060565B1

Description

Für die Kultur von Zellen verschiedener Art, wie Knochenmarks-.', Endothel- und Herzmuskelzellen oder Leukozyten, sind verschiedene Kulturmedi en bekannt. Diese Medien sind in der Regel wäßrige Lösungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten. Hauptbestandteile der KuI-turmedien sind Salze, Zucker und Metaboliten, Aminosäuren, Nucleotide und Nucleoside, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere Zusätze, wie Tenside, Schwermetallsalze und Farbstoffe. Spezielle Beispiele für übliche Kulturmedien sind unter den Bezeichnungen "HAM", "Medium 199" und "NCTC" bekannt; vgl. H.J. Morton, In Vitro 6 ,(197O) , S. 89 bis 108.

Zur Kultur von Zellen, wie Leukozyten, wird den Kulturmedien bei einer geplanten Dauer der Kultur über 1 Stunde meist Serum, beispielsweise Kalbsserum oder Pferdeserum, zugesetzt, da die Serumbestandteile für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen günstig sind. Wenn jedoch die serumhaltige Kulturlösung auf Proteine (Mediatoren) aufgearbeitet werden soll, die durch die Kultur erzeugt werden, bereitet die Gewinnung der meist nur in geringen Konzentrationen enthaltenen Produktproteine wegen der Vielzahl der aus dem Serum stammenden fremden Proteine große Schwierigkeiten. Außerdem kann dabei nicht mit Sicherheit festgestellt werden, ob ein bestimmter Mediator humoraler oder

³^ zellulären Ursprungs ist und von welcher Spezies er stammt; d.h. ob er ein Mediator der Spezies ist, deren Zellen kultiviert wurden, oder der Spezies, von der das verwendete (meist heterologe) Serum stammt.

L J

Neben den serumhaltigen Kulturmedien sind zwar auch serumfreie, synthetische Medien bekannt, vgl. H.J. Morton, a.a.O. Auch diese bekannten Medien haben aber bei der Kultur von Zellen, wie Leukozyten, bzw. bei der Aufarbeitung der entstandenen Mediatoren verschiedene Nachteile, da die in ihnen enthaltenen Tenside, Schwermetallsalze und/oder Farbstoffe die entsprechenden Mediatoren schädigen oder verunreinigen.

Andererseits fehlen den bekannten serumfreien Medien häufig essentielle Bestandteile, die für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Leukozyten erforderlich sind. Unter den bekannten Kulturmedien befindet sich somit keines, das beispielsweise für eine Leukozytenkultur zur Gewinnung von zellulären Spurensekreten, wie Entzündungsmediatoreri, in befriedigender Weise verwendet werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues vollsynthetisches Kulturmedium für die Kultur von Zellen, insbesondere von eukaryontisehen Zellen, wie Leukozyten, bereitzustellen, mit dem sowohl günstige Bedingungen für die Zellkultur geschaffen werden, als auch eine problemlose Aufarbeitung der Kulturlösung und Gewinnung der von den Zellen sekretierten Proteine ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein vollsynthetisches Zellkulturmedium, enthaltend Salze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere übliche Zusätze in wäßriger Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren und/oder mindestens ein Flavanoid und/oder mindestens ein Ubichinon und/oder Vitamin U und/oder Mevalolacton enthält.

^ Vorzugsweise enthält das vollsynthetische Zellkulturmedium der Erfindung zusätzlich mindestens ein definiertes Protein, das in einer besonders bevorzugten Ausführungsform hochreines, molekular einheitliches Serumalbumin ist.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das vollsynthetische Zellkulturmedium der Erfindung noch weitere, für die Kultur von eukaryontischen Zellen, wie Leukozyten, günstige Verbindungen aus den Stoffklässen der 'Polyhydroxyverbindungen und Zucker, Aminosäuren und Peptide, Nucleoside und Nucleosidbasen, anionischen Verbindungen und/oder Vitamine enthalten, deren Verwendung in den bekannten Kulturmedien nicht üblich ist.

■ig Vorzugsweise ist das Zellkulturmedium der Erfindung frei von Tensiden, Schwermetallsalzen und Farbstoffen, die die Zellen ■ schädigen und die Gewinnung der gewünschten Zellprodukte aus der Kulturlösung stören können.

Das Zellkulturmedium der Erfindung eignet sich in hervorragender Weise zur Kultur von eukaryontischen Zellen, wie Knochenmarkszellen, Endothelzellen, Herzmuskelzellen und insbesondere von Leukozyten, während deren Kultur..· zelluläre Sekrete erzeugt werden. Diese hervorragende Eignung des Kulturmediums der Erfindung ist auf seine stoffliche Zusammensetzung zurückzuführen, die eine Reihe von besonders wertvollen Stoffen für die Erhaltung des Lebens der Zellen und ihr Wachstum einschließt. Die Art dieser zusatz^ liehen Verbindungen wird nachstehend im einzelnen erläutert.

