DE3002996A1

DE3002996A1 - Vorrichtung zur plasmadirektinjektion mit automatischer anreicherungs- und waschphase fuer die quantitative hochleistungsfluessigkeitschromatographie

Info

Publication number: DE3002996A1
Application number: DE19803002996
Authority: DE
Inventors: Klaus 7950 Biberach Beschke; Willy Dr. Dipl.-Chem. Roth
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-01-29
Filing date: 1980-01-29
Publication date: 1981-07-30

Description

Vorrichtung zur Plasmadirektinjektion mit automatischer
Anreicherungs- ind Waschpase für kr dz qiin i ti j v Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Plasmadirektinjektion- mit automatischer Anreicherungs-, Wasch- und Chromatographiephase für die quantitative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, z. B. bei der Bestimmung von Pharmaka oder deren Metaboliten im Plasma.
Mit der raschen Entwicklung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in den letzten Jahren und der damit verbundenen universellen Detektionsmöglichkeiten zur Erfassung kleinster Substanzmengen eröffncten sich für die pharmazeutische und biochemische AnaLytik neue Möglichkeiten, z. B. bei der Bestimmung von Wirkstoffzusammensetzungen in galenischen Formen, bei der Ermittlung von Inhaltsstoffen in Drogen, bei der Auffindung von Pharmaka und deren Metaboliten in Körperflüssigkeiten im Rahmen pharmakokinetischer Studien.
Bisher begnügte man sich bei der Probenvorbereitung und Probenaufarbeitung vor der Durchführung einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit klassischen und damit arbeitsintensiven und zeitraubenden, aber auch mit ein.er Vielzahl von mit Fehlermöglichkeiten behafteten Aufarbeitungsmethoden. Die Probenaufarbeitung ist in ihren Verfahrensschritten auf die zu bestimmenden Substanzen abgestimmt. Im folgenden sollen die Schritte bei einer gängigen Probenvorbereitung für die Hochlelstungsflüssigkeitschromatographie, dargestellt an der Isolierung einer Substanz aus Humanplasma, aufgezählt werden: Gewinnung des Plasmas, Abpuffern des selben mit einer Säure oder Base, Auswahl und Hinzufügen des internen Standards, Vorsetzen des Plasmas mit-einem Extraktionsmittel, mechanische Extraktion, Durchführung einer Phasentrennung, Filtration bzw. Evaporation, Wiederauflösen des gewonnenen Rückstands und Injektion in den Hochleistungsflüssigkeitscbromatographen.
Es wurde nun ebr. W2g gefunAen,~ der routinemäßig eine Aufarbeitung der zu untersuchenden Substrate, z. B. Humanplasma oder Urin, unter Ausschaltung der oben beschriebenen klassischen Methoden zur Probenvorbereitung, gestattet. Dieser neue Weg wird durch eine Vorrichtung ermöglicht, die eine Plasma- bzw.
Urindirektinjektion in zwei oder mehreren alternierend geschalteten Anreicherungssäulen vorsieht, wobei diese Anreicherungssäulen (im folgenden auch Vor säulen genannt) über automatisch und/oder manuell steuerbare Mehrwegventile mit der eigentlichen chromatographischen Trennsäule verbunden sind. Das gesamte Anreicherungssystem, d. h. zwei oder mehrere Vorsäulen, steht mit dem eigentlichen Trennsystem in Verbindung, wobei durch eine entsprechende Steuerung im Wechsel jeweils die Anreicherungssäulen mit der Probe beschichtet werden und gleichzeitig die im Plasma bzw. im Urin befindlichen Begleitstoffe, wie z. B. Proteine, Salze (polare wasserlösliche Metaboliten) , Harnstoff usw. der Vorsäule mit einem Spülmechanismus eluiert werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einem kontinuierlich arbeitenden Probenaufgabe-, Anreicherungs- und einem direkt damit verkoppelten Chromatographiesystem; sie gestattet die Durchführung einer Applikations-, Anreicherungs- und Waschphase und einer damit verkoppelten Chromatographiephase. Die Gesamtvorrichtung besteht im einzelnen aus einer Injektionsstelle für die Probenaufgabe in Verbindung mit einem Verteilungssystem, z. B. einem Mehrwegventil, einem 6-Weghahn, der einerseits mit einem Dosierungssystem, z. B. einer das Applikationsvolumen dosierenden Probeschleife, andererseits mit einer die Spülflüssigkeit unter Druck setzenden Pumpe in Verbindung steht und der die Entnahme der in dem Dosiersystem anstehenden Probemenge durch die Spülflüssigkeit gestattet. Dieses Mehrwegventil, das die Probenaufgabe regelt, kann auch durch andere, vollautomatisierte Probennahme - oder Applikationssysteme ergänzt oder gegebenenfalls trsetzt werden; im allgemeinen werden 10 bis 2000 ul Probenflüssigkeit programmiert appliziert.
