NL8004361A - Homogeen fibroblasten-interferon en de bereiding daarvan. - Google Patents

Description

N.Q. 29.281

Homogeen fibroblasten-interferon en de bereiding daarvan.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op humaan-fibroblasten-interferon als homogeen proteine en een werkwijze voor de bereiding daarvan door een combinatie van affiniteit-chromatografie en hoge-druk-vloeistofchromatografie (HPLC).

5 Sedert de ontdekking daarvan door Isaacs en Lindenmann in het jaar 1957 is het onderzoekers in de gehele wereld in twee decennia niet gelukt het interferon, zowel uit leukocyten als uit fibroblas-ten als homogeen peptide met succes te isoleren in zodanige hoeveelheden, die een karakterisering van de specifieke biologische en che-10 mische eigenschappen ervan mogelijk maken. Terwijl verschillende auteurs beweren, muizen- of humaan-interferonen tot het bereiken van homogeniteit te hebben gezuiverd, worden door de betreffende auteurs geen enkel van de klassieke bewijzen voor de homogeniteit van proteïnen geleverd of eigenschappen van de zogenaamd zuivere verbindin-15 gen beschreven.

De toepassing van HPLC voor het zuiveren van proteïnen is algemeen bekend. In de literatuur zijn in het bijzonder typen kolommen voor de ionenuitwisselende en uitsluitende chromatografie voor de zuivering van proteïnen beschreven [ zie bijvoorbeeld Regnier en Roel, 20 J.Chromatog.Sci. 14, 316 (1976) en Chang en medewerkers, Anal. Bio-chem. ^8, 1839 (1976)]. In de omkeerfasen-chromatografie werd bijvoorbeeld Lichrosorb RP-18 (kolommen op basis van met octadecyl gemodificeerd SiOg) met succes voor de zuivering van peptiden, zoals β-endorfine, gebruikt [zie bijvoorbeeld Rubinstein en medewerkers, 25 Proc, Natl.Acad.Sci. ïï.S.A. 2A, 4969-72 (1977)]·

Voorts is bekend, dat men de affiniteit-chromatografie voor de zuivering van humaan-fibroblasten-interferon kan toepassen. Zo beschrijven Davey en medewerkers, J.Biol. Chem. 251, 7620 (1976) de toepassing van concanavalin A-sefarose 4£ hij de bereiding van ge-zuiverd humaan-fibroblasten-interferon. Jankowski en medewerkers, Biochemistry Ij), 5182 (1976), gebruiken blauw-dextran-sefarose voor hetzelfde doel. Ten slotte is volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.172.071 de zuivering van verschillende onzuivere oplossingen van leukocyten- en fibroblasten-interferon mogelijk door affiniteit-3 5 chromat o grafi e aan een blauw dextran-sefarose-kolom, waarbij pre-paraten met een specifieke activiteit tussen 1 en 5*10ö internationale interferon-eenheden worden verkregen. Extra zuiveringstrappen ζφι niet vermeld en de verkregen interferonpreparaten moeten nog een groot gehalte aan nrodukten met een acti- -2- viteit soortgel ijk aan die van interferon bevatten en slechts voor een groot gedeelte van verontreinigende proteinen rijn bevrijd.

De verbeterde methode volgens de uitvinding voor de bereiding saa humaan-fibroblasten-interferon als homogeen proteine heeft be-5 trekking op een combinatie van affiniteit-chromatografie en EPLC en is gekenmerkt doordat men A. een oplossing in waterjvan humaan-fibroblasten-interferon in onzuivere toestand op een affiniteit-chromatografie-kolom brengt, waaraan het interferon wordt geadsorbeerd, het interferon elueert 10 en het in bepaalde fracties van het eluaat in een grotere zuiverheid verkrijgt en B. de verkregen interferonfracties onder HPLC-omstandigheden door een of meer met een buffer geequilibreerde chromatografiekolom-men op basis van een cyclohexyl-, fenyl-, difenyl-, octyl-, octa- 15 decyl- of cyanopropylgroepen bevattende SiOg-matrix leidt, waarbij het interferon wordt geadsorbeerd en het telkens met een gradiënt van met water mengbare oplosmiddelen in een gebufferd zuur water bevattend systeem elueert, zodat het interferon in de vorm van een enkele karakteristieke piek in bepaalde fracties van het eluaat 20 wordt verkregen.

Yoor de trap van de affiniteit-chromatografie van de werkwijze volgens de uitvinding kan concanavalin A-sefarose 4B of blauw dextran-sefarose worden gebruikt, waarbij het laatstgenoemde de voorkeur verdient, in verband met aanzienlijk grotere opbrengsten 25 en een eindprodukt met een grotere stabiliteit.

Ter uitvoering van de affiniteit-chromatografie onder toepassing van concanavalin A-sefarose 4B kan het volgende algemene voorschrift van de werkwijze gelden: a) 20-30 kolomvolumina onzuiver humaan-fibroblasten-interferon 30 (specifieke activiteit ongeveer 10^ eenheden/mg) in Eagle's Minimal- medium, bevattend 5% feutaal kalverserum, worden op een concanavalin A-ffifarose 4B-kolom bij een doorstromingssnelheid van 30-60 cm/uur gepompt; b) er wordt met eenmet fosfaat gebufferde keukenzoutoplossing 35 (jOK) met een pH van 7,2 gewassen; c) er wordt met EHK-0,1M a-methylmannoside (a-MM) gewassen en d) er wordt ΙΊΕΚ-Ο,ΙΜ α-ΜΜ, bevattend 50% ethyleenglycol (V/Υ) geëlueerd.

Het volgens de trap d) verkregen gezuiverde interferon heeft 7 40 een specifieke activiteit van ongeveer 10 eenheden/mg bij een op- 800 4 3 61 Μ -* -3- brengst van ongeveer 10-30%.

Voor de uitvoering van de affiniteit-chromatografie onder toepassing van blauw-dextra n-sefarose kan het volgende algemene voorschrift gelden: 5 a) 10-40 kolomvolumina van de vloeistof boven een cultuur (1-3· 104 eenheden/ml, 0,2-1 mg proteine/ml) worden door toevoeging van een verzadigde NaCl-oplossing op een gehalte van 1,25 M NaCl ingesteld en op de kolom gepompt bij een lineaire doorstromingssnelheid van 20-40 cm/uur; 10 b) de kolom wordt met 5-15 kolomvolumina van 1M NaCl/0,02-0,05M fosfaat en daarna met 5-15 kolomvolumina van 1M NaCl/O,02-0,05M fosfaat, bevattend 15% (Y/V) ethyleenglycol (pH 7,2), gewassen en c) interferon wordt met 1M NaCl/0,02-0,05M fosfaat,bevattend 50% (Υ/Υ) ethyleenglcyol (pH 7,2), geëlueerd.

