DE3028919C2

DE3028919C2 -

Info

Publication number: DE3028919C2
Application number: DE3028919A
Authority: DE
Inventors: Heinz-Juergen 4130 Moers De Freisen; Sidney North Caldwell N.J. Us Pestka
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1979-07-31
Filing date: 1980-07-30
Publication date: 1988-02-18
Also published as: ATA395080A; SE466290B; PH18479A; PT71625A; AR229931A1; IE801589L; FI70721B; RO81474B; FR2462167B1; DK328880A; HU185382B; IE50075B1; DOP1980002948A; KE3364A; JPH02138226A; NO151158B; MY8500274A; AT372387B; US5015730A; NO802297L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Fibroblasten- Interferon und dieses enthaltende pharmazeutische Präparat sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung durch eine Kombination von Affinitäts- Chromatographie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).

Das Human-Fibroblasten-Interferon der vorliegenden Erfindung ist insbesondere frei von Natriumdodecylsulfat und gekennzeichnet durch

(a) homogene Form;
(b) eine spezifische Aktivität von etwa 4×10⁸ Einheiten/mg;
(c) ein Molekulargewicht von etwa 20 500 gemäß Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;
(d) die folgende relative Aminosäurezusammensetzung (±15%) basierend auf 24stündiger Hydrolyse in 6,0N HCl, enthaltend 0,2% Thioglycolsäure (bezogen auf einen Wert für Leucin von 22,0):
(e) die Aminosäure-Teilsequenz
H₂N-Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser- Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . . und
(f) höchstens 3 Glucosaminreste, 0 Galaktosamin- und 0 Mannosaminreste pro Molekül.

Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957 hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben. Während verschiedene Autoren beanspruchen, Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt zu haben, werden von ihnen keine der klassischen Beweise für die Homogenität von Proteinen geliefert oder Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.

Die Anwendung von HPLC zur Reinigung von Proteinen ist allgemein bekannt. In der Literatur sind insbesondere Säulentypen für die Ionenaustausch- und Ausschluß-Chromatographie zur Reinigung von Proteinen beschrieben (z. B. Regnier und Noel, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976], und Chang et al., Anal. Biochem. 48, 1839 [1976]). In der Umkehrphasen- Chromatographie wurde z. B. Lichrosorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifiziertem SiO₂) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie β-Endorphin, verwendet [siehe z. B. Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4969-72 (1977)].

Es ist ferner bekannt, daß man die Affinitäts- Chromatographie zur Reinigung von Human-Fibroblasten- Interferon heranziehen kann. So beschreiben Davey et al., J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), die Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B bei der Herstellung von gereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon. Jankowski et al., Biochemistry 15, 5182 (1976), verwenden Blau Dextran- Sepharose zu dem gleichen Zweck. Schließlich gelingt gemäß US-Patent 41 72 071 (de Maeyer et al.) die Reinigung verschiedener roher Lösungen von Leukozyten- und Fibroblasten-Interferon durch Affinitätschromatographie an einer Blau Dextran-Sepharose-Säule, wobei Präparate mit einer spezifischen Aktivität zwischen 1 und 5×10⁸ internationale Interferon-Einheiten erreicht werden. Zusätzliche Reinigungsschritte werden nicht offenbart, und die erhaltenen Interferon-Präparate sollen noch einen hohen Anteil an Produkten mit Interferon-ähnlicher Aktivität enthalten und lediglich zu einem großen Teil von verunreinigenden Proteinen befreit sein.

In Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 520-523 (1976) wird von Knight die Reinigung von Human-Fibroblasten-Interferon durch Fraktionierung an Carboxymethyl-Sephadex und präparative Polyacrylamid- Gelelekrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) beschrieben, wobei ein Produkt resultierte mit einer auf mindestens 2×10⁸ Einheiten/mg veranschlagten spezifischen Aktivität und einem gelelektrophoretisch ermittelten Molekulargewicht von 20 000. Es wird festgestellt, daß es sich hinsichtlich der Molekulargröße um eine homogene Substanz handelt. Die Frage, ob es sich bei diesem Produkt aber bereits um eine reine Verbindung handelt, d. h. einerseits um Fibroblasten-Interferon frei von Verunreinigungen durch andere Glykoproteine gleichen Molekulargewichts (S. 522, rechte Kolonne) oder andererseits um chemisch einheitliches Material (S. 523, linke Kolonne), wurde ausdrücklich offengelassen. Während die vorliegende Erfindung ausdrücklich auf ein chemisch einheitliches Material abstellt (siehe Angabe der Aminosäurenzusammensetzung und Angabe einer Partialsequenz) ist von einem solchen in der Knight- Publikation ausdrücklich nicht die Rede. Ein wesentlicher Unterschied beider Produkte liegt darin, daß Knight Komplexe des Fibroblasten- Interferons mit Natrium-dodecylsulfat (SDS) erhielt, weil er als letzte Stufe der Reinigung eine präparative SDS-PAGE verwendete. Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren vermeidet eine solche Stufe und liefert von SDS völlig freies Fibroblasten-Interferon. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angewandte SDS-PAGE diente lediglich analytischen Zwecken bzw. Zwecken der Molekulargewichtsbestimmung. Beim SDS handelt es sich um eine hämolytisch wirkende und stark toxische Verbindung und der Gehalt eines Interferons an 0,05-1,0% SDS ist für dessen pharmazeutische Anwendung prohibitiv (vgl. z. B. US-PS 44 62 940).

