DE2951639C2

DE2951639C2 -

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Publication number: DE2951639C2
Application number: DE19792951639
Authority: DE
Inventors: Erich Dipl.-Chem. Dr. Cohnen; Ben Dr. 2000 Hamburg De Armah
Original assignee: Individual
Current assignee: ARMAH, BEN, DR., 2000 HAMBURG, DE
Priority date: 1979-12-21
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1989-06-15
Also published as: DE2951639A1

Description

Gegenstand der Erfindung sind 1,2,4-Triazin- Derivate, nämlich Tetrazolo [1,5-f][1,2,4]triazin-6,8(5H,7H)- dion der Formel (I)

und 6-Azido-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion der Formel (II)

sowie deren physiologisch verträgliche Salze, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und ihre Verwendung als am Tier physiologisch wirksame Mittel zur Erzeugung von Hyperuricämie.

Verbindungen der Formel (I) und (II) und die Salze sind kompetitive Inhibitoren der Uricase, einem Enzym, das bei den meisten Säugern die Umwandlung von Harnsäure in Allantoin reguliert. Beim Menschen und einigen Primaten dagegen ist Harnsäure das Endprodukt des Purinstoffwechsels, da beim Menschen und bei diesen Primaten dieses Enzym fehlt. Eine Erhöhung der Harnsäure im Serum (Hyperuricämie) manifestiert sich in einer Reihe von Erkrankungen wie Gicht oder Nierensteine.

Das Studium der Hyperuricämie beim Menschen und deren Beeinflussung durch Arzneimittel erfordert ein geeignetes Tiermodell. Die Verwendung normaler Laboratoriumstiere ist wegen des durch das Enzym Uricase bedingten Abbaus der Harnsäure zu Allantoin nicht möglich. Es ist bekannt, daß eine Hemmung der Uricase-Aktivität in vivo durch selektive Inhibitoren des Enzyms ein geeignetes Testmodell zur Bestimmung der uricosurischen Wirkung von Arzneimitteln darstellt. Als wirkungsstarke Verbindung einer Reihe von s-Triazinen erwies sich in vitro und in vivo das Kalium-Salz der 1,3,5-Triazin- 2,4(1H,3H)-dioxo-6-carbonsäure = Oxonic acid (vergl. z. B. C.A., Bd. 71, [1969], Ref. 37398c).

Die erfindungsgemäßen 1,2,4-Triazin-Derivate und deren Salze, beispielsweise die Natriumsalze, besitzen eine vergleichbare inhibitorische Wirkung in vitro, sind aber in vivo der Oxonic acid deutlich überlegen. Während Oxonic acid i.p. injiziert werden muß, können die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Salze wegen ihrer leichten Löslichkeit in Wasser dem Trinkwasser der Versuchstiere beigegeben werden. Oxonic acid hemmt, selbst wenn sie in hohen Dosen (250 mg/kg i.p.) verabreicht wird, die Uricase nur kurzfristig, dagegen beobachtet man nach Gaben von 20-50 mg/kg der erfindungsgemäßen Verbindungen an Katzen einen über viele Stunden stark erhöhten Serum-Harnsäure-Spiegel. Aus C.A., Bd. 90, [1979], Ref. 145664n ist bekannt, daß Allantoxanamid ein wirksamer Uricaseinhibitor in vivo ist. Allantoxanamid ist ebenfalls peroral unwirksam. Desweiteren geht aus C.A., Bd. 80, [1973], Ref. 23149w hervor, daß 2,8-Diazahypoxanthin und 8-Azaxanthin ebenfalls wirksame Uricaseinhibitoren in vivo sind.

Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht dem Futter oder Trinkwasser der Tiere zugemischt, können sie auch als solche oder in Form ihrer Salze, gegebenenfalls mit geeigneten festen oder flüssigen physiologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gebräuchlicher Art vermischt, zur Herstellung von Lösungen für Injektionszwecke und insbesondere von peroral zu verabreichenden Präparaten, wie Dragees, Tabletten oder Liquida, verwendet und dann in dieser Form verabreicht werden.

Als Hilfs- und Trägerstoffe können beispielsweise die auch zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten geeigneten Stoffe wie Milchzucker (Lactose), Gelatine, Maisstärke, Stearinsäure, Äthanol, Propylenglykol, Äther des Tetrahydrofurfurylalkohols und Wasser dienen.

Die Verbindungen der Formeln I und II sowie deren Salze können durch Umsetzung von 6-Brom-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)- dion der Formel (III)

mit einem Alkalimetallazid erhalten werden. Ein geeignetes Alkalimetallazid ist z. B. Natriumazid. Die Ausgangsverbindung (III) ist in der Literatur beschrieben.

Die Reaktion wird mit einem Überschuß des Azids in wäßriger Lösung bei erhöhter Temperatur durchgeführt. Dabei cyclisiert das primär entstehende 6-Azido-1,2,4-triazin-3,5-(2H,4H)- dion der Formel (II) spontan zum Tetrazolo [1,5-f][1,2,4]triazin- 6,8(5H,7H)-dion der Formel (I) unter Bildung eines Alkalisalzes.