Eet verkregen interferon heeft een specifieke activiteit van ongeveer 3.10^ eenheden/'mg en kan in deze trap in een opbrengst van ongeveer 80% worden verkregen.

Het in de affiniteit-chromatografie gebruikte blauw dextran-sefarose kan door koppeling van blauw dextra n. (aan dextran gekop-20 peld cibacron blauw f^Qck) aan CNBr-geactiveerd sefarose 4® bij pH

9,5 worden verkregen.

Deze koppelingswerkwijze is,en ook het wassen en het verouderen van de hars en de belading en de eluering van de kolom, van bijzonder grote betekenis ter verkrijging van maximale opbrengsten en 25 een bijzonder zuiver humaan-fibroblasten-interferon.

Indien het interferon afkomstig is van een serumvrij medium, wordt de zuivering daarvan door éénmalige of tweemalige passage door een Bauw sefarose-4D-kolom en eluering met een gebufferde oplossing in watsr van ethyleenglycol (30-50%, Y/V, pH 7,2) bereikt.

30 Yoor een verdere zuivering van het interferon wordt het na de affiviteit-chromatografie onderworpen aan een enkele of enige keren preparatieve HPLC met een grote oplossing en een grote opbrengst. Yoor de HPLC worden kolommen op basis van een poreuze SiOg-matrix gebruikt, waaraan cyclohexyl-, octyl-, octadecyl-, fenyl-, 55 difenyl- of eyanopropylgroepen zijn gebonden. Door middel van deze kolommen die na elkaar en onder verschillende ρΞ-omstandigheden alsmede met verschillende gradiënten van het organische elueringsniddel kunnen worden gebruikt kan het humaan-fibroblasten-interferon worden gezuiverd totdat het homogeen is. Homogeniteit van het interferon 40 is gegeven indien bij de natriumdodecylsulfaat-(NaDodSO.)-polyacryl-* * a / τ e 4 4 -4- amide-gelelektroforese een enkele band wordt verkregen, een constante specifieke activiteit is bereikt en bij de HPLC een enkele piek wordt verkregen met overeenkomende activiteit- en proteine-banden.

De chromatografiekolommen op basis van een onregelmatig gevorm-5 de volledig poreuze SiOg-matrix (deeltjesgrootte ongeveer 10yum, poriëngrootte ongeveer 10 ^ mm) die cyclohexyl-, octyl-, octadecyl-, fenyl- of cyanopropylgroepen bevat zijn in de handel verkrijgbaar.

Een geschikt HPLC-systeem is in het Amerikaanse octrooischrift 4.II6.O46 (Stanley Stein) beschreven.

10 Yolgens de werkwijze van de uitvinding wordt de door de affini- teit-chcomatografie gezuiverde oplossing van humaan-fibroblasten-terferon in een water bevattende buffer met een pH van 4-8 door de SiOg-kolom geleid. Een daarvoor bij voorkeur toegepaste buffer is een mengsel van pyridine/mierezuur/water (8:8:84, V/Υ). Gewoonlijk 15 wordt onder druk gewerkt, bij voorkeur in het gebied van 3,4 tot ongeveer 340 atm. Het aan de kolom gebonden interferon wordt vervolgens op selectieve wijze geëlueerd onder toepassing van een water bevattend buffermengsel met een gradiënt van een met water mengbaar organisch oplosmiddel. Als geschikte met water mengbare organische 20 oplosmiddelen komen in het bijzonder alkanolen, zoals n-propanol, isopropanol, n-butanol, tert.butanol, ethanol en methanol in aanmerking, Bijzonder geschikt voor de eluering van humaan-fibroblasten-interferon is een mengsel van propanol en butanol.

Het eluaat wordt op gebruikelijke wijze gefractioneerd en het 25 proteinegehalte van de afzonderlijke fracties wordt voortdurend door monitoren met een grote gevoeligheid geregistreerd. Een daarvoor geschikt systeem is beschreven door Bohlen en medewerkers, Anal.Biochem. 67, 438 (1975) (zie ook Amerikaans octrooischrift 3*876.881).

De keuze van de voor de HPLC meest geschikte hars is afhanke-30 lijk van de herkomst en de zuiverheid van het humaan-fibroblasten-interferon. Materiaal dat van een concanavalin A-sefarose-kolom afkomstig is wordt doelmatig door HPLC aan een met cyclohexyl gemodificeerde SiOg-kolom en aansluitend aan een met octyl gemodificeerde SiOg-kolom tot het bereiken van homogeniteit gezuiverd. Anderzijds 35 wordt materiaal dat afkomstig is van een blauw dextran-kolom door een enkele passage of door een aantal passages door een met octyl gemodificeerde SiOg-kolom of door passage door een met octyl gemodificeerde alsmede een met cyanopropyl gemodificeerde SiOg-kolom en ten slotte, voor zover is vereist, door een met difenyl gemodificeer-40 de SiOg-kolom tot het bereiken van homogeniteit gezuiverd. Indien r η n k 3 61 -5- ί * het materiaal afkomstig is van een serumvrij preparaat en indien de affiniteitchromatografie wordt uitgevoerd aan een blauw sefarose- 4B-kolom is een éénmalige passage door een met octyl gemodificeerde

SiOg-kolom voldoende voor het bereiken van homogeniteit.

5 In verband met de gevoeligheid van humaan-fibroblasten-inter- feron ten opzichte van organische oplosmiddelen zoals propanolen, een butanol of 2-methoxyethanol bijyneutrale pH werd de chromatografie bij zure pH-waarden uitgevoerd. Daar humaan-fibroblasten-interferon hydrofober is dan leukocyten-interferon en daar voorts andere, meer 10 hydrofobe proteïnen in de gedeeltelijk gezuiverde fibroblasten- interferon-preparaten aanwezig zijn is een mengsel van propanol en butanol als elueringsmiddel in de HPLC aan de toegepaste omkeerfasen het meest doelmatig gebleken. De toepassing van dit mengsel maakt het mogelijk het gehalte organisch oplosmiddel te beperken en daardoor 15 minder artefakten in het eluaat te verkrijgen.

