DE3024270A1

DE3024270A1 - Masse zur bestimmung von menschlichem erythropoietin und deren anwendung

Info

Publication number: DE3024270A1
Application number: DE19803024270
Authority: DE
Inventors: Takashi Ogura; Tetsuo Tomiyama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1979-06-28
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1981-01-22
Also published as: GB2053469A; JPS6333103B2; GB2053469B; DE3024270C2; JPS566161A; FR2460482A1; FR2460482B1; US4321058A

Description

V. 43731/80 - Ko/He

Seikagaku Kogyo Co., Ltd. . Tokyo (Japan)

Masse zur Bestimmung von menschlichem Erythropoietin

und deren Anwendung

Die Erfindung betrifft eine Masse zur Bestimmung von menschlichem Erybhropoietin, ein Verfahren für deren Herstellung sowie deren Anwendung zur Bestimmung de,«? menschlichen Erythropoietins.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Masse zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins, dessen Anwendung im Gegensatz zu den äusaerst komplizierten, zeitraubenden und kostspieligen bisher angewandten biologischen Yersuchsmassnahmen es ermöglicht, sowohl quantitativ als auch qualitativ mit Genauigkeit und Exaktheit das in einer Flüssigkeitsprobe enthaltene menschlische Erythropoietin mittels einfacher Versuchstaassnarimen unter

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Anwendung eines einfachen Instrumentes zu bestimmen. Ausserdem ermöglicht es die Ausbildung einer genauen ätiologischen Analyse von anämischen Patienten sowie eine Bewertung der Ergebnisse vorgenommener therapeutischer Behandlungen und die Erstellung einer Prognose der Krankheit. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der vorstehenden Hasse sowie ein Verfahren zu deren Anwendung zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins.

Spezifisch befasst sich die Erfindung mit einer Kasse zur Bestimmung von menschlichem Erythropoietin, welche im wesentlichen aus synthetischen polymeren Latex^teilchen, vorzugsweise Teilchen von synthetischem polymereja Latex vom Styroltyp aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten Produkten oder aminhaltigen carboxylierten Produkten derselben, besteht, mit einem Verfahren zur Herstellung der Kasse und der Anwendung der Kasse.

Die Lebensdauer menschlicher Erythrocyten beträgt etwa 120 Tage und 1/120 der gesamten Erythrocyten werden täglich in dem Reticulo-Endothelial-System zerstört. Gleichzeitig wird die gleiche Anzahl an Erythrocyten gebildet, um die Anzahl der Erythrocyten stets konstant zu halten.

Die Erythrocyten werden durch die Seifung und Differenzierung der Erythroblasten in dem Knochenmark gebildet und Erythropoietin ist ein Paktor, welcher durch Einwirkung auf die undifferenzierten Stammzellen deren Differenzierung zu Erythrocyten einleitet. Die Ausscheidung von Erythropoietin wird beschleunigt, wenn ein Abfall im Sauerstoffpartialdruck der Körpergewebe auftritt« Somit ist Ery-

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thx-opoietin ein Humoralhormon, welch.es die Anzahl der Erythrocyten steuert, die im Knochenmark gebildet werden.

Im Pail von Säugetieren wird die Gesamtheit oder ein grosserer Teil dieses Erythropoietins durch die Niere durch, ein Sialinsäure enthaltendes Glycoprotein gebildet» dessen Molekulargewicht auf etwa 27 000 bis 66 000 geschätzt wird.

Die Störungen, bei denen die menschlichen Erythrocyten abnehmen, d. h. Anämien, können grob ätiologisch in drei Arten unterteilt werden. Die ersts Art ist diejenige, wo die Stammzellen, der Ursprung der Erythrocyten, anomal sind, so dass die Erythrocyten nicht gebildet werden können, selbst wenn die Produktionsfähigkeit des Erythropoietins normal ist, d. h. die aplastische Anämie. Diese Anomalie der Stammzellen kann weiterhin in solche.. Fälle unterteilt werden, wie die Hypoplastie des Knochenmarks, die Anomalie des Knochenmarks selbst, die Unzulänglichkeit der Stellen, wo die Erythrocyten gebildet werden und den Abfall der Reaktivität für Erythropoietin. Im Fall der anämischen Störungen dieser Art tritt der Mechanismus des Körpers, der zu einer Erhöhung der Anzahl der Erythrocyten tendiert, in Wirkung, so dass die Menge des Erythropoietins einen extrem oder abnormal hohen Wert zeigt. Die zweite Art der Anämie ist diejenige einer chronischen Renalinsuffizienz, d. h. Anämie der Eenalkrankheiten. Da in diesem FaI dies eine organische Störung der Nieren, der Erzeuger des Erythropoietins_?darstellt, kann Erythropoietin nicht gebildet werden, selbst wenn die Stamczellen normal sind. Deshalb kann keine Erhöhung der Anzahl, der Erythrocyten 'stattfinden, so dass sich eine

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• (θ'

inämie ergibt. In diesem Fall ist in der Flüssigkeit lediglich, eine niedrige Konzentration an Erythropoietin vorhanden. Die dritte Art der Anämien ist der Fall, wo sowohl die Stammzellen als auch die Erythropoietin-Prodüktivitätsfähigkeit normal sind, wobei der anämische Zustand auf Eisenmangel, Hämorrhage, Vitamin B^-Mauagel, auf Autoimmunität zurückzuführende Hämolyse und dgl. zurückzuführen ist. In diesem Fall zeigt der Betrag des Erythropoietins einen hohen Wert und eine negative Beziehung zur Menge des Hämoglobins.