Die Cyclisierungsreaktion ist unter sauren Bedingungen reversibel; bei Behandlung der Verbindung (I) mit starken Säuren wie Mineralsäuren oder Kationen-Austauschern öffnet sich der Tetrazolring unter Bildung der Azidoverbindung der Formel (II).

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1 Tetrazolo[1,5-f][1,2,4]triazin-6,8(5H,7H)-dion

19,2 g (0,1 M) 6-Brom-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion werden mit 26,0 g (0,4 M) NaN₃ in 80 ml Wasser 7 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung wird der Niederschlag filtriert und aus 50 ml Wasser umkristallisiert. Man erhält 15,4 g Tetrazolo [1,5- f][1,2,4]triazin-6,8(5H,7H)-dion als Natriumsalz (C₃H₁N₆O₂Na + H₂O). Fp. über 300°C (Z).

IR-Spektrum (KBr): 1700 (C=O), 1640 (C=N), 3450 cm^-1(NH)

Beispiel 2 6-Azido-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion

10 g Tetrazolo [1,5-f][1,2,4]triazin-6,8(5H,7H)-dion werden in 100 ml konzentrierter Salzsäure gelöst und 15 Stunden bei Raumtemperatuur gerührt. Nach Filtration wird eingedampft und der Rückstand mit wenig Eiswasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 5,2 g 6-Azido-1,2,4-triazin-3,5-(2H,4H)-dion. Fp. 173°C (Z).

IR-Spektrum (KBr): 1650-1750 (C=O), 3240 (NH), 2150 cm^-1 (N₃).

1. In vitro Untersuchungen Enzymkinetische Untersuchung von Hemmsubstanzen der Uricase

Mit Uricase aus Schweineleber (Fa. Boehringer, Best.-Nr.: 127469) wurde der Harnsäureabbau und seine Hemmung durch die Substanzen (I) und (II) des Patentes im Vergleich mit Oxonic acid gemessen. Die Bestimmungen wurden nach der Vorschrift der Fa. Boehringer durchgeführt:

Durch die Uricase wird die Harnsäure + H₂O + O₂ zu Allantoin + H₂O und CO₂ abgebaut, die optische Dichte nimmt entsprechend der Harnsäurekonzentration ab.

Boraxpuffer 20 mmol/l, pH 9,1; 10 min O₂ begast
3,0 ml/Ansatz
Harnsäure in Boraxpuffer	0,1 ml/Ansatz
Uricase	0,02 ml/Ansatz
	3,12 ml

Es wird bei einer Wellenlänge von 293 nm,, einer Schichtdicke von 1 cm und der Temperatur von 25°C gemessen. Das Endvolumen in der Küvette beträgt 3,12 ml. Die Reaktion wird durch die Zugabe der Uricase gestartet. Der Abbau der Harnsäure im Ansatz wurde aus dem Mittelwert der Δ E-Differenzen/min berechnet. Die Hemmung des Harnsäureabbaus durch die Substanzen (I) und (II) des Patentes und der Oxonic acid wurde mit dem Harnsäureabbau ohne Hemmstoff verglichen, bei gleichem Volumen in der Küvette und gleicher Uricase-Konzentration.

Ergebnis

Das Ergebnis ist in der Tab. 1 zusammengestellt. Die K_i-Werte zeigen eine Hemmung der Enzymaktivität durch die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) und (II) sowie durch Oxonic acid.

Tabelle 1

Hemmung der Uricase-Aktivität aus der Schweineniere durch Testsubstanzen

2. In vivo Untersuchung mit ¹⁴C-Harnsäure

Katzen im Gewicht von 2-4 kg wurden mit Urethan-Chloralose narkotisiert. Bei spontaner Atmung wurde Ringerlösung 0,2 ml/min in die Vena femoralis infundiert. Die Harnleiter wurden katheterisiert und der Harnfluß nach außen abgeleitet und diskontinuierlich gesammelt. ¹⁴C-Harnsäure (55 μCi/Tier) wurde den Katzen intravenös injiziert. Nach 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5 und 6 Stunden wurde der Harn gesammelt und der Anteil von ¹⁴C-Harnsäure bzw. ¹⁴C-Allantoin mit Radio-DC ermittelt.

Die Verbindung (I) (BE 3231) wurde in Dosen von 20 und 50 und 100 mg/kg i.v. verwendet. Die Verbindung (II) (BE 6509) wurde in Dosen von 20 und 50 cm/kg geprüft. Die Oxonic acid-Dosen betrugen 10, 50 und 100 mg/kg. Zu den oben angegebenen Zeiten nach Behandlung wurden Harnproben entnommen.

Die kinetische Halbwertzeit wurde als diejenige Zeit definiert, bei der ¹⁴C-Harnsäure zu 50% in ¹⁴C-Allantoin umgewandelt wurde, d. h. der Zeitpunkt bei dem das Verhältnis ¹⁴C-Harnsäure/¹⁴C-Allantoin 1 : 1 betrug.

Eine langandauernde Uricasehemmung hatte somit eine längere "Halbwertzeit" zur Folge.