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein betrifft eine Kombination von Affinitäts-Chromatographie und HPLC und ist dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in unreinem Zustand zunächst der Affinitäts-Chromatographie an Concanavalin A-Sepharose oder Blau Dextran Sepharose und die erhaltenen Interferon-Fraktionen dann der ein- oder mehrmaligen HPLC an Säulen auf der Basis einer durch Cyclohexyl- oder Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix unterworfen werden, wobei im Fall von vorhergehender Concanavalin A-Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/ Isopropanol/n-Butanol-/Wasser 8 : 8 : 20 : 0 : 64 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs 8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist, während im Fall von vorhergehender Blau Dextran Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/ Wasser 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/ n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs ebenfalls 8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist.

Für die Affinitäts-Chromatographie-Stufe des vorliegenden Verfahrens kann Concanavalin A-Sepharose 4B oder Blau Dextran-Sepharose verwendet werden, wobei letztere bevorzugt ist, im Hinblick auf wesentlich höhere Ausbeuten und ein stabileres Endprodukt.

Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B kann die folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden:

(a) 20-30 Säulenvolumina rohen Human-Fibroblasten-Interferons (spezifische Aktivität etwa 10⁴ Einheiten/mg) in Eagle's Minimalmedium, enthaltend 5% fötales Kälberserum, werden auf eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule bei einer Durchflußrate von 30-60 cm/Stunde gepumpt;
(b) es wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PPK) vom pH 7,2 gewaschen;
(c) es wird mit PPK-0,1M α-Methylmannosid (α-MM) gewaschen und
(d) es wird mit PPK-0,1M α-MM, enthaltend 50% Ethylenglykol (V/V), eluiert.

Das nach Schritt (d) erhaltene gereinigte Interferon weist eine spezifische Aktivität von etwa 10⁷ Einheiten/mg auf bei einer Ausbeute von etwa 10-30%.

Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Blau Dextran-Sepharose kann die folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden:

(a) 10-40 Säulenvolumina eines Kultur-Überstandes (1-3×10⁴ Einheiten/ml, 0,2-1 mg Protein/ml) werden durch Zusatz von gesättigter NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule gepumpt bei einer linearen Durchflußrate von 20-40 cm/Stunde;
(b) die Säule wird mit 5-15 Säulenvolumina von 1M NaCl/ 0,02-0,05M Phosphat und dann mit 5-15 Säulenvolumina von 1M NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 15% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) gewaschen und
(c) Interferon wird mit 1M NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 50% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) eluiert.

Das erhaltene Interferon hat eine spezifische Aktivität von etwa 3×10⁶ Einheiten/mg und kann in diesem Schritt in einer Ausbeute von etwa 80% erhalten werden.

Die in der Affinitäts-Chromatographie verwendete Blau Dextran-Sepharose kann durch Kupplung von Blau Dextran (an Dextran gekoppeltes Cibacron Blau F3GA) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B bei pH 9,5 erhalten werden.

Dieses Kupplungsverfahren ist, genauso wie das Waschen und Altern des Harzes und die Beladung und Elution der Säule, von entscheidender Bedeutung, um maximale Ausbeuten und ein hochreines Human-Fibroblasten-Interferon zu erhalten.

Stammt das Interferon aus einem Serum-freien Medium, so wird seine Reinigung durch ein- oder zweimalige Passage durch eine Blau Sepharose-4B-Säule und Elution mit einer gepufferten wäßrigen Lösung von Ethylenglykol (30-50%, V/V, pH 7,2) erreicht.

Zur weiteren Reinigung des Interferons wird es nach der Affinitäts-Chromatographie ein- bzw. mehrmaliger präparativer HPLC mit hoher Auflösung und hoher Ausbeute unterworfen. Für die HPLC werden Säulen auf der Basis einer porösen SiO₂-Matrix, an die Cyclohexyl- oder Octylgruppen gebunden sind, verwendet. Mittels dieser Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen pH-Bedingungen sowie mit unterschiedlichen Gradienten des organischen Elutionsmittels verwendet werden können, kann das Human-Fibroblasten-Interferon bis zur Homogenität gereinigt werden. Homogenität des Interferons ist dann gegeben, wenn bei der Natriumdodecylsulfat (NaDodSO₄)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein einziges Band erhalten wird, eine konstante spezifische Aktivität erreicht ist und bei der HPLC ein einzelner Peak erhalten wird, mit übereinstimmenden Aktivitäts- und Protein-Banden.