Während die Anämien selbst" leicht durch eine Zählung der tatsächlichen Anzahl der Erythrocyten, die Bestimmung des Hämatocytenvolumsns nach dem Hämatocritverfahren oder die Bestimmung des Hämoglobins leicht diagnostiziert werden können, ist die Diagnose der Ursache des anämischen Zustande s, ob nämlich die Ursache der Störung auf eine Anomalie der Stammzellen zurückzuführen ist, ob sie auf eine unzureichende Produktion von Erythropoietin auf Grund von Eenalstörungen zurückzuführen ist oder ob die Ursache auf andere Gründe ausser den vorstehenden Ursachen zurückzuführen ist, äusserst wichtig bei der Aufstellung der Behandlungsvorschrift und bei der Erstellung einer Prognose der Krankheit. In jedem Fall ist eine Bestimmung des Erythropoietins in der Körperflüssigkeit für diesen Zweck unerlässlich.

Das bisher zur Bestimmung angewandte Verfahren war jedoch ein biologisches Verfahren, das sowohl kompliziert als auch zeitraubend und kostspielig war. Bei diesem Verfahren wird die Menge des Erythropoietins in folgender Weise berechnet. Polythythemische Mäuse oder hungernde Batten werden mit Erythropoietin indiziert, worauf dann

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eine Injektion mit ?*$e erfolgt. Die Menge des Erythropoietins wird aus der Geschwindigkeit berechnet, mit der das ^°Fe in die Erythrocyten aufgenommen wird. Obwohl dieses Verfahren eine ganz ausgezeichnete Spezifität hat, bestehen solche Nachteile, dass eine grosse Anzahl von Tieren während eines langen Zeitraumes gezüchtet werden auss und dass ein Isotop verwendet wird. Darüberhinaus erfordert das Verfahren erhebliche Arbeit und Kosten. Es ist deshalb schwierig, es bei den klinischen Untersuchungen anzuwenden.

Zur Verminderung dieser Nachteile und Störungen wurde ein Verfahren entwickelt, welches darin besteht, dass die Erythrocyten vorhergehend mit menschlichem Erythropojetin überzogen werden und anschliessend der Antierythropoietin-Antikörper mit dem in der Probe enthaltenen Erythropoietin neutralisiert wird und anschliessend diese sensibilisierten Hämatocyten zur Durchführung der Hemmung.der Antigen-Antikörper-Agglutinierungsreaktion verwendet werden und eine Bestimmung aus den erhaltenen Ergebnissen vorgenommen wird. Da jedoch bei diesem Verfahren die Notwendigkeit zur Entfernung des nicht-spezifischen Hämagglutins, welches im menschlichen Serum enthalten ist, besteht, muss eine Sehandlung zur Absorption des Hämagglutins vorgenommen werden. Ferner muss ein Test, der die Entfernung bestätigt, unvermeidlich ausgeführt werden.

Die vorliegenden Untersuchungen wurden im Hinblick auf die Lösung dieser Schwierigkeiten der üblichen Verfahren und zur Entwicklung eines Verfahrens durchgeführt, bei dem leicht das menschliche Erythropojetin spezifisch mit guter Genauigkeit und innerhalb eines relativ kurzen

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Zeitraumes gemessen werden kann. Es wurde bei diesen Untersuchungen festgestellt, dass synthetische polymere Latexteilchen oder Teilchen aus einem synthetischen polymeren Latex vom Styroltyp, die mit gereinigtem menschlichem Erythropoietin (Antigen) überzogen sind» leicht gebildet werden können und dass bei Anwendung dieses Latex als Vereuchsprobe das in der Körperflüssigkeit enthaltene Erythropoietin leicht und mühelos mit guter Genauigkeit durch die passive Latex-AgglutinieruDgshemmreaktion bestimmt werden kann, ohne dass solche Vorbehandlungen, wie Absorption der Flüssigkeiten, wie Serum und Urin, mittels eines Trägers notwendig sind.

