DE2653032A1

DE2653032A1 - Radioimmun-nachweisverfahren fuer ein schilddruesenhormon und dafuer geeignetes reagens

Info

Publication number: DE2653032A1
Application number: DE19762653032
Authority: DE
Inventors: Nathan Lewin; James F Monthony; Paul F Wegfahrt
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1976-08-27
Filing date: 1976-11-22
Publication date: 1978-03-02
Also published as: BR7608202A; JPS5329922A; DE2653032C2; US4108974A; CA1075153A; FR2363109A1; GB1570097A

Description

PATENTANWÄLTE 9 R R Ί Γ) Ί ?

R. SPLANEMANN dr. B. REITZNER J.RICHTER F. WERDERMANN

DIPL.-ING. DIPL.-CHEM. DIPL.-ING. DIPL.-ING.

MÖNCHEN

HAMBURG

BIO-RAD Laboratories, Inc. 32nd Griffin Avenue

Richmond, California 94 804 USA

Patentanmeldung

München 2 22. November 1976 Tal 13

Telefon (039) 22 62 07/22 62 09 Telegrarnnne: inventius München

unsere Akte= 1325-1-9787

Ihr Zeichen:

Radioimmun--irachweisverfahren für ein Schilddrüsenhormon und dafür geeignetes Reagens

Die Erfindiing betrifft ein verbessertes Radioimmin-irachweisverfahren (Radioimmunoasaay) für S«hilddrüsenhornione und die Reagentien, die in einem solchen Ifachweisverfahren verwendet werden.

Aus der US-Patentschrift 3 555 W (Axen et al) ist die kovalente Bindung von Antikörpern an in Wasser inlösliche Polymere bakannt. Dabei werden die Antikörper kovalent an die Polymeren gebunden und dann in Hachweisverfahren für Proteine und Polypeptide verwendet. Als Polymeres wird dabei vorzugsweise vernetztes Dextran verwendet.

In der Corning HäMO PHASE, einem handelsüblichen Radioimmunnachweissystem für Thyroxin (nachfolgend abgekürzt mit T-4·),

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werden an poröse Glasteilchen !covalent gebundene Antikörper verwendet, die anschließend in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, die Hinderserumalbumine und Thimerosal zum Blockieren des Thiroxin bindenden Globulins (!FBG) enthält, suspendiert werden·

In dem handelsüblichen Badioimmunnachweisverf ahren nach Sorin wird eine Doppelantikörper-Methode angewendet, bei der der zweite Antikörper an Cellulose immobilisiert wird. Das Nachweisverfahren selbst dient für den Nachweis eines anderen Hormons, nämlich eines die Schilddrüse stimulierenden Hormone·

In dem Patent (Patentanmeldung P 26 41 713.0) ist ein Immunfluoreszenz-Nachweisverfahren in fester Phase beschrieben, bei dem die Immunreaktanten !covalent an in Wasser unlösliche hydrophile polymere Teilchen, z.B. an Polyacrylamidteilchen, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, gebunden sind·

In der US-Patentschrift 3 911 0% (Chopra) ist die Verwendung von Blockierungsmitteln zur Verdrängung des Schilddrüsenhormons aus einem nicht-extrahierten Serum vor der Bestimmung des Schilddrüsenhormons in einem Konkurrenz-Bindeverfahren beschrieben·

Das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende Nachweisverfahren beruht auf den Prinzipien des von Berson und Yalow'beschriebenen Radioimmunnachweisverfahrens (Badioimmunoassay) ₀ Bei dem !röstverfahren gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird eine gemessene Menge eines Patientenserums oder eines Thyroxin-Standards mit radioaktiv markiertem Thyroxin (T-4 *J) und 8-Anilino-i-naphthalinsulfonsäure (AHS) gemischt und anschließend wird ein immobilisiertes T-4—Antiserum zugegeben (das T-4—Antisera» ist kovalent an in Wasser suspendierbare hydrolysierte Polyacrylamid-Perlen