Het volgens de uitvinding verkregen homogen humaan-fibroblasten-interferon werd na de telkens laatste HPLC-kolcm in de vorm van een enkele piek geïsoleerd en leverde een enkele nauwe band bij de UaDodSO^-polyacrylamide-gelelektroforese bij aanwezigheid 20 van 2-mercaptovethanol op. De extractie van het gel leverde een afzonderlijke piek van antivirale activiteit op, die overeenkwam met de proteineband. Iedere gebruikelijke proef ter bepaling van humaan -fibroblasten-interferon-activiteit kan voor dit doeleinde worden gebruikt. Het molecuulgewicht van het homogene humaan-fibroblasten-25 interferon, bepaald door polyacrylamide-gelelektroforese, was ongeveer 20.500. De specifieke activiteit van het gezuiverde materiaal 0 was ongeveer 4·10 eenheden/mg.

De volgende U-terminale partiële sequens kon aan een monster van homogeen humaan-fibroblasten-interferon worden vastgesteld: 1 5 10 15 50 met -ser-tyr-asn-leu -leu-gly-fe-leu-gln -arg-ser-ser-asn-fe - 19 gin-.. .-gln-lys

Interferonen hebben een antivirale, antitumor-, groeiremmende en immuunsupressieve activiteit. Deze activiteiten konden zelfs op g klinische schaal worden vastgesteld door toediening van 1-10.10 35 eenheden/dag met betrekkelijk onzuivere preparaten, die minder dan Λ% humaan-interferon bevatten. Het gezuiverde homogene humaan-fibroblasten-interferon volgens de uitvinding kan op de wijze, die reeds van interferon-preparaten bekend is^ worden toegepast onder aanpassing van de dosering aan de verhoogde zuiverheidsgraad.

40 De onderhavige uitvinding wordt door de volgende voorbeelden -6- geillustissrd, die betrekking hebben op de wijze van werken en op de betreffende produkten. Alle in eenheden/ml of eenheden/mg vermelde interferon-titers zijn betrokken op een standaard voor humaan-leuco-cyten-interferon (G023-901-527) van het US National Institute of 5 Health.

Yoorbeeld I.

Gonoanavalin A-affiniteit-chromatografie.

50 ml concanavalin A-sefarose 4B (geëquilibreerd met EDE met een pH van 7,2, bevattend 0,1M a-MM) werden in een polypropeen-10 kolom van 50 ml met een polyetheen 'rit gepakt. Beladen werd met 1,25 η 1 van een onzuivere interferon-oplossing ( 2.10 eenheden, specifieke activiteit 2.10^ eenheden/mg) bij een doorstromingssnelheid van 180 ml/uur (35,5 cm/uur). De kolom werd vervolgens met 150 ml EBE en met 600 ml EBE, bevattend 0,1M a-MM, gewassen. Het interferon werd 15 ten slotte met de vermelde buffer, bevattend 50% (v/v) ethyleenglycol.

g ' geëlueerd. Opbrengst 9% (1,8.10 eenheden, specifieke activiteit ongeveer 1,10 eenheden/mg ). Bij een grotere bandbreedte van de piek werd onder toevoeging van andere fracties een opbrengst van 15% 6 6 verkregen (3*10 eenheden, specifieke activiteit 2-4.10 eenheden/mg).

20 HPIiC

120 ml van het eluaat van de concanavalin A-sefarose 4B-kolom (2,5-10^ eenheden, ongeveer 2-4*10^ eenheden/mg) werden bij een doorstromingssnelheid van 0,4-0,8 ml/min direct op een kolom van 4,6.300 mm op basis van een cyclohexylgroepen bevattende SiOg-matrix (chro-25 megabond 10yum) die tevoren met een mengsel van pyridine/mierezuur/ isopropanol/water (8:8:20:64; Y/Y; buffer A) was geëquilibreerd, gegoten, waarbij de maximale druk beneden 306 atm werd gehouden. Het voor de HELC toegepaste systeem kwam hoofdzakelijk overeen met het door Bohlen en medewerkers beschreven systeem (Anal.Biochem. 67, 30 438 (1975)).

Bij een doorstromingssnelheid van 0,4 ml/minuut werd de volgende gradiënt,uitgaande van de buffer A,voor de buffer B (pyridine/ mierezuur/isopropanol/n-butanol/water 8:8:25:20:39, Y/Y) toegepast: 0-25% B, 32 minuten; 25-60 % B, 225 minuten; 60-100% B, 63 minuten.

35 Er werden fracties van 2,0 ml opgevangen. De samengevoegde fracties 6 26-29 (2.10 eenheden) werden met 4 Bil pyridine/mierezuur verdund en direct op een kolom van 4,6 x 300 mm op basis van een octylgroepen bevattende SiOg matrix (chromegabond 10^um) gegoten. Er werd onder de voor de cyclohexylkolom vermelde omstandigheden geëlueerd. De 40 specifieke activiteit in het centrum van de activiteitspiek was onge- β o n k 7 «1 -7- » « g veer 4·10 eenheden/mg bij een totale opbrengst gezuiverd humaan-fibroblasten-interferon van 10^ eenheden.

Het aan een cocanavalin A-kolom gezuiverde interferon werd bij de HPLC aan een cyclohexylgroepen of een octylgroepen bevattende 5 kolom vlak bij de hoofdpiek geëlueerd. Indien bij de HPLC eerst aan de octylkolom wordt gechromatografeerd, wordt het interferon direct voor de hoofdpiek geëlueerd, terwijl het bij gebruik van een cyclo-hexylkolom als eerste kolom direct na de hoofdpiek wordt geëlueerd.

Monsters van het door HPLC gezuiverde humaan-fibroblasten-10 interferon werden aan 12,5 of 15% NaDodSO^-polyacrylamide-gel in tris/glycine-buffer aan een elektroforese onderworpen (1^ug proteïne). Door kleuren met coomassie blauw werd een afzonderlijke band verkregen. Door een proef op antivirale activiteit werd vastgesteld dat het maximum van deze activiteit in het centrum van de gekleurde 15 band lag. Het molecuulgewicht werd bepaald onder toepassing van rund-serum-albumine, chymotrypsine, eytochroom C en ribonuclease als vergelijkende stoffen en was ongeveer 20.500. De relatieve beweeglijkheid van de humaan-fibroblasten-interferon-band was niet afhankelijk van de aanwezigheid van mercaptoethanol in het monster.