Die Chromatographie-Säulen auf der Basis einer unregelmäßig geformten, völlig porösen SiO₂-Matrix (Partikelgröße etwa 10 µ, Porengröße etwa 10^-5 mm), die Cyclohexyl- oder Octylgruppen enthält, sind im Handel erhältlich. Ein geeignetes HPLC-System ist im US-Patent Nr. 41 16 046 (Stanley Stein) beschrieben.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die durch die Affinitäts-Chromatographie gereinigte Lösung des Human- Fibroblasten-Interferons in einem wäßrigen Puffer vom pH 4-8 über die SiO₂-Säule geschickt. Ein für diesen Zweck bevorzugter Puffer ist ein Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/Wasser (8 : 8 : 84, V/V). Gewöhnlich wird unter Druck vorzugsweise im Bereich von 3,4 bis etwa 340 atm. gearbeitet. Das an die Säule gebundene Interferon wird anschließend in selektiver Weise eluiert unter Verwendung eines wäßrigen Puffergemisches mit einem Gradienten eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels. Als geeignete, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kommen vor allem Alkanole wie n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tert.-Butanol, Ethanol und Methanol in Frage. Besonders geeignet für die Elution von Human-Fibroblasten-Interferon ist ein Gemisch aus Propanol und Butanol.

Das Eluat wird in üblicher Weise fraktioniert und der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wird ständig durch hochempfindliche Monitore registriert. Ein für diesen Zweck geeignetes System haben Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975), bechrieben (vgl. auch US-Patent Nr. 38 76 881).

Die Wahl des für die HPLC geeignetsten Harzes hängt von der Herkunft und Reinheit des Human-Fibroblasten- Interferons ab. Material, das von einer Concanavalin A- Sepharose-Säule stammt, wird zweckmäßigerweise duch HPLC an einer Cyclohexyl-modifizierten SiO₂-Säule und anchließend an einer Occtyl-modifizierten SiO₂-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Andererseits wird Material, das von einer Blau Dextran-Säule stammt, mittels ein- oder mehrmaliger Passagen durch eine Octyl-modifizierte SiO₂-Säule oder mittels Passage durch eine Octyl-modifizierte sowie eine Cyanopropyl-modifizierte SiO₂-Säule und schließlich, sofern notwendig, eine Diphenyl-modifizierte SiO₂-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Stammt das Material aus einem Serum-freien Präparat und wird die Affinitäts- Chromatographie an einer Blau Sepharose-4B-Säule durchgeführt, so genügt eine einmalige Passage durch eine Octyl- modifizierte SiO₂-Säule, um Homogenität zu erreichen.

Im Hinblick auf die Empfindlichkeit von Human-Fibroblasten-Interferon gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Propanolen, Butanol oder 2-Methoxyethanol, bei neutralem pH, wurde die Chromatographie bei sauren pH-Werten durchgeführt. Da Human-Fibroblasten-Interferon hydrophober ist als Leukozyten-Interferon und da ferner andere, mehr hydrophobe Proteine in den teilweise gereinigten Fibroblasten-Interferon-Präparaten vorliegen, bewährte sich ein Gemisch aus Propanol und Butanol als Elutionsmittel in der HPLC an den verwendeten Umkehrphasen am besten. Die Verwendung dieses Gemisches erlaubte es, den Gehalt an organischem Lösungsmittel zu begrenzen und dadurch weniger Artefakte im Eluat zu erhalten.

Das gemäß vorliegender Erfindung erhaltene homogene Human-Fibroblasten-Interferon wurde nach der jeweils letzten HPLC-Säule in Form eines einzelnen Peaks isoliert und lieferte ein einzelnes enges Band bei der NaDodSO₄- Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Jeder übliche Assay zur Bestimmung von Human- Fibroblasten-Interferon-Aktivität kann zu diesem Zweck verwendet werden.

Das Molekulargewicht des homogenen Human-Fibroblasten- Interferons, bestimmt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese, betrug etwa 20 500. Die spezifische Aktivität des gereinigten Materials war etwa 4×10⁸ Einheiten/mg.

Die folgende N-terminale Partialsequenz konnte an einer Probe von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon festgestellt werden:
Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe- Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . .

Interferone besitzen antivirale, Antitumor-, wachstumshemmende und immunsupressive Aktivität. Diese Aktivitäten konnten sogar in klinischem Maßstab festgestellt werden bei Verabreichung von 1-10×10⁶ Einheiten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger als 1% Human-Interferon enthielten. Das gereinigte homogene Human-Fibroblasten- Interferon der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen Weise, wie bereits von Interferon-Präparaten bekannt, verwendet werden, unter Anpassung der Dosierung an den gesteigerten Reinheitsgrad.