Berson und. E.S* Talow, ¹¹J. Clin. Invest.", *&, 1157(1960), 809809/0619

gebunden). Sie Mischung wird bei Raumtemperatur inkubiert_o Die ANS verdrängt das !Thyroxin aus den Serumproteinen· Während der Inkubation tritt das verdrängte Thyroxin mit dem markierten Thyroxin für die immobilisierten 3?hyroxin-Ant !körper auf der Basis der jeweiligen relativen Konzentrationen in Konkurrenz,

Die Menge des markierten Thyroxins, das an den Antikörper gebunden wird, steht in umgekehrter Beziehung zu der Menge des in dem Serum vorhandenen nicht-markierten endogenen Thyroxins· Nach der Inkubation wird die Mischung zentrifugiert und der immobilisierte Thyroxin-Antikörper-Komplex wird am Boden des Böhrchens in Form einer Pille (eines Kugelchens) konzentriert* Das nicht-gebundene Thyroxin in der überstehenden flüssigkeit wird dekantiert und die Radioaktivität der Pille wird gezählt· Unter Verwendung von vorher in einem Humanserum geeichten Thyroxin-Standarde wird eine Standardkurve hergestellt« Die Thyroxinkonzentration in dem Patientenserum wird aus der Standardkurve entnommen·

Durch die vorliegende Erfindung wird ein neuartiges Beagens für die Verwendung in dem Immunnachweisverfahren (Immunoassay) geschaffen, das aus hydrolysieren vernetzten Polyacrylamidtexlchen, an denen mindestens ein Farbstoff aus der Gruppe Alcian-GeIb und Alcian-Blau absorbiert ist, besteht oder diese enthält· Diese einen Farbstoff aufweisenden Teilchen weisen beträchtliche praktische Vorteile für denjenigen auf, der das Nachweisverfahren im Labor durchführt· Wenn man nämlich berücksichtigt, daß die Polyacrylamidteilchen wasserklar und nur schwer zu sehen sind, so wird durch die einen Farbstoff aufweisenden Teilchen (gefärbten Teilchen) die Überwachung der zu Beginn durchgeführten Einfülloperationen in die verschiedenen verwendeten Gefäße erleichterte Nach der Zentrifugierung, bei der die Pille gebildet wird, erlaubt der Farbstoff die leichte Lokalisierung der Pille für die übrigen Behandlungsstufen. Der Farbstoff erlaubt es auch dem Experimentator, das versehentliche Abdekantieren der Perlen (Kügelchen) zusammen mit

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der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren xu vermeiden· Es wurde gefunden, daß die in diesen Reagens verwendeten Farbstoff· insofern neuartig bzw. einzigartig sind, als sie die Fähigkeit haben, an der Oberfläche der Polyacrylamidteilchen absorbiert zu worden unä in dem ionischen Puffermilieu, das während der verschiedenen Stufen des Nachweisverfahrens vorliegt, daran su verbleiben. Sas Gesant-Naehweisverfahren selbst weist eine Reihe von neuartigen bzw· einzigartigen Eigenschaften auf· Die erfindungsgemäß als Substrate in Torrn einer festen Phase für die Antikörper verwendeten hydrolysieren, vernetzten Polyacrylamidteilchen sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, stabil· hydrophile Suspensionen zu bilden· Die Folge davon ist, daß die Eeaktionsmischung während der Abtrennung des Schilddrüsenhormons von den Serumproteinen und der konkurrierenden Bindung in Gegenwart eines radioaktiven Tracers an den Antikörper nicht gerührt werden nuß, um den gewünschten homogenen Zustand aufrechtzuerhalten. Sas Verfahren umfaßt auch die Beschleunigung der Inkubation durch Anwendung von Wärme, z.B. durch Inkubation bei Temperaturen von etwa 37 bis etwa 5O°C· Diese Erwärmung kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht durchgeführt werden, weil das Rühren nicht erforderlich ist« Die bekannten Verfahren, wie z.B. diejenigen nach Aren et al (Dextranteilchen), Sorin (Celluloseteilchen) und Corning (Glasteilchen), unterscheiden sich dadurch von dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß sich diese Teilchentypen relativ schnell absetzen und bei diesen Nachweisverfahren die immobilisierten Reagentien während der Zugabe ständig gerührt werden müssen_>und daß die Lösung innerhalb der Inkubationszeit stets gerührt werden muß· Bei Anwendung einer Erwärmung ist das konstante Rühren ein höchst unbequemer Arbeitsgang· Der Vollständigkeit halber sei noch darauf hingewiesen, daß bei dem Corninfverfahren, in dem Glasteilchen zum Immobilisieren des Antikörpers verwendet werden, bei kurzen Hachweisverfahren vielleicht weniger Ab-