Da der mit Erythropoietin (Antigen) überzogene Latex eine Agglutinierung durch Reaktion mit dem Antierythropoietin-Antikörper erleidet, findet eine Agglutination des mit Antigen überzogenen Latex nicht statt, falls dieser Antikörper vorhergehend mit dem in der Probe enthaltenen Antigen neutralisiert wurde. Falls die Probe kein Antigen enthält, kann der Antikörper nicht neutralisiert werden. Infolgedessen findet die Agglutinierung des mit Antigen überzogenen Latex infolge dieses Antikörpers statt. Dadurch wird es möglich, die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antigene mittels der passiven Latex-Agglutinierungs-Hemmreaktion zu bestimmen.

Somit wird es mittels eines Verfahrene, welches in der Zugabe vorgeschriebener Mengen des Antikörpers zu fortschreitend verdünnten Proben zwecks Neutralisation des in der Probe enthaltenen Erythropoietina und der anschlieBeenden Zugabe des mit Antigen überzogenen Latex und der Beobachtung des Agglutinierungs-Heaktionstausters, besteht,

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welches durch diesen Latex und den unneutralisiert verbliebenen Antikörper gebildet wurde, möglich, leicht die Menge des Erythropoietins zu bestimmen.

Bis jetzt gibt es keine Vorschläge hinsichtlich einer derartigen Kasse zur Bestimmung von menschlichem Erythropoietin, noch für eine Masse, die im wesentlichen aus synthetischen polymeren Latexteilchen und auf der Oberfläche dieser Latexteilchen aufgezogenen menschlichen Erythropoietin besteht.

Weiterhin wurde gefunden, dass diese Hasse mit einem Antierythropoietin-Antikörper reagiert, welcher zu der Versucheprobe zugegeben wurde, und nicht im mindesten mit anderen Antikörpern reagiert, die in der Probe oder dem Plasmaprotein vorliegen können. Aus der Tatsache, dass die unüberzogenen Latexteilchen überhaupt nicht mit dem Antierythropoietin-Antikörper, anderen Antikörpern oder Plasmaprotein reagieren, ist zu schliessen, dass das Erythropoietin an die Latexteilchen gemäss der Erfindung als Antigen gebunden wird. Es wurde dabei gefunden, dass die Bestimmung des menschlichen Erythropoietins gemäss der vorliegenden Erfindung leicht und mit überlegener Genauigkeit ausgeführt werden kann, ohne dass es notwendig ist, die Versuchsprobe irgendwelchen Vorbehandlungen oder !Testen zur Bestätigung derartiger Behandlungen zu unterwerfen, sondern dass durch die Anwendung einfacher Arbeitsgänge und Instrumente der Erfolg erreicht werden kann, indem eine Körperflüssigkeit oder eine Verdünnung hiervon in eine Vertiefung einer Mikroplatte gebracht wird, hierzu ein zur Anwendung bei der Immunisierung hergestellter Antierythropoietin-Antikörper zugesetzt wird und an-

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schliessend die Kasse gemass der Erfindung tropfenweise zugegeben wird.

Eine Aufgabe der Erfindung bestellt deshalb in einer neuen und ausgezeichneten Masse zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins, einem Verfahren zur Herstellung derselben und der Anwendung dieser Masse.

Die'vorstehenden und weiteren Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Verschiedene synthetische Latexteilchen können zur Herstellung der Masse zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins gemäss der Erfindung verwendet werden. Beispier.e für Polymere oder Copolymere, welche derartige Lateye bilden, umfassen beispielsweise Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, aminhaltiges carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol-Butadien-Copolymere, carboxyliertes Styrol-Butadien-Copolymere, Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, Vinyltoluol-tert.-Butylstyrol-Copolymere, Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylnitril , Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymere, Polyvinyl acet at- Acrylat, Polyvinylpyrrolidion und Vinylchlorid-Acrylat-Copolymere.

Dio bevorzugten Teilchen aus synthetischen polymeren Latexen sind Teilchen synthetischer Polymerlatexe vom ßtyroltyp aus der Gruppe von Styrolpolyiaeren, Styrolcopolymeren, wie Copolymeren von Styrol mit einem Monomeren aus der Gruppe von Chlortyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid und carboxyliert^ oder aminhaltige carboxyliert Produkte hiervon. Diese synthetischen Polymerlatexteilchen können nach einer Vorbehandlung

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ihror Oberflächen mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel verwendet werden. Beispielsweise wird es bevorzugt, diese !Teilchen zu verwenden, nachdem ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxidtyp hieran gemäss dem in der japanischen Patent-Veröffentlichung 9716/76 beschriebenen Verfahren absorbiert wurde. Beispiele für geeignete nicht-ionieche oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxidtyp sind Blockcopolymere von Äthylenoxid und Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylenalkyläthern und Polyoxyäthylenalkylaryläthern.