Die Verfahrens- und Produktaspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele illustriert. Alle in Einheiten/ml oder Einheiten/mg angegebenen Interferon-Titer beziehen sich auf einen Standard für Human- Leukozyten-Interferon (GO23-901-527) des US National Institutes of Health.

Beispiel 1 Concanavalin A-Affinitäts-Chromatographie

50 ml Concanavalin A-Sepharose 4B (äquilibriert mit PPK vom pH 7,2, enthaltend 0,1M α-MM) wurde in eine 50 ml Polypropylen-Säule mit einer Polyethylenfritte gepackt. Es wurde mit 1,25 l roher Interferon-Lösung (2×10⁷ Einheiten, spezifische Aktivität 2×10⁴ Einheiten/mg) bei einer Durchflußrate von 180 ml/Stunde (35,5 cm/Stunde) beladen. Die Säule wurde dann mit 150 ml PPK und mit 600 ml PPK, enthaltend 0,1M α-MM, gewaschen. Das Interferon wurde schließlich mit dem obigen Puffer, enthaltend 50% (V/V) Ethylenglykol, eluiert. Ausbeute 9% (1,8×10⁶ Einheiten, spezifische Aktivität etwa 1×10⁷ Einheiten/mg). Bei einer größeren Bandbreite des Peaks werden unter Einschluß weiterer Fraktionen 15% Ausbeute erhalten (3×10⁵ Einheiten, spezifische Aktivität 2-4×10⁶ Einheiten/mg).

HPLC

120 ml des Eluates der Concanavalin A-Sepharose 4B- Säule (2,5×10⁶ Einheiten, etwa 2-4×10⁶ Einheiten/mg) wurden bei einer Durchflußrate von 0,4-0,8 ml/Min. direkt auf eine 4,6×300 mm-Säule auf der Basis einer Cyclohexylgruppen enthaltenden SiO₂-Matrix (Chromegabond 10 µ), die vorher mti einem Gemisch von Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/Wasser (8 : 8 : 20 : 64; V/V; Puffer A) äquilibriert wurde, gegeben, wobei der maximale Druck unter 306 atm. gehalten wurde. Das für die HPLC verwendete System entsprach im wesentlichen dem von Bohlen et al. (Anal. Biochem. 67, 438 [1975]) beschriebenen.

Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min. wurde der folgende Gradient, ausgehend vom Puffer A, für Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/ Wasser, 8 : 8 : 25 : 20 : 39, V/V) verwendet: 0-25% B, 32 Min.; 25-60% B, 225 Min.; 60-100% B, 63 Min. Es wurden Fraktionen zu 2,0 ml gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 26-29 (2×10⁶ Einheiten) wurden mit 4 ml Pyridin/Ameisensäure verdünnt und direkt auf eine 4,6×300 mm-Säule auf der Basis einer Octylgruppen enthaltenden SiO₂-Matrix (Chromegabond 10 µ) gegeben. Es wurde unter den für die Cyclohexylsäule angegebenen Bedingungen eluiert. Die spezifische Aktivität im Zentrum des Aktivitäts-Peaks war etwa 4×10⁸ Einheiten/mg bei einer Gesamtausbeute an gereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon von 10⁶ Einheiten.

Das an einer Concanavalan A-Säule gereinigte Interferon wird bei der HPLC an einer Cyclohexylgruppen- bzw. einer Octylgruppen-tragenden Säule sehr nahe beim Haupt- Peak eluiert. Wird bei der HPLC zuerst an der Octyl-Säule chromatographiert, so wird das Interferon direkt vor dem Haupt-Peak eluiert, während es bei Verwendung einer Cyclohexyl-Säule als erster Säule unmittelbar nach dem Haupt- Peak eluiert wird.

Proben des HPLC-gereinigten Human-Fibroblasten-Interferons wurden an 12,5 oder 15% NaDodSO₄-Polyacrylamid-Gel in Tris/Glycinpuffer der Elektrophorese unterworfen (1 µg Protein). Nach Anfärbung mit Coomassie Blau wurde ein einziges Band erhalten. Durch Assay auf antivirale Aktivität wurde festgestellt, daß das Maximum dieser Aktivität im Zentrum der gefärbten Bande lag. Das Molekulargewicht wurde mit etwa 20 500 bestimmt unter Verwendung von Rinderserumalbumin, Chymotrypsin, Cytochrom C und Ribonuclease als Vergleichssubstanzen. Die relative Beweglichkeit der Human-Fibroblasten-Interferon-Bande war nicht von der Anwesenheit von Mercaptoethanol in der Probe abhängig.