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Setzprobleme auftreten als bei den anderen· Insgesamt gesehen gibt es jedoch auch da noch Absetzprobleme· Dies geht aus der Tatsache hervor, daß die im Handel angebotenen Materialien in fabrikmäßig vorher gefüllten !öhrchen für jede Nachweisprobe geliefert werden, was auf die Schwierigkeit der Erzielung von gleichmäßigen Suspensionen für die genaue Probenentnahme eines aliquoten Anteile hinweist·

Andere neuartige bzw. einzigartige Aspekte der Erfindung leiten sich von den geringen nicht-spezifischen Bindungseigenschaften der Polyacrylamidteilchen ab. Die nicht-spezifi-

sche Bindung ist so gering, daß bei den anfänglich/getrennten feststoff-Teilchen nach der Inkubation ohne jede vorhergehende Waschung die Radioaktivität direkt gemessen werden kann. Die bekannten Feststoff-Träger, wie z.B. diejenigen der oben genannten US-Patentschrift von Axen et al,müssen vor der Messung des radioaktiven Tracers gewaschen werden· Die Eliainierung der Waschstufen sowie die Eliminierung; der Zugabe anderer Elemente, wie oberflächenaktiver Mittel, wie sie von Axen et al verwendet werden zur Verminderung der nicht-spezifischen Absorption ,führen zu einer beträchtlichen Erhöhung der Empfindlichkeit Aind zu einer Vereinfachung des erfindungsgemäßen Hachweieverfahrens ·

Die oben genannten Vorteile werden erzielt durch Verwendung von hydrolysieren vernetzten Polyacrylamidteilchen, die in der nicht-hydrolysierten Form eine !Peilchengröße von 0,1 bis 10 Mikron, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 5 Mikron und insbesondere eine Teilchengrößenverteilung aufweisen, die sich um etwa 5 Mikron herum konzentriert« Bezüglich der anderen Eigenschaften dieser Teilchen in Verbindung mit Immunreaktanten sei auf die weiter oben genannte Patentanmeldung P 26 41 713*0 und den einschlägigen Stand der Technik verwiesen·

*)bzw. Geschwindigkeit

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Die Erfindung wird nachfolgend an Hand einer bevorzugten Aueführungeform näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu seine

Herstellung von Antikörper-Perlen

Von der Bio-Rad-Laboratories, Inc· of Richmond, Kalifornien/USA unter dem Warenzeichen "BIO-GEL P" bezogene Polyacrylamid-Perlen (1 bis 5 Mikron) werden mit starkem Alkali hydrolysiert zur Herstellung der Carbonstureform. Bei diesem Verfahren quellen die hydratisieren Perlen beträchtlich auf (5 bis 10 u) als Folge von ionischen Abstoßungen und einer Verminderung der Vernetzung· Diese Perlen haben eine Dichte, die sehr nahe bei derjenigen von Wasser liegt und ihre wäßrigen Suspensionen sind sehr stabil« Ein kontinuierliches Mischen ist nicht erforderlich und über Zeiträume von Stunden hinweg bleiben sie nahezu homogen·

Über die Bildung von Amidbindungen, welche die Carboxylatgruppen der Perle an die freien Amingruppen an dem Antikörper binden, werden die Antikörper kovalent an die hydrolysierten Perlen gebunden· Dies kann dadurch erzielt werden, daß man eine Suspension der hydrolysierten Perlen mit einem Kuppler, wie z.B. einem wasserlöslichen Carbodiimide behandelt und anschließend eine verdünnte lösung des gesamten Antiserums oder von gereinigten Antikörpern zugibt und die dabei erhaltene Mischung stehen läßtο