Ihre besondere Eignung in Zellkulturmedien wurde bisher nicht beschrieben. Das Zellkulturmedium der Erfindung schädigt also die zu kultivierenden Zellen nicht, sondern fördert im Gegenteil ihr Wachstum in hervorragender Weise und ermöglicht somit auch die Gewinnung von zellulären Sekretprodukten, wie Mediatoren, in besonders günstiger Weise.

L J

Außer zur Zellkultur mit dem Ziel der Gewinnung zellulärer Sekrete eignet sich das Zellkulturmedium der Erfindung auch für Kulturen, deren Ziel die biologit>une Untersuchung der Zellen und ihrer Funktionen ist. Beispiele für solche Kulturen sind die Anlegung von Zellstammlinien, die Untersuchung der Motilität von Zellen, Zellklonierung und ZeIltypisierung. Das Zellkulturmedium eignet sich sowohl für Suspensions- und Schichtkulturen, als auch für Diffusionskulturen an Membranen.

Ein zweiter wesentlicher Vorteil des vollsynthetischen Zellkulturmediums der Erfindung besteht darin, daß die während der Kultur entstandenen Proteine und andere gewünschte Produkte verhältnismäßig leicht aus der Kulturlösung gewonnen werden können, da diese kein die Gewinnung erschwerendes Proteingemisch (Serum) enthält, sondern nur wenige definierte, vorzugsweise ein einziges, bestimmtes Protein.

Nachstehend werden die Bestandteile des erfindungsgemäßen Kulturmediums im einzelnen erläutert, wobei zunächst die üblicherweise in solchen Medien verwendeten Stoffgruppen aufgeführt werden.

Eine erste wesentliche Stoffgruppe in Kulturmedien sind Salze. Unter diese Gruppe fallen als notwendige Bestandteile Alkali- und Erdalkalimetallionen, wie Na-, K-, Mg- und Ca-Ionen als Kationen, sowie Chlorid-, Phosphat-, Sulfat-, Carbonat- und Acetationen als Anionen. Die Verwendung von Salzen mit den vorstehend genannten Ionen ist in den Zellkulturmedien für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen erforderlich.

Eine zweite wichtige Stoffgruppe in Kulturmedien sind Zukker und Zuckerderivate. Zu dieser Gruppe gehören als notwendige und übliche Bestandteile beispielsweise Glucose, Ribose, 2-Desoxy-D-ribose und myo-Inosit.

L J

Aminosäuren und ihre Derivate sind eine dritte wesentliche Stoffgruppe in Zellkulturmedien. üblicherweise werden Gemische aus den natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet, wobei einzelne Aminosäuren, wie Carnitin und L-Ornithin, in den bekannten Kulturmedien fehlen. Bekannt ist ferner auch die Verwendung bestimmter Peptide, wie Glutathion.

Eine weitere Gruppe von Stoffen, die in den herkömmlichen Kulturmedien enthalten sind, sind Nucleotide, Nucleoside und ihre Derivate, beispielsweise Adenin, Adenosin, Guanin, Thymidin, Uracil und Hypoxanthin.

Schließlich sind in den üblichen Zellkulturmedien auch verschiedene Vitamine, Vitaminoide und Coenzyme enthalten, wie Ascorbinsäure, Biotin, Pantothenat, Ergocalciferol, Riboflavin, Vitamin A, Vitamin B₁₂, Pyridoxal und Nicotinamid. Als zusätzliches Steroid ist ferner die Verwendung von Cholesterin in Kulturmedien bekannt.

Nach Bedarf werden den bekannten Kulturmedien auch Antibiotika, wie Penicillin oder Streptomycin, zugesetzt, üblicherweise enthalten diese Kulturmedien außerdem Tenside, Schwermetallionen und Farbstoffe.

Die vorstehend genannten Stoffe werden in zahlreiche Kombinationen als Kulturmedien zur Zellkultur, verwendet, üblicherweise wird den aus den genannten Stoffen erhaltenen wäßrigen Lösungen Serum zugesetzt, wenn eine langer dauernde Zellkultur notwendig oder gewünscht ist.

Das Kulturmedium der Erfindung zeichnet sich durch folgende Unterschiede gegenüber den bekannten Kulturmedien aus:

1) Das Medium der Erfindung enthält zusätzlich zu den vorstehend bezeichneten üblichen Stoffgemischen wenigstens eine der folgenden Komponenten:

L J

- mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren, ■*· mindestens ein Flavanoid,

- mindestens ein Ubichinon,

- Vitamin U,

- Mevalolacton.