Beispiel 2 Herstellung der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule

50 g bepackte Sepharose 4B wurde mit 1 l Wasser gewaschen und nochmals in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert. Es wurden 15 g fein verteiltes CNBr unter leichtem Rühren zugesetzt und der pH-Wert auf 11±0,2 durch tropfenweise Zugabe von 10N NaOH eingestellt. Die Temperatur wurde durch Zugabe von Eis auf 20±5°C gehalten. Nach 15-20 Minuten wurde mit einem Volumen-Eiswasser versetzt und die Suspension auf einem Buchner-Trichter nochmals mit 5 Volumina 0,01N HCl gewaschen.

Das aktivierte Harz wurde sofort in 50 ml 0,4M Natriumcarbonatpufffer (pH 9,5), enthaltend 1,00 g gelöstes Blau Dextran, suspendiert und über Nacht bei 4°C in einer Rundbodenflasche geschüttelt. Es wurde mit 10 Volumina 1M NaCl, 2 Volumina 50% (V/V) Ethylenglykol, enthaltend 1M NaCl und 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2), gewaschen, über Nacht in 50% (V/V) Ethylenglykol stehengelassen, mit einem Volumenteil 80%igem (V/V) Ethylenglykol und 5 Volumina Gibco No. 11 Minimalmedium (MEM) gewaschen und in diesem Medium über Nacht bei 50°C aufbewahrt. Nach nochmaligem Waschen mit 3 Volumina 80%igem (V/V) wäßrigem Ethylenglykol, enthaltend 1M NaCl, und anschließend mit 2 Volumina MEM wurd das Harz in MEM aufgeschlämmt und in eine Säule übergeführt.

Affinitäts-Chromatographie

Ein Gemisch aus 1,5 l rohem Human-Fibroblasten-Interferon (2×10⁴ Einheiten/ml; 1 mg Protein/ml; spezifische Aktivität 2×10⁴ Einheiten/mg Protein) und 0,27 Volumina gesättigter NaCl-Lösung (etwa 6,3M) wurde auf eine 50-ml- Polypropylen-Säule mit einer Polythylen-Fritte, enthaltend 35 ml Blau Dextran-Sepharose 4B, bei einer Durchflußrate von 100 ml/Stunde (20 cm/Stunde) gegeben. Die Säule wurde nacheinander mit 200 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) und 500 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2) und 75 ml Ethylenglykol, gewaschen und schließlich mit 500 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2) und 250 ml Ethylenglykol eluiert. Etwa 90% des Interferons wurde in einem einzigen Peak zusammen mit dem Durchbruch des 50% Ethylenglykol enthaltenden Lösungsmittels eluiert. Die spezifische Aktivität im Peak-Maximum, mit dem mehr als 50% des gesamten Interferons eluiert wurde, lag bei 1×10⁷ Einheiten/mg.

HPLC

(A) 125 ml von der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule eluierte Interferon-Lösung (3×10⁷ Einheiten; 1×10⁷ Einheiten/mg) wurden auf eine 4,6×300 mm Säule auf der Basis einer Octylgruppen enthaltenden SiO₂-Matrix (Chromegabond 10 µ) prä-äquilibriert mit 1M NaCl/50% (V/V) Ethylenglykol, gepumpt. Bei einer Durchflußrate von 0,45 ml/Min. wurde, ausgehend von Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/ n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7, V/V), der folgende Gradient beim Übergang zu Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/ Isopropanol/n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 25 : 20 : 39, V/V) eingehalten: 0-25% B, 30 Min.; 25-55% B, 190 Min.; 55-100% B, 20 Min.; 100% B, 60 Min. Die Interferon-Aktivität stimmte im wesentlichen überein mit einem einzigen Protein-Peak in den Fraktionen 18-23 (jede Fraktion enthielt 1,5 ml Elutionsflüssigkeit).

(B) Bei Applikation von etwa einem Viertel der in Stufe (A) applizierten Menge an der gleichen Säule unter den für die Cyclohexyl-Säule in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, stimmte die Interferon-Aktivität mit einem Protein-Peak in den Fraktionen 24-26 überein.

(C) Unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Beladung, Gradient und Durchflußmenge wie in (A) und den gleichen Puffern A und B wie in (B) an einer Octylgruppen-enthaltenden Säule (9,6×500 mm, Chromegabond), so daß ¹/₉ der Beladung pro Kolonnenvolumen resultierte, wurde eine bessere Trennqualität erreicht.

(D) Das Material, das die höchste spezifische Aktivität (4×10⁸ Einheiten/mg) aus Verfahrensschritt (A) enthielt, wurde rechromatographiert an einer Cyanopropylgruppen-enthaltenden Säule unter Verwendung von Pyridin/Ameisensäure/ Wasser (8 : 8 : 84, V/V) und einem einstündigen Gradienten bezüglich n-Propanol (0-40%, V/V), bei einer Durchflußrate von 0,3 ml/Min. Es wurde ein symmetrischer Hauptpeak erhalten.