20 Toorbeeld II.

Werkwijze ter verkrijg van de blauw dextraan-sefarose 4B-kolom.

50 g bepakte sefarose 4B werden met 1 liter water gewassen en opnieuw in 50 ml gedestilleerd water gesuspendeerd. Er werden 15 g fijn verdeeld CNBr onder zwak roeren toegevoegd en de pH werd door 25 druppelsgewijs toevoegen van 10 N NaOH op 11 + 0,2 ingesteld. De temperatuur werd door toevoegen van ijs op 20 + 5°C gehouden. Ha 15-20 minuten werd een volumedeel ijswater toe gevoegd en de suspensie werd op een Buchner-trechter opnieuw met 5 volume-eenheden 0,01N HOI gewassen.

30 De geactiveerde hars werd direct in 50 ml 0,4M natriumcar- bonaatbuffer ( pH 9>5)* bevattend 1,00 g opgelost blauw dextraan gesuspendeerd en tot de volgende dag bij 4°0 in een vat met ronde bodem geschud. Er werd met 10 volume-eenheden 1M NaCl, 2 volume-eenheden 50% (7/7) ethyleenglycol, bevattend 1M NaCl en 0,05M na-35 triumfosfaat (pH 7>2), gewassen, tot de volgende dag in 50% (7/7) ethyleenglycol laten staan, met 1 volumedeel 80-procents (7/7) ethyleenglycol en 5 volume-eenheden Gibco Ho. 11 minimaalmedium (MEM) gewassen en in dit medium tot de volgende dag bij 50°c bewaard. Na opnieuw wassen met 3 volume-eenheden 80-procents (7/7) water bevat-40 tend ethyleenglycol, bevattend 1M NaCl, en daarna met 2 volume- -8- eenheden MEM werd de hars in MEM gesuspendeerd en in een kolom gebracht.

Affiniteit-ohromatografie♦

Een mengsel van 1,5 liter onzuiver humaan-fibroblasten-5 interferon ( 2.10^ eenheden/ml; 1 mg proteine/ml; specifieke activiteit 2.10^ eenheden/mg proteïne) en 0,27 volumedeel van een verzadigde NaCl-oplossing (ongeveer 6,3 M) werd in een polypropeen-kolom van 50 ml met een polyetheenfrit, bevattend 35 nil blauw dex-traan-sefarose 4B, bij een doorstromingssnelheid van 100 ml/uur 10 (20 cm/uur) gebracht. De kolom werd na elkaar met 200 ml 1M NaCl, bevattend 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2) en 500 ml 1M NaCl, bevattend 0,05M natriumfosfaat (pH 7,2) en 75 ml ethyleenglycol gewassen en ten slotte met 500 ml 1M NaCl, bevatteid 0,05M natriumfosfaat (pH 7,2) en 250 ml ethyleenglycol geëlueerd. Ongeveer 90%’ 15 van het interferon werd in een enkele piek samen met de doorgegane hoeveelheid van het 50% ethyleenglycol bevattende oplosmiddel geëlueerd. De specifieke activiteit in het piek-maximum waarmede meer n dan 50% van het totale interferon werd geëlueerd was ongeveer 1.10' eenheden/mg.

20 HPIiC

A) 125 ml van de blauw dextraan-sefarose 4B-kolom geëlueerde 7 7 interferonoplossing (3.10 eenheden; 1.10' eenheden/mg) werden op een kolom van 4,6 x 300 mm op basis van een octylgroepen bevattende SiOg-matrix (Chromegabond 10yum) vooraf geëquilibreerd met 1M NaCl/ 25 50% (v/v) ethyleenglycol gepompt. Bij een doorstromingssnelheid van 0,45 ml/min werd uitgaande van buffer A (pyridine/mierezuur/isopro-panol/n-butanol/water, 8s8i20s3»3s60,7, V/Υ) met de volgende gradiënt bij de overgang naar buffer B (pyridine/mierezuur/isopropa-nol/n-butanol/water 8:8:25:20:39, V/V) gehandhaafd: 0-25% B, 30 mi-30 nuten; 25-55% B, 190 minuten; 55-100% B, 20 minuten; 100% B, 60 minuten. De interferon-activiteit kwam hoofdzakelijk overeen met een enkele proteine-pek in de fracties 18-23 (iedere fractie bevatte 1,5 ml elueringsvloeistof).

B) Door toepassing van ongeveer een vierde van de in de trap Δ 35 toegepaste hoeveelheid aan de gelijke kolom onder de voor de cyclo- hexyl-kolom in voorbeeld I beschreven omstandigheden kwam de inter-f eronactiviteit overeen met een pioteine-piek in de fracties 24-26.

C) Onder gelijke omstandigheden met betrekking tot de belading, de gradiënt en de doorstromingshoeveelheid zoals in A) en de gelijke 40 buffers A en B zoals in B) aan een octylgroepen bevattende kolom 800 4361 * * -9- (9>6 x 500 mm, Chromegabond)., zodat 1/9 van de belading per volume&el van de kolom re suit eerde y werd een betere s opleidingskwaliteit bereikt.

D) Het materiaal dat de hoogste specifieke activiteit (4·10^ eenheden/mg) nit trap A) bevatte werd opnieuw gechromatografeerd 5 aan een cyanopropylgroepen bevattende kolom onder toepassing van pyridine/mierezuur/water (8:8:84 * Υ/Υ) en een gradiënt van één uur met betrekking tot n-propanol (0-40%, Y/v) bij een doorstromingssnelheid van 0,5 ml/minuut. Er werd een symmetrische hoofdpiek verkregen.

10 NaDodSO^-polyacrylamide-gelelektr oforese

De elektroforese zoals in voorbeeld I is beschreven van interferonmonsters die volgens de trappen A), b) en C) waren verkregen leverde een hoofdband met een molecuulgewicht van 20.500 op, die in de proef op interferon overeenkwam met het midden van de ac-15 tiviteitspiek. Een tweede band die een molecuulgewicht van ongeveer 10.500 had en 20-500 had en 20-50% van het totale materiaal betrokken op dé kleuringsintensiteii bevatte varieerde van monster tot monster en had een antivirale activiteit. Indien de monsters niet met mercaptoethanol zijn behandeld wordt een band met een molecuul-20 gewicht van 40.000 waargenomen, die echter slechts een ondergeschikte activiteit heeft. De aminozuuranalysen van de banden met de mole-cuulgewichten 20.000 en 40.000 onderscheiden zich niet onderling, terwijl de analyse van de band die een molecuulgewicht van 10.000 heeft zeer duidelijk verschilde.

