DE3110611A1 - "mitogene der leukozyten und des entzuendungsgewebes:natuerliche leukopoetine zur selektiven anregung der teilung und differenzierung von leukozyten" - Google Patents

Description

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Die Zerstörung von körpereigenem Gewebe bei Entzündungen, welche durch nicht-immunologische und/oder durch immunologische Prozesse verursacht werden, führt zur Bildung verschiedener endogener Substanzen (Mediatoren und Hormone). Sie regulieren die komplexen Einzelschritte der Aktivierung des Entzündungs- und des Gewebereparaturprozesses. Die Mediatoren entstehen entweder durch begrenzte und regulierte Proteolyse vom Plasma- oder Serumfaktoren als hunorale Mediatoren, oder sie werden durch aktive Sekretion und/oder Zell-Lyse aus Zellen und Geweben als zelluläre Mediatoren freigesetzt. Dabei spielen vor allem die Mediatoren und Hormone eine große Rolle als spezifische chemische Informationsträger, welche von Zellen im Verlauf von Zellteilungsprozessen (Mitosen) gebildet und sezerniert werden. Sie sind Teil des Körperabwehrsystems, dessen systemische und lokale Aktivierung sie mitregulieren. Die Mediatoren tragen dadurch zur Entfernung und Entgiftung der.zerstörten körpereigenen Stoffe und/oder der eingedrungenen Fremdkörper bei. Ferner.ermöglichen sie durch Regulierung der ZeIlteilungs- und Gewebewachstumsprozesse bei der Wundheilung die Wiederherstellung der physiologischen Funktionen des Organismus. Wie die klassischen Hormone endokriner Drüsen sind auch die Entzündungsmediatoren Stoffe, die nur in sehr geringer Konzentration als Spuren im Gewebe oder Blut vorhanden sein können. Man kann z.B. berechnen, daß eine sich teilende Zelle nur etwa bis zu 5000 solcher Madiatorsiolaküle im Gleichgewicht in ihrem umgebenden Medium halten kann.

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Eine Reaktion, welche zur Teilung einer Zelle unter Verdoppelung des Chromosomenbestandes führt, wird als "Mitose" bezeichnet. Unter den Leukozyten unterscheidet man die reifen, voll ausdifferenzierten zirkulierenden Leukozytenc arten der Granulozyten (segmentförmige neutrophile, eosinophile, basophile Phagozyten) und die monönukleären Leukozyten (monozytäre Phagozyten und Lymphozyten) mit ihren verschiedenen Unterarten (T, B-Zellen usw.). Von diesen zirkulierenden Zellen sind nur die monönukleären Leukozyten

IQ weiter teilungs- und differenzierungsfähig. Zu den Zellvorstufen dieser adulten Leukozytenarten gehören insbesondere für die Entwicklungs- und Reifungsreihe (Hämatopoese) der segmentförmigen Granulozyten (Leukopoese) deren Vorläufer, der stabförmige Granulozyt, dessen Vorläufer, der adulte und juvenile Metamyelozyt, welcher aus der Reihe Myelozyt, Promyelozyt, Myeloblast und Knochenmarksstammzelle hervorgeht.

Körpereigene endogene chemische Stoffe, welche die Prozesse dieser Zellentwicklung und Reifung steuern und regeln, nennt man Leukopoetine; vgl. H.E. Whipple und M.I. Spitzer eds., Leukopoesis in Health and Disease, Ann. N.Y. Acad. Sei., 113 (1964), S. 511 bis 1092. Zu den Leukopoetinen gehören unter anderem die Stoffe, die die Teilung und Differenzierung der Leukozyten und ihrer Vorstufen anregen (Mitogene).

Über die Mitose der teilungsfähigen peripheren Leukozyten und der Leukozyten-Vorstufen des Knochenmarks existieren zahlreiche Veröffentlichungen; vgl. J. Lobue und A.S. Gordon, "Humoral Control of Growth and Differentiation", Vol. I, Academic Press, New York, 1973. Es wurde auch über verschiedene Arten von biologischen Aktivitäten, beispielsweise aus Zellkulturen, berichtet, die mitogene Wirkung auf Leukozyten oder ihre Vorstufen zeigen. Eine solche Aktivität ist beispielsweise der von T.R. Bradley und D. Metcalf, Aust. J.

Exp. Biol. Med. Sex. 44 (1966), S. 287, sowie von zahlreichen anderen Autoren beschriebene "colony stimulating factor". Unter dieser Bezeichnung werden Aktivitäten zusammengefaßt, die beispielsweise an Serum- oder Urinextrakten beobachtet werden. Sie sind in der Lage, die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten und Makrophagen in in vitro-Kulturen anzuregen.

Eine ähnliche Aktivität ist der von D.Y. Mochizuki u. Mitarb./ j. Immunol. Meth. 39 (1980), S. 185 bis 201 beschriebene "T cell growth factor". Diese Aktivität entsteht beispielsweise aus T-Zellen und Makrophagen und ist in der Lage, in vitro Langzeitkulturen von T-Zellen zu. erhalten.

Unter der Bezeichnung LAF (lymphocyte activating factor) ist eine andere biologische Aktivität beschrieben worden; vgl. I. Gery und R.E. Handschuhmacher, Zeil. Immunol. 11 (1974), S. 162.

Bisher konnte keine der zahlreichen beschriebenen Mitose-Aktivitäten als differenzierter Stoff gewonnen und charakterisiert werden. Alle Arbeiten beschränken sich im Gegenteil im wesentlichen auf den experimentellen Nachweis der Mitose-Aktivität von Undefinierten Lösungen oder Gemischen.

Es fehlt deshalb bisher auch jede gesicherte Kenntnis über die chemische Natur der aktiven Stoffe und ihre biologische Spezifität.

Die Mitoseaktivität wird als "Mitose-Index" einer ZeIlpopulation (Verhältnis der Zahl der in Mitose befindlichen Zellen zur Gesamtzahl) bestimmt. Ein zweiter Test beruht auf dem Einbau von radioaktivem Thymidin; vgl. J. Paul, "Cell & Tissue Cultures", 5. Aufl. 1975 Churchill Livingstone,

London.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Klasse von zellulären Mitogenen der Leukozyten in hochgereinigter Form und in wägbaren Mengen bereitzustellen, die biologisch spezifische, natürlich wirkende Mediatoren der Zellteilung und Differenzierung der Leukozyten und/oder

ihrer Vorstufen darstellen und sich

zur spezifischen Beeinflussung des AbwehrzuStandes von Säugern, z.B. des Menschen eignen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirtschaftliches, sowie labormäßig und technisch handhabbares Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieser Spurenproteine aus Leukozyten oder Entzün- ; dungsgewebe zu schaffen, bei dem sie in hochgereinigtem Zustand und in wägbaren Mengen erhalten werden können. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft demnach Mitogene der Leukozyten und des Entzündungsgewebes, die gekennzeichnet sind durch folgende Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:.

- selektive Anregung der Teilung und Differenzierung. (Mitose} von Knochenmarks-- und/oder Gewebeleukozyten;

- LD₅₀ nicht bestimmbar, da keine lethalen Wirkungen, selbst bei mehr als der 10 OO¹ -fachen Dosis der physio logisch aktiven Schwellendosis, ersichtlich sind;

- keine Mobilisierung adulter oder juveniler Leukozyten

(Leukozytose- oder Linksverschiebungsreaktion);

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine spasmogene Aktivität auf gestreifte Muskulatur;

- kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder -ähnlichen Wirkungen;

- keine chemische Anlockung (Chemotaxis) von Leukozyten

in vitro; 35

^Γ - 18 -

- keine positive oder negative chemokinetische'Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo;

- keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

- keine Entzündungswirkung in situ.?

- keine chemotropische Mitogenwirkung auf Blutgefäßzellen;

b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktionen);

- Schmelzpunkt: etwa 2OO°C (Zers, unter Luft- und Sauerstoff aus Schluß) ;

-kein normaler freier und selbständiger Blut-, Blutplasma- oder Blutserumbestandteil;

- .sie entstehen aus Leukozyten als zelluläre Mediatoren;

- elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Äcrylamidmatrizen: anodisch;

- löslich in wäßrigen Medien einschließlich 10 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10;

- sie adsorbieren reversibel in Struktur und biologischer Aktivität an Anionen-und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und können nativ der Voluitienverteilungschromatograpliie unterworfen werden.

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311061 ι -^:-^:- "- ■

Γ Π

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Die Mitogene der Erfindung sind zelluläre Entzündungsmediatoren mit topobiochemisch und biologisch spezifischer Wirkung. Ihre biologische Aufgabe ist die Anregung von Teilung und Differenzierung von peripheren Leukozyten und ihrer Vorstufen im Knochenmark (Blasten). Diese Leukopoetine sind keine normalen selbständigen Blut- oder Serumbestandteile . Sie entstehen in vitro bei der Kultur von Leukozyten oder in vivo bei der Ansammlung von Leukozyten am Entzündungs— ort neben einer Vielzahl anderer Hormone und Mediatoren. . :

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Die erfindungsgemäß erstmals isolierten, in hochreinem Zustand gewonnenen und charakterisierten Mitogene der Leukozyten und des Entzündungsgewebes sind chemotaktisch inaktiv für alle Leukozytenarten und induzieren keine Schockreaktior.en oder andere ersichtlichen systemisch abträglichen Reaktionen. Sie haben auch keine chemokinetische und Phagozytose stimulierende Aktivität für die verschiedenen Leukozytenarten. Ferner sind sie ohne kapillarpermeabilitätserhöhende/ ohne pyrogene und ohne spasmogene Wirkung. Außerdem haben sie keine Leukozytose induzierende Wirkung. Dies zeigt, daß sich die Mitogene der Erfindung in vielen ihrer biologischen und chemischen Eigenschaften von strukturellen und funktioneilen Eigenschaften der bakteriellen Endotoxine unterscheiden.

Auch die anderen molekularen Eigenschaften der Mitogene der Erfindung, besonders ihre zur Aktivität notwendigen niedrigen Blutspiegel, weisen auf die Hormonähnlichkeit dieser Entzündungsmediatoren hin. Die aktiven Schwellendosen liegen bei etwa 10 bis 50 pmol/1.

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Die Mitogene der Erfindung lassen sich in zwei Klassen aufteilen: Verbindungen, die teilungsfähige'periphere Leukozytenarten zur Mitose anregen, werden je nach der Art der Zielzellen als "Lymphomitogene" (wirken auf Lymphozyten) oder "Histiomitogene" (wirken auf Histiozyten = Makrophagen) bezeichnet. Verbindungen, die Leukozytenvorstufen des Kno-

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- 20 -

chenmarkszur Mitose anregen, werden als "Blastogene" bezeichnet.

Die Mitogene der Erfindung stammen aus Monozyten, Granulozyten oder Lymphozyten. Auch diese unterschiedliche Herkunft wird in ihrer Bezeichnung berücksichtigt. Das Monocyto-Blastogen (MBG) ist demnach ein Mitogen, das aus Monozyten stammt und die Mitose von Leukozytenvorstufen des Knochenmarks anregt. Entsprechend ist das Granulocyto-Blastogen (GBG) ein Mitogen, das aus Granulozyten stammt und ebenfalls die Mitose von Leukozytenvorstufen des Knochenmarks anregt. Das Monocyto-Histiomitogen MHM ist demgemäß ein Mitogen, das aus Monozyten stammt und die Mitose von Histiozyten (= Makrophagen) anregt. Schließlich ist das Lymphozyto-Lymphomitogen (LLM) ein Mitogen.aus Lymphozyten, das die Mitose von Lymphozyten anregt.