NaDodSO₄-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Elektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben von Interferonproben, die in den Verfahrensschritten (A), (B) und (C) erhalten wurden, lieferte eine Hauptbande vom Molekulargewicht 20 500, die im Assay auf Interferon-Aktivität mit der Mitte des Aktivitätspeaks übereinstimmte. Eine zweite Bande, die ein Molekulargewicht von etwa 10 500 aufwies und 20-50% des gesamten Materials, bezogen auf die Färbungsintensität, enthielt, variierte von Probe zu Probe und besaß keine antivirale Aktivität. Wenn die Proben nicht mit Mercaptoethanol behandelt wurden, wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von 40 000 beobachtet, die aber nur untergeordnete Aktivität aufwies. Die Aminosäureanalysen der Banden mit den Molekulargewichten 20 000 und 40 000 unterschieden sich nicht, während die Analyse derjenigen Bande, die ein Molekulargewicht von 10 000 aufwies, sehr deutlich differierte.

Die Elektrophorese einer gemäß Verfahren (D) erhaltenen Interferon-Probe lieferte ein Molekulargewicht von etwa 20 500 und eine spezifische Aktivität von 4×10⁸ Einheiten/mg. Die Aminosäureanalyse dieses homogenen Peptids lieferte nach 24stündiger Hydrolyse in 6N HCl die folgenden, auf Leucin mit 25,0 bezogenen Werte:

Beispiel 3 Blau Dextran-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie

(a) 5 l Kulturüberstand, enthaltend 19 400 Einheiten/ml Fibroblasten-Interferon, wurden durch ein 0,3-µ-Filter filtriert und dann auf eine Säule mit 275 ml Blau Dextran- Sepharose gegeben. Der Überstand wurde vorher durch Zugabe von 1350 ml einer gesättigten Lösung von NaCl (6,3M) auf 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule bei einer Durchflußrate von 360 ml/Stunde gepumpt. Etwa 4-6% des Interferons passierten die Säule ohne adsorbiert zu werden.

(b) Die Säule wurde dann bei einer Durchflußrate von 420 ml/Stunde mit 1300 ml einer wäßrigen Lösung, die 15% (V/V) Ethylenglykol, 1M NaCl und 0,02M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, gewaschen. Etwa 1% des adsorbierten Interferons wurden von der Säule eluiert.

(c) Das Interferon wurde dann bei einer Durchflußrate von 420 ml/Stunde mit einer wäßrigen Lösung, die 50% (V/V) Ethylenglykol, 1M NaCl und 0,02M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, eluiert. Mit den ersten 200 ml des Eluates wurde wenig Interferon eluiert. Das meiste Interferon wurde mit den nächsten 300 ml des Eluats eluiert, wie die folgende Tabelle zeigt:

Es wurden insgesamt 114% der eingesetzten Interferon- Aktivität wiedergefunden.

HPLC

Die Fraktionen 2-6 der Blau Dextran-Sepharose-Kolonne (250 ml; 13×10⁷ Einheiten; spezifische Aktivität 8,12× 10⁶ Einheiten/mg) wurden auf eine Säule (9,5×500 mm) auf der Basis einer Octylgruppen-enthaltenden SiO₂-Matrix bei einer Durchflußrate von 4 ml/Min. gepumpt. Während 12 Minuten wurde Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/ n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 20 : 2,5 : 61,5. V/V), bei einer Durchflußrate von 2 ml/Min., durch die Säule gepumpt. Anschließend wurde mit dem folgenden Gradienten bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/1-Propanol/n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 25 : 25 : 34, V/V), bei einer Durchflußrate von 1,25 ml/Min., eluiert: 0-20% B, 18 Min.; 20-29% B, 57 Min.; 29% B isokratisch während 27 Min.; 29-30% B, 3 Min.; 30-100% B, 36 Min.; 100% B, 54 Min.

Die Interferon-Aktivität wurde im isokratischen Bereich des Gradienten eluiert, und zwar gemeinsam mit einem Peak der mit einem Fluorescamin-Monitor-System nachgewiesen wurde. 45×10⁶ Einheiten Interferon (Ausbeute 35%) mit einer spezifischen Aktivität von 2×10⁸ Einheiten/mg wurden im Pool zusammengefaßt (50 ml)). Nach zweimonatiger Aufbewahrung bei -20°C in verschlossenem Polypropylen- Ampullen war die Aktivität auf 10% des Wertes nach HPLC zurückgegangen. Proteinverlust trat nicht ein.