Ergebnis

Die Abb. 1 zeigt die gemessenen Eliminationsgeschwindigkeiten für ¹⁴C-Harnsäure unter Kontroll-Bedingungen sowie nach der Behandlung mit der Verbindung (I) (BE 3231) bzw. mit der Verbindung (II) (BE 6509) bzw. mit Oxonic acid.

Unter Kontrolle wurde nach 30 min nur 10% der verabreichten Radioaktivität als ¹⁴C-Harnsäure wiedergefunden.

Schon die Dosis 20 mg/kg der erfindungsmäßigen Verbindungen führten zu einer Verzögerung der Umwandlung von ¹⁴C-Harnsäure in Allantoin. Die 50% Aktivität wurde bei 20 mg/kg nach 3 bzw. 3,5 Stunden für Verbindung (I) bzw. (II) ermittelt. Diese Halbwertzeit erhöhte sich dosisabhängig. Bei Oxonic acid betrug die Halbwertzeit für ¹⁴C-Harnsäure 1-1,5 Stunden. Die Wirkungsdauer von Oxonic acid war nicht dosisabhängig wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich ist.

Tabelle 2

Halbwertzeit für die 50%ige Umwandlung von ¹⁴C-Harnsäure in ¹⁴C-Allantoin. Das Verhältnis Harnsäure/Allantoin = 1 : 1 im Harn wurde nach folgenden Zeiten erreicht:

Die erfindungsgemäßen Substanzen haben eine bedeutend längere Hemmung der Uricase-Aktivität zu verzeichnen und sind der Oxonic acid in dieser Hinsicht deutlich überlegen.

3. Nachweis der oralen Wirksamkeit

Weibliche Wistar-Ratten in Gruppen von 8 Tieren wurden mit Verbindung (I) (BE 3231) in Dosen von 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 und 100 mg/kg behandelt. Anschließend wurden die Ratten mit 5 ml/Tier einer 0,3%igen Kochsalz- Lösung oral belastet und in Stoffwechselkäfigen gehalten.

Der Harn wurde über 5 Stunden kumuliert gesammelt und der Harnsäuregehalt mit der photometrischen Phosphorwolframsäure-Methode nach Sobrinho/Simoes (Boehringer Ingelheim Diagnostica) bestimmt.

Alle genannten Dosen der Verbindung (I) wurden sowohl parenteral (subcutan, intraperitoneal) als auch peroral an getrennten Gruppen von je 8 Tieren verabreicht.

Bei einer Gruppe von 8 mit 100 mg/kg p.o. der Verbindung (I) behandelten Tieren wurde die Harnsäure stündlich sowohl im Harn wie auch im Blutserum bestimmt.

Ergebnis

Im Vergleich zur subcutanen wie auch zur intraperitonealen Applikation hatte die perorale Verabreichung von Verbindung (I) die stärkste Ausscheidung von Harnsäure im Harn zur Folge. Wie aus Abb. 2 ersichtlich, hatte die orale Dosis von 1 mg/kg und aufwärts eine beträchtliche Harnsäure Ausscheidung zur Folge. Die Erklärung für die stärkere Harnsäure-Ausscheidung nach oraler Gabe liegt wohl darin, daß die Enzym-Aktivität in der Leber am größten ist und nach oraler Gabe schneller beeinflußt wird. Die Abb. 3 zeigt ferner den Verlauf der Harnsäure-Konzentration im Harn bzw. im Blut nach einmaliger oraler Verabreichung von Verbindung (I) (BE 3231) an 8 Wistar-Ratten. Es zeigte sich, daß die durch Uricasehemmung hervorgerufene Erhöhung der Harnsäure in Blut und Harn noch bis zu 24 Stunden andauerte.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die erfindungsmäßigen Verbindungen in vivo eine der Oxonic acid vergleichbare Hemmwirkung auf die Uricase-Aktivität haben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben im Vergleich zur Oxonic acid eine signifikant längere Hemmung der Uricase-Aktivität nach intravenöser Applikation.

Im Gegensatz zu der oral nicht wirksamen Oxonic acid haben die erfindungsmäßigen Verbindungen eine ausgezeichnete orale Wirksamkeit zu verzeichnen.

Claims

1. Tetrazolo [1,5-f][1,2,4]triazin-6,8(5H,7H)-dion der Formel (I) und 6-Azido-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion der Formel (II) sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung (I) bzw. deren Salze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Brom- 1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion der Formel (III) mit einem Alkalimetallazid in wäßriger Lösung bei erhöhter Temperatur umsetzt.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung (II) bzw. deren Salze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Brom- 1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion (III) mit einem Alkalimetallazid, in wäßriger Lösung bei erhöhter Temperatur umsetzt und das erhaltene Tetrazolo [1,5-f][1,2,4]triazin-6,8-(5H,7H)-dion mit starken Säuren behandelt.

4. Am Tier physiologisch wirksames Mittel zur Erzeugung von Hyperuricämie, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere der Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder deren verträgliche Salze und gegebenenfalls übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel enthält.