Die ungesättigten Fettsäuren sind als Vitamin F bekannt, Sie erweisen sich als wertvolle Synthesebausteine für die zu kultivierenden Zellen, insbesondere im Fall von Leukozytenkulturen. Als ungesättigte Fettsäuren kommen vorzugsweise ölsäure, Linolsäure und Linolensäure und ihre Derivate in Frage. Das Zellkulturmedium der Erfindung enthält mindestens zwei dieser Säuren, um das Nahrungsangebot für die Zellen auf einer breiten Basis zu halten. Die ungesättigten Fettsäuren sind im Zellkulturmedium der Erfindung in einer Menge von mindestens 0,1 μιαοΐ/ΐ bis höchstens der 8-fachen Serumalbuminkonzentration enthalten. Bevorzugt ist ein Bereich von 0,1 bis 20 μπιοΐ/ΐ.

Flavanoide (Bioflavanoide) sind als Flavonderivate und als Vitamin P bekannt. Auch diese Stoffgruppe erweist sich wegen seiner günstigen Wirkungen auf Zellmembranen als wertvoller Bestandteil für die zu kultivierenden Zellen, insbesondere Leukozyten, und Endothelzellen. Bevorzugt für die Verwendung im Zellkulturmedium der Erfindung sind Flavanoide, wie Morin, insbesondere solche mit einem L-Rutinose- oder einem L-Rhamnose-Rest, wie Rutin, Hesperidinum^Sesonders wirksam ist Rutin, das auch wegen seines verhältnismäßig niedrigen Preises bevorzugt ist. Die Flavanoide sind im Zellkulturmedium der Erfindung in einer Menge von 0,1 bis 50 μπιοΐ/l, vorzugsweise von 1 bis 20 μπιοΙ/1 enthalten.

Ubichinone sind Coenzyme, die als Elektronenüberträger bei biologischen Oxidationsprozecsen beteiligt sind und bei der oxidativen Phosphorylierung eine Rolle spielen. Auch diese Stoffgruppe stellt deshalb einen wertvollen Bestandteil des Zellkulturmediums der Erfindung dar. Bei-

spiele für geeignete "Ub!chinone sind Ubichinon Q- und Ubichinon Q₅₀ (Coanzym Q₁₀)· Die Ubichinone sind im Medium der Erfindung in einer Menge von etwa 0,01 bis 20 μπιοΐ/ΐ enthalten, wobei die Obergrenze nur durch den , .und ihre Löslichkeit . , _

hohen Preis dieser Verbindungen/bestimmt wird. Bevorzugt ist ein Bereich von 0,05 bis 2,0 μπιοΐ/ΐ.

Vitamin ü (DL-Methylmethioninsulfoniumchlorid) ist ebenfalls ein wertvoller Bestandteil des Zellkulturmediums, der für das Gedeihen der Zellen günstig ist. Das Vitamin U wird vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 20 umol/l, insbesondere von 0,5 bis 10 μιηοΐ/ΐ eingesetzt.

Mevalolacton (3,S-Dihydroxy-3-methyl- 0-valerolacton) ist ein wichtiger biochemischer Baustein für die Biosynthese der Isoprenoide und deshalb für das Zellwachstum von großem Vorteil. Es wird in einer Menge von 0,5

bis 30 μΐηοΐ/l, insbesondere von 1 bis 15 μΐηοΙ/1 einge-^SetZt·

Jede der vorstehend als Kennzeichen des Mediums der Erfindung genannten Komponenten {ungesättigte Fettsäuren, Flavanoid, Ubichinon, Vitamin U Mevalolacton) ergibt bereits bei alleinigem Zusatz zu einem Zellkulturmedium · üblicher Zusammensetzung eine beträchtliche Verbesserung der Wachstums- und Lebensbedingungen der Zellen. Diese kommen beispielsweise durch die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen nach Beendigung der Kultur zum Ausdruck. Demnach wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bereits durch ein Zellkulturmedium gelöst, das nur eine der vorstehend bezeichneten Komponenten zusätzlich zu den üblichen Bestandteilen eines Kulturmediums enthält.

L · J

' Bevorzugte Ausführungsformen des Zellkulturmediums der Erfindung enthalten mindestens zwei der genannten Komponenten in beliebiger Auswahl, wobei wiederum die Zweierkombinationen bevorzugt sind, bei denen eine Komponente mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren sind.