Dieser 50-ml-Peak (spezifische Aktivität etwa 0,2× 10⁸ Einheiten/mg) wurde mit 1 ml Thiodiglykol und 20 ml n-Propanol versetzt. Mittels Assay wurden für dieses Gemisch insgesamt 4,26×10⁶ Einheiten festgestellt. Dem Gemisch wurden 100 ml 0,1% Triton X-100/0,3% Thiodiglykol zugesetzt. Dieses Gemisch, das gemäß Assay insgesamt 5,1×10⁶ Einheiten enthielt, wurde innerhalb von 30 Minuten auf eine Säule auf der Basis einer CN-Gruppen- enthaltenden SiO₂-Matrix (4,6×250 mm, 5 µ/8×10⁶ mm, Spherisorb), äquilibriert mit einem Gemisch von Pyridin/ Ameisensäure/Wasser (8 : 8 : 84, V/V, Puffer A), bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/Stunde, gepumpt. Der folgende Gradient bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/n-Propanol/Wasser, 8 : 8 : 50 : 34, V/V) bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/Min. wurde eingestellt: 0-25% B, 30 Min.; 25-50% B, 210 Min. Die Interferon-Aktivität wurde mit dem einzigen festgestellten Peak eluiert. Es wurden 4,2×10⁶ Einheiten (82%) in drei 1-ml-Fraktionen wiedergefunden.

Dieser Pool, der 69% des gesamten, auf die erste CN- Säule aufgegebenen Proteins darstellt, wurde mit 2 ml 0,1% Triton X-100 vermischt und nochmals auf die gleiche CN- Säule aufgegeben. Es wurde mit dem gleichen Gradienten in der halben Zeit eluiert. Die gesamte Aktivität (11,75× 10⁶ Einheiten; Ausbeute 280%) wurde in einem einzigen Peak eluiert.

Die die Interferon-Aktivität von der zweiten CN-Säule enthaltenden Fraktionen (4 ml) wurden auf eine 4,6×250 mm- Säule auf der Basis einer Diphenylgruppen-enthaltenden SiO₂-Matrix, die vorher mit einem zweistündigen linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B (gleiche Puffer wie für die CN-Säule) vorbehandelt und mit Puffer A äquilibriert war, bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/Min. gepumpt.

Es wurde der folgende Gradient bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/Min. verwendet: 0-25% B, 22 Min.; 25-50%, 98 Min. Der zweite Peak, der eluiert wurde, als das Gradient-Instrument 33% Puffer B anzeigte, stimmte mit dem Interferon-Aktivitäts-Peak überein. Es wurden insgesamt 2,6×10⁶ Einheiten (22%)und 40 µg Protein mit diesem Peak eluiert.

Die Diphenylgruppen-tragende SiO₂-Säule wurde folgendermaßen hergestellt:

SiO₂ (10^-2 mm, 10^-5 mm Porengröße) wurde in 6N HCl (10 : 1, V/G) während 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln eingeweicht. Es wurde dann mit Wasser neutral gewaschen und anschließend durch Waschen mit Aceton und Methanol das Wasser entfernt. Nach Trocknen unter vermindertem Druck über Nacht wurde die Kieselsäure (10 g) in 100 ml trockenem Toluol, das 10 ml Dichlordiphenylsilan enthielt, 6 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die so modifizierte Kieselsäure wurde zunächst mit 100 ml Toluol gewaschen und anschließend in einem Soxhlet-Extraktor nacheinander mit 250 ml Toluol, Aceton und Methanol jeweils während 8 Stunden behandelt. Schließlich erfolgte Behandlung mit Trimethylchlorsilan in der vorstehend angegebenen Weise.

Je 3 g Trägermaterial wurden dann in 10,7 ml Chloroform und 2,3 ml n-Butanol suspendiert und in 4,6×250-mm- Säulen aus rostfreiem Stahl unter einem Druck von 340 atm. gefüllt. Die Säulen wurden anschließend mit 75 ml Ethanol gewaschen.

Aminosäureanalysen der Mittelfraktion des erhaltenen Interferon-Peaks nach Hydrolyse in 5,7N HCl lieferten die folgenden Ergebnisse:

Hexosaminanalyse nach 6-, 14- und 24stündiger Hydrolyse des Interferons mit 5,7N HCl, enthaltend 0,02% Thioglykolsäure, bei 110°C, unter Verwendung der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule lieferte 3 Glucosaminreste pro Molekül. Es wurde weder Galactosamin noch Mannosamin gefunden.

Die Endgruppenbestimmung wurde mit einer 90 pMol- Probe aus der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule durchgeführt und ergab Met als N-terminale Aminosäure.

150 pMol-Proben sowohl von Fibroblasten- wie von Leukozyten-Interferon wurden dem tryptischen Abbau unterworfen und anschließend chromatographiert. Es wurden in den beiden Proben keine identischen Peptidfragmente gefunden.

Durch Sequenzierung einer 1,25-nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon wurde Met als N-terminale Aminosäure festgestellt. Sequenzierung einer weiteren 5,9-nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon lieferte die folgende N-terminale Aminosäuresequenz:

H₂N-Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg- Ser-Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . .

Beispiel 4

Rohes Interferon wurde aus menschlichen Fibroblasten (Zell-Linie GM 2504A, erhältlich beim Human Genetic Mutant Repository, Camden, N. J., USA) gewonnen. Das rohe Material wurde 1M bezüglich Natriumchlorid durch Zugabe gesättigter Natriumchloridlösung gemacht. Dieses Material wurde durch eine Säule von Blau Sepharose-4B (Volumen 20-25 ml, Durchmesser 2,5 cm, Durchflußmenge 2,5 ml/Min.) gegeben. Während des Beladens wurde das Rohmaterial mit Eis gekühlt. Nach der Beladung wurde die Säule mit 250 ml der folgenden Lösung (2,5 ml/Min.) gewaschen:
30% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).

Schließlich wurde das Interferon bei einer Durchflußrate von 2,5 ml/Min. mit 250 ml der folgenden Lösung eluiert:
50% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).

Typische Ergebnisse des Assays waren:
5% Aktivität im Durchfluß,
10% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
85% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.

Die Fraktionen des Interferon-Peaks aus der ersten Blau Sepharose-Säule wurden zusammengefaßt und mit der folgenden Lösung auf einen Ethylenglykolgehalt von 10% (V/V) gebracht:
2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).

Dieses Material wurde auf eine Blau Sepharose-Säule gegeben (Volumen 20-25 ml, 2,5 cm Durchmesser, Durchflußrate 2,5 ml/Min.). Es wurde mit 250 ml einer Lösung, enthaltend 2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2) und 30% (V/V) Ethylenglykol gewaschen und eluiert mit einer Lösung, enthaltend 2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2) und 50% (V/V) Ethylenglykol.

Typische Ergebnisse des Interferon-Assays waren:
10% Aktivität im Durchfluß,
30% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
60% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.

HPLC

Zunächst wurde die Probe aus dem 50%igen (V/V) Ethylenglykol-Eluat von Blau Sepharose untersucht. Es folgten Proben, die zweimal über die Blau Sepharose-Säule gegeben wurden, in welchen Fällen die 30%igen oder die 50%igen Ethylenglykol-Eluate verwendet werden konnten.

Es wurde eine 25×0,46-cm-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix (Lichrosorb RP-8) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Wasser gewaschen und dann mit dem Eluat der Blau Sepharose-Säule beladen. Vor die Pumpe wurde eine Mischkammer (5 ml) geschaltet. Es wurde bei einer Durchflußrate von 22 ml/Std. mit dem folgenden stufenweisen Gradienten von n-Propanol, bei einem konstanten, durch 1M Ameisensäure/0,8M Pyridin gewährleisteten pH von 4,2 gearbeitet:
0% 10 Min.; 30% 40 Min.; 32% 40 Min.

Schließlich wurde die Säule mit 60%igem n-Propanol gewaschen und vor der nächsten Verwendung mit 1M Ameisensäure und 0,8M Pyridin äquilibriert.

Das Interferon wurde mit dem 32%igen n-Propanol-Eluat (zwischen 80 und 90 Minuten) eluiert. Dieses Material war homogen aufgrund der NaDodSO₄-Acrylamid-Gelelektrophorese (Färbung mit Coomassie Blau oder vorheriger Markierung der Probe mitFluram).

Aminosäureanalysen (24stündige Hydrolyse, 0,2% TGS, 5,7N HCl) wurde an neun verschiedenen Proben aus vier unterschiedlichen Präparaten durchgeführt. Die mittlere Aminosäurezusammensetzung, bezogen auf einen Leucinwert von 22,0, geht aus der folgenden Tabelle hervor:

Basierend auf den zu verschiedener Zeit durchgeführten Analysen verschiedener Proben, die durch unterschiedliche, in diesem und den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfahren erhalten wurden (24stündige Hydrolyse in 6N HCl mit 0,2% Thioglykolsäure, TGS), weist homogenes Human- Fibroblasten-Interferon die folgende Aminosäurezusammensetzung auf (±15%):

Beispiel 5

Homogenes Human-Fibroblasten-Interferon (1,5 mg) mit einer spezifischen Aktivität von 4×10⁸ Einheiten/mg wurde in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6×10⁶ Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei -20°C) aufbewahrt.

Claims

1. Human-Fibroblasten-Interferon, frei von Natriumdodecylsulfat, gekennzeichnet durch

2. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten- Interferon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in unreinem Zustand zunächst der Affinitäts-Chromatographie an Concanavalin A-Sepharose oder Blau Dextran Sepharose und die erhaltenen Interferon-Fraktionen dann der ein- oder mehrmaligen HPLC an Säulen auf der Basis einer durch Cyclohexyl- oder Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix unterworfen werden, wobei im Fall von vorhergehender Concanavalin A-Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/ Isopropanol/n-Butanol/Wasser 8 : 8 : 20 : 0 : 64 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs 8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist, während im Fall von vorhergehender Blau Dextran Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/ Wasser 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/ n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs ebenfalls 8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist.

3. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines Human- Fibroblasten-Interferons gemäß Anspruch 1.