Die Vorsäulen stehen über ein weiteres druckfestes Verteilerelement, z. B. bei Vorliegen von 2 Vorsäulen, über einen 6-Weghahn, miteinander in der Weise in Verbindung, daß bei der Beschickung der einen Vor säule mit dem Probengut und der Spülflüssigkeit, die Spülflüssigkeit mit etwaigen störenden Begleitstoffen ausgeschleust wird, während gleichzeitig.das durch eine Pumpe unter Druck gesetzte Eluens durch die andere Vorsäule fließt, wo es die dort adsorbierten Substanzen aufnimmt und über das vostéhend~~bes^chrïebene Mehrwegverteilersystem in die Chromatographiesäule einbringt. Durch entsprechendes Umschalten des die beiden Vor säulen und die Eluens-zuführende Pumpe verbindenden Mehrwegventils bzw. -hahnen erfolgen die Spülphasen der Vorsäulen im Wechsel (alternierende Vorsäulenschaltung").
Zum besseren Verständnis sei auf die Zeichnung verwiesen, die eine beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemäße-n Vorrichtung schematisch aufzeigt. In dieser Zeichnung-ist (1) das Probenahme- oder Applikationssystem in Form eines 6-Weghahns, (12) ist die Injektionsstelle, (13) ist der Auslaß in eine, die Probenmenge volumenmäßig bestimmende Doserschleife (14), die über den Einlaß (1.5) mit dem 6-Weghahn (1) verbunde-n ist. Nach Füllen der Prohenchieife (14) wird das Ventil umgeschaltet und das in (14) befindliche Probengut iiber (18) auf (21) weiter geleitet. Der Weitertransport geschieht mit der durch die Pumpe (19)', die über den Einlaß (17) mit dem 6-Weghahn (1) in Verbindung steht, unter Druck eingeführten Waschflüssigkeit; letztere drückt, nach der Herstellung einer Verbindung zwischen Einlaß (17) und Auslaß (13), die Probe aus der Dosierschleife (14) über den Einlaß (15) in den Auslaß (18).
Das die Verteilung auf die Vor säulen regelnde 6-Wegventil (2) ist mit dem 6-Wegventil (1) über den Einlaß (21 verbunden, die Aus- bzw. Einläße (22) und (26) sind an die Vorsäulen (5) und (4) angeschlossen, der Auslaß (23) bedient die Chromatographiesäule (6),, die noch mit einem Detektor (7) verbunden ist. Die Ein- bzw. Ausläße (24) und (25) dienen zur Verbindung des Einlaßes (26) mit dem Auslaß (23). In der Zeichnung sind, durch ausgezogene Linien, die Verbindungen so eingestellt, daß die das Probengut.mitführende Waschflüssigkeit durch die Vorsäule (5) fließt und gleichzeitig das die Vorsäule (4) durchströmende Eluenz in Richtung auf die Chromatographiesäule (6).
Das die beiden Vorsäulen (4) und (5) verbindende druckfeste Verteilerelement, in der Zeichnung als 6-Weghahn (3) dargestellt, steht über den Einlaß (31) mit der Vorsäule (5) und dem Einlaß (35) mit der Vorsäule (4) in druckfester Verbindung.
Der Auslaß (32)-dient ur: Austeaung der Waschflüssigkeit, die gegebenenfalls noch einem Detektor (8) zugeführt werden kann oder ansonctcn' vcl:worrcn wird. Der linla,3 (36) steht mit der Pumpe (37) in Verbindung, während die Ein- bzw. Ausläße (33) und (3,4) einerseits sowie 24 und 25 andrerseits über kurze Kapillarschleifen miteinander verbunden werden. Der 6-Weghahn (3) ist, in der Zeichnung durch durchgezogene Linien angedeutet, so geschaltet, daß die aus der Vorsäule (5) austretende Waschflüßigkeit zum Detektor (8) geleitet und anschließend verworfen wird, während gleichzeitig das von der Pumpe (35) gelieferte Eluens über die Ein- bzw. Ausläße (36) und (35) in die Vorsäule (4) fließt, wo es die adsorbierten Substanzen aufnimmt und über den 6-Weghahn (2) der Chromatographiesäule (6) zuführt.