25 De elektroforese van een volgens werkwijze D) verkregen inter- feronmonster leverde een molecuulgewicht van ongeveer 20.500 en een 0 specifieke activiteit van 4*10 eenheden/mg op. De aminozuuranalyse van dit homogeen peptide leverde na een hydrolyse van 24 uren in 6ïT HC1 de volgende, op leucine met 25,0 betrokken waarden op: 30 asx 15»4 + 0,2 ala 11,8 + 0,4 tyr 9»6 ± 0,2 thr 7>8 + 0,3 cys n. bep. fe 7,3 + 0,1 ser x^ 7,7 + 0,2 val 6,9 + 0,1 his 4»5 + 0,1 glx 24,1 + 0,4 met 2,8 + 0,4 lys 11,6 + 0,4 pro 2,8 + 0,4 ile 8,7 + 0,1 arg 8,8 + 0,4 35 gly 4»9 ± 0,3 leu 25,0 trp n.bep.

x) gecorrigeerde waarde n.bep. niet bepaald.

Yoorbeeld III.

Blauw dextraan sefarose-affiniteit-chromatografie♦ 40 a) 51 van hoeveelheid boven de cultuur, bevattend 19·400 o η n a τ 1 -10- eenheden/ml fibroblaaten-interferon werden door een 0,3^um filter gefiltreerd en daarna op een kolom met 275 ml blauw dextraan-eefa-roae gegoten. i)e hoeveelheid boven de cultuur werd tevoren door toevoeging van 1550 ml van een verzadigde NaCl-oplossing (6,3M) op 1,25 5 M NaCl ingesteld en op de kolom met een door stromingssnelheid van 360 ml/uur gepompt. Ongeveer 4-6% van het interferon passeerden de kolom zonder te worden geadsorbeerd.

b) De kolom werd daarna met een doorstromingssnelheid van 420 ml/uur met 1300 ml van een oplossing in water die 15% (v/v) ethyleen- 10 glycol, 1M NaCl en 0,02 M natriumfosfaat (pH 7,2) bevatte gewassen. Ongeveer 1% van het geadsorbeerde interferon werden van de kolom ge-elueerd.

c) Het interferon werd daarna met een doorstromingssnelheid van 420 ml/uur met een oplossing in water die 50% (v/v) ethyleenglycol, 15 1M NaCl en 0,02 M natriumfosfaat (pH 7,2) bevatte geëuleerd. Met de eerste 200 ml van het eluaat werd een kleine hoeveelheid interferon geëlueerd. Het merendeel van het interferon werd met de volgende 300 ml van het eluaat geëlueerd, zoals uit de volgende tabel bl i j kt; 20 Tabel A.

Fraktieno. Fraktie- Proteine Interferon Spec.activiteit volume (,ug/ml) titer (eenh./mg) (ml) ' (eenh./ml) 1 200 n.bep. 122 5 6 2 50 43 3.8 x 10' 9,02 x 10 25 3 50 82 ll,64x 105 1,42x 107 4 50 63 7,72x 105 1,23 x 107 5 50 62 1,94* 105 3,13 x 106 6 50 49 9,7 x 104 1,97 x 106 7 50 41 3,64x 104 8,87 x 105 30 Er werden in totaal 114% van de interferonactiviteit waarvan was uitgegaan teruggevonden.

HPIiC

De frakties 2-6 van de blauw dextraan-sefarose-kolom (250 7 6 ml; 13.10 eenheden; specifieke activiteit 8,12.10 eenheden/mg) 35 werden op een kolom (9,5x500 mm) op basis van een octylgroepen bevattende Si02-matrixmet een doorstromingssnelheid van 4 ml/min gepompt. In 12 minuten werd buffer A (pyridine/mierezuur/2-propanol/ n-butanol/water, 8:8:20:2,5:61,5, V/V) met een door stromingssnelheid van 2 ml/min door de kolom gepompt. Vervolgens werd met de 800 4361 -11- volgende gradiënt betrokken op de buffer B (pyridine/mierezuur/ 1-propanol/n-butanol/water, 8:8:25:25:34» V/V) met een door stroming s-snelheid van 1,25 ml/min geëlueerd; 0-20% B, 18 minuten; 20-29% B, 57 minuten; 29% B isocratisch gedurende 27 minuten; 29-30% B, 3 mi-5 nuten; 30-100% B, 36 minuten; 100% B, 54 minuten.

De interferonactiviteit werd in het isocratische gebied van de gradiënt geëlueerd, namelijk samen met een piek die met een fluo- g rescamine-systeem werd aangetoond. 45·10 eenheden interferon (op- g brengst 35%) met een specifieke activiteit van 2.10 eenheden/mg 10 werden in de pool samengevat (50 ml) . Na een bewaring van 2 maanden bij -20°C in gesloten polypropeenampullen was de activiteit tot 10% van de waarde volgens HPLC verminderd. Verlies aan proteine trad niet 8 op. Aan deze 50 ml-pool (specifieke activiteit ongeveer 0,2.10 eenheden/mg) werden 1 ml thiodiglycol en 20 ml n.propanol toegevoegd.

15 Door middel van een proef werden voor dit mengsel in totaal 4>26.

g 10 eenheden vastgesteld. Aan het mengsel werden 100 ml 0,1% Triton X-100/0,3% thiodiglycol toegevoegd. Dit mengsel dat volgens de proef in totaal 5»1*10^ eenheden bevat werd binnen 50 minuten op een kolom op basis van een CN-groepen bevattende Si0o-matrix ( 4>é x 250 mm, -6 ά 20 5^um/8.10 mm, sferisorb) geëquilibreerd met een mengsel van pyridine/mierezuur/water (8:8:84, V/V, buffer A) met een doorstromingssnelheid van 1,5 ml/uur gepompt. De volgende gradiënt betrokken op de buffer B ( pyridine/mierezuur/n-propanol/water, 8:8:50:54, V/v) met een doorstromingssnelheid van 0,5 mm/min werd ingesteld: 0-25% 25 D, 30 minuten; 25-50% B, 210 minuten. De interferonactiviteit werd g met de enige vastgestelde piek geëlueerd. Er werden 4»2.10 eenheden (82%) in drie frakties van 1 ml teruggevonden.