Das MBG hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Mitogene folgende speziel-Ie Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische Stimulierung der Teilung und Differenzierung von Knochenmarksleukozyten;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro < 50 pmol/1;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) : etwa 25 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 1;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I :

L J

3110611	1 cm	- _ ·	), 200C)	+_ 6%
- 21 -	0
Tabelle I	O
Wellenlänge, nm E1 mg/m±f	0	(H2o:
248 (min)	0	,23
260	0	,36
276 (max)		,56
280		,55
290		,38
400		O
450		0
500		0
550		0
600		0
700		O
800		O
850	0
900	0
1000	0

Das MBG wird von Monozyten durch Sekretion erzeugt. Die Erzeugung kann beispielsweise durch Mitogenwirkungen, wie 25 polyvalente Lektinmitogene, z.B. aus Canavalia ensiformis (Concanavalin A = CON)j Endotoxine oder zelluläre Immuhreaktionen, stimuliert werden.

Das GBG hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend ge-

30 nannten gemeinsamen Eigenschaften der Mitogene folgende spezielle Eigenschaften:

- 22 -

a) biologische Wirkungen:

- spezifische Stimulierung der Teilung und Differenzierung von Knochenmarksleukozyten;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <5.nmol/l; 5

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 85 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 2; . '

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle II:

Tabelle II

Wellenlänge, nm E. _Λ ^_a/inX ■ · ₁ ·._· _{m n 90}o_r, +6%

ι *iiy / hl.*» f ι will . \n.^\J j £*\J w/ "^*

251 (min) 0,22

260 0,30

280 O,55

281 (max) _O,56 290 O,41

400 0

450 O

500 O

550 0

600 0

700 . 0

800 · 0

850 0

900 0

0

*28O^/£l26O ¹^⁸³

^r - 23 -

Das GBG wird von Granulozyten durch Sekretion erzeugt. Die Erzeugung wird bereits durch die Entnahme aus der physiologischen Umgebung (Blutkreislauf) stimuliert, z.B. durch Auswanderung ins Gewebe. Eine Stimulierung durch Zu-

5. satz von Mitogenen ist demnach hier nicht erforderlich.

Das MHM hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Mitogene folgende spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische Stimulierung der Mitose von peritonealen Makrophagen;

- Schwellendosis .der Wirksamkeit in vitro <1 nmol/1

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) : etwa 13 000 Daltons;

- löslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 9o % (3,6 mol/1);

- Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 3; .

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle • III:

	3110611 1O':..:<	+ 6%
	- 24 -
	Tabelle III
Wellenlänge, nm	E 1 mg/ml/1 cm (H3O, 200C)
252 (min)	0,20
260	O,27
279 (max)	0,56
280	0,56
290	0,46
400	O
450	0
500	0
550	0
600	0
700	0
800	0
850	0
900	0
1000	0
Ε28Ο/Ε26Ο	2,O7

Das MHM wird wie das MBG von Monozyten durch Sekretion erzeugt. Die Erzeugung kann ebenso wie beim MBG durch Mi to-²⁵ genwirkungen, beispielsweise Lektine, Endotoxine oder zelluläre Immunreaktionen, stimuliert werden.

Das LLM hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Angiotropine folgen-³⁰ de spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische Stimulierung der Mitose von .peripheren , Lymphozyten;

- .Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro ro,5 nmol/1;

b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 17 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- Adsorptionsspektrum (üV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 4;

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle IV:

Tabelle IV

Wellenlänge, nra E _{Λ mcr/rn}, _{1 cm (H}^ _2Qo_c) + 6 %

25 2 (min) 0,32

260 0_r41

2 80 0,78

28 2 (max) 0,79

290 0,61

⁴⁰° °

450 0

500 0

550 0

600 0

⁷⁰° °

800 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O ¹'⁹⁰

L ■ J

Das LLM wird von Lymphozyten durch Sekretion erzeugt. Seine Erzeugung kann ebenso wie diejenige der aus Monozyten stammenden Mitogene der Erfindung durch Mitogenwirkungen, beispielsweise Lektine/ Endotoxine oder zelluläre Immunreaktionen stimuliert werden.

Bis zur unphysiologischen Konzentration von 1 μΐηοΐ/ΐ besitzen die Mitogene der Erfindung weder chemotaktische noch chemokinetische, noch Phagozytose stimulierende Aktivitat für neutrophile, eosinophile und mononukleäre Leukozyten vom Mensch, Kaninchen, Schwein, Hund, Meerschweinchen oder Ratte, ferner keine Kontraktionswirkung auf die glatte Muskulatur des Meerschweinchenileums, keine kapillarpermeabilitätserhöhende Wirkung im Hauttest beim Meerschweinchen mit Evans Blau als intravenös injiziertem Marker. Schließlich besitzen sie auch keine ersichtliche Schockwirkung, selbst bei intravenöser Applikation bis zur 1000-fachen Dosis der biologisch aktiven Menge beim Meerschweinchen oder Kaninchen, sowie keine pyrogene Wirkung am Kaninchen (standardisierte Methode durch rektale Temperaturmessung nach Europäischer Arzneibuch Bd. II (1975 S. 56 bis 59), noch irgendeine andere sichtbare systemische biologische Reaktion bei intravenöser Verabreichung einer hohen Dosis von etwa 1 nmol/kg bei Meerschweinchen und Ratten.

Die Fig. 1 bis 4 zeigen die UV-Absorbtionsspektren der Mitogene MBG, GBQ, MHM und LLM in Wasser bei 20⁰C und Extinktionsskala (0-100) E= 0-2 bei einer Schichtdicke d = 1 cm.

In Fig. 5 ist ein Pyrogen-Standardtest nach Europäisches Arzneibuch Bd. II (1975) an drei verschiedenen Kaninchen

(a, b und c) vom Durchschnittsgewicht von etwa 3 kg dargestellt, der durch intravenöse Verabreichung von MHM in einer Menge von 30 ng in 1 ml (0,9 Gewicht/Volumen)-prozentiger physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wurde. In den Diagrammen der Fig. 5 ist der rektal bestimmte Temperaturverlauf bei den Kaninchen vor (VA), während (*) und kurz nach (P) sowie weiterhin 30 bis 180 Minuten nach der Applikation graphisch dargestellt.
^L ■ ■ J

^Γ - 27 -

Europäisches Arzneibuch Bd. II (1975), britische und amerikanische (USP) Standards (Pharmacopoeia 1973, 1975) erlauben die Bezeichnung "pyrogenfrei" oder "fehlende pyrogene Wirkung" für Präparate, welche in drei Versuchskaninchen als Summe aller Abweichungen der rektalen Temperatur den Wert 1,15 bis 2,6⁰C nicht überschreiten. Der in Fig. 8 wiedergegebene Versuch erfüllt dieses Kriterium. Demnach ist das MHM-Präparat gemäß diesen Bestimmungen pyrogenfrei und ohne pyrogene Wirkung. Dies trifft auch für die anderen hochgereiriigten Mitogen-Präparate zu. Dieses äußerst sensitive Kriterium auf Verunreinigungen mit bakteriellen Endotoxinen und anderen ubiquitären Pyrogenen zeigt die große Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens und ist ein Parameter für die biologische Spezifität.

Die erfindungsgemäß hergestellten und gewonnenen Mitogene stellen wertvolle körpereigene Wirkstoffe dar, die zur spezifischen Beeinflussung des AbwehrzuStandes des Körpers, z.B. des Immunstatus verwendet werden können. Sie eignen sich zur spezifischen Beeinflussung, Zellteilung und Differenzierung von Leukozyten und ihrer Vorstufen und damit auch von Leukozytenfunktionen, beispielsweise bei Entzündungsreaktionen, Mykosen und beim Herzinfarkt. Des weiteren können die Chemorekrutine zur Herstellung ihrer Antikörper verwendet werden.

Die Mitogene der Erfindung werden einzeln oder als Gemisch in Form üblicher Arzneimittel parenteral,'vorzugsweise intravenös, oder lokal, Säugern, z.B. Menschen, in einer Tagesdosis y 50 fmol in Konzentrationen J> 50 pmol/1 gegeben.

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Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der Mitogene der Leukozyten -_r und des Entzündungsgewebes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Leukozyten oder Entzündungsgewebe homogenisiert oder Leukozyten kultiviert und die entstandenen Mitogene aus den Homogenaten oder aus der überstehenden Kulturlösung gewinnt.

Grundsätzlich ist es auch möglich, Leukozyten auf Mediatoren direkt ohne Kultur aufzuarbeiten. Ein derartiges Verfahren ist jedoch unwirtschaftlich, da die Leukozyten dabei zerstört werden, die Ausbeuten mangels Anregung der Synthese sehr gering sind und die Mediatoren durch die intrazellulären Strukturbestandteile der Leukozyten verunreinigt sind. Deshalb ist es im Verfahren der Erfindung bevorzugt, die Mitogene aus dem Überstand der Leukozytenkultur zu gewinnen. Die Kultur der Leukozyten kann grundsätzlich in jedem die Leukozyten erhaltenen Medium durchgeführt werden.

Für die Kultur von Zellen verschiedener Art, wie Knochenmarks- und Herzmuskelzellen oder Leukozyten; sind verschiedene Kulturmedien bekannt. Diese Medien sind in der Regel wäßrige. Lösungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Verbindun- gen enthalten. Hauptbestandteile dieser Kulturmedien sind Salze, Zucker und Metaboliten, Aminosäuren, Nucleoside-, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und — weitere Zusätze, wie Tenside, Schwermetallsalze und Farb-

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r _ ₂₉ _ -ι

Stoffe. Spezielle Beispiele für übliche Kulturmedien sind unter den Bezeichnungen "HAM" "Medium 199" und "NCTC" bekannt; vgl. H.J. Morton, In Vitro 6 (1970), S. 89 bis 108.

Zur Kultur von Zellen, wie Leukozyten, wird den Kulturmedien bei einer geplanten Dauer der Kultur über 1 Stunde meist Serum, beispielsweise Kalbsserum oder Pferdeserum, zugesetzt, da die Serumbestandteile für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen günstig sind. Wenn jedoch die serumhaltige Kulturlösung auf Proteine (Mediatoren) aufgearbeitet werden soll, die durch die Kultur erzeugt werden, bereitet die Gewinnung der meist nur in geringen Konzentrationen enthaltenen Produktproteine wegen der Vielzahl der aus dem. · Serum stammenden fremden Proteine große Schwierigkeiten. Außerdem kann dabei nicht mit Sicherheit festgestellt werden, ob ein bestimmter Mediator humoraler oder zellulären Ursprungs ist und von welcher Spezies er stammt; d.h. ob'er ein Mediator der Spezies ist, "deren Zellen kultiviert¹ wurden, oder der Spezies, von der das verwendete (meist;heterologe)

·

Serum stammt.

Neben den serumhaltigen Kulturmedien sind zwar auch serumfreie, synthetische Medien bekannt; vgl. H.J. Morton, a.a.O.

Auch diese bekannten Medien haben aber bei der Kultur von 25

Zellen, wie Leukozyten, bzw. bei der Aufarbeitung der entstandenen Mediatoren verschiedene Nachteile, da die in ihnen ' enthaltenen Tenside, Schwermetallsalze und/oder Farbstoffe die entstehenden Mediatoren schädigen oder verunreinigen.