Durch die Kombination mehrerer dieser Komponenten wird eine noch größere Verbesserung der Kulturbedingungen erreicht. Spezielle Beispiele für besonders günstige Kombi-'0 nationen der zusätzlichen Komponenten des Mediums sind:

a) zwei oder drei ungesättigte Fettsäuren und ein Flavanoid;

b) die Kombination nach a) + ein Ubichinon,

c) die Kombination nach a) + Vitamin ü;

d) zwei oder drei ungesättigte Fettsäuren, Vitamin U und Mevalolacton;

e) ein Flavanoid, ein Ubichinon und Mevalolacton;

f) alle möglichen Kombinationen mit vier der Komponenten;

g) die Kombination aller Komponenten. 20

2) Obwohl Serum ein das Leben der Zellen förderndes komplexes Substanzgemisch ist, das aus diesem Grund in herkömmlichen Zellkulturmedien weit verbreitet ist, ist seine Verwendung im Medium der Erfindung nicht bevorzugt. Die Gründe dafür sind: Bei der Verwendung des Mediums zur Kultur von Leukozyten und der Gewinnung zellulärer Mediatoren wäre die mögliche gleichseitige Entstehung humoraler Mediatoren für die Identifizierung der gewünschten Produkte sehr ungünstig. _ Es würde erhebliche Schwierigkeiten bereiten, bei der Isolierung festzustellen, ob ein bestimmter Mediator humoraler oder zellulärer Herkunft ist und ob er aus der Spezies der Zellen oder derjenigen des ^Serums stammt. Außerdem ist es nicht sinnvoll. Zellen in aufwendigen Arbeitsvorgangen zunächst von Serum und anderen Körperflüssigkeiten abzutrennen, um sie dann wieder mit (Fremd)-Seren zu versetzen. Ferner können ungünstige ünnunreaktionen in heterologen Systemen das Gedeihen der Zellen und die Beurteilung der Sekretionsreak-

L tionen stören. J

Der Serumzusatz dient normalerweise als Proteinquelle im .

Zellkulturmedium und zur Verbesserung des Oberflächenverhaltens (Chemokinesis) der Zellen. Verhältnismäßig kurze Zeit können die Zellen auch ohne Proteine am Leben erhalten werden. Das Medium der Erfindung ist deshalb grundsätzlich proteinfrei und eignet sich aus diesem Grund auch für Untersuchungen über die Chemokinesis und Chemotaxis der Zellen, bei denen Proteine stören können. - · Für die länger dauernde Kultur von Zellen, insbesondere Leukozyten, ist jedoch ein Zusatz eines Proteins zu dem Zellkulturmedium aus mehreren Gründen bevorzugt.

Ohne Protein im Zellkulturmedium sind die Zellen nicht motil (keine Chemokinesis). Ferner wird ein Protein als Träger für hydrophobe Moleküle benötigt, die in freier Form toxisch wären. Aus den genannten Gründen wird im Medium der Erfindung bevorzugt auch mindestens ein Protein verwendet, jedoch, um die mit der Verwendung von Proteingemischen Undefinierter Zusammensetzung (Serum) verbundenen Nachteile zu vermeiden, ⁿur ein Protein oder ein Gemisch aus vorzugsweise wenigen

definierten Proteinen. Besonders bevorzugt enthält das ZeIl-■ kulturmedium der Erfindung nur ein definiertes Protein.

Spezielle Beispiele für Proteine sind Serumalbumin, 25 Fibrinogen, Ovalbumin und ähnliche Proteine, die nicht oder nur in definierter Weise zur Mediatorbildung befähigt sind.

Das bevorzugte Protein im Zellkulturmedium der Erfindung ! ist Serumalbumin, da es als Träger für hydrophobe Stoffe und

als Wirkstoff auf Zelloberflächen besonders gut geeignet ist. Um die vorteilhaften Wirkungen des Proteinzusatzes zu

erhalten, muß das Protein (Serumalbumin) mindestens in einer

Menge von 0,5 μπιοΐ/ΐ in der Kulturlösung enthalten sein.

Das Zellkulturmedium der Erfindung kann auch mehrere Proteine enthalten, solange diese definiert sind und nicht oder nur in definierter Weise zur Mediatorbildung befähigt sind.

3) Neben den vorstehend unter a) bis c) genannten Merkmalen kann sich das Medium der Erfindung noch durch weitere, wahlweise vorhandene Komponenten auszeichnen, die in herkömmlichen Medien nicht üblich sind. Hierzu gehören: - anionische Stoffe, nämlich Citronen-, Bernstein- und/ oder Brenztraubensäure. Diese Verbindungen sind weitere wertvolle Nahrungsstoffe für das Gedeihen der Zellen, ins b.esondere bei Leukozytenkulturen. Sie sind in einer Menge von 0,1 bis 5, vorzugsweise 0,2 bis 1 μπιοΐ/l enthalten. - Polyhydroxyverbindungen, Zucker und Zuckerderivate, nämlich Xylitol, D-Xylose, D-Galactose, Glycerin und/ oder Glucurono-V-Lacton. Auch diese Verbindungen sind wert volle Nahrungsmittel; sie sind einzeln oder im Gemisch in einer Menge von 0,1 bis 5, vorzugsweise 0,2 bis 2 μΐηοΐ/ΐ im Zellkulturmedium der Erfindung enthalten.