Deze pool die 89% van het totale, op de eerste CN-kolom gegoten proteine omvat werd met 2 ml 0,1% Triton X-100 gemengd en op-30 nieuw op dezelfde CN-kolom gegoten. Er werd met een gelijke gradiënt in de helft van de tijd geëlueerd. De totale activiteit (11,75· g 10 eenheden; opbrengst 80%) werd in een enkele piek geëlueerd.

De frakties die de interferonactiviteit van de tweede CN-kolom bevatten (4 ml) werden op een kolom van 4*6 x 250 mm op basis ^ van een bifenylgroepen bevattende SiOg-matrix, die tevoren met een lineaire gradiënt van 2 uren van de buffer A lot de buffer B (gelijke buffers zoals voor de CN-kolom) was voorbehandeld en met buffer A was geëquilibreerd met een doorstromingssnelheid van 1,5 ml/min gepompt .

40 . Er werd de volgende gradiënt met een doorstromingssnelheid van ann*361 -12- 0,5 ml/min toegepast: 0-25% B, 22 minuten; 25-50%, 98 minuten. De tweede piek die werd geëlueerd nadat de gradiënt-inrichting 55% buffer B aanduidde kwam overeen met de interferon-activiteit-piek. Er werden in totaal 2,6.10^ eenheden ( 22%) en 40^ug proteine met deze 5 piek geëlueerd.

De bifenylgroepen bevattende SiOg-kolom werd op de volgende wijze verkregen:

SiOg (10 mm, 10 5 mm poriëngrootte) werd in 6N HCI (10:1, V/G) 24 uren onder af en toe schudden geweekt. Vervolgens werd het 10 SiOg met water neutraal gewassen en daarna werd het water door wassen met aceton en methanol verwijderd. Na drogen onder verminderde druk tot de volgende dag werd het kiezelzuur (10 g) in 100 ml droeg tolueen, dat 10 ml dichloorbifenylsilaan bevatte 6 uren onder terug-vloeikoeling verhit. Het op deze wijze gemodificeerde kiezelzuur· 15 werd eerst met 200 ml tolueen gewassen en daarna in een soxhlet-ex-tractor na elkaar met 250 ml tolueen, aceton en methanol telkens 8 uren behandeld. Ten slotte werd de behandeling met trimethylchloor-silaan op de tevoren vermelde wijze uitgevoerd.

Telkens 5 S van het als drager gebruikte materiaal werden ver-20 volgens in 10,7 nil chloroform en 2,5 ml n-butanol gesuspendeerd en met de suspensies werden kolommen van 4,6 x 550 mm van roestvrij staal onder een druk van 540 atm gevuld. De kolommen werden vervolgens met 75 ml ethanol gewassen.

Aminozuuranalysen van de middenfraktie van de verkregen inter-25 feron-piek na hydrolyse in 5,7 N ÏÏC1 leverden de volgende resultaten op:

Tabel B.

asx 15,4 17,6 17,95 15,2 thr 7.8 8,6 8,4 7,5 ser 30 7,7 8,5 9,1 9,9 glx 24,1 21,1 21,4 n.b. pro 2.8 n.b. n.b. 5,36 gly 4.9 6,9 6,6 7,4 ala 11.8 10,7 10,7 9,9 cys 35 n.b. 5,96 5,4 n.b. val 6.9 7,84 8,2 6,9 met 2.8 4,5 4,5 3,7 ile 8,7 8,6 8?9 7,8 leu 25,0 25 25 ^ 25xx^tyx 40 9,6 10,5 9,0 8,1 fe 800 4 3 61 -13- vervolg tabel B.

7,3 9,5 9,8 9,0 his 4,5 7,5 6,9 6,1 lys 11,6 12,3 11,8 11,25 arg 5 8,8 11,25 10,6 8,8 trp n.b. n.b. n.b. 2,93 24 uren 24 uren 48 uren 24 uren

TGZ TGZ TGZ TGZ

TGZ thioglycolzuur 10 x) niet-gecorrigeerde waarde xx) referentiewaarde n.b. niet bepaald

Hexosamineanalysen na hydrolyse van het interferon met 5>7N HCl bevattend 0,02% thioglycolzuur bij 110°G na 6, 14 en 24 uren onder toepassing van de middenfraktie van de interferonpiek van de bifenylkolom leverden drie glucosamineresten per molecuul op. Er werd nah galactosamine noch manosamine gevonden. De bepaling van eindgroepen werd met een monster van 90 pmol uit de middenfraktie van de interferonpiek van de bifenylkolom uitgevoerd en leverde 20 "met' als N-terminaal aminozuur op.

Monsters van 150 pmol zowel van fibroblasten-interferon als van leucooyten-interferon werden aan de tryptische ontleding onderworpen en nagechromatografeerd. In de beide monsters werden geen identieke peptidefragmenten gevonden.

25 Door sequensering van een monster van 1,25 nmol van fibroblas ten-interferon werd"me-i' als N-terroinaal aminozuur bevestigd en ook de door Hunkapillar en Hood, Biochemistry 2124 (1978) gepubli- 3 10 ceade sequens 3-10, namelijk tyr -asn-leu-leu-gly-fe-leu-gln .

Sequensering van een ander monster van 5,9 nmol van fibroblasten- 30 interferon leverde de volgende N-terminale aminozuursequens op: 1 5 10

HgN-met -ser-tyr-asn-leu -leu-gly-fe-leu-gln -arg-ser-ser-asn- f e ^ ^-gln-... gln-lys ...

Voorbeeld 17.

Onzuiver interferon werd uit humane fibroblasten (. Ceq-iijn gm 35 2504A) gewonnen. Het onzuivere material werd door toevoeging van een verzadigde natriumchlorideoplossing op 1M betrokken op natrium-chloride ingesteld. Dit materiaal werd door een kolom van blauw sefarose-4B (volume 20-25 ml, diameter 2»'5 cm, doorstromingssnelheid 2,5 ml/min) geleid. Tijdens het beladen werd het onzuivere ma-40 teriaaL met ijs gekoeld. Na het beladen werd de kolom met 250d. van oAiuui -14- de volgende oplossing (2,5 ml/min) gewassen: 50% ethyleenglycol, 1M NaCl, 50 mM NagHPO^ ( pH 7,2).