Andererseits fehlen den bekannten serumfreien Medien häufig essentielle Bestandteile, die für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Leukozyten erforderlich sind. Unter den bekannten Kulturmedien befindet sich somit keines, das für eine Leukozytenkultur zur Gewinnung von zellulären Spurensekreten, wie Mitogene - in befriedigender Weise verwendet werden kann.

L · -J

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Für die Kultur der Leukozyten wird deshalb vorzugsweise ein neues, vollsynthetisches Kulturmedium verwendet, mit dem sowohl günstige Bedingungen für die Zellkultur geschafffen werden, als auch eine problemlose Aufarbeitung der KulturlÖ-sung und Gewinnung der von den Zellen sekretierten Mitogene ermöglicht wird.

Das erfindungsgemäß bevorzugt verwendete vollsynthetische Zellkulturmedium enthält die üblichen Stoffgruppen, wie SaI-ze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme und Steroide in wäßriger Lösung. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen oder ein Gemisch von mehreren Stoffen enthält, die bisher in Zellkulturmedien noch nicht verwendet wurden und die sich als besonders wertvoll für die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Leukozyten und ihre Fähigkeit zur .Mediatorproduktion erweisen. Zu diesen Stoffen gehören ungesättigte Fettsäuren, Flavanoide, Ubichinone, Vitamin U und Mevalolacton.

Das Zellkulturmedium wird zur längerdauernden Leukozytenkultur vorzugsweise ohne Zusatz von Serum verwendet. Statt dessen enthält es mindestens ein definiertes Protein,das in einer besonders bevorzugten Ausführungsform hochreines, molekular einheitliches Serumalbumin ist.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäß verwendete, vollsynthetische serumfreie ZeIl.-kulturmedium noch weitere, für die Kultur von Leukozyten günstige Verbindungen aus den Stoffklassen der Polyhydroxyverbindungen und Zucker, Aminosäuren, Nucleoside, anionischen Verbindungen und/oder Vitamine, deren Verwendung in den bekannten Kulturmedien nicht üblich ist, enthalten. Die Bestandteile des erfindungsgemäß verwendeten Mediums sind in ihren Mengenverhältnissen so aufeinander abgestellt, daß die

L -J

35

:"Y3-VIG611.X

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Konzentrationen der Komponenten im Medium weitgehend den natürlichen Konzentrationsbereichen des Plasmas angepaßt sind; vgl. Ciba-Geigy AG (Herausgeber) (1969) in Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen, 7. Auflage Geigy S.A., Basel.

Vorzugsweise ist das Zellkulturmedium frei von Tensiden, Schwermetallsalzen und Farbstoffen, die die Zellen schädigen und die Gewinnung der gewünschten Zellprodukte aus der KuItürlösung stören können.

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Die genaue Zusammensetzung und die Eigenschaften des neuen Zellkulturmediums sind in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung P 3110 559·9 beschrieben.

Besonders bevorzugt ist für die Kultur der Leukozyten im Verfahren der Erfindung das Zellkulturmedium mit der in nachstehender Tabelle VIII angegebenen Zusammensetzung.

Zur Herstellung des Mediums wird Wasser mit der ASTM-1-Qualität verwendet; vgl. ASTM D-1193-70 Standard-Specifikation for Reagent Water 1970; Annual Book of ASTM-Standards, Easton Maryland, ASTM 1970. Es ist darüberhinaus von möglichen Endotoxin-Kontaminationen durch Ultrafiltration an tensidfreien Membranen mit der Ausschlußgrenze von 10 000 Daltons befreit. Das fertige Medium wird filtersterilisiert an tensidfreien Membranen mit f>0,2 μΐη Porengröße.

Tabelle y

Nr. Komponente

■ffioi/l'

Nr. Komponente

mol/1

1	KCl	5,0	m	47	Taurin	Ό,Ι	m
2	KH PO	0,2	m	48	L-Threonin	0,2	m
3	NaCl 4	120,0	m	49	L-Tryptophan	50,0	μ
4	NaHPO	0,8	EL	50	L-Tyrosin	0,1	m
5	Na2S04	O,2	m	51	L-Valin	0,2	m
6	L-Äscorbinsäure	O,2	m	52	Glutathion reduziert	3,0	μ
7	Cholinchlorid	50,0	μ	53	Carnosin	5,0	μ
8	2-Desoxy-D-ribose	5,0	μ	54	Mevalolacton	5,0·	μ
9	D-Galactose	0,5	m	55	Adenin	50,0	μ
10	D-Glucose	5,O	m	56	Adenosin	50 ,O	μ
11	D-Glucurono-y-lacton	0,1	m	57	Cytidin . '	50,O	μ
12	Glycerin	; 50,0	μ	58	Guanin .	5,O	μ
13	myo-Inosit	0,5	m	59	Guanosin	20,0	μ
14	Na-Acetat	O,2	ra	6O	Hypoxanthin	5,O	μ
15	Na-Citrat	50,0	μ	61	5-Methyicytosin	5,0	μ
16	Na-Pyruvat	O,l	m	62	Thymidin	20,0	μ
17	D-Ribose	20,0	μ	63	Thymin	5,0	μ
18	Bernsteinsäure	O/l	m	64	Uracil	5,0	μ
19	Xylit	10,0	μ	65	. üridin	20,0	μ
20	D-Xylose	20,0	μ	66	Xanthin	5,0	μ
21	CaCl	2,0	m	67	D-Biotin	1,0	μ
22	MgCl	1/0	m	68	D-Ca-pantothenat	5,0	μ
23	NaHCO-	10,0	m	69	Ergocalciferol	0,5	μ
24	Humanes Serumalbumin	7,7	μ	70	D,L-Carnitin	50,0	μ
25	Penicillin	1/0	μ	71	Folsäure	5,0	μ
26	Streptomycin	1,0	μ	72	D,L- Ot*-Liponsäure	2,0	μ
27	L-Glutamin	1,0	m	73	Menadion	0,2	μ
28	L-Alanin	0,2	m	74	Nicotinsäureamid ·	20,0	μ
29	L-Asparagin	0,1	m	75	Pyridoxal-HCl	5,O	μ
30	L-Asparaginsäure	0,1	m	76	Pyridoxin-HCl	2,O	μ
31	L-Glütaminsäure	0,1	m	77	Riboflavin	I/O	μ
32	Glycin	O,2	m	78	Rutin ·	5,O	μ
33	L-Prolin	O/l	m	79	Thiamin-HCl	• 5,0	μ
34	L-Serin	0,1	m	80	D ,L-fV-Tocopherylaceti	at 1,O	μ
35	E—Arginin		m	81	Vitamin-A-acetat	I/O	μ
36	4-Aminobenzoesäure	2,O	μ	82	Vitamin K	0,2	μ
37	L-Cystein	O,2	m	83	Vitamin B Vitamin IT .	O,5	μ
38	L-Histidin	O/l	m	84	Cholesterin'	I/O	μ
39	L-Hydroxyprolin	10,0	μ	85.	Coenzym-Q10	IfO	μ
40	L—Isoleucin	0,2	m	86	Linolsäure	■ o,i	μ
41	L-Leucin	O,2	m	87	Linolensäure	1,0	μ
42	L-Lysin-HCl	O,2	m	88	Ölsäure	5,0	μ
43	L-Methionin	0,1	m	89	Äthanol	5,0	μ
44	L-Ornithin	50,0	μ	90	pH 7,10	1,0	m
45	L-Phenylalanin	0,1	m	91	Concanavalin A	- .-
46	Sarcosin	50,0	μ	92 ι	50,0	η

Je nach der Art der gewünschten Produkte x^erden entweder gemischte Leukozytenpopulationen oder einzelne Leukozytenarten kultiviert. Die Herstellung und Kultur der Leukozyten muß unter sterilen Bedingungen erfolgen. Die Kultur wird ausreichend lange Zeit durchgeführt, um eine befriedigende Mediatorausbeute zu erhalten. Hierfür hat sich eine Dauer von etwa 10 bis 50 Stunden als geeignet erwiesen. Bei kürzeren Zeiten ist die Mediatorausbeute zu gering, so daß das Verfahren unwirtschaftlich ist. Bei einer Kulturdauer über etwa 50 Stunden ist andererseits das Medium erschöpft und die Zellen beginnen abzusterben, so daß eine Erhöhung der Ausbeute nicht mehr zu erwarten ist.

Die Kultur der Leukozyten wird bei einer Temperatur von etwa 30 bis 42°C, vorzugsweise von etwa 37°C durchgeführt. Bei niedrigeren Temperaturen ist der Kulturprozess unbefriedigend, während bei Temperaturen über 42°C die Leukozyten geschädigt werden.

Die Kultur wirkt mit einer Konzentration von etwa 10 bis

ο 7 8

5 x 10 Zellen/ml, vorzugsweise 10 bis 10 Zellen/ml durchgeführt. Bei niedrigeren Zellkonzentrationen ist die Mediatorausbeute pro Volumeneinheit der Kulturlösung zu gering. Das . Verfahren wird infolge zu großer Kulturvolumina unwirtschaftlieh. Bei Zellkonzentrationen über 5 χ 10⁸ Zellen/ml tritt sehr rasch Verarmung des Mediums an Nahrungsstoffen auf.

Die Kultur kann an der Atmosphäre durchgeführt werden. Vorzugsweise wird über der Kultur ein erhöhter Kohlendioxidpartialdruck aufrecht erhalten, der bis etwa 10 Vol%, insbesondere bis etwa 2 VoI%, reichen kann. Von großer Bedeutung ist die SauerstoffVersorgung der Kultur. Sie kann beispielsweise durch Einleiten von Luft sichergestellt werden. Um eine Kontaminierung der Kultur zu vermeiden, ist die zugeführte Luft vorzugsweise sterilisiert und hitzedekontamxniert, d.h. von Endotoxinen und anderen organischen Bestandteilen

befreit. Die Lösung kann während der Kultur gerührt oder geschüttelt werden.

Bestimmte fciitogene der Erfindung werden schon durch normale · Kultur von Leukozyten oder Leukozytenarten in befriedigender Ausbeute erhalten. Beispielsweise entsteht das GB G durch Kultur von Leukozyten-Mischpopulation oder von homogener Granulozyten-Population ohne äußere Einflüsse unter den vorstehend angegebenen Bedingungen in hoher Ausbeute.

' · ■' Andere Mitogene der Erfindung entstehen jedoch nur in geringer Menge durch normale Kultur von Leukozyten oder Leukozytenarten. Dies trifft beispielsweise auf die Mitogene der mononukleären Zellen.

Für ihre Erzeugung in größerer Ausbeute ist eine Stimulierung der Kultur durch einen äußeren Einfluß erforderlich, der zu einer Mitose der Zellen führt. Als Mitose einleitende Einflüsse kommen der Zusatz von polyvalenten Mitogenen, Endotoxin-Mitogenen sowie Immunreaktionen an der Zelloberfläche von sensibilisierten Zeilen in Frage. Beispiele für geeignete Mitogene sind Lektine, insbesondere solche aus Canavalia ensiformis (concanavalin A = CON). Der Mitose einleitende Faktor wird dem Kulturmedium gelöst zugesetzt.