Der Antikörper-Perlen-Komplex kann durch Zentrifugieren oder Filtrieren von dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden und der nicht-umgesetzte Antikörper kann aus der überstehenden Flüssigkeit zurückgewonnen werden. Die Perlen werden mit einem chaotropen Mittel, wie Harnstoff, Guanidin oder Thiocyanat, gewaschen, um den adsorbierten Antikörper und irgendein endogenes Substrat, das an die Antikörper gebunden ist,

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zu entfernen. Die dabei erhaltenen Perlen werden gründlich gewaschen« um Salze zu entfernen, und sie können in bakteriostatische Mittel enthaltenden gepufferten Suspensionen aufbewahrt oder lyophilisiert werden, ohne daß ein Verlust an Antikörperaktivität auftritt.

Hydrolyse der Polyacrylamid-Perlen

100 g Polyacrylamid-Perlen (Durchmesser 1 bis 5 Mikron) werden in 10 1 2 η NaOH suspendiert und 16 bis 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt« Die Reaktionsmischung wird mit konzentrierter Phosphorsäure (pH 6 bis 7) neutralisiert· Die Perlen werden durch Zentrifugieren oder Jiltrieren abgetrennt und dreimal mit 10 1 Wasser gewaschen· Die gewaschenen Perlen werden in 10 1 0,05 M PO^-Puffer erneut suspendiert und der pH-Wert wird auf 5»5 eingestellt· Die Perlen-Arbeitskonzentration beträgt 10 sg/ml (bezogen auf das Trockengewicht)_o

Kupplung des Antiserums ait den hydrolysierten Perlen

1 1 einer Suspension von 10 g hydrolysiert en Perlen wird auf 4°C abgekühlt und magnetisch gerührt. Zu der Perlensuspension werden 2 g trockenes 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDAC) zugegeben· Der pH-Wert der Mischung steigt schnell an und fällt dann langsam auf seinen ursprünglichen Wert zurück· Wenn der pH-Wert auf etwa die Hälfte des anfänglichen Anstieges (pH 5,8) gefallen ist, wird das Antiserum oder der gereinigte Antikörper der Mischung zugegeben. Die zugegebene Antiserum-Menge rariiert in Abhängigkeit von dem Antikörper-Titer, sie beträgt Jedoch in der Hegel 1 ml des ganzen Antiserums pro g Perlen oder weniger. Man läßt die Beaktionsmischung bei 4°C über Nacht stehen· Man trennt die Perlen ab und suspendiert sie erneut in 1 1 3 M HH^SClT in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS)· Diese läßt man erneut 1 bis 2 Stunden lang stehen und trennt a«nn die Perlen ab, die man M- mal mit 1 1 PBS wäscht, suspendiert sie erneut in

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2 6 5 ^ ί Ki 2

PBS irnd läßt über Nacht bei 4⁰G stehen«

Die Perlen können bequem mehrere Monate lang bei 4-⁰C in PBS aufbewahrt werden. Natriumazid (0,01 %) ist ein befriedigendes Koiiservienüigsmittele Di© Perlen können aber auch in einem anderen Puffer (z.B. in Barbital) wieder suspendiert und lyophilisiert werden.

Vortitration der Antikörper-Perlen

Es werden Suspensionen von Antikörper-Perlen in Mengen von 2 bis 20 mg/ml in regelmäßigen Zeitabständen hergestellt· Diese Perlen werden in dem normalen Kachweissystem getestet und die Perlenkonzentration, welche bei der gewünschten Dosis anspricht und die Tracer-Bindung werden nach den folgenden Kriterien ausgewählt:

Die Tracer-Bindung sollte zwischen 20 und 80 %, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 50 bis 60 fliegen bei einer solchen Dosisansprechempfindlichkeit, daß der 5 xig/dl-Standard 30 bis 70 %_f vorzugsweise 50 %,der Zähler des KuIl-Standards aufweist₀

Herstellung der Standards

Die Standards werden hergestellt durch Zugabe eines spektroskopisch bestimmten Mengenverhältnisses von Thyroxin zu thyroxinfreiern Humanserum bis ssur Erzielung eines Gehaltes von 20 iig/dl. Das dabei erhaltene Material wird einer Reihenverdünnung mit thyroxinfreiern Serum unterworfen, um die anderen Konzentrationen, d.h. Konzentrationen von 10, 5t 2,5 bzw. 1 ng/dl, herzustellen»