- Aminosäuren und Derivate, nämlich L-Ornithin, Sarcosin und Taurin. Auch diese in Zellkulturmedien ungewöhnlichen Aminosäuren erweisen sich als sehr wertvolle Nafcrungsbestandteile bei der Kultur von Leukozyten. Diese Verbindungen sind im Medium der Erfindung einzeln oder im Gemisch in einer Menge von 0,05 bis 2, vorzugsweise 0,1 bis 1 mmol/1 enthalten.

- Carnitin und Carnosin. Carnitin (3-Hydroxy-4-[trimethylanutioniol, -buttersäure-betain) dient im Fettsäurestoffwechsel als übertrager von Acylgruppen und hat Vitamincharakter. Carnosin (N-ß-Alanyl-L-histidin) hat eine noch weitgehend unbekannte Funktion, ist aber in Geweben weit verbreitet. Beide Stoffe sind wertvolle Aufbaustoffe für das Wachstum der Zellen. Carnitin, kann im Medium in einer Menge von 1 bis 200, insbesondere von 10 bis 100 pmol/l, Carnosin in einer Menge von 0,1 bis 20,. insbesondere von 1 bis 10 umol/l enthalten sein.

- Nucleoside und Nucleosidbasen, nämlich Cytidin, Guanosin, Guanosin, 5-Methylcytosin und/oder üridin. Auch diese Verbindungen sind in herkömmlichen Zellkulturmedien unüblich, jedoch als Bausteine der Nahrung für Zelltei-

! lungen wertvoll. Diese Stoffe sind in einer Menge von 0,01 bis 1, vorzugsweise 0,02 bis 0,5 μΐηοΐ/ΐ einzeln oder im Gemisch im Kulturmedium der Erfindung enthalten. Nucleotide werden dem Medium der Erfindung im Gegensatz zu bekannten Medien vorzugsweise nicht zugesetzt, da sie als solche nicht in die Zellen aufgenommen werden. - Vitamine, nämlich Vitamin K₁ (2-Methyl-3-phyty1-1,4-naphthochinon). Vitamin K. enthält den wichtigen Phytolrest. Der Zusatz dieses Vitamins bewirkt ein besonders günstiges Wachstum der Zellen, insbesondere bei Leukozytenkulturen. Es wird in einer Menge von 0,1 bis 2, vorzugsweise 0,2 bis 1 μΐηοΐ/ΐ im Zellkulturmedium der Erfindung eingesetzt.

4) Es enthält vorzugsweise kein Tensid, kein Schwermetallsalz und keinen Farbstoff.

Tenside, die in den bekannten Zellkulturmedien vermutlich dazu dienen sollen, hydrophobe Stoffe in Lösung zu halten, sind im Medium der Erfindung störend, da sie sich ungünstig auf das Reinigungsverhalten und die Struktur der von den Zellen sekretierten Proteine, wie Mediatoren, auswirken können. Schwermetallionen werden im Zellkulturmedium der Erfindung vermieden, da sie die Aktivität der sekretierten Proteine durch Verbindung mit den Sulfhydrylgruppen schädigen und das Redoxpotential des Kulturmediums stören können. Außerdem fördern sie die Zersetzung einiger Vitamine, wie Vitamin C. Farbstoffe sind störend, da sie sich mit Spurenproteinen aufgrund .hydrophober Wechselwirkungen irreversibel verbinden können.

30

Die Bestandteile des Zellkulturmediums der Erfindung sind in ihren Mengenverhältnissen in der wäßrigen Lösung so aufeinander abgestimmt, daß die Konzentrationen der Komponenten im

35

r 311055^

Medium weitgehend den natürlichen Konzentrationsbereichen des Plasmas angepaßt sind? vgl. Geigy AG (Herausgeber) (1969) in Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen, 7. Auflage, Geigy S.A. Basel Das Prinzip der Anpassung an die natürlichen Konzentrationsbereiche des Plasmas wird vorzugsweise nur dann verlassen, wenn es wirtschaftlich nicht sinnvoll ist. Beispielsweise wird das teuere Serumalbumin vorzugsweise nur in solcher Menge zugesetzt, daß die Chemokinesis

der Zellen nicht beeinträchtigt ist. 10

Zur Kultur der Zellen können dem Medium der Erfindung nach Bedarf weitere Zusätze einverleibt werden, die dem beabsichtigtem Zweck dienen. Beispielsweise können zur Auslösung physiologischer Funktionen Mitogene, Chemokinesine 15

oder Chemotaxine zugesetzt werden.