Zur Beendigung der Kultur werden die Leukozyten von der KuI-turlösung abzentrifugiert, die anschließend auf die entstandenen Mitogene aufgearbeitet wird. Um eine Schädigung der Zellen und damit eine Verunreinigung der Kulturlösung durch Zellbestandteile zu vermeiden, wird die Kultur bei verhältnismäßig niedriger Beschleunigung, d.h. etwa 300 bis 400 x g, zentrifugiert. Nach dem Abtrennen des Großteils der Zellen vom Überstand wird dieser zweckmäßigerweise bei höherer Beschleunigung erneut zentrifugiert, um restliche Schwebeteilchen zu entfernen. Die abgetrennten Leukozyten können entweder erneut kultiviert, kryopräserviert oder einer anderen Verwendung zugeführt werden.

L J

Die von den Zellen befreite Kulturlösung enthält die Sekretionsprodukte der kultivierten Leukozyten. Dazu gehören die Mitogene-= - -- öer Erfindung und ferner eine Anzahl weiterer Proteine und andere Stoffe. Ihre Konzentration in der Kulturlösung liegt etwa im nonomolaren Bereich. Für die Gewinnung von etwa 1 bis 10 mg eines definierten Mediators ist im Hinblick auf eine Ausbeute bei der Reinigung in der Größenordnung von etwa 10 % demnach ein Kulturlösungs-Volu-^ men von etwa 1000 Liter erforderlich. Für die Zahl der einzusetzenden Zollen kann man berechnen, daß zur Gewinnung einer Menge von etwa 100 nmol (entsprechend etwa 1 isg eines Mediators mit dem Molekulargewicht 10 000 Dal ton) aufgrund

14 der molekularem Effizienz der Zellen ein Wert von etwa 10 Leukozytenzellen erforderlich ist. Dies bedeutet, daß zum Ziel der Mediatorisolierung in wägbaren Mengen etwa 50 kg Leukozyten für die Kultur erforderlich sind. Der leichten Verfügbarkeit wegen sind Leukozyten von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen, Ratte, Maus oder Meerschweinchen bevorzugt. Für die Gewinnung der erforderlichen großen Leukozytenmenge eignet sich insbesondere das in der Patentanmeldung P 30 09 126.0 beschriebene Verfahren; .vgl. auch J.H. Wissler u. Mitarb., Zeitschr. f. Phys. Chem. 361 (1980) S. 351 bis 352.

Außer durch Kultur von Leukozyten können die Mijogerie der Erfindung auch aus Entzündungsgewebe gewonnen werden. Dort entstehen sie durch die Ansammlung der Leukozyten infolge des durch die GewebeSchädigung ausgelösten Enfczündungsprozesses. Das Entzündungsgewebe kann in üblicher Wei— se gewonnen und für die Präparation der^Mi^toSfene wendet werden. Dazu wird das Entzündungsgewebe in Pufferlösung homogenisiert und die löslichen Bestandteile (Exsudat) werden von den unlöslichen Strukturbestahdteilen des Gewebes getrennt.
35

L . -I

Γ - 36 -

Vorzugsweise wird entzündetes infarziertes Herzmuskelgewebe verwendet, welches durch Ligation des linken vorderen absteigenden Astes der linken Koronararterie mittels einer transfemoralen Kathedertechnik während 24 Stunden gebildet wird. Der Leukozyten enthaltende, entzündete Herzmuskelteil wird bei O bis 4⁰C von nicht infarziertem, gesundem Gewebe abgetrennt.

Für die Isolierung und Gewinnung der Mitogene der ETrfindung ist, wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, die Aufarbeitung eines sehr großen Kulturlösungsvoluinens erforderlich. Zu Beginn des Reinigungsverfahrens ist es deshalb . aus praktischen Gründen notwendig, eine möglichst effektive Verminderung des zu behandelnden Volumens durchzuführen. Die Kulturlösung enthält neben den geringen Mengen an erzeugten Proteinen das Gemisch der Bestandteile des Mediums. Vorteilhafterweise wird deshalb im ersten Schritt der Reinigung eine Abtrennung der entstandenen Proteine.·:von den Bestandteilen des Mediums und gleichzeitig von dem großen Volumen äer wäßrigen Lösung durchgeführt. Dies kann durch eine selektive Aussalzung der Proteine aus der Kulturlösung bewirkt werden, die beispielsweise durch Zugabe aines Sulfates oder Phosphates erreicht wird. Nachstehend wird die Fällung der Proteine am Beispiel derl'Aussalzung durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu der Kulturlösung beschrieben.

Durch Sättigung der Kulturlösung mit Ammoniumsulfat wird der Großteil der entstandenen Proteine zusammen mit gegebenen- · falls enthaltenem Serumalbumin ausgefällt. Nach dem Abtrennen des Proteinniederschlags, beispielswaise durch Zentrifugieren, kann dieser in der nachstehend beschriebenen Weise in seine einzelnen Komponenten aufgetrennt und die enthaltenen Mitogene gewonnen werden. Der erhaltene überstand enthält neben den löslichen Bestandteilen des Mediums auch den in gesättigter Ammqniumsulfatlösung löslichen Teil

sich .

der Proteine, unter denen/auch ein Teil der Mitogene befindet. Der überstand wird konzentriert und die erhaltenen

Proteine werden daraus in der nachstehenden Weise gewonnen. L

Wenn die proteinhaltige Kulturlösung mit Ammoniumsulfat bis zur Sättigung versetzt wird, fällt der größere Teil der Proteine aus. Auf diese Weise wird ein Proteingemisch erhalten, das aus einer Anzahl verschiedener Proteine besteht und dessen Trennung in die einzelnen Komponenten infolgedessen mühsam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das in der Kulturlösung enthaltene Proteingemisch deshalb bereits in der Fällungsstufe in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Diese Auftrennung in mehrere Proteinfraktionen ist möglich, da die einzelnen Proteine bei verschiedenen Ammoniumsulfatkonzentrationen ausgefällt werden. Vorzugsweise wird die Kulturlösung im Verfahren der Erfindung deshalb stufenweise mit Amrtioniumsulfat bis zu bestimmten Sättigungsgraden versetzt, wobei in jeder Fraktion der Teil der Proteine ausfällt, dessen Löslichkeit sprodukt unterhalb des jeweiligen SalzSättigungsgrades liegt. Durch geeignete Wahl der Sättigungsgrenzen der einzelnen Fraktionen kann im Verfahren der Erfindung eine grobe Auftrennung in Gruppen von Proteinen bereits bei der Fällung erzielt werden.

Beispielsweise wird die Kulturlösung zunächst bis zu einer Sättigung von 35 % mit Ammoniumsulfat versetzt. Der erhaltene Proteinniederschlag wird abgetrennt. Danach wird der Sättigungsgrad der überstehenden Lösung auf 45 % erhöht- Es bildet sich erneut ein Proteinniederschlag, der abgetrennt wird. Anschließend wird die überstehende Lösung auf einen Sättigungsgrad von 90 % eingestellt. Der dabei erhaltene Proteinniederschlag wird ebenfalls abgetrennt. Die überstehende Lösung dieser Fällung wird beispielsweise durch . Enfcwässerungs-Dialyse oder Ultrafiltration konzentriert.

Die Salzfällung der Proteine wird ebenso wie die nachfolgende Reinigung vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa O bis 1O°C, insbesondere etwa O bis 4°C durchgeführt. Die für die Reinigung verwendeten Lösungen besitzen einen pH-Wert

L . J

zwischen 5 und 9, insbesondere zwischen 6 und 8. um eine pH-Konstanz der Lösung zu erreichen, wird vor der Salzfällung vorzugsweise ein starker Puffer, z.B. 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, zugesetzt. Zur Aufrechterhaltung des Redoxpotentials der Proteine wird den Lösungen vorzugsweise Cystein in einer Menge von 0,001 mol/1 zugesetzt. Sterile Bedingungen für die Proteinreinigung sind nicht erforderlich. ·

Die bei der Salzfällung erhaltenen Proteine können nach Auflösen in einem Proteine nicht schädigenden Medium direkt der nachstehend beschriebenen Reinigung und Auftrennung zugeführt werden. Der überstand der letzten Fällungsstufe wird konzentriert, beispielsweise durch Entwässerungsdialyse oder Ultrafiltration. Dabei werden alle Verbindungen mit einem·Molekulargewicht von größer als etwa 300 bis 500 Daltons, d.h. auch die Proteine und Peptide dieser Frak^ tion, als Retentat quantitativ erhalten.

Die in der vorstehend beschriebenen Stufe erhaltenen Proteinfraktionen enthalten die Mitogene _äer Erfindung im Gemisch mit zahlreichen Fremdproteinen (andere sezernierte Proteins gegebenenfalls Serumalbumin und gegebenenfalls CON). Die Fremdproteine liegen in den Gemischen in weit überwiegender Menge vor. Durch eine Reihe von Reinigungsschritten müssen die

Mitogene -.__■ angereichert und von den Fremdproteinen soweit befreit werden, daß diese ihre molekulare biologische Spezifität nicht mehr stören. Die Mitogene selbst sind ebenfalls eine Stoffklasse, die in ihre einzelnen, spezifisch

wirkenden Individuen aufgetrennt wird. 30

Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Strukturstabilitäts- und Moleküloberflächenbeschaffenheitsunterschiede zwischen dem gesuchten Wirkstoff und den

L · J

begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennnungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigenschaften, technische Ausführbarkeit, Autoraatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art "der verwendeten Trennungssehritte von Bedeutung, sondern insbesondere deren optimierte Gestaltung und deren sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb des Rahmens der Strukturstabilität und der anderen Strukturparameter des gesuchten Wirkstoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsiebfiltration, Dialyse, Ionenaustaüschadsorptionen, usw.), aber in unterschiedlicher Kombination, für die Handhabungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik (z.B. Hydroxylapatitchromatographie, Zonenpräzipitationschromatographie, usw.) an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz, oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz, von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Wirkstoffes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einem wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoffreinigungsverfah- ;».. ren ein säulenchromatographischer Reinigungsschritt oder ein .'.

Lyophilisierungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Ausgangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Wirkstoffrohextraktes nicht auf '■: mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere Verfahrensschritte

reduziert wurde.
35

L -J

Für die Reinigung der einzelnen Proteinfraktionen bieten sich eine Mehrzahl von an sich einzeln in der Biochemie bekannten Bei-

nigungsschritten an. Beispiele für solche Reinigungsschritte sind: Präparative und analytische Molekularsiebfiltration, Anionen- und Kationenaustauscherchromatographie bzw. -Eintopfadsorptionsverfahren, Chromatographie an Hydroxylapatit, Zonenpräzipitationschromatographie und Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration.

Bereits durch einmalige Durchführung eines der genannten Rei— · nigungsverfahren kann eine beträchtliche Menge an Begleit— proteinen von den Mitogenen ",abgetrennt werden. Jedoch haften die in den Fraktionen enthaltenen Proteine trotz ihres verschiedenen Molekulargewichts häufig sehr stark aneinander. Sie werden beispielsweise in der Molekularsiebfiltration durch das Bestehen nicht idealer Gleichgewichte bei Proteinpolyelektrolyten oft unvollständig entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Es empfiehlt sich deshalb, mindestens zwei der genannten Trennverfahren hintereinander

durchzuführen. Vorzugsweise werden die Mitogen-Aktivität enthaltenden Proteinfraktionen mindestens drei der genannten Reinigungsschritte nacheinander unterzogen.

Alle Kombinationen der erwähnten Trennschritte sind Gegen-25

stand des erfindurigsgemäßen Verfahrens. Dabei gehört es zum Kenntnisstand des Fachmanns, daß bestimmte Folgen von Trennschritten weniger sinnto.ll sind als andere Kombinationen. Beispielsweise ist dem Fachmann bewußt, daß bei Durchführung einer

präparativen Molekularsiebfiltration nach einer analytischen 30

Molekularsiebfiltration neben der unhandlichen Verfahrensweise auch ein schlechteres Gesamtergebnis in Bezug auf die Trennwirkung erhalten wird als bei umgekehrter Reihenfolge.