Ten slotte werd het interferon met een doorstromingssnelheid van 2,5 ml/min met 250 ml van de volgende oplossing geëlueerd: 5 50% ethyleenglycol, 1M NaCl, 50 mM Ï^HPO^ ( pH 7,2).

Typische resultaten van de proef waren: 5% activiteit in de doorgestroomde hoeveelheid 10% activiteit in de 50-gew.procents ethyleenglycoloplossing 85% activiteit in de 50-gew.procents ethyleenglycoloplossing.

10 De frakties van de interferonpiek uit de eerste blauw sefarose- kolom werden samengevoegd en met de volgende oplossing op een ethy-1eenglycolgehalte van 10% (Υ/Υ) gebracht: 2M NaCl, 50 mM NagHPO^ (pH 7,2).

Dit materiaal werd op een’ blauw sefarose-kolom gegoten (volume 15 20-25 ml, diameter 2,5 cm, doorstromingssnelheid 2,5 ml/min). Er werd met 250 ml van een oplossing gewassen die 2M NaCl, 50 mM NaJIPO^ (pE 7m2) en 50% (Υ/Υ) ethyleenglycol bevatte en er werd geëlueerd met een oplossing die 2M NaCl, 50 mM Na2HP0^ (pH 7,2) en 50% (y/y) ethyleenglycol bevatte.

20 Typische resultaten van de interferon-proef waren: 10% activiteit in de doorgestroomde hoeveelheid 50% activiteit in de 50-procents ethyleenglycoloplossing 60% activiteit in de 50-procents ethyleenglycoloplossing.

HPIiC

25 Eerst erd het monster van het 50-procents (Y/Y) ethyleenglycol- eluaat van blauw sefarose onderzocht. Daarna volgden monsters die twee keren door de blauw sefarose-kolom waren . geleid waarbij de 50-procents of de 50-procents ethyleenglycoleluaten konden worden gebruikt.

50 Er werd een kolom van 25 x 0,46 cm op basis van een door oc- tylgroepen gemodificeerde SiC^-matrix (Lichrosorb RP-8) gebruikt.

De kolom werd eerst met water gewassen en daarna met het eluaat van de blauw sefarose-kolom beladen. Yodr de pomp was een mengkamer (5ml) geschakeld. Er werd met een doorstromingssnelheid van 22 ml/ 35 uur met de volgende trapsgewijze gradiënten van n-propanol bij een constante, door 1M mierezuur/0,8M pyridine gehandhaafde pH van 4,2 gewerkt: 0% 10 min; 50% 40 min; 52% 40 min.

Ten slotte werd de kolom met 60-gew.procents n-propanol gewas-

40 sen en voordat de kolom opnieuw werd gebruikt werd de kolom met 1M

800 4 3 61 -15- mierezuur en 0,8 M pyridine geëquilibreerd.

Het interferon werd met het 32-procents n-propanoleluaat (tussen 80 en 90 minuten) geëlueerd. Dit materiaal was homogeen op grond van de UaDodSO^-acrylamide-gelelektroforese (kleuring met coomassie 5 blauw of markering vooraf van het monster met Fluram).

Aminozuuranalysen ( hydrolyse van 24 uren, 0,2% TGZ, 5>7® HCl) werden met negen verschillende monsters van vier verschillende preparaten uitgevoerd. De gemiddelde aminozuursamenstelling betrokken op een leucinewaarde van 22,0 blijkt uit de volgende tabel: 10 Tabel C.

asx 15,1 ± 0,7 met 4,5 ± 0,7 thr χ) 7,0 + 0,5 ile 9,4 ± 0,1 ser 7,5 ± 0,5 leu 22,0 gly 22,2 + 0,5 tyr 8,8 + 0,2 15 pro niet bepaald fe 8,0+0,3 cys 3,0 + 0,3 his 4,5 ± 0,1 gly 6,9 + 0,7 lys 11,0 + 0,6 ala 7,4+1,0 arg 11,9+0,7 val 5,7 + 0,5 trp niet bepaald 20 x) niet gecorrigeerde waarde.

Gebaseerd op de in verschillende tijden uitgevoerde analysen van een aantal monsters die volgens verschillende in dit voorbeeld en in de tevoren vermelde voorbeelden beschreven werkwijzen zijn verkregen (hydrolyse van 24 uren in 6H HCl met 0,2% thioglycolzuur, 25 TGZ), heeft homogeen humaan-fibroblasten-interferon de volgende ami-nozuursamenstelling (+ 15%):

Tabel D.

asx 15,1 gly 6,9 tyr 8,8 thr x) 7,0 ala 7,4 fe 8,0 30 ser x^ 7,5 val 5,7 his 4,5 glx 22,2 met 4,5 lys 11,0 pro 3,0 ile 9,4 arg 11,9 cys 3,0 leu XX^ 22,0 trp 3,0 x) niet gecorrigeerde waarde 35 χχ) referentiewaarde

Voorbeeld 7.

Homogeen humaan-fibroblasten-interferon (1,5 mg) met een specifieke activiteit van 4·10® eenheden/mg werd in 25 ml 5-piocents normaal humaan-serumalbumine opgelost. De oplossing werd door een bac-40 teriologisefce filter gefiltreerd en over 100 aseptische ampullen 0 0 0 4 3 61 -16- verdeeld. Elke ampul bevatte 6.10 eenheden zuiver interferon dat geschikt was voor de parenterale applicatie. De ampullen werden tot het gebruik daarvan bij voorkeur in de koude (bij -20°C) bewaard.

(conclusies) 800 43 61

Claims (16)

1. Humaan-fibroblasten-interferon als homogeen proteine, g e-kenmerkt door 0 a) een specifieke activiteit van ongeveer 4·10 eenheden/mgj 5 b) een molecuulgewicht van ongeveer 20.500 volgens de natrium-dodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese; c) de volgende relatieve aminozuursamenstelling (+ 15%) gebaseerd op een hydrolyse van 24 uren in 6,0 U HC1 dat 0,2% thioglycol-zuur bevat (betrokken op een waarde voor leucine van 22,0)i 10 asx 15»1 gly 6,9 tyr 8,8 thr x) 7,0 ala 7,4 fe 8,0 ser x) 7,5 val 5»7 his 4,5 glx 22,2 met 4,5 lys 11,0 pro 3»0 ile 9,4 arg 11,9 ^ cys 3)0 leu 22,0 trp 3)0 x) niet-gecorrigeerde waarde. d) de gedeeltelijke aminozuur-sequens 1 ^ 10 HrtlT-met -ser-tyr-asn-leu^-leu-gly-fe-leu-gln -arg-ser-ser- ^15 19 asn-fe -gin-... gln-lys -.... en 20 e) ten hoogste drie gluco^amineresten, 0 galactoseamine- en 0 man- no^mineresten per molecuul.