Gemäss der Erfindung haben die synthetischen Polymerlatexteilchen vorzugsweise einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von O₁OI bis 10/um, stärker bevorzugt 0,1 bis 1 /Uia. Zur Erhöhung der Eeproduzierbarkeit der Ergebnisse der Bestimmungen wird es bevorzugt, Teilchen innerhalb eines relativ engen Bereiches, beispielsweise eines Bereiches von 0,2 + 0,005, hinsichtlich der Grössenverteilung anzuwenden. Bas spezifische Gewicht der Latexteilchen beträgt vorzugsweise etwa 0,9 bis 1,4, und stärker bevorzugt etwa 1,1 bis 1,3· ialls die Bestimmung unter Anwendung einer Agglutinierreaktion auf einer Mikroskopglasplatte ausgeführt wird, können Latexteilchen mit einem breiten Bereich des spezifischen Gewichtes verwendet werden. Im Fall eines Mikrotiter-Verfahrens wird es bevorzugt, Latexteilchen mit einem spezifischen Gewicht von mindestens 1,1 einzusetzen.

Das menschliche Erythropoietin, welches gemäss der Erfindung zur Erzielung der Masse, die aus synthetischen polymeren Latexteilchen und menschlichem auf der Oberfläche der Latexteilchen aufgezogenem Erythropoietin aufgebaut

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ist, finden sich, in solchen Körperflüssigkeiten, wie Blut und Urin. Obwohl es möglich ist, sowohl Blut als auch Urin als Ausgangsmaterial gemäss der Erfindung einzusetzen, ist Urin besonders geeignet, da er eine Ausscheidung darstellt und somit leicht zur Verfügung steht. Wie in Journal of Biological Chemistry, Band 252, Seite 5558-5564-(1977) angegeben, können sämtliche bekannten Hassnahmen, wie Äthanol-Ausfüllung, Aceton-Ausfällung, Gerbsäure-Ausfällung, Lithiumoxid-Ausfällung, Aussalzung mit Ammoniumsulf et, Gelfiltration, DEAE-Cellulose-Chromatographie, Polyacrylamidgel-Ohromatogreiphie und Kaolin-Adsorption und Dissoziation - zur Herstellung von Erythropoietin aus den vorstehenden Ausgangsmaterialien angewandt werden.

Da Erythropoietin eine Erhitzung auf beispielsweise 100° C während 15 Minuten aushalten kann, ist es auch wirksam, das Material einer wärmebehandlung bei beispielsweise etwa 80 bis 100° C während etwa 10 bis etwa 15 Minuten vor seiner !Reinigung zu unterziehen, so dass ein Grossteil der anderen gegebenenfalls vorhandenen Proteine wärmemodifiziert werden. Das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Erythropoietin kann eines sein, welches nach einem der vorstehend aufgeführten Verfahren oder Kombinationen hiervon erhalten wurde. Jedoch wird es bevorzugt, dass es ein einziges Protein von hoher Reinheit ist, da die Möglichkeit für Nebenreaktionen besteht, falls die Reinheit niedrig ist.

Der Antikörper kann durch Anwendung des in dieser Weise erhaltenen gereinigten Erythropoietins als Antigen und Immunisierung von Tieren mit der Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern in üblicher Weise, wie Ziegen, Kaninchen und

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Meerschweinchen, durch Inokulierung dieser Tiere mit dem Erythropoietin mit anschliessender Abnahme des Blutes derselben erhalten werden. Sämtliche Tiere können in diesem Fall verwendet werden, sofern sie solche sind, worauf der Antikörper leicht erhalten werden kann.

' Es besteht infolgedessen keinerlei Beschränkung hinsichtlich der Klasse der zu verwendenden Tiere.

Die Masse zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins gemäss der Erfindung kann nach einem einfachen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann sie erhalten werden, indem die Latexteilchen und das Antigen (Erythropoietin) in Wasser, einer physiologischen Salzlösung oder verschiedenen Pufferlösungen von pH 5,5 bis 10, vorzugsweise pH 6,4 bis 7»6. bei etwa 4° bis etwa 40° C während etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden unter gelindem Rühren vorzugsweise mit Konzentrationen der Latexteilchen von 0,05 bis 3 % und Konzentrationen des Antigens von 50 bis 1000 miu/ml kontaktiert werden.

Der verwendete Puffer kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung, wie z. B. M/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15M NaCl (abgekürzt PBS) oder glycingepufferte Salzlösung sein.Gewünschtenfalls können etwa 0,01 bis etwa 0,1 % eines Proteins, wie £)chsenserum-Albumin (abgekürzt BSA) vorzugsweise zu der Antigenlösung zugesetzt werden, um eine nicht-spezifische Agglutinierung zu verhindern. Nach der llberzugsresktion wird das Eeaktionsgemisch mit einem wässrigen Lösungsmittel gewaschen. Das nicht an den Latexteilchen adsorbierte Antigen kann vollständig

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durch Väschen der Teilchen beispielsweise mit derartigen Puffern entfernt werden. Wiederum wird es empfohlen, dass der Latex in einem Verdünnungsmittel suspendiert wird, um den nicht vom -Antigen überzogenen !Teil der Latexteilchen mit Protein gesättigt zu halten.