Herstellung des Tracer/Blockierungsmittels

Das Tracer/Blockierungsmittel wird hergestellt durch Auflösen von trägerfreiem J ^-Thyroxin (mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2200 Curie pro mllol) und 1,8-Anilinonaphthalinsulfonsäure (ANS) in 0,0375 M Barbital-Puffer und Aufteilen

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■ ' ■ ' ORIGINAL SNSPECTED

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dar Mischung in Phiolen in einer solchen Menge, daß jede Phiole 1,65 mg ANS und 5 bis 10 Mikroeurie J¹²* enthält, wobei diese Menge für 11Q Teströhrchen ausreicht.

In dem Tracer/Blockierungsmittel kann Jedes der bekannten Blcckierungsmittel verwendet werden, z.B. diejenigen, wie sie in dar oben genannten US-Patentschrift von Chopra beschrieben sind» Erfindungsgemäß werden der radioaktive QJracer und das Blockierungsmittel vorher miteinander kombiniert, bevor sie mit der zu testenden Serumprobe gemischt werden» Diese vorher hergestellte Kombination kann iyophilisiert werden und ist sehr stabil, wobei ihre Stabilität nur durch die Isotopen-Halbw©rtszeit des Tracers begrenzt ist» Diese vorher hergestellte Kombination kann mit einem Puffer verdünnt werden, bevor sie mit der Serumprobe gemischt wird, und durch diese vorher kombinierte Form wird die mehrfache nachfolgende Zugabe zu der Probe in dem EFaehweisvsrfahren (lest) vermieden«,

Herstellung der gefärbten Perlen (mit farbstoff versehenen Perlen) ___ _ι

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von gefärbten (mit einem Farbstoff versehenen) Perlen ist das folgende: der Farbstoff (Alcian-Blau und/oder -Gelb) wird in einer Menge von 0,25 bis 1,5 g Farbstoff pro 100 g Perlen (vorzugsweise in einer Menge von 1 g Farbstoff/100 g Perlen) in einer Minimalen Menge 3 %iger Essigsäure (etwa. 100 ml/g) gelöst. Diese Lösung wird filtriert und mit einer wäßrigen Suspension von hydrolysierten Perlen bei Raumtemperatur gemischt» Der Farbstoff wird innerhalb einer Stunde an den Perlen adsorbiert. Der gegebenenfalls vorhandene, nicht-adsorbierte Farbstoff kann durch Zentrifugieren von den Perlen entfernt werden» Diese gefärbten (mit Farbstoff versehenen) Perlen können als Verdünnungsmittel für die Antikörper-Perlen verwendet werden, die wie vorstehend angegeben hergestellt werden. Das Verdün-

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nungsmittel wird den auf einen bestimmten Titer eingestellten Ferien in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Gesamtmenge der Perlen pro Nachweis (Test) auf einen Wert innerhalb eines Bereiches zu bringen, der zweckmäßig 0,5 bis 2,5» vorzugsweise 1,5 mg pro Versuch (Test) liegt· Es können auch andere Mengen angewendet werden. Wenn der Antikörper-Perlen-Titer so groß ist, daß es nicht erforderlich ist, verdünnende Perlen zuzusetzen, dann kann ein Teil der Antikörper-Perlen selbst auf die vorstehend angegebene Weise gefärbt werden.