Es ergibt sich folgendes Arbeitsprinzip: nach der Injektion einer Probe (z. B. einer Plasmaprobe) steht eine Flüssigkeit mit einem bei der Verwendung einer Vorrichtung gemäß der Zeichnung, beispielsweise durch die Dosierschleife (14) definierten Applikationsvolumen für die anschließende Chromatographie zur Verfügung. Durch Umschalten des 6Weghahns (1) wird die Plasmaprobe auf die Vorsäule (5) gespült, wobei die zu detektierende Substanz an dieser Vorsäule angereichert und die Plasmabegleitstoffe (z. B. Salze, Proteine) durch die Spülung durch die Pumpe (19) aus dieser Vorsäule entfernt werden, indem der Einlaß (31) mit dem Auslaß (32) des 6-Weghahns (3) gekoppelt ist.
In der gleichen Zeit wird durch die Pumpe (37) das Eluens in die Vorsäule (4) gepumpt, wo es diese zu bestimmende Substanz, die zuvor am Trägermaterial dieser Vorsäule spezifisch adsorbiert wurde, ablöst und von dort in die Chromatographiesäule (6) transportiert. Damit das wechselseitige Be- und Entladen der beiden Vorsäulen (4) und (5) zum richtigen Zeitpunkt erfolgt, wird parallel zu der erfolgten Applikation des Probegutes über den Probegeber (in der Zeichnung nicht gesondert dargestellt) ein an sich bekanntes, elektrisches Zeitelement in Gang gesetzt, das die Dauer der Waschphase (z. B. 5 Minuten) auf der Vorsäule kontrolliert und, nach deren Beendigung die Schalthähne (2) und (3) z. B. pneumatisch oder elektrisch ansteuert; hierbei wird gleichzeitig beispielsweise ein Integrator-Schreiber in Gang gesetzt.
Der Schaltvors er -z. o: pneuPati.schen Hähne (2 und 3 in der Zeichnung) bedingt nun zwei Folgereaktionen: Einmal wird die auf der Vorsäule (5) angereicherte Substanz in den Eluentenstrom der Pumpe (37) geschaltet. Pumpe (37) fördert mit einem für die eigentliche Chromatographie zusammengestellten Eluens (z. B. Methanol/Wasser bzw. Puffer), die zuvor auf der Vorsäule (5) angereicherte und von Begleitstoffen geklärte Substanz im "Backflush" auf die chroma.tographische Säule (6) (z. B.
Länge = 120 mm x 4,6 mm innerer Durchmesser), die mit Reversed Phase Material gepackt ist. Gleichzeitg wird bei dem eben eingeleiteten Schaltvorgang die zweite Vorsäule (4) in den von Pumpe (19) -geförderten Wasserstrom geschaltet. Hierdurch wird die Vorsäule (4) vom Eluens der Pumpe (37) befreit und somit wieder für den neuen Anreicherungsschritt regeneriert und äquilibriert. Durch diesen Schalttrick wird sichergestellt, daß kein organisches Lösungsmittel mehr auf der Vorsäule (4) vorhanden ist, das einmal zur Denaturierung von Eiweiß führen könnte, und zum anderen einer Anreicherung auf dieser Vorsäule entgegenwirken könnte.
Der gesamte Zeittakt besteht somit aus einer Anreicherungs- und Waschphase auf der Vorsäule (4) bzw. (5) und einer chromatographischen Trennphase auf der Hauptsäule (6). Der Autosampler ist auf diese Gesamtzeit programmiert und stoppt über ein eingebautes "0quilibrierungsdelay" den Integrator/Schreiber. Die "Äquilibrierungsdauer" ist zeitlich so bemessen, daß während dieser Zeit der Schreiber/Integrator seinen Ausdruck durchführen, und auf "Ready" zurückgehen kann. Nach erneuter Applikation des Probengebers wird wieder, wie bereits zuvor beschrieben, die elektronische Schaltuhr in Gang gesetzt, die dann wieder nach Ablauf der Waschphase (Vorsäule 5) die pneumatischen Ventile und den Integrator/Schreiber startet, etc.
Die Vorsäulen weisen beispielsweise eine Länge von 20 mm und einen inneren Durchmesser von 4,6 mm auf. Die Flußrate in den Vorsäulen beträgt vorzugsweise ca. 1 ml/min. Die Vorsäulen sind mit einem für die Anreicherung geeigneten Füllmaterial (z. B.
Reversed Phase- oder Ionenaustauschermaterial, Teilchengröße 20-50 um) gepackt.
Das erfindungsgemäße V-rfa}.ren hic-tet gegenüber den herkömmlichen anal.ytischen Methoden zul- Probenvorbereitung für die fiochleistungsflüßigkeitschromatographie folgende Vorteile: es entfallen zeitaufwendige, teure und kapazitätsbelastende Probenaufarbeitungsstraßen oder Aufarbeitungstechniken, es genügt nur ein Pipettierschritt, es entfällt die flüssig-flüssig Extraktion, desweiteren das Finengen von Lösungsmitteln, die Frstellung eines internen Standards, desweiteren wird die Probenverwechslungsgefahr verringert und die zu untersuchende Probenmengen, z. B. Plasmamengen, sind mengenmäßig sehr variabel. Hinzu kommt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung voll automatisierbar ist und sogar einen Nachtbetrieb erlaubt.