Die Molekularsiebfiltration bewirkt eine Auftrennung der 35

Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht. Da ein überwiegender Teil der begleitenden Fremdproteine ein anderes

L -J-

Molekulargewicht als die Mitogene .- aufweist, kann ihre Abtrennung auf diese Weise erreicht v/erden. Für die Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wird ein hydrophiles, in'Wasser quellendes Molekularsieb verwendet. Beispiele für geeignete Molekularsiebe sind mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane (Sephadex), mit Acrylamid vernetzte Agarosen (Ultrogele) und raumvernetzte Acrylamide (Biogele), deren Ausschlußgrenzen größer als die zur Auftrennung verwendeten

Separationsgrenzen sind.
10

Die Molekularsiebfiltration wird, falls mehrere Trennstufen zur Anwendung kommen, vorzugsweise als einer der Ersten durchgeführt. Je nach dem Längen-Durchmesser-Verhältnis der verwendeten Säule und dem Teilchendurchmesser der Gelmatrix, welche die theoretische Bodenzahl der Säule beeinflussen, wird die Molekularsiebfiltration als "präparativ" oder "analytisch" bezeichnet. Sie wird als . . Vpräparativ" bezeichnet,, wenn die Chromatographie an Säulen mit einem Dimensionsverhältnis Länge z. Durchmesser, bis 10 : 1.

·· · ■

und einer Beladung von bis zu 1/3 des Säuleninhalts bzw. unter voller Ausnutzung des gesamten, matrizentypischen ' Separationsvolumens durchgeführt wird. "Analytisch" bedeutet ein Längen-Durchmesser-Verhältnis über 10:1, vorzugsweise etwa 50:1, und- eine Beladung bis maximal 3 % des Säuleninhaltes. .

Bei der präparativen Mdlekularsiebchromatographie werden GeI-matrizen mit möglichst großer Teilchengröße benutzt, um schnelle Durchfluß raten der oft etwas viskosen Prdteinlö- ' sungen bei möglichst niedrigen Drucken zu erzielen.'Bei der analytischen Molekularsiebfiltration wird die Teilchengröße der Gelmatrix so klein wie möglich gewählt, um eine maxima- > le theoretische Bodenzahl der Säule bei technisch und sicherheitsmäßig vertretbarem Druck und einer Flußgeschwindigkeit der mobilen Phase von 2 bis 4 cm/h zu erreichen. Diese Parameter sind von der Gelmatrixstruktur abhängig und von Gel zu Gel verschieden.

^Γ . - 42 -

Falls mehrere präparative Molekularsiebfiltrationen nacheinander durchgeführt werden, kann die Separationsgrenze abgestuft gewählt werden. Daran anschließend kann eine analytische Molekularsiebfiltration mit entsprechend abgestuften Separationsgrenzen durchgeführt werden. Die Ausschlußgrenze des verwendeten Gels muß jedenfalls größer als etwa 10 000 Daltons sein, um eine Volumenverteilung der Mitogene zwischen- - ·.· der stationären Gelmatrixphase und der mobilen wäßrigen Pufferphase zu ermöglichen.

Die "Ausschlußgrenze" bezeichnet den hydrodynamischen Parameter eines gelösten Teilchens, welcher der Porengröße der Gelmatrix entspricht. Teilchen mit größerem hydrodynamischen Parameter können nicht mehr in die Gelraatrix eindringen (Volumenverteilungskoeffizient K = 0) . Die "Separationsgrenze" bezeichnet einen zur Trennung von gelösten Teilchen zweckmäßigerweise festgesetzten hydrodynamischen Parameter, der zwischen einem Volumenverteilungskoeffizienten K_n = 0 und K = 1 liegt.
^υ

Zur Molekularsiebfiltration werden die Proteine gelöst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf das Molekularsieb aufgebracht. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes Lösungsmittel ist 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat- · · und 0,001mol/l Cystein

lösung mit einem Gehalt von 0,3 mol/1 NaGl/ und einem pH-Wert von -7,4. Nach der Filtration werden die Mitogene enthaltenden Fraktionen in der nachstehend beschriebenen Weise konzentriert _f. und gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen.

Als Anionenaustauscher für die Reinigung der Proteine eignen sich beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextran-(Sephadex),oder Zellulosematrizen, an welche funktionelle Gruppen mit Anionenaustauscherkapazitat gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein in einer Pufferlösung vorgequollener und äquilibrierter schwacher Anionenaus-

^r 4₃

tauscher in der Cl~-Form, wie DEAE-Sephadex-A 50_/verwendet und die Behandlung bei einem pH-Wert von 8 bis 10 durchgeführt. Ein spezielles Beispiel für eine solche Pufferlösung ist 0,01 mol/1 Txis-HCl, welche 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat.

Bei der Verwendung des Anionenaustauscher wird die Proteinfraktion einer solchen Menge Anionenaustauscher zugesetzt, die zur vollständigen Adsorption der Mitogene und der positiv ac', s orb i er enden Begleitproteine ausreicht.

Üblicherweise genügen dazu zwei Volumenteile gequollener Anionenaustauschar pro Volutren konzentrierter Proteinfraktion. Die Reaktion kann entweder als Chromatographieverfahren oder als leichter handhabbares Eintopfadsorptionsverfahren gestaltet werden.

Im Eintopfverfahren wird die überstehende Flüssigkeit mit den negativ adsorbierten Proteinen von dem mit den positiv adsorbierten Mitogenen*.- . und anderen Proteinen beladenen L Anionenaustauscher, beispielsweise durch Filtrieren (in der Chromatographiesäule) Dekantieren oder Zentrifugieren (im Eintopfverfahren) abgetrennt. Der beladene Anionenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine zu 0,04 mol/1 NaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 10 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15⁰C von anhaftenden, negativ adsorbierten Verbindungen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine ^um Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte T.ris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0. .

Der von negativ adsorbierten Verbindungen befreite, mit Chemorekrutin und anderen Proteinen beladene Anionenaustauscher wird ηνά mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert, welche eine größer als 0,04 mol/1 NaCl entsprechende Ionenstärke und einen pH-Wert zwischen 4,0 und 10,0 hat. Vorzugsweise wird eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von 5,0 bis 7,0 verwendet. Ein spezielles Beispiel für eine, derartige Salzlösung ist eine 2,0 mol/1 NaCl-Lösung, welche mit 0,01 mol/1 Piperazin-HCl

um pH-Wert 6,5 gepuffert ist und welche 0,001 mol/1 Cystein enthält.

Wird die Anionenaustauscherreaktion als Chrotnatographip-ver-? fahren gestaltet, so kann die Elution der Mitogene und anderer Proteine auch durch einen linearen NaCl-Konzentrationsgradienten erfolgen.

Als Kationenaustauscher eignen sich für die Reinigung der Pro-

■jO teinfraktion beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextran- '(Sephadex) oder Zeliulasematrizen-, an welche funk-' tionelle Gruppen mit Kationenaustauscherkapazität gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwach saurer Kationenaustauscher in der Na -Form, wie CM-Sephadex C-50, verwendet, und die Behandlung bei einem pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt. Die Proteinfraktionen können zur Erleichterung der Einstellung der Beladungsgleichgewichte vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher mit einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung verdünnt werden, welche eine zu 0,04 mol NaCl/Liter äquivalente maximale Ionenstärke hat. Sie kann gleichzeitig zur Einstellung des pH-Wertes dienen. Ein · . spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetatpufferlösurig mit einem Gehalt von 0,04 mol/1 KaCl und einem pH-Wert von 4 bis 6. Die-. se Kationenaustauscherreaktion kann sowohl als Chromatögraphieverfahren als auch als technisch leicht handhabbares Eintopfyerfahren gestaltet werden.

Der Kationenaustauscher wird der Proteinfraktion in einer Menge zugesetzt, die ausreichet, um die Proteinfraktion zu adsorbieren. Üblicherweise genügen dazu etwa 2 Volumenteile gequollener Ionenaustauscher pro Volumenteil Proteinfraktion. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit von dem mit den Proteinen beladenen Kationenaustauscher, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Der beladene

Kationenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine in 0,04 mol/1 MaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat,· vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15⁰C von anhaftenden, nicht adsorbierten Verbindungen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung, ist die erwähnte Kaliumphosphat—Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0.

Der von negativ adsorbierten Verbindungen befreite, mit den Proteinen beladene Kationenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert. Vorzugsweise wird hierzu eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 verwendet. Spezielle Beispiele für derartige Salzlösungen sind eine wäßrige 0,5 mol/1 Kaliumphosphatlösung vom pH-Wert 6,5 bis 7,5 oder eine 2 bis 5 mol/1 Natriumchloridlösung vom gleichen pH-Wert.

Für die Chromatographie an Hydroxylapatit werden möglicherweise aus vorangegangenen Schritten vorhandene Salze, z.B. AmmoniuEisulfat und vor allem Phosphate, vorzugsweise durch Dialyse oder Ultrafiltration an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von .500" Dal tons, vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit entfernt. Abgesehen von der Viskositätserhöhung durch Fremdzusätze ist aber für das Gelingen der " Chromatographie an Hydroxylapatit lediglich die Phosphatkonzentration der Proteinlösung kritisch. Die Eluierurig der Mitogene erfolgt durch einen Kaliumphosphat^.

Konzentrationsgradienten, der vorzugsweise linear ist. Die Mitogene enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und in der nachstehend erwähnten Weise konzentriert.

Die Verwendung von Hydroxylapatit ist für die strukturschonende Reingewinnung der Mitogene "·. von wesentlicher Bedeutung. Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist

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es aber mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden,- größere Proteinvolumina an Hydroxylapatitsäulen zu Chromatographieren. Einerseits neigt nämlich Hydroxylapatit bei größeren Proteinvolumina sehr stark zur Verstopfung und wird dadurch unbrauchbar. Andererseits ist Hydroxylapatit teuer, was seinem Einsatz in größerem Haßstab entgegensteht. Aus diesen Gründen ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, aus den Proteinfraktionen, in denen die Mitogene enthalten - -. sind, bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der begleitenden Fremdproteine durch geeignete Verfahrensschritte abzutrennen und dadurch das Proteinvolumen, das auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden muß, entscheidend zu verkleinern.

Bei der Zonenpräzipitationschrpmatographie (vgl. J. Porath, Nature, Bd. 196 (1962), S. 47-4S) werden Proteinverunreinigungen der .Mitogene durch Aussalzfraktionierung der Proteine mittels eines. Salzkonzentrationsgradienten abgetrennt.

.

Grundprinzip der Proteintrennung mittels der Zonenpräzipitationschromatographie sind unterschiedliche,, strukturgegebene reversible Löslichkeitseigenschaften der Proteine. Sie gehören zu den empfindlichsten molekularen Trennparametern und wurden häufig als Kriterium für den Kachweis der molekularen Einheitlichkeit eines Proteins verwendet. Dabei können Temperatur-und pH-Wert, Dimension der Säule, Ari des Salzes, Form des Gradienten und Beladung der Säule in einem verhält- ■ nismäßig breiten Bereich variiert werden.