Das nachfolgend beschriebene Beispiel erläutert die praktische Durchführung des Nachweises (Tests):

Behandlungsstufen:

1. Es werden zwei 12 am χ 75 aa-Reaktionsröhrchen für jeden Standard einschließlich des Null-Standards, jede Kontrollprobe und jede Probe markiert;

2. jeweils 25JiI des Standards, der Kontrollprobe oder der Patientenprobe werden in die geeigneten Röhrchen gegeben;

3. allen Röhrchen (den Standards, den Kontrollproben und den Proben) werden 2,0 ml einer Tracer/Blockierungsmittel-Lösung zugegeben;

4. durch Zugabe von 2,0 al Tracer/Blockierungsmittel-Lösung

zu einem 12 mn χ 75 am-Reaktionsröhrchen wird ein Ge samt zähler -impulsröhrchen hergestellt und dieses wird bis zu der Stufe 9 beiseite gestellt;

5. jedem Röhrchen werden 100 nl der T-4-Antikörper-Perlen zugegeben und jedes Röhrchen wird gemischt;

6. alle Röhrchen werden mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert;

7. alle Röhrchen werden 10 Minuten lang bei 3000 TJpM zentrifugiert, ua die T-4-Antikörper-Perlen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren, unmittelbar danach wird die folgende Stufe durchgeführt;

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8. die überstehenden Flüssigkeiten werden verworfen durch schnelles Umkippen der Röhrchen in einen geeigneten Behälter, wenn sie aus der Zentrifuge entnommen werden, der letzte Tropfen wird durch vorsichtiges Abdrücken des Röhrchenrandes an einem Papiertuch entfernt;

9. jedes Röhrchen einschließlich des Gesamt-Zählerimpulsröhrchens wird 1 Minute lang ausgezählt und die Zählimpulse werden aufgezeichnet.

In der nachfolgenden Tabelle sind die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendeten Proben und Standards und die dabei erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.

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Röhrchen Zähl impulse pro durchschnittlich© %Bj^B

Gesamtzählimpulse O-Standard 1,O*-Standard 2,5*-Standard 5,0"-Standard 10,0·-Standard 20,0*-Standard Probe Nr. Probe Hr.

dl Minute (CPM) minus Eintergrund

68 604 68 773

39 826

40 254

32 902 35 514-

25 944

26 362

19 076 19 651

13 117 12 978

8 466 8 662

16 912 10 804

10 510 10 804

Anzahl der CPM

68 40 33 26 19 13

16

10

100	-
82,9
65,3	-
48,3	«α
32,6	_
21₉4	6,7
41,8	14,3
26,6

NJ CJ)

Die Berechnung des Prozentsatzes des gebundenen markierten T-4 (B), das sowohl mit den Standards als auch mit den Proben assoziiert ist, erfolgt durch Division der durchschnittlichen Anzahl der Zählimpulse pro Minute (CPM) der Standards und. der Proben durch die durchschnittliche Anzahl der Zählimpulse (CPM) des Null Standards (B_Q) und durch Multiplizieren des Quotienten mit 100, wobei man das Verhältnis % B/B_o erhält»

In einem Diagramm wurde das berechnete Verhältnis % B/B oder die durchschnittliche Anzahl der Zählimpulse pro Minute jedes der Standards auf der linearen Achse gegen die Konzentration von T-4 auf der log-Achse von halblogarithmischem 2-Cyclus-PapIer aufgetragen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der beiliegenden Zeichnung dargestellt»

Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse, die bei der praktischen Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens erhalten wurden, zeigen, daß das Nachweisverfahreη in zufriedenstellender Weise arbeitet.

Genauigkeit

Mehrfachbestimmungen (Replikate) von Hypothyroid-, Euthyroid- und Hyperthyroid-Seren, die in einem einzigen Versuch untersucht wurden, ergaben die folgenden Präzisionswerte:

Serum- Anzahl der mittlerer T-4-Gehalt Standardabprobe Mehrfachbe- /Ug/dl weichung

Stimmungen '

1	16
	14
3	15

2,03 0,09

7,15 0,18

12,19 0,57

Mehrfachbestimmungen von Hypothyroid-, Euthyroid- und Hyperthyroid-Kontrollseren, die in elf verschiedenen Labora-

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torien in achtzehn getrennten Tests untersucht wurden, ergaben die folgenden Präzisionswerte:

Kontroll- Anzahl der serum Mehrfachbe stimmungen	18	!•rückgewinnung	mittlerer T-4-Gehalt /ug/dl	Standard abweichung
1	18	0,08	0,21
2	18	6,27	0,67
3	15,5	1,4

16 aliquote Anteile eines Hypothyroid-Sammelserums wurden mit 5,0 und 10,0 /ug/dl Thyroxin versetzt und in einem einzigen Test untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefaßt:

Von außen züge- mittlerer gernes- mittlerer Ge- mittlerer

sctztes T-4 sener T-4-Gehalt halt an zurück-Prozentyug/dl /ug/dl gewonnenem T-4 satz der

' ' /Ug/dl Rückgewin.