Außerdem können neben den üblichen Phosphat- und Carbonat-Puffersystemen auch andere Puffer, beispielsweise organische Puffersysteme wie HEPES = N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N'-2-

äthansulfonsäure, üblicherweise in einer Konzentration von 0,01 mol/1, eingesetzt werden.

In der nachstehenden Tabelle I sind die Bestandteile eines herkömmlichen Zellkulturmediums zusammengestellt. Das Medium

von Tabelle I entspricht bezüglich der Komponenten im wesentlichen dem bekannten Medium 199, wobei nur die Tenside, Schwermetallsalze, Farbstoffe und Nucleotide fehlen, die ;

im Zellkulturmedium der Erfindung vorzugsweise weggelassen werden. Die Medium-Zusammensetzung gemäß Tabelle I dient als Grundgemisch für die in den nachstehenden Beispielen erläuterten Medien der Erfindung. Dies bedeutet, daß in den Beispielen jeweils nur die zusätzlich eingesetzten Komponenten tabellarisch oder im Text angegeben werden. Die Konzentrationen der Bestandteile des Grundgemisches gemäß Tabelle I \

OJ j

entsprechen nicht denjenigen des Mediums 199, sondern sind j im Sinn der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung an \

die natürlichen Plasmakonzentrationen angepaßt.

L !

Zur Herstellung des Mediums wird Wasser mit der ASTM-1-Qualität verwendet; vgl. ASTM D-1193-7.0 Standard-Specifikation for Reagent Water 1970; Annual Book of ASTM-Standards, Easton Maryland, ASTM 1970. Es ist darüberhinaus von möglichen Endotoxin-Kontaminationen durch Ultrafiltration an tensidfreien Membranen mit der Ausschlußgrenze von 10 000 Daltons befreit. Das fertige Medium wird filtersterilisiert an tensidfreien Membranen mit f>0,2 μπι Porengröße.

	Komponente	η - * * - * ·* «ι - .1* - - *>	Nr.	Komponente	0559-1
	KCl	- 17 -	36	L-Threonin
	KHPO NaCl	Tabelle I	37	L-Tryptophan
	Na HPO		38	L-Tyrosin
Nr.	L-Äscörbinsäure	mol/1	39	L-Valin	mol/l
1	Cholinchlorid	5,0 m	40	Glutathion reduziert	0,2 m
2	2-Desoxy-D-ribose	0,2 m	41	Adenin	50,0 μ
3	D-Glucose	120,0 m	42	Adenosin	o,l m
4	myo-Inosit	0,8 m	43	Guanin	0,2 m
5	Na-Acetat	0,2 m .	44	Hypoxanthin	3,0 μ
6	D-Ribose	0,2 m	45	Thymidin	50,0 μ
7	CaCl	50,0 μ	46	Thymin	50,0 μ
8	MgCl^	5,0 μ	47	Uracil	5,0 μ
. 9	NaHCO	5,O m	48	Xanthin	5,Ο μ
10	Penicillin	0,5 m	49	D-Biotin	20,0 μ
11	Streptomycin	0,2 m	5O	D-Ca-pantothenat	5,0 μ
12	!•-Glutamin	20,0 μ	51	Ergocalciferol	5,0 μ
13	L-Alanin	2,0 m	52	Folsäure	•5,0 μ
14	L-Asparagin	1,0 m	53	D, L-Ot-Liponsäure	1 /O μ
15	L-Aspäraginsäure	10,0	54	Menadion	5,0 μ
16	L-Glutaminsäure	1#O μ	55	Nicotinsäureamid	Ο,5 μ
17	Glycin	1,0 μ	56	Pyridoxal-HCl	5,0 μ
18	L-Prolin	1,0 m	57	Pyridoxin-HCl	2,Ο μ
19	L-Serin	0,2 m	58	Riboflavin	0,2 μ
20	L-Arginin	0,1 m	59	Thiamin-HCl	20,0 μ
21	:4-Aminobenzoesäure	0,1 m	60	D ,L-ßO-Tocophery lace^	5,0 μ
22	L-Cystein	0,1 m		tat	2,0 μ
23	L-Histidin	0,2 m	61	Vitamin-A-acetat	1,0 μ
24	L-Hydroxyprolin	0,1 m	62	Vitamin B - Cholesterin	5,0 μ
25	L-Isoleucin	0,1 m	63	Äthanol
26	L-Leucin	0,1 m	64	pH 7,10	1/0 μ
27	L-Lysin_2Cl	2,0 μ	65		Ι,Ο μ
28	L-Methionin	0,2 m			0,5 μ
29	L-Pheny!alanin	O,l m ,' ■			t/O μ
30	10,0 μ			.- 1,0 m
31	0,2 m		-
32	0,2 m
33	0,2 m
34	0,1 m
35	0,1 m