Claims

- ^~ ~*Pa.sntarsptüche 1. Vorrichtung zur Probendirektinjektion mit automatischer Anreicherungs- und Waschphase für die quantitative Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus einem mit einem Probennahme- oder Applikationssystem zusammenschaltbaren Verteilungssystem (1), das in druckfester Ver.bindung mit einer die Spülflüssigkeit zuführenden Pumpe (19) verbunden ist, aus einem mit dem Verteilungssystem (1) druckfest verbundenen Mehrwegventil (2), aus daran angeschlossenen Vorsäulen (4) .bzw. (5), die an ihrem anderen Ende mit einem Mehrwegventil (3) mit daran angeschlossener Pumpe (37) druckfest ,verbunden sind, und aus einer an das Mehrwegventil (2) angeschlossenen Chromatographiesäule (6) besteht.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verteilungssystem (1) eine Injektionsstelle (12) aufweist, desweiteren eine mit dieser Stelle (12) verbindbare Außlaßstelle (13), die ihrerseits mit einer Dosierschleife (14) Sest: verstanden ist, die an ihrem anderen Ende an einen Einlaß (15) anschließt, der wechselseitig mit einem offenen Auslaß (16) bzw. mit einem, mit der Pumpe (19) in Verbindung stehenden Einlaß (17) verbunden sein kann und deren Einlaß (17) wiederum mit einem Auslaß (18) zum Weitertransport der Flüssigkeit in Verbindung gebracht werden kann.
3. Vorrichtunt gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mehrwegventil (2) mit dem Verteilungssystem (1) über den Einlaß (21) druckfest in Verbindung steht, andererseits aber druckfest mit zwei oder mehreren Vorsaulen, z. B. (4) und (5) über entsprechende Auslässe bzw.

Einläße, z. B. (22) und (26) gekoppelt ist, einen mit den Aus- und Einläßen (22) und (26) verbindbaren Auslaß (23) aufweist, der seinerseits mit einer Chromatographiesäule (6) verbunden ist.
4. Vorrichtung-en.äß Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mehrwegventil (3) über Ein- bzw. AusgÄngo (31) bzw. (35) mit den Vorsäulen (5) hzw. (4) druckdicht verbunden ist, der Ausgang (32) nach außen führt und der Eingang (36) mit einer Pumpe (37) in Verbindung steht, wobei Aus- bzw. Eingänge (33) und (34) mit den Aus- bzw.

Eingängen (32) und (35) schaltbar sind, und die Vorsäule (4) mit dem Einlaß (26) des Mehrwegventils (2) im Eingriff steht.
5. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn- -zeichnet, daß die Chromatographiekolonne mit einem Detektor (7) und der Auslaß (32) des Mehrwegventils (3) mit einem Detektor (8) in Verbindung stehen.
6. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein elektrisches Zeitelement die Schalthähnen bzw. Mehrwegventile (1), (2) und (3) und den Integrator elektrisch oder pneumatisch ansteuert, und ein Autosampler, auf den gesamten Zeittakt programmiert, einen Äquilibrierungsverzögerer elektrisch beeinflußt und damit auch den Integrator mit Schreiber.