0 2,03

5 7,15 5,12 102,4

10 12,19 10,16 101,6

Die vorstehend beschriebene bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erläutert das Nachweisverfahren für Thyroxin. Um das Verfahren auch für die Bestimmung von Trijodthyronin anwenden zu können, ist es lediglich erforderlich, geeignete Antikörper für die Bindung an das hydrolysierte Polyacrylamid und einen geeigneten Radiotracer zu verwenden.

Patentansprüche:

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ORIGINAL INSPECTED

ZO .

L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche

1. Radioimmun-Nachweieverfahren (Radioimmunoassay) für ein schilddrüsenhormon aus der Gruppe Thyroxin und Trijodthyronin in einer wäßrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man hydrolysierte vernetzte Polyacrylamid-Teilchen, die in der nicht-hydrolysierten Form eine Größe von etwa 0,1 bis etwa 10 Mikron aufweisen und an die über kovalente Bindungen Antikörper zu dem zu bestimmenden Schilddrüsenhormon gebunden sind, die das Schilddrüsenhormon enthaltende wäßrige Probe und das mit einem radioaktiven Isotop markierte Schilddrüsenhormon miteinander in Kontakt bringt, um einen (Dell des markierten Schilddrüsenhormons und des nicht-markierten Schilddrüsenhormons an den Antikörper zu binden unter Bildung eines Zwei-Phasen-Systeme, das besteht aus einer festen Phase, die den gebundenen Teil des markierten und des nicht-markierten Schilddrüsenhormons enthält, und einer flüssigen Phase, die das nicht-gebundene markierte und das nichtgebundene, nicht-markierte Schilddrüsenhormon enthält, die beiden Phasen voneinander trennt und die Radioaktivität mindestens einer der festen und flüssigen Phasen bestimmt, wobei der Wert der !Radioaktivität eine Funktion der Konzentration des Schilddrüsenhormons in der wäßrigen Probe ist.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Radioaktivität der abgetrennten festen Phase direkt nach der Abtrennung ohne jedes vorhergehendes Waschen bestimmt wird·

3· Radioimmun-ITachweisverfahreji zur Bestimmung eines Schilddrüsenhormons aus der Gruppe Thyroxin und Trijodthyronin in einer wäßrigen Serumprobe, bei dem man die das zu bestimmende Schilddrüsenhormon enthaltende wäßrige Serumprobe, das mit einem radioaktiven Isotop markierte Schilddrüsenhormon, ein

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ORIGINAL INSPECTED·

Blockierungamittel in einer zur Verdrängung praktisch des gesamten zu messenden ausgewählten Schilddrüsenhormons ausreichenden Menge und einen Antikörper in einer für die Konkurrenzbindung des zu bestimmenden Hormons ausreichenden Menge und eines dafür geeigneten Typs miteinander mischt, den Horaon-Antikörper-Komplex von dem freien radioaktiven Schilddrüsenhormon trennt und die Hadioaktivität des Hormon-Antikörper-Komplexes bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung einer Antikörper-Polymerfeststoff-Phase, die mit der wäßrigen Probe eine im wesentlichen stabile hydrophile Suspension bildet, Antikörper verwendet, die !covalent an hydrolysierte, vernetzte Polyaerylamid-Teilchen gebunden sind, die in der nicht-hydrolysierten Form eine Größe von etwa 1 bis etwa 5 Mikron aufweisen.