Als Verdünnungsmittel wird eine Losung, welche durch Zusatz von etwa 0,1 % BSA zum beispielsweise einer glycingepufferten Natriumchloridlösung oder einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung erhalten wurde, wozu weiterhin 0,01 bis 0,5 % Natriumazid (FaITz) zugegeben wurde, verwendet.

Der in dieser Weise erhaltene mit Antigen überzogene Latex kann in einem Kühlschrank suspendiert in einem Verdünnungsmittel mit einer Eonsentration von beispielsweise etwa 0,25 Gew.% gehalten werden oder er kann lyophilisiert werden. Bei der Ausführung der Lyophilisierung können verschiedene Aminosäurer», insbesondere solche Aminosäuren wie Glycin und Natriumglutamat, und/oder Dextran in solchen Mengen wie 0,2 bis 2 Gew.% im Pail der Aminosäuren und 0,3 bis 3 Gew.% im Fall des Dextrans zu dem Verdünnungsmittel als Stabilisatoren zugegeben werden, worauf der antigenüberzogene Latex in flüssigen Stickstoff oder flüssiger Luft rasch gefroren werden kann.und dann lyophilisiert wird. Der Aufbewahrungszeitraum wird weiterhin durch die Lyophilisierung verlängert und der lyophilisierte antigenüberzogene Latex kann üblicherweise stabil während etwa 2 Jahren oder mehr gelagert; werden.

Da der antigenüberzogene Latex gemäss der Erfindung durch den Antierythropoiatin-Antikörper agglutiniert

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wird, wird zunächst ein Antikörper zu der. menschlichen Flüssigkeit oder ihrer Verdünnung zugesetzt und der Antikörper mit üec in der menschlichen Flüssigkeit oder deren Verdünnung vorliegenden Antikörper neutralisiert. Dann wird der antigenüberzogene Latex zu dem Gemisch zugesetzt, so dass er mit dem verbliebenen Antikörper reagieren kann., ■vorauf das Agglutinierungsmuster abgelesen wird.

Somit ergibt sich gemäss der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins unter Ausnutzung der vorstehenden Reaktion.Das Verfahren besteht in der qualitativen oder quantitativen Bestimmung des menschlichen Erythropoietins im menschlichen Urin oder Serum unter Anwendung einer Masse, welche aus synthetischen Polymerlatexteilchen und auf der Oberfläche der Latexteilchen aufgezogenem menschlichen Erythropoietin be steht·

Zur Ausführung der Bestimmung können an sich bekannte Massnahmen angewandt werden, und beispielsweise kann das Hive au des menschlichen Erythropoietins im Serum oder Urin leicht nach dem Mikrotiter-Verfahren ermittelt werden. Nach diesem Verfahren wird eine gegebene Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend ausgeführten Aft portionsweise auf eine KLkroplatte gegossen und dann.wird eine gegebene Menge einer Versuchsprobe, wie Serum oder Urin, in die erste Aussparung der Platte eingeführt und aufeinanderfolgend mit einem Verdünner verdünnt. Andererseits wird eine Verdünnungsreihe in der gleichen Veise unter Anwendung eines Standard-Erythropoietins mit einer bekannten Konzentration hergestellt. Eine gegebene Hange des Antikörpers wird dann zu sämtlichen Proben und der Verdün-

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nungsreihe zugesetzt, worauf die Proben bei Eaumtemperatur während 15 bis 20 Minuten zur Neutralisation des Antikörpers gehalten werden. Daran schliesst sich der Zusatz und das Vermischen einer gegebenen Menge des mit Antigen überzogenen Latex an. Nach Stehen während eines gegebenen Zeitraums bei Raumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutinieruag beobachtet. Die absolute Menge des Erythropoietins kann durch Vergleich mit der Standard-Erythropoietinreihe bestimmt werden.

Die zur Messung des menschlichen Erythropoietins bestimmte Masse gemäss der Erfindung in Form eines Latex oder getrockneten Produktes hat die folgenden äusserst überlegenen Vorteile. Spezifisch kann kein Antikörper für den Träger vorliegen. Tatsächlich wurde auch kein solcher festgestellt. Infolgedessen muss keinerlei beliebige Vorbehandlung an die zu testende Körperflüssigkeit erfolgen, noch ist es notwendig, einen Test zur Bestätigung einer derartigen Vorbehandlung auszuführen. Die Arbeitsweise zur Bestimmung besteht lediglich darin, dass die Körperflüssigkeit oder ihre Verdünnung in eine Aussparung einer Mikroplatte gebracht wird, tropfenweise hierzu ein Antikörper zugesetzt wird und anschliessend tropfenweise der mit Antigen überzogene Latex zugesetzt wird. Somit kann die Bestimmung des Erythropoietins 3ehr leicht mit einem einfachen Verfahren ausgeführt werden, ohne dass spezielle Techniken erforderlich sind. Da ferner das Antigen aus einem gereinigten'besteht, ist es äusserst spezifisch. Ausserdem ist die Empfindlichkeit des Testes vollständig zufriedenstellend für die Bestimmung von menschlichen Körperflüssigkeiten. Weiterhin ist es möglich, qualitative und quantitative Bestimmungen einer Anzahl von Proben gleichzeitig auszuführen.