Die Temperatur bei der Zonenpräzipitationschromatographie kann etwa O bis 4O°C betragen. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von etwa O bis 1O°C, insbesondere etwa 4 bis 6°C. Der pH-Wert kann zwischen etwa 4 und 10 liegen? bevorzugt ist ein pH-Wert-^im Bereich von 6 bis 8, insbesondere etwa 7.

Das. Verhältnis von Länge : Durchmesser der verwendeten Säule soll größer als etwa 10 : 1 sein, bevorzugt ist ein Verhältbis von 30 bis 100 : 1, insbesondere etwa 50 : 1. Als Salze

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Γ . - 47 -

kommen alle Proteine nicht schädigenden Salze mit Aussalzwirkung in Frage. Beispiele für solche Salze sind Natriumkaliumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Bevorzugt wird Ammoniumsxilfat verwendet.

Der Salzkonzentrationsgradient kann jede beliebige Form haben, so lange die Aussalzpurikte der Proteine laufstreckenmäßig getrennt sind. Bevorzugt sind lineare Konzentrationsgradienten, insbesondere ein ansteigender linearer Konzentrationsgradient von 25 bis 100 % Ammoniumsulfatsättigung. Die Beladung der Säule beträgt höchstens etwa 5 %, vorzugsweise etwa 1 %.

Die Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die vorstehend für die analytische Molekularsiebfiltration beschrieben sind. Es können die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen verwendet werden. Bevorzugt ist Sephadex G 50 bei einem Länge-Durchmesser-Verhältnis der Säule von mindestens etwa 50 : 1 und einer Beladung von höchstens etwa 3 % des Säuleninhalts. Als Lösungsmittel und zur Eluierung werden vorzugsweise die bei der analytischen Molekularsiebfiltration benutzten Lösungsmittel eingesetzt.

Bei der Kreislaufmolekularsiebfiltration wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen im Kreislauf wieder in die gleiche Säule geleitet. Auf diese Weise wird die Laufstrecke der Proteine differentiell verlängert. Bei einer anderen Ausführungsform, der Kaskadenmolekularsiebfiltration, wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen auf eine neue Säule mit gleichen oder ähnlich definierten Parametern geleitet

Zwischen den vorstehend erläuterten Reinigungsschritten können die erhaltenen, Mitogene enthaltenden Proteinlösungen zu nachfolgenden Auftrennungen der Proteine von

unerwünschten Salzen gereinigt und konzentriert werden.

Dieses Konzentrieren (Abtrennen des Großteils der wäßrigen Salzlösung von den Proteinen) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Mitogene und die _% Begleitproteine durch Ultrafiltration oder Entwässerungsdialyse an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons oder durch Lyophilisieren konzentriert werden. Dazu kann auch eine Molekularsiebfiltration durch Wahl der entsprechenden mobilen Phase in üblicher Weise modifiziert angewendet werden. Bei den Molekularsiebfiltrationen wird der Proteinlösung vorzugsweise etwa 0,4 mol/1 AmmoniumsuXfat· zugesetzt. Im Gegensatz zu höheren Konzentrationen hat das Ammoniumsulfat in dieser Konzentration einen starken Einsalzeffekt gegenüber Proteinen. Durch diese Maßnahmen, werden demnach die Proteine während der Molekularsiebfiltration in Lösung gehalten. Ferner verhindert Ammoniumsulfat das bakterielle Wachstum und hemmt gewisse Enzyme. Dadurch trägt es zur Stabilisierung der Mitogene bei, vor allem wenn die Chromatographie bei höheren Temperaturen (über etwa 20°C) und unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wird.

Für aussalzbare Mitogene "\ · wird eine vollständige Präzipitation mit allen Begleitproteinen durch Aussalzen, mit— tels Einstellen des Eluats auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,25 bis 3,7 mol/1 (80 bis 90 % AmmoniumsulfatSättigung) bevorzugt durchgeführt. Hierzu wird Amme— niumsulfat in einer Menge von etwa 630 g/l Eluät zugesetzt % (Sättigung etwa 90 %). Der pH-Wert wird dabei vorzugsweise auf etwa 4 bis 9 und die Temperatur zwischen 40⁰C^ vorzugsweise zwischen O und 8 ⁰C, gehalten» Die Mitogene enthaltenden ausgefällten Proteine fallen als Proteinniederschlag an und werden darin beispielsweise .durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren von dem praktisch proteinfreien überstand angetrennt. Die Zentrifugation erfolgt zweckmäßigerweise bei mindestens 10 000 χ g während mindestens

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45 Minuten, bevorzugt 1 Stunde einstufig; oder zweistufig bei niedrigeren. Kraftwirkungen in der ersten Stufe und einer Wiederholung bai höheren Kräften, z.B. 10 000 bis 50 000 χ g, für den überstand der ersten Stufe durch Durchflußzentrifugation.

Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei der Durchführung der Reinigungsschritte nicht besonders kritisch.. Wenn die Erhaltung der nativen Konfqrmation der Proteine beabsichtigt ist, empfiehlt sich die Einhaltung einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 8⁰C, vorzugsweise etwa 0 bis 4⁰C. Ferner müssen die Trenn- und Reinigungsstufen unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgeraäßen Verfahrens besteht darin, daß die Einhaltung dieser Bedingungen erstmals leicht möglich ist. Zur Oxidationsverhinderurig wird die Proteinlösung vorzugsweise ferner mit etwa 0,001 raol/1 Cystein versetzt.

Die erhaltenen Mitogene-_-„.. -,.: können in einer gepufferten . physiologischen Salzlösung, beispielsweise in 0,0015 mol/1 _: Natriumkaliuniphosphatlösung, die 0,15 mol/1 (0,9 %) NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, nach üblicher Filtersterilisation (0,2 μια Porenweite) nativ und biologisch aktiv auch bei Raumtemperatur (für mindestens 200 Stunden) oder eingefroren bei -25⁰C (für mindestens 5 Jahre) aufbewahrt werden. Diese Stabilität der Mitogene kann unter anderem als eines der Kriterien für ihren hochreinen Zustand angesehen werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Gewinnung der Mitogene -, ausgehend von Leukozyten aus Schweineblut beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Es können auch Leukozyten bzw. Entzündungsgewebe anderer Säuger verwendet werden.

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- 50 - — ·

Beispiel 1

Es wird die Herstellung von Mitogenen in einer KuItürlösung einer gemischten Leukozytenpopulation und die Abtrennung des Monocyto-Blastogen (MBG), de« Granulocyto-Blastogen (GBG), des Monocyto-Histiomitogens (MH.M)jnd des Lymphocyto-Lymphomitogens (LLM) von den übrigen Bestandteilen .!der !Kultur lösung erläu-

tert. Sämtliche Arbeitsschritte werden bei O bis 8⁰C in Gegenwart von 0,001 mol/1 Cystein durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Zentrifugationen erfolgen wie beschrieben, entweder einstufig oder zweistufig (als Durchfluß zentr if ugat ion) .

•ti
50 kg (etwa 10 ) Leukozyten werden als gemischte Zellpopulation physiologischer Zusammensetzung aus 10 000 Liter Schweineblut isoliert und in 20 Chargen ä* 2,5 kg (etwa 12

5 χ 10 Zellen) unter sterilen Bedingungen kultiviert. Als Kulturlösung wird das in Tabelle V aufgeführte Medium verwendet. Pro Charge werden 50 1 Kulturmedium eingesetzt- Die Kultur wird in Glasgefäßen ausgeführt. Die Zelldichte beträgt anfangs 10⁸ Zellen/ml. Die Kultur wird bei 37°C in einer Atmosphäre von 1 v/v % CO₂ für 40 .Stunden aufrechterhalten. Während dieser Zeit wird die Zellsuspension langsam gerührt (60 U.p.M.) und mit sterilen, wa.-ssergewaschenen, bei etwa 500°C in einem Quarzrohr hitzedekontaminierten_; feinen (kleiner als 1 mm) Luftblasen (etwa 5 1 Luft/Std.) durchflutet. Zusätzlich zum Sauerstoffpartialdruck wird der pH-Wert (7,1) und der D-G.lucosespiegel gemessen und konstant gehalten. Durch den Gehalt des Kulturmediums an einem polyvalenten Mitogen (CON) werden die Zellen während der Kultur zur Mitose angeregt. Zahl, Differential und morphologische Lebensfähigkeit (Farbstoffausschlußtest) der Zellen v/erden laufend mit üblichen Methoden der HämatoLogie und Zellkulturtechnik bestimmt. Die funktioneile Lebensfähigkeit der Zellen wird aufgrund ihrer Motilität und StimulLerbarkeit mit chemokinetischen und chemotaktischen Proteine ι gemessen. Mitosen

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werden durch Ciromosomenzählung bestimmt. Die morphologische

biotechnischen ·ν Lebensfähigkeib der Zellen am Ende der/Kultur ist >95 %.

Der gesamte Zellverlust (hauptsächlich Granulozyten) während der Kultur liegt bei höchstens 20 %, was für primäre Zellkul türen normal ist.

Die Kultur wird durch Trennung der Zellen von der überstehenden Lösung durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 400 χ g und 10°C beendet. Die Zellen werden zweimal mit einer SaIzlösung gewaschsn, die 0,15 mol/1 NaCl und 0,0015 mol/1 Natriumkalium];aosphat enthält, und den pH-Wert 7,1 aufweist. Sie können anderweitig verwendet werden.

Die Kulturlösung wird sodann bei 10 000 χ g 1 Stunde lang bei 4°C zur Ertfernurig von Schwebeteilchen erneut zentrifugiert. Die erh iltene_ klare Kultur lösung (zusammen 1000 Liter mit einem Gehalt ν ^n etwa 1400 g Protein und andere Makromoleküle) wird unmittelbar der Aussalzf-raktionierung mit Ammoniumsulfat unterworfen. ' . .

1. Schritt der Reinigung (Äussalzfraktionierung)

Die Kulturlösurig wird mit 0,5 mol/1 Natriumkalium-Phosphat-Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mol/1 versetzt. Ferner wird festes L-Cystein bis zu einer Konzentration von 0,001 mol/1 zugesetzt.

Dann wird die Kulturlösung durch Zugabe von 199g Ammoniumsulfat/1 Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 35 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom gelöste Proteine enthaltenden überstand abgetrennt. Es wird die Proteinrohfraktion 1 als ämmoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa lOO g protein enthält. Die Proteinrohfraktion 1 kann getrennt nach dem nachstehend für die Proteinrohfraktion 3 angegebenen Verfahren zur Gewinnung ihrer Inhaltsstoffe aufgearbeitet werden.

- 52 -

Anschließend wird die Kulturlösung durch Zugabe von 60 g Amminiumsulfat/1 Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 45 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein weiterer Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom gelöste Proteine enthaltenden überstand abgetrennt. Es wird die Proteinrohfraktion 2 als ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 6Ό g protein enthält. Die Proteinrohfraktion 2 kann ebenfalls getrennt nach dem nachstehend für die Proteinrohfraktion 3 angegebenen Verfahren zur Gewinnung ihrer Inhaltsstoffe aufgearbeitet werden.

Sodann wird die Kulturlösung durch Zugabe von 323 g Ammoniumsulfat/l Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 90 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein weiterer Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom gelöste Proteine enthaltenden Überstand abgetrennt. Es wird die Proteinrohfraktion 3 als ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 1088 g Protein enthält.

in dieser Fraktion befindet sich auch der Großteil des Serumalbumins. Die Proteinrohfraktion 3 wird nach dem nachstehend angegebenen Verfahren auf die darin enthaltenen Mitogene MBG, GBG, MHM und LLM aufgearbeitet. Der proteinhaltige überstand 4 der Rohfraktion 3 enthält 160 g Protein und andere Makromoleküle. Er kann ebenfalls zur Gew .nnung seiner Inhaltsstoffe aufgearbeitet werden.