2. Humaan-fibroblasten-interferon volgens conclusie 1, voor de behandeling van virale en neoplastische ziekten.

3. Werkwijze voor de bereiding van humaan-fibroblasten-inter-25 feron als homogeen proteine, met het kenmerk, dat men A. een oplossingswater van humaan-fibroblasten-interferon in onzuivere toestand in een affiniteit-chromatografie-kolom brengt waaraan het interferon wordt geadsorbeerd, het interferon elueert en het interferon in bepaalde frakties van het eluaat in een gro- 30 tere zuiverheid verkrijgt en B. de verkregen interferonfrakties onder HPLC-omstandigheden door een of meer met een buffer geëquilibreerde chromatografiekolommen op basis van een cyclohexyl-, fenyl-, difenyl-, octyl-, octadecyl- of cyanopropylgroepen bevattende Si02-matrix leidt, waarbij het inter- 35 feron wordt geadsorbeerd en telkens met een gradiënt van met water mengbare oplosmiddelen in een gebufferd zuur water bevattend systeem elueert, zodat het interferon in de vorm van een enkele karakteristieke piek in bepaalde frakties van het eluaat wordt verkregen. 40

4· Werkwijze voor de bereiding van humaan-fibroblasten-inter- 800 4 3 61 -18- feron als homogeen proteïne, met het kenmerk, dat men A. een oplossing in water van humaan-fibroblasten-interferon in onzuivere toestand in een affiniteit-chromatografie-kolom brengt waaraan het interferon wordt geadsorbeerd, het interferon elueert 5 en het interferon in bepaalde frakties van het eluaat in een grotere zuiverheid verkrijgt en B. de verkregen interferonfrakties onder HPLC-omstandigheden door een of meer met een buffer geëquilibreerde chromatografiekolommen op basis van een cyclohexyl-, fenyl-, octyl-, octadecyl- of cyano- 10 propylgroepen bevattende SiOg-matrix leidt, waarbij het interferon wordt geadsorbeerd en telkens met een gradiënt van met water mengbare oplosmiddelen in een gebufferd zuur water bevattend systeem elueert, zodat het interferon in de vorm van een enkele karakteristieke piek in bepaalde frakties van het eluaat wordt ver- 15 kregen.

5· Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men de affiniteit-chromatografie aan concanavalin A-sefarose en de HPLC-werkwijze eerst aan een cyclohexylgroepen bevattende SiOg-kolom met een stijgende n-butanol—gradiënt in een mengsel van pyri- 2o dine/mierezuur/2-propanol/n-butanol/water en daarna aan een octyl -groepen bevattende SiOg-kolom onder giijke omstandigheden uitvoert.

6. Werkwijze volgens conclusie 5» m e t het kenmerk, dat men bij de HPLC-werkwijze een beginsamenstelling van het als elueermiddel gebruikte mengsel van 8:8:20:0:64, V/V en een eindsa- 25 menstelling daarvan van 8:8:25:20:59» V/V, toepast.

7. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men de affiniteit-chromatografie aan blauw dextran^sefarose en de HPLC-werkwijze aan een octylgroepen bevattende SiOg-kolom met een stijgende n-butanol-gradiënt in een mengsel van pyridine/miere- 20 zuur/2-propanol/n-butanol/water uitvoert.

8. Werkwijze volgens conclusie 7,met het kenmerk, dat men bij de HPLC-werkwijze een beginsamenstelling van het als elueermiddel gebruikte mengsel van 8:8:20:3,3:60,7, V/V, en een eind-samenstelling daarvan van 8:8:25:20:39» V/V toepast. 25

9· Werkwijze volgens conclusie 7» met het· kenmerk, dat men de van de octylgroepen bevattende SiOg-kolom geëlueerde samengevoegde interferon-active frakties vervolgens aan een eyclo-propylgroepen bevatttende SiOg-kolom opnieuw chromatografeert met een stijgende n-propanol-gradiënt in een mengsel van pyridine/mie- 40 rezuur/n-propanol/water. 800 4361 'i- ..Jf -19-

10. Werkwijze volgens conclusie 9> m e t het kenme rk, dat men een beginsamenstelling van het als elueermiddel gebruikte mengsel van 8:8:0:84» Y/Y en een eindsamenstelling daarvan van 8:8:40:44» Y/Y toepast.

11. Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenme rk, dat men bij de EPLC-werkwijze een beginsamenstelling van het als elueermiddel gebruikte mengsel van 8:8:20:0:64» Y/Y en een eindsa-menstelling daarvan van 8:8:25:20:39» Y/Y toepast.

12. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenme rk, 10 dat men de van de cyclopropylgroepen bevattende SiOg-kolom geëlueer- de samengevoegde interferon-actieve frakties aan dezelfde kolom opnieuw chromatografeert en vervolgens aan een difenylgroepen bevattende Si02“kolom chromatografeert.

13. Werkwijze volgens conclusie 4»met het kenme rk, 15 dat het onzuivere humaan-fibroblasban-interferon afkomstig is van een serumvrij preparaat, dat de affiniteit-ehromatografie aan blauw sefarose 4B en de ÏÏPLC-werkwijze aaneen octylgroepen bevattende SiOg-kolom met een mengsel van pyridine/mierezuur/n-propanol/water en met een discontinue trapsgewijze n-propanol-gradiënt wordt uitge-20 voerd.

14· Werkwijze volgens conclusie IJ, 1 e t het kenmerk, dat men de volgende n-propanol-gradiënt (y/y) toepast: 10 minuten 0%, 40 minuten 30% en 40 minuten 32%, waarbij het interferon tussen de 80ste en 90ste minuut wordt geëlueerd. 25

15· Werkwijze voor de bereiding van farmaceutische preparaten, met het kenmerk, dat men homogeen humaan-fibroblasten-interferon volgens conclusie 1 of verkregen volgens conclusies 3-14 met gebruikelijke toevoegsels en dragers in een daartoe geschikte vorm brengt.

16. Farmaceutische preparaten op basis van een homogeen humaan- fibroblasten-interferon. 800 4 3 61