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Die Bestimmung der Konzentration von Erythropoietin in der Körperflüssigkeit, die bisher nach, einem äussorst komplizierten biologischen Versuchsverfahren ausgeführt werden musste, kann jetzt sehr leicht innerhalb eines kurzen Zeitraumes mittels eines einfachen Verfahrens durchgeführt werden, wenn der mit Antigen überzogene Latex gemäss der Erfindung verwendet wird. Es wird dadurch möglich, eine genaue ätiologische Analyse von anämischen Patienten auszuführen und auch Untersuchungen über die Ergebnisse der erfolgten Behandlung und eine Prognose der Krankheit zu machen. Ferner kann das erfindungsgemässe Verfahren auch zur Bestimmung der Konzentration von Erythropoietin in der Stufe seiner Herstellung aus beispielsweise Urin verwendet werden.

Aus der Tatsache, dass dieser mit Antigen überzogene Latex lediglich mit dem Antierythropoietin-Antikörper reagiert und nicht mit sämtlichen anderen Antikörpern ausser diesem oder dem Plasmaprotein reagiert und dass ein unüberzogener Latex überhaupt nicht mit dem Antierythropoietin-Antikörper, anderen Antikörpern als diesem oder Plasmaprotein reagiert, lässt sich feststellen, dass das Erythropoietin an diesen überzogenen Latex gebunden ist.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der nachfolgenden Herstellungs- und Arbeitsbeispielen beschrieben, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.

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Herstellungsbeispiel 1

Herstellung von Erythropoietin

O,i % Phenol wurden zu dem Urin eines anämischen Patienten zugesetzt und nach Zugabe des 4-fachen Volumens an Äthanol wurde das Gemisch über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Dann wurde das Gemisch bei 3000 TJ/min während 30 Minuten zentrifugiert, worauf das Sediment gesammelt und in einer physiologischen Salzlösung gelöst wurde und erneut über Nacht gegen eine physiologische Salzlösung dialysiert wurde. Diese wurde dann anteilsweise in kleine Reagenzgläser gegeben, wobei diese Reagenzgläser in siedendes Wasser während 15 Minuten eingetaucht wurden und dann mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert wurden. Der Kaolinadsorption und -dissoziationsarbeitsgang wurde mit der überstehenden Flüssigkeit ausgeführt. Spezifisch wurde 5mal in einer physiologischen Salzlösung (Acid Washed Kaolin* Produkt der Fisher Scientific Company) gewaschenes Kaolin in einer Menge von 10 % zugesetzt und nach der Einstellung des pH-Wertes auf 4,8 wurde das Gemisch schwach bei 4·° C 24 Stunden lang gerührt. Das Kaolin wurde auf der Zentrifuge bei 3000 U/min abgetrennt, gesammelt und mit einem Acetatpuffer von pH 4,8 gewaschen. Es wurde dann in 1 M NH^OH suspendiertschwach während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und bei 3000 U/min während 30 Minuten zentrifugiert und anechliessend wurde die erhaltene überstehende Flüssigkeit abgetrennt. Nachdem dieser Arbeitsgang dreimal wiederholt worden war, wurden die überstehenden Flüssigkeiten vereinigt. Diese Probe wurde erneut gegen eine Lösung mit einem Gehalt von 0,029 M NaH₂PO₄ und 0,029 M NaCl dialysiert. Dann wurde diese Probe zu einer DEAE-Cellulese zugegeben,

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die mit einer Lösung von 0,029 M UaH₂PO^ und 0,029 M ITaCl im Gleichgewicht stand und schwach bei Raumtemperatur während 1 Stunde zu ihrer Adsorption gerührt. Dann wurde die DEAE-Cellulose durch Zentrifugation bei 2000 U/min gesammelt, in der vorstehenden Lösung zweimal gewaschen und anschliessend dreimal in einer Lösung mit dem Gehalt von 0,05 M Na₂HPO^ und 0,15 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde dann mit Lyphogel (Bezeichnune, eines Polyacrylamidgels der Gelman Instrument Co., USA) konzentriert und anschliessend mit Sephadex G-100 (vernetztes Dextran der Pharmacia Fine Chemicals, AB. Schweden) einer Gelfiltration unterzogen und anschliessend der aktive Teil gesammelt. Dieser wurde erneut mit Äthanol ausgefällt, worauf dsr Niederschlag in Äthanol gewaschen wurde und nach der Auflösung in einer physiologischen Salzlösung erneut gegen eine physiologische Salzlösung zur Bildung der Erythorpoietinprobe gelöst wurde.