Die Beispiele erläutern die Erfindung, wobei die Beispiele 1 und 2 auf die Verwendbarkeit eines proteinfreien Mediums der Erfindung und die übrigen Beispiele auf die Kultur von Zellen in dem Medium der Erfindung, das ein definiertes Protein enthält, gerichtet sind.

Beispiel

Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das rieben dem Grundgemisch gemäß Tabelle I folgende Bestandteile gemäß Tabelle II enthält.

Tabelle II

Komponente

Menge, μΐηοΐ/l

Lino!säure Linolensäure ölsäure Rutin Vitamin U D-Galactose Bernsteinsäure D-Xylose L-Ornithin Sarcosin Guanosin D,L-Carnitin

5,0

1,0

500,0

100,0

20,0

50,0

20,0

50,0

In dem Medium, das die in Tabelle II genannten Bestandteile zusätzlich zu dem Grundgemisch enthält, werden etwa 10 Lymphozyten/ml aus Hundemilz kultiviert. Die Kultur wird unter üblichen sterilen Bedingungen (37⁰C, 3 % CO₂) als Schichtkultur durchgeführt. Zur Stimulierung der Zellteilung wird der Kultur 50 nmol/1 Lektin aus Canavalia

ensifoririis (Concanavalin A) zugesetzt. Nach 48 Stunden werden die Zellen gezählt und einer Chromosom enanalyse unterworfen. Die Zahl der lebenden Zellen ist größer 90 %.

Beim Hauptteil der Zellen ist Mitose angeregt worden. 5

Beispiel 2

Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das neben dem Grundgemisch gemäß Tabelle I folgende Bestandteile gemäß Tabelle III enthält.

Tabelle III

Komponente Menge, μπιοΐ/ΐ

Linolsäure 1,5

Linolensäure 4,0

ölsäure 5,0

Coenzym Q_1ri 0,1

^1O

Mevalolacton 5,0

Glycerin 50,0

Xylitol 10,0

5-Methylcytosin 5,0

Carnosin 5,0

Mit dem Medium gemäß Grundgemisch und Tabelle III werden bei der Kultur von Lymphozyten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen vergleichbare Ergebnisse hinsichtlieh Lebensfähigkeit und Mitose erzielt.

Beispiel 3

Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das neben dem Grundgemisch gemäß Tabelle I folgende Bestandteile gemäß Tabelle IV enthält.

- 20 ι Tabelle IV

Komponente Menge, μπιοΐ/l

Mevalolacton 5,0

D-Glucurono-/-lacton 100,0

Taurin 0,1

D,L-Carnitin 50,0

Vitamin K₁ 0,2

menschliches Serumalbumin · 30,0

In dem Medium wird eine Fibroplasten-Monoschichtkultur (Maus L NCTC Clone 929) durchgeführt. Die Bedingungen entsprechen den in Beispiel 1 genannten. Nach Beendigung der Kultur zeigen die Zellen eine Lebensfähigkeit >92 %.

Beispiel 5

^! 20

! Beispiel 4 wird mit der Änderung wiederholt, daß anstelle

; von Mevalolacton die gleiche Menge Morin eingesetzt wird.

Die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Kultur ist >90 %.

! Beispiel6

j 25

Beispiel 4 wird mit der Änderung wiederholt, daß anstelle von Mevalolacton Vitamin ü in einer Menge von 2 μΐηοΐ/l eingesetzt wird. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Kultur ist >90 %. ·

30

Beispiel 7

Beispiel 4 wird mit der Änderung wiederholt, daß zusätzlich Linolsäure, Linolensäure, Quercitrin und Coenzym Q„_ 10

in Mengen von 2,0, 5,0, 3,0 und 0,2 pmol/l eingesetzt

^: werden. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach Beendigung der

j Kultur ist > 95 %

1 Beispiel9

Für eine Kultur von Leukozyten zur Herstellung und Gewinnung von zellulären Mediatoren aus den Leukozyten wird ein besonders reiches Zellkulturmedium verwendet, das neben dem