4« Verfahren zur Bestimmung eines Schilddrüsenhormons aus der Gruppe Thyroxin und Tri^odthyronin in einer nicht-extrahierten Serumprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine abgemessene Menge eines nicht-exfcrahierten Serums, ein Blockierungsmittel in einer zur Verdrängung praktisch des gesamten zu bestimmenden Schilddrüsenhormons ausreichenden Menge, radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon des zu bestimmenden Typs und hydrolysierte Polyacrylamid-Teilchen, an die über kovalente Bindungen Antikörper des Typs zur Bindung des zu bestimmenden Hormons gebunden sind und die eine solche Größe haben, daß sie mit der Probelösung eine hydrophile Suspension bilden, miteinander mischt, zur Verdrängung des zu bestimmenden Hormone durch das Verdrängungsmittel und zur Konkurrenzbindung des markierten und des nicht-markierten Hormons an die Antikörper auf der Basis ihrer relativen Konzentration inkubiert unter Bildung eines Zwei-Phasen-Systeme, das besteht aus einer festen Phase, die den gebundenen Anteil des markierten und des nicht-markierten Hormons enthält, nrtfl einer flüssigen Phase, die das nicht-gebundene markierte und das nicht-gebundene, nicht-markierte Hormon enthält, die

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beiden Phasen voneinander trennt und die Radioaktivität mindestens einer der festen und flüssigen Phasen bestimmt, wobei der Wert der Radioaktivität jeweils eine Funktion der Konzentration des Hormons in der Serumprobe ist.

5« Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung quantitativ durch Vergleich des gemessenen

Wertes der Radioaktivität mit einer Standardkurve erfolgt·

6· Verfahren nach Anspruch 4· oder 5» dadurch gekennzeichnet, daß als Blockierungsmittel 8-Aniiino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) verwendet wird,

7 ο Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der flüssigen Phase getrennt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4· bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß als zu bestimmendes Schilddrüsenhormon Thyroxin (T-4-) und als Blockierungemittel 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) verwendet werden und daß die Abtrennung der festen Phase durch Zentrifugieren oder Filtrieren erfolgt·

9c Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß als zu bestimmendes Schilddrüsenhormon Trijodthyronin (T-3) und als Blockierungsmittel 8-Anilino-1-naphthalinsiüfoneäure (ANS) verwendet werden und daß die Abtrennung der festen Phase durch Zentrifugieren oder Filtrieren erfolgt.

Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyacrylamid-Teilchen in jeder untersuchten Serumprobe in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 2,5 mg enthalten sind.

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11· Verfahren nach eines der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet! daß als Polyacrylamid-Teilchen eine Kombination aus Teilchen, an die Antikörper gebunden sind, und aus von Antikörpern freien Teilchen verwendet wird, wobei der jeweilige Mengenanteil ausreicht, üb eine Tracer-Bindung von etwa 20 bis etwa 80 % zu erzielen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Mengenanteil der Teilchen so ausgewählt wird, daß eine Tracer-Bindung von etwa 50 bis etwa 60 % erzielt wird.

13· Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß Kindest ens einige der Polyacrylamid-Teilchen mindestens einen Farbstoff aus der Gruppe Alcian-Blau und Alcian-Gelb daran adsorbiert enthalten.

Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei einer Temperatur von etwa 37 bis etwa 50°G durchgeführt wird, um die Inkubationsdauer abzukürzen·

15· Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockierungsmittel und das radioaktiv markierte Hormon vor dem Mischen mit der Serumprobe miteinander kombiniert werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockierungsmittel und das radioaktiv markierte Hormon, die vorher miteinander kombiniert worden sind, vor dem Mischen mit der Serumprobe lyophilisiert und mit einem Puffer verdünnt werden·

17· Eeagens für die Verwendung in einem Kadioimmun—Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus oder enthält hydrolysierte, vernetzte Polyacrylamid-Teilcnen, die mindestens einen Farbstoff aus der Gruppe Alcian-Gelb und

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f) p r '■> η ο ί 2 O D :-> Ij 3 /.

Alcian-Bi.au aar

18«, Reagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet _t daß es den Parhstoff in einer Menge von 0,25 his 1,5 g pro 100 g Teilchen enthält.

19o Reagens nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyacrylamid-Teilchen eine solche Größe aufweisen, daß sie eine stabile hydrophile Suspension bilden, und daß sie in Mischung mit zusätzlichen ähnlichen Teilchen vorliegen, die jedoch kovalent an Antikörper gebunden sind.

809 809/0619 _0RIGINAL ,NSPECTED