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Γ _ ₅₃ _

Feinreinigung ιler Proteinrohfraktion 3

1. Anionenaustauscherchromatographie

Die vorstehend erhaltene Proteinrohfraktion 3 wird in einem möglichst kleiaem Volumen 0,01 mol/1 Fris-HCl-Lösung, die 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,3 hat, gelöst. Die etwas trübe Lösung (20 Liter) wird nach Zentrifugieren an ^y

einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons solange gegen den Lösudgspuffer dialysiert, bis keine Sulfatxonen mehr nachweisbar sind. Sodann wird die erhaltene klare Lösung auf eine Säule mit einem gequollenen regenerierten und im oben genannten Puff er sy stem äquilibrierten Anionenaustauscher (Cl als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhvdrin vernetzten Dextranmatrix (DEAE-Sephadex-A 50) gegeben.

Die Säule hat das 4-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältr.is (Länge zu Durchmesser) von 10 :'1. Die Gelsäule wird soclann mit der oben ;genannten Adsorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 mn

=1,0 ist.
25

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_ - 54 -

Zur Elution der Mitogene und der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes, der Tris- und der Cystein-Konzentration im Konzentrationsbereich von 0,04 bis 2,0 mol/1 linear ist, über 2 Tage eluiert. Sodann wird ein gleicher Gradient zur pH-Änderung von 8 auf 6,5 zur v/eiteren Elution von Verbindungen benutzt, welcher aus einem 0,01 mol/1 Piperazin-HCl-Puffer, 2,0 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein, pH'6,5, besteht. 10

Die Mitogene enthaltenden Fraktionen werden getrennt gesammelt (MBG, GBG, MHM und LLM werden in diesem Schritt getrennt) und von. nun an getrennt den nachstehend erläutertem weiteren Reinigungsstufen unterzogen.
15

2. Präparative Molekularsiebfiltration . '-·

Nach dem Konzentrieren der Proteine der Fraktionen, durch.

Fällen mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene, GMR bzw. MLR enthaltende Proteinniederschlag in einem möglichst kleinen Volumen einer 0,003 mol/1 Natriurakaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, gelö3t. Nach dem Äbzentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand wird die Lösung zur präparativen Molekularsiebfiltration auf . eine mit einer mit Acrylamid vernetzten Agafose-Molekularsiebmatrix (ültrogel AcA 34; 60 bis 160 μχα Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen, die das 10-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 20 : 1 aufweist. "Hierauf wird die Säule bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) mit 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, eluiert.

35
, Für das MBG wird die Fraktion mit den Separations grenzen 20 000 und

; 30 000 Daltons, im Fall des GBG diejenige mit der Separationsgrenzen

70 000 und 100000 Daltons, im Fall des MHM diejerige mit den Separaticns-_L grenzen 10 000 und 16 000 Daltons und im Fall des LLM diejenige mit den J

Separationsgrenzen 14 000 und 20 000 Daltons gesainmelt.

Die Fraktionen werden zur Proteinkonzentrierung lyophilisiert, ultrafiltriert an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons oder auf eine Ammoniumsulfatkonzentratkonzentration von 3,7 mol/1 eingestellt. Der ausgefallene Proteinniederschlag wird durch Zentrifugieren vom Überstand abgetrennt.

3. Kationenaustauscherchromatographie 10

Die erhaltenen MBG, GBG, MHM bzw. UM enthaltenden Proteinniederschläge werden in 1,5 Volumenteilen Pufferlösung aus 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat, 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein, pH 6,0, gelöst und zur Entfernung von wenig ungelöstem Rückstand 1 Sturide bei 10 000 χ g zentrifugiert. ' Die klare Lösung wird an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons solange gegen den Lösungspuffer dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar sind. Sodann wird die erhaltene klare Lösung auf eine Säule mit einem gequollenen, regenerierten und im oben genannten Puffersystem äquilibrierten Kationenaustauscher (Na als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (CM-S.ephadex-C 50) gegeben.

Die Säule hat das 4-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 10 : 1. Die GeI-• säule wird sodann mit der oben genannten Adsorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 nm = 1 ,0 ist. Dabei werden MBG, MHM und LIM eluiert.

.

Zur Elution des GBG _:- und der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes, der Phosphat- .und der Cystein-Konzentration im Konzentrationsbereich von 0,04 bis 2,0 mol/1 linear ist, über 2 Tage eluiert. Sodann wird die weitere Elution mit einem Phosphat-

Konzentrationsgradienten von 0,01 bis 0,5 mol/1 pH 8,0, unter Beibehaltung der NaCl-Konzentration (2 mol/1) und der Cysteinkonzentration durchgeführt.

Die MBG, GBG, MHM bzw. LLM enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und wie üblich konzentriert.

4. Chromatographie an Hydroxy!apatit

Die die Mitogene enthaltenden Proteinniederschlage werden in möglichst wenig .0,0001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält, gelöst und gegen diesen Puffer durch Molekularsiebfiltration, Ultrafiltration oder Dialyse entsalzt (Ausschlußgrenze 500 Daltons), bis in der Dialysen—Pufferlösung kein Sulfat mehr nachzuweisen ist. Sodann wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch einstündiges Zentrifugieren bei 1O 000 χ g entfernt.

Die erhaltenen klaren, MBG, GBG, MHM bzw. LLM enthaltenden Proteinlösungen werden getrennt auf eine mit Hydroxylapatit · gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule besitzt ein Verhältnis Länge zu Druchmesser von 10 : 1 und das vierfache Volumen des aufzutragenden Proteinvolumens. Die Säule wurde vorher mit dem fünffachen ihres Volumens des genannten Puffers äquilibriert (Fluß 3 cm/h). ·

Die negativ adsorbierten Proteine werden durch Eluieren mit der zum Äquilibrieren der Säule verwendeten Pufferlösung aus—

^O gewaschen. Sodann wird die Eluierung der MBG, GBG, MHM bzw. LLM enthaltenden Fraktionen mit einem linearen Phosphatkonzentrationsgradienten von 0,0001 mol/1 bis 0,5 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 unter Konstanthaltung des angegebenen Cysteinzusatzes über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt. MBG wird bei einer mittleren Phosphatkonzentration von etwa 0,003mol/l, , GBG bei etwa 0,1 mol/1, MHM bei etwa 0,006 mol/1 und LLM bei etwa

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1 °/^ο1 mol/1 eluiert. Der Elutionsgradient wird mit Hilfe der Leitfähigkeitsmessung verfolgt und kontrolliert.- Die Konzentrierung der die Mitogene enthaltenden Fraktionen erfolgt in üblicher Weise.

5) Zonenpräzipitationschromatographie

Die die Mitogene enthaltenden Fraktionen werden in 0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-25) gefüllt ist. Die Matrix befindet sich in einem ansteigenden linearen Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 1,0 bis 4,0 mol/1 Ammoniumsulfat (25 bis 100 % Sättigung). Die Steigung des Gradienten beträgt + 2% Ammoniumsulfatsättigung/cm Säulenhöhe (0,08 mol/1 (NH-)₂SO₄/cm), wobei der Bereich des Gradienten

über etwa die halbe Säulenlänge reicht. Das. Verhältnis Länge : Durchmesser der Säule beträgt 50 : 1, das Säulenvolumen ist 100 mal größer als das Auftragsvolumen. Die Stromungsgeschwindigkeit beträgt 2 cm/h.

Die Eluierung erfolgt mit der vorstehend genannten Natriumkaliumphosphatlösung, die 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die die Mitogene ' enthaltenden Fraktionen, welche bei 72 % (MBG), 52 % (GBG), 65 % (I-5HM) bzw. 61 % (LIi-I) Arationiumsulfatsättigung"'" '

eluieren, "werden gesammelt und die Proteine in üblicher Weise konzentriert. 30

6. Analytische Kreislaufmolekularsiebfiltration

Die die Mitogene enthaltenden Fraktionen werden in 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, aufgelost. Anschließend wird ein kleiner Anteil an

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~⁵⁸-

unlöslichen Stoffen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 48 000 x g entfernt.

Hierauf wird die erhaltene klare Lösung einer analytischen Kreislaufmolekulargewichtsfiltrationschromatographie unterzogen. Dazu wird die Lösung bei einer Temperatur von 4⁰C auf. eine mit Ultragel AcA 44 mit einer Teilchengröße von 60 bis 100 μΐη gefüllte Säule aufgebracht, die das 50- ache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50 : 1 besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein entlialtjVme Eluate werden bei einer Separationsgrenze von 30 000 Daltons (MBG), 100 000 Daltons (GBG), 20 000 Daltons (MHM) bzw. 24'0OO DaI-tons (LLM) dreimal im Kreislauf geführt. Nach üblicher Proteinkonzentrierung werden etwa 6 mg MBG, 8 mg GBG, 6 mg MHM bzw. 5 mg LLM erhalten. Die Mitogene weisen eine Reinheit von >95 % auf.

Beispiel2

1 2

3,5 kg (etwa 7 χ 10 ) Monozyten, die aus Schweineblut gewonnen wurden, werden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen kultiviert. Durch den Gehalt des Kulturmediums an einem polyvalenten Mitogen (COn) werden die Zellen während der Kultur zur Mitose angeregt.

Die in der Kulturlösung entstandenen Mitogene MBG und MHM werden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert und in hochreinem Zustand gewonnen. Es werden ähnliehe Ausbeuten wie in Beispiel 1 erreicht.

Beispiel 3

Es wird die Herstellung von Mitogenen aus einem Entzündungsgewebe und die Abtrennung der darin enthaltenen Mitogene von den übrigen Bestandteilen des Gewebes beschrieben. Es werden 500 g infarziertes, entzündetes Herzmuskelgewebe vom Hund

^Γ -59- -=■ '^:-^: "^ίπ

bei 0-4 ⁰C verwendet. Das Herzmuskelgewebe wird/im Fleischwolf zerkleinert und mit dem dreifachen Volumen seines Gewichtes einer 0,05 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung versetzt, welche 0,001 mol/1 Cystein enthält,/Die erhaltene Suspension wird mit einem Homogenisator (Ultraturax) homogenisiert. Anschließend wird der überstand, der die löslichen Anteile des Entzündungsgewebes enthält, von den ungelösten Bestandteilen durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g abgetrennt. Die Arbeiten werden bei einer Temperatur von 4⁰C durchgeführt.

Dann _wi_rd die erhaltene Lösung 3 Stunden bei 100 000 χ g zentrifuigert. Die dabei erhaltene klare Lösung wird von der oben aufschwimmenden Lipidschicht abgetrennt.