Her stellung; sbei spiel 2

Herstellung eines Erythropoietin-Antikörpers

Eine in der gleichen Weise wie vorstehend hergestellte Probe, wobei jedoch die Wärmebehandlung nicht ausgeführt worden war, wurde als Antigen für die Immunisierung verwendet. Nach der Vermischung dieses Antigens mit Freund-Unvo11standigkeitshilfsmittel wurde das Gemisch subkutan dreimal in Kaninchen mit einem Gewicht von 2 bis 3 kg im Abstand von 7 Tagen injiziert und anschliessend wurde eine intramuskuläre Injektion verabfolgt. Drei Wochen später wurde die Probe in Lösung in einer physiologischen Salzlösung intravenös injiziert. Eine Woche nach

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der abschliessenden Injektion wurde das Gesamtblut aus der Carotidarterie abgenommen und das Serum wurde in üblicherweise abgetrennt und anscnliessend auf 56° C während 30 Minuten erhitzt. Das Material wurde bei 4° 0 nach der Zugabe von 0,1 % ITatriumazid aufbewahrt. Von den erhaltenen Antiserum wurde bestätigt, dass es ein einziger Antikörper war, auf Grund der Tatsache, dass es eine einzige Bande mit einem Antigen nach dem Ouchtalony-Verfahren sowie nach der Immunoelektrophorese bildete.

Beispiel 1

Herstellung eines mit Erythropoietin (Antigen) überzogenen Latex

Ein Polystyrollatex (SEL 59, «spezifisches Gewicht 1,18, Teilchendurchmesser 0,9 Mikron , Produkt der Takeda Chemical Industry Company) wurde in einem Gemisch aus 1 Volumen eines 1/15 M-Phosphatpuffers (pH 7,2) und 3 Volumen einer physiologischen Salzlösung (abgekürzt mit PBS) so dispergiert, dass die Teilchenkonzentration 0,25 % betrug. Zu der erhaltenen Suspension wurde in einer·gleichen Menge ein mit PBS in der Weise verdünntes Erythcpoietin zugesetzt, dass es 250 miu/ral enthielt (milli immuno chemical unit /ml). Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 3 Stunden gehalten und dann zur Sammlung der Latexteilchen zentrifugiert, welche mit FBS und dann mit dem Verdünnungsmittel gewaschen wurden, worauf die Teilchen in dem Verdünnungsmittel zu einer Konzentration von 0,25 % zur Erzielung eines mit Antigen überzogenen Latex suspendiert wurden. Obwohl dieser mit Antigen

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überzogene Latex mit einem Antierythropoietin-Antikörper auf einer Mikroplatte agglutinierte, ergab er keine Agglutinierung, wenn verschiedene Antikörper von menschlichem Albumin, menschlichem IgG, menschlischem Transferrin, menschlichem Haptoglobin und menschlichem ßo-Mikroglobulin zugesetzt wurden. Ferner fand keine Agglutinierung «rfcatt, wenn der mit Antigen überzogene Latex zugesetzt wurde, nach^dem der Antierythropoietin-Antikörper durch Zusatz von Erythropoierdn neutralisiert worden war. Weiterhin fand, obwohl der Antierythropoietin-Antikörper unter identischen Bedingungen zu einem Latex^ welcher nicht mit Erythropoietin überzogen wordeD war, zugegeben wurde, eine Agglutinierung nicht statt. Dadurch wurde bestätigt, dass dieser antigenüberzogene Latex spezifisch mit dem Antierythropoietin-Antikörper und Agglutinaten reagiert.

Das verwendete Verdünnungsmittel wurde erhalten, indem BSA zu einer mit 1/60 M-Phosphat gepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,2) zu einer Konzentration von 0,1 % zugesetzt worden war.

Bai spiel 2

Lyophilisierung des mit Antigen überzogenen Latex

Dor in Beispiel 1 hergestellte mit Antigen überzogene Latex wurde in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt von 0,5 Gew.% Glycin und 0,7 Gew.% Dextran (Dextran, Molekulargewicht 200 000 bis 300 000, Produkt der Wako Jyunyaku Co.) zu einer Konzentration von 2,5 % suspendiert. Hach der Rasch-Gefrierung dieses Materials im·flüssigen Stickstoff wurde es lyophilisiert.

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Beispiel 5

BsStimmung des Erythropoietins

Das Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde in jede Aussparung einer Mikroplatte vom V-Typ gegossen. Zu der ersten Aussparung wurden 0,025 ml Serum zugesetzt. Weiterhin wurden 75 miu/oil an Standard-Erythrdpoietin zu dar ersten Ausbohrung einer weiteren Leitung zugesetzt und fortschreitend mit eine« Verdünnungsmittel nach den Zweifach-Serienverdünnungsverf ahren verdünnt. Sämtliche Aussparungen wurden dann mit 0,025 ml eines vorhergehend mit Standard-Erythropoietin in der Weise verdünnten Antierythropoietin-Antikörpers vermischt, dass die sechste Aussparung den Endpunkt darstellte. Dana wurden die Mischungen bei Bäumteraperatur während 30 Minuten gehaltsn, worauf 0,05 ml des in Beispiel 1 erhaltenen mit Antigen überzogenen Latex zu jeder Aussparung zugegeben wurden. Die Gemische wurden gründlich mit einem Micromixer vermischt und bei Raumtemperatur während mindestens 10 Stunden stehengelassen. Der Endpunkt der Hemmung der Agglutinierung wurde dann gernessen und die Erythropoietin-Konzentration wurde durch Vergleich mit dem Standard-Erythropoietin berechnet.