5 Grundgemisch die folgenden in Tabelle V angegebenen Bestandteile enthält.

Tabelle V
10 Nr. Komponente nol/1

1	D-Galactose
2	D-Glucurono-Y-lacton
3	Glycerin
4	Na-Citrat
5	Na-Pyruvat
6	Berη s te in s äure
7	Xylit
8	D-Xylose
9	Menschliches Serumalbumin
10	L-Ornithin
11	Sarcosin
12	Taurin
13	Cytidin
14	Guanosin
15	5-Methylcytosin
16	Uridin
17	Rutin
18	Coenzym-Q. (Ubichinon 50)
19	Linolsäure
20	Linolensäure
21	ölsäure
22	Carnosin
23	Mevalolacton
24	D,L-Carnitin
25	Vitamin K.
26	Vitamin U
27	Concanavalin A

0,5	m
0,1	m
50,0	μ#
50,0	μ
0,1	m
0,1	m
10,0	μ
20,0	μ
7,7	μ
50,0	μ
50,0	μ
0,1	m
50,0	μ
20,0	■μ
5,0	μ
20,0	μ
5,0	μ
0,1	μ .
1,0	μ
5,0	μ
5,0	μ
5,0	μ
5,0	μ
0,2	μ
1/0	μ
50,0	η

L ' j

Die Herstellung und Kultur der Leukozyten erfolgt unter sterilen Bedingungen. Die Kultur wird 40 Stunden lang durchgeführt, um eine befriedigende Mediatorausbeute zu erhalten. Die Temperatur der Kultur beträgt etwa 37⁰C, die ZeIlkonzentration etwa 5 χ 10 Zellen/ml und der CO .,-Partialdruck über der Kultur etwa 1,5 %. Nach Beendigung der Kultur werden die Leukozyten aus der Kulturlösung abzentrifugiert. Ihre Lebensfähigkeit ist größer 98 %. Sie können erneut kultiviert, kryopreserviert oder einer anderen Verwendung zugeführt v/erden.

Beispiel

In dem Zellkulturmedium gemäß Beispiel 8 werden unter im übrigen gleichen Bedingungen Schweineaorta-Endothelzellen als Monoschicht-Sekundärkultur kultiviert. Durch den Zusatz von Angiotropinen aus Leukozyten werden zahlreiche Mitosen stimuliert.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIUS :TÄ;U<£rtJsr&R"-:H:EUNEMANN ; RA^LH "PATENTANWÄLTE*" ^ ' SIEBERTSTRASSE A ■ 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29 45 3 VOPAT D u.Z.: R 061 (Ra/kä) 18- März 1981 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. 3400 Göttingen/ Bunsenstr. 10 " Vollsynthetisches Zellkulturmedium " Patentansprüche

1. Vollsynthetisches Zellkulturmedium, enthaltend Salze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme. Steroide, und weitere übliche Zusätze in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren und/oder mindestens ein Flavanoid und/ oder mindestens ein übichinon und/oder Vitamin ü und/oder Mevalolacton enthält.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren und eine der anderen vier Komponenten enthält.

3. Medium nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren und zwei der anderen vier Komponenten enthält.

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4. Medium nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren, mindestens ein Flavanoid und mindestens ein Ubichinon enthält.

5. Medium nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren, mindestens ein Flavanoid und Vitamin U enthält.

6. Medium nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Flavanoid, mindestens ein übichinon und/oder Vitamin ü und/oder Me-valolacton enthält.

7. Medium nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,

daß es mindestens ein definiertes Protein enthält. 15

8. Medium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es hochreines, molekular einheitliches Serumalbumin enthält.

9. Medium nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,

daß es als ungesättigte Fettsäuren ölsäure, Linolsäure und Linolensäure enthält.

10. Medium nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als Flavanoid Rutin enthält.

11. Medium nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als übichinon Coenzym Q₁₀ enthält.

12. Medium nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, 30

daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Xylitol, D-Xylose, D-Galactose, Glycerin und Glucurono-J'-Lacton enthält.

13. Medium nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet,

daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe L-Ornithin, 35

Sarcosin und Taurin enthält.

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14. Medium nach. Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Carnitin und Carnosin enthält.

15. Medium nach Anspruch 1 bis 14/ dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Cytidin, Guanosin, 5-Methy!cytosin und üridin enthält.

16. Medium nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Citronensäure, Bernsteinsäure und Brenztraubensäure enthält.

17. Medium nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, 15

daß es zusätzlich Vitamin K- enthält.

18. Medium nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bestandteile in einem Mengenverhältnis enthält, das der Zusammensetzung des natürlichen Blutplasmas angepaßt ist.

19. Medium nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von Tensiden, Schwermetallsalzen und Farbstoffen.

20. Verwendung des Zellkulturmediums gemäß Anspruch 1 bis 19 zur Kultur von eukaryontisehen Zellen.

21. Ausführungsform nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontisehen Zellen Leukozyten von Säugern sind.

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