Die erhaltene, Mitogene enthaltende klare Lösung wird nun gemäß Beispiel 1 einer fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat unterzogen. Die erhaltene Proteinfraktion 3 wird ebenfalls gemäß Beispiel 1 auf die Mitogene aufgearbeitet. Es werden etwa 0,02 mg MBG, etwa 0,0.2 mg GBG, etwa O,o2. mg MHM und etwa 0,0 3 mg LLM erhalten.
20

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 3 wird ein Homogen!sat von 500 g Leukozyten hergestellt und in der dort angegebenen Pufferlösung suspendiert. Die Aufarbeitung auf die in den Leukozyten enthaltenen Mitogene erfolgt gemäß Beispiel 1. In den nicht unter Stimulierung kultivierten Leukozyten sind nur verhältnismäßig geringe (etwa 1 %) Mengen der Monocyto- und Lymphocyto-Mitogene enthalten. Die Ausbeuten betragen: etwa 5 μg GBG, etwa 1 μg LLM, etwa 1 ug MGG und ebenfalls etwa 1 \ig MHM.
30

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Leerseite

Claims (1)

1. VOSSlUS- VOSSIUS-TAUCHNER -HH-UNEMA-NK' · PAUH

   PATENTANWÄLTE

   SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O 75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN · TELEX 5-29 453 VOPAT D

   J 8. Mti Jöö:

   u.Z.: R 062 (Ra/kä)

   Max-Planck-Gesellschaft
   zur Förderung der Wissenschaften e.V. 3400 Göttingen

   " Mitogene der Leukozyten und des Entzündungsgewebes: Natürliche Leukopoetine zur selektiven Anregung der Teilung und Differenzierung von Leukozyten "

   Patentansprüche

   1. Mitogene der Leukozyten und des Entzündungsgewebes, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
   a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:

   - selektive Anregung der Teilung und Differenzierung

   (Mitose) von Knochenmarks- und/oder Gewebeleukozyten;

   - LDg₀ nicht bestimmbar, da keine lethalen Wirkungen, selbst bei mehr als der 1000 —fachen Dosis der physiologisch aktiven Schwellendosis, ersichtlich sind;

   - keine Mobilisierung adulter oder juveniler Leukozyten (Leukozytose- oder Linksverschiebungsreaktion);

   - keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

   - keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

   - keine spasmogene Aktivität auf gestreifte Muskulatur;

   - kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder -ähnlichen Wirkungen;

   - keine chemische Anlockung (Chemotaxis) von Leukozyten in vitro;

   Γ _ 2 _

   - keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

   - keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

   - keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

   - keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo;

   - keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

   - keine Entzündungswirkung in situ.;

   - keine chemotropische Mitogenwirkung auf Blutgefäßzellen;

   b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

   - Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktionen);

   - Schmelzpunkt: etwa 20O⁰C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß);

   - kein normaler freier und selbständiger Blut-, Blutplasma- oder Blutserumbestandteil;

   - sie entstehen aus Leukozyten als zelluläre Mediatoren;

   - elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

   - löslich in wäßrigen Medien einschließlich 10 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10;

   - sie adsorbieren reversibel in Struktur und biologischer Aktivität an Anionen-und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und können nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden.

   2. Mitogene nach Anspruch 1, erhältlich aus Leukozyten, durch Kultur von Leukozyten und Gewinnung aus der überstehenden Kulturlösung oder aus Entzündungsgewebe. 35

   L J

   Γ .3- -·-■ ■"■"■- ■ "·

   1 3. Mitogene nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Teilung und Differenzierung von Knochenmarksleukozyten anregen.

   5 4. Mitogen (Monocyto-Blastogen) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

   a) biologische Wirkungen:

   - spezifische Stimulierung der Teilung und bifferenzie-10 rung von Knochenmarksleukozyten;

   - Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro < 50 pmol/1;

   b) physikalisch chemische Eigenschaften:

   - Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruk-15 tür): etwa 25 000 Daltons;

   - unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

   - Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 1;

   20 - Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I :

   Tabelle I

   Wellenlänge, mn E_{1 mg/mlf1 cm (H}^_{0) f 2}o°C) ± ^6%

   248 (min) 0,23

   260 0,36

   276 (max) 0,56

   280 0,55

   290 0,38

   400 0

   450 0

   500 0

   550 O

   600 0

   700 0

   800 0

   850 0

   900 0

   1000 0

   5. Mitogen (Granulocyto-Blastogen) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Granulozyten erhältlich

   ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

   a) biologische Wirkungen:

   - spezifische Stimulierung der Teilung und Differenzierung von Knochenmarksleukozyten;

   - Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <5 nmol/1; 30

   b) physikalisch chemische Eigenschaften:

   - Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 85 000 Daltons;

   - unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sätti-

   gung von 90 % (3,6 mol/1);

   L J

   - Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Be-

   reich) gemäß Fig. 2;
   - Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle II:

   Tabelle II

   Wellenlänge, nm E_{1 mg/ml} . _y ^. ^ ₂₀o_c) ± 6%

   251 (min) 0,22

   260 0,30

   280 0,55

   281 (max) 0,56 290 0,41

   ⁴⁰° °

   450 0

   500 0

   550 0

   600 0

   700 0

   800 0

   850 0

   900 0

   0

   ^E28O^/E26O ¹'⁸³

   6. Mitogene nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Mitose von Gewebeleukozyten anregen.

   7. Mitogen (Monocyto-Histiomitogen) nach Anspruch β, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:
   a) biologische Wirkungen:

   - spezifische Stimulierung der Mitose von peritonealen Makrophagen;

   L J

   _ g _ ι

   - Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <1 nmol/1 b) physikalisch chemische Eigenschaften:

   - Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) : etwa 13 000 Daltons;

   - löslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 9o % (3,6 mol/1);

   - Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 3;

   - Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle

   Tabelle III

   Wellenlänge, nm E _{1 mg/ml/1 cm 2Q<>C) +} 6%

   _< ^

   252 (min) 0,20

   260 0,27

   279 (max) 0,56

   280 0,56

   290 0,46

   400 0

   450 0

   500 0

   550 0

   600 0

   700 0

   800 0

   850 0

   900 0

   0

   ^E28O^/E26O ²<⁰⁷

   8. Mitogen (Lymphozyto-Lymphomitogen) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Lymphozyten erhältlic ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

   a) biologische Wirkungen:

   - spezifische Stimulierung der Mitose von .peripheren Lymphozyten;

   - Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <Ό,5 nmol/1; 5

   b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

   - Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 17 000 Daltons;

   - unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

   - Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 4;

   - Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle IV:

   Tabelle IV

   Wellenlänge, nm E _{1 mg/mlr 1 cm} ^ _2Qo_c) + 6 %

   25 2 (min) 0,32

   260 0,41

   2 80 0,78

   28 2 (max) 0,79

   290 0,61

   ⁴⁰° °

   450 . 0

   500 0

   550 0

   600 0

   ⁷⁰° °

   800 0

   850 0

   900 0

   0

   ^E28O^/E26O ¹'⁹⁰

   L -I

   9. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der Mitogene nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Leukozyten oder Entzündungsgewebe homogenisiert oder Leukozyten kultiviert und die entstandenen Mitogene aus den Homogenaten oder aus der überstehenden Kulturlösung gewinnt.

   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gemischte Leukozytenpopulation kultiviert.

   11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Leukozytenart kultiviert.

   12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten in einem vollsynthetischen, Zellkulturmedium kultiviert, das Serumalbumin als einziges Protein enthält.

   13. Verfahren nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Kultur die Mitose der Leukozyten anregt.

   14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anregung der Mitose der Leukozyten ein polyvalentes Mitogen oder Endotoxin-Mitogen zusetzt oder eine Immunreaktion an der Zelloberfläche auslöst.

   15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mitose der Leukozyten durch Zusatz eines Lektins anregt.

   16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lektin aus Caiiavalia ensiforinis iConcanavalin" A = CON) verwendet.

   17. Verfahren nach Anspruch 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur der Leukozyten in einem Zellkultur-

   L J

   Γ _ ₉ _ ■'■■■ '■ - "·"""

   iasdium mit der in Tabelle V angegebenen Zusammensetzung durchführt.

   18. Verfahren nach Anspruch 9 bis 17, dadurch gekennzeich-

   net, daß man die Kultur der Leukozyten etwa 40 Stunden bei

   7 8

   etwa 37⁰C und einer Konzentration von etwa 10 bis 10 Zellen/ml Kulturlösung unter einem CO~-Partialdruck von etwa 1 % und unter ausreichender Sauerstoffzufuhr für die Kultur durchführt.

   19. Verfahren nach Anspruch 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Beendigung der Kultur durch Abtrennen der Leukozyten den in der Kulturlösung enthaltenen bei Salzzusatz unlöslichen Proteinanteil durch Aussalzen aus der Lösung, und den in der gesättigten Salzlösung löslichen Proteinanteil durch Konzentrieren dieser Lösung gewinnt.

   20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammoniumsulfat zum Aussalzen der Proteine verwendet.

   21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ammoniumsulfatkonzentration der Kulturlösung stufenweise erhöht, nach jedem Ammoniumsulfatzusatz die ausgefallenen Proteine abtrennt und damit mehrere Proteinrohfraktionen mit abgestufter Löslichkeit bei verschiedener Ammoniumsulfatkonzentration gewinnt.

   22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ammoniumsulfatkonzentration der Kulturlösung stufenweise auf 35 %, 45 % und 90 % Sättigung einstellt.

   23. Verfahren nach Anspruch 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man den überstand der Aussalzfällung nach dem Abtrennen des Proteinniederschlags durch Ultrafiltration oder Dialyse konzentriert.

   - 10 -

   24. Verfahren nach Anspruch 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch stufenweise Aussalzung gewonnenen Proteinrohfraktionen und den konzentrierten Überstand der Aussalzfällung getrennt auf Mitogene aufarbeitet. 5

   25. Verfahren nach Anspruch 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufarbeitung der Proteinrohfraktionen und die Gewinnung der Mitogene durch präparative und analytische Molekularsiebfiltration/ Anionen- und Kationenaustauscherchromatographie bzw. -eintopfadsorptionsverfahren, Chromatographie an Hydroxylapatit, Zonenpräzipitationschromatographie und/oder Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration durchführt.

   26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei der genannten Reinigungsschritte nacheinander durchführt.

   27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens drei der genannten Reinigungsschritte hintereinander durchführt.

   28. Verfahren nach Anspruch 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monocyto-Blastogens eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, gegebenenfalls während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach.Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Monozyto-Blastogen im

   L J

   Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

   29. Verfahren nach Anspruch 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Granulocyto-Blastogen eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Granulozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen Überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Granulocyto-Blastogen im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt .

   30. Verfahren nach Anspruch 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monocyto-Histiomitogen eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen Überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekular-Siebfiltration,einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebf iltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Monozyto-Histiomitogen im Eluat der KaskadenmolekularSiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

   31. Verfahren nach Anspruch 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Lymphozyto-Lymphomi toger? s eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Lymphozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekular Siebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Lymphozyto-Lymphomitogen im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

   32. Verfahren nach Anspruch 9 und 19 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man statt der Kulturlösung der Leukozy-

   ten den löslichen Anteil eines Leukozyten- bzw. Entzündungsgewebe-Homogenats verwendet.

   33. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Ab—

   wehrzustandes,der Leukopoese und von Entzüdnungsprozessen des Körpers von Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt· an mindestens einem Mitogen nach Anspruch 1 bis 8 und übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

   3Q 34. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Abwehr zustandes_; der Leukopoese und von Entzündungsprozessen des Körpers von Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem anti^Mitogen-Immunoglobulin.

   - 13 -

   1 35. Verwendung mindestens eines die Teilung und Differenzierung von Leukozyten anregenden Mitogens nach Anspruch bis 8 zur spezifischen Beeinflussung des AbwehrzuStandes, der Leukopoese und von Entzündungsprozessen des Körpers von

   5 Säugern.

   36. Verwendung von mindestens einem anti-Mitogen-Immunoglobulin zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes₍der Leukopoese und von Entzündungsprozessen des IQ Körpers von Säugern.