Die erhaltenen Ergebnisse, wenn die Konzentration des Erythropoietins im menschlichen Serum nach diesem Verfahren bestimmt wurde, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

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Tabelle Bestimmung des Serum - Erythropoietins(Agglutinierungsheramwert)

Br. 1 2 ? 4 5 6 7 8 9 10 11 12 miu/ml

Standardlösung 75 miu/ml _,_____ _{+ + + +} + ₊

Gesunder Erwachsener (27 Jahre alt, männlich --.-__ + + + + + ._{f +} 37.5

ebenso (46 Jahre alt, männlich -__.-_ _{+ + + + + +}

Aplastische Anämie (18 Jahre alt, weiblich _-------«.-. - ₊ 2400

ebenso (24 Jahre alt, männlich ---.-.-.---» + ₊ 12OO

H^po ferritische Anämie (51 Jahre alt, weiblich --____-_ + + + +

Chronische Eenalinsuffizient (47 Jahre alt,

männlich) - + + + + + + + + + + + 2,3

ebenso (39 Jahre alt, männlich --- + + + + + + + + + 9*3

-: unagglutiniert +· i agglutiniert

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Beispiel 4

Ein Verdünnungsmittel wurde zu dem mit Antigen überzogenen Latex, der nach Beispiel 2 erhalten wurde, in der Weise zugegeben, dass die Konzentration der Latexteilchen 0,25 % betrug, worauf der Arbeitsgang wie in Beispiel 3 ausgeführt wurde, um das im Serum enthaltene Erythropoietin zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse waren die gleichen wie in Beispiel 3.

Wie sich aus den vorstehenden Ergebnisse zeigt, zeigte das Erythropoietin im Blut einen hohen Wert im Fall der hypoferritisehen Anämie und einen abnormal hohen Wert im Pail der aplastischen Anämie, jedoch einen abnormal niedrigen Wert im Fall der renischen Anämie. Dadurch lässt sich feststellen, dass die Bestimmung des Erythropoietins von anämischen Patienten äusserst wertvoll für die Diagnose der Ursache der Anämie bei diesen Patienten sowie für die Bestimmung des Ausma3ses der Krankheit ist.

Die Anwendung des mit Antigen überzogenen Latex gemass der Erfindung ermöglicht es, sehr einfach das Niveau des Erythropoietins innerhalb einer äusserst geringen Menge der Probe und ferner ohne die Notwendigkeit irgendeiner Vorbehandlung der Probe festzustellen. Das Verfahren gemäss der Erfindung lässt sich somit als besonders geeignet zur Anwendung in der klinischen Diagnose bezeichnen.

030064/0821

Claims

Patent an spräche

Masse zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins, dadurch gekennzeichnet, dass diese Masse im wesentlichen aus synthetischen polymeren Latexteilchen und auf den Oberflächen dieser Latexteilchen aufgezogenem menschlichen Erythropoietin besteht.
2. Masse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 /um besitzen.
3· Masse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexteilchen ein spezifisches Gewicht von 0,9 bis 1,4 besitzen.
4. Masse nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, das3 sie einen Stabilisator aus Aminosäuren und/oder Dextran enthält.
5. Masse nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnnet, dass die synthetischen Polymerlatexteilchen Teilchen eines synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp aus de:? Gruppe von Latexen de¹" Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder aminhaltigen carboxylierten Produkten hiervon bestehen.
6. Masse nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie synthetische Polymerlatexteilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchaesser von 0,01 bis 10/um und einem spezifischen Gewicht von 0,9 bis 1,4 vom Styroltyp enthält, die aus Teilchen eines Latex aus der Gruppe

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•S-

von Styrolpolyceren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder aminhaltigen carboxylierten Produkten hiervon Gesteht, auf den Oberflächen dieser Latexteilchen aufgezogenem menschlichen Erythropoietin und einem aus Glycin in einer Konzentration von 0,2 bis 2 Gev.% und Dextran in einer Konzentration von 0,3 bis 3 Gew.% aufgebauten Stabilisator bestehen.

7· Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins in menschlichem urin oder Serum nach dem Mikrotiterverfahrsn, dadurch gekennzeichnet, dass eine Masse angewandt wird, die im wesentlichen aus synthetischen polymeren Latexteilchen und dem auf den Oberflächen dieser Latexteilchen aufgezogenen menschlichen Erythropoietin besteht.

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