DE2822568A1 - Dns-transfer-vektor und ein gen eines hoeheren organismus enthaltender mikroorganismus - Google Patents

Description

Unsere Nr. 21 974 D/wl

The Regents of the University of California
Berkeley, Ca., V^St.A.

DNS-Transfer-Vektor und ein Gen eines höheren Organismus enthaltender Mikroorganismus

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthält, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen und Waehstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehören ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält.

Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet:

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DNS = Desoxyribonukleinsäure RNS - Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS

(enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)

mRNS - messenger-RNS tRNS = transfer-RNS dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat A = Adenin T = Thymin G = Guanin C = Qytosin Tris = 2-Amino-2-hydroxy-ethyl-1,3-propandiol EDTA = Ethylendiamin-tetraessigsäure ATP = Adenosintr!phosphat TTP = Thymidintriphosphat

Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information. Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt. Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.

Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.

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Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe)	TTK	Histidin (His)	CAK
Leucin (Leu)	XTY	Glutamin (GIn)	CAJ
Isoleucin (lie)	ATM	Asparagin (Asn)	AAK
Methionin (Met)	ATG	Lysin (Lys)	AAJ
Valin (VaI)	GTL	Asparaginsäure (Asp)	GAK
Serin (Ser)	ORS	Glutaminsäure (GIu)	CAJ
Prolin (Pro)	CCL	Cystein (Cys)	TGK
Threonin (Thr)	ACL	Tryptophan (Try)	TGG
Alanin (AIa)	GCL	Arginin (Arg)	WGZ
Tyrosin (Tyr)	TAK	Glycin (GIy)	GGL
Terminationssignal	TAJ
Terminationssignal	TGA

Schlüssel: Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-EmIe links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:

A G C T

Adenin Guanin Cytosin Thymin

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ORIGINAL INSPECTED

X=T oder C, falls Y=A oder G X=C, falls Y=C oder T Y = A, G, C oder T, falls X=C Y=A oder G, falls X=T W=C oder A, falls Z= A oder G W=C, falls Z=C oder T Z = A, G, C oder T, falls W=C Z=A oder G, falls W=A QR = TC, falls S = A, G, C oder T QR = AG, falls S=T oder C S = A, G, C oder T, falls QR = TC S=T oder C, falls QR = AG J=A oder G

K=T oder C

L = A, T, C oder G M = A, C oder T

Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.

In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an dem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb

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der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.

Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel 1st die Herstellung des Insulins.

Der direkte Vorläufer des Insulins ist ein Polypeptid, das Proinsulin, das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner, D. P. Cunningham, D., Spigelman, L. und A ten, B., Science I57, 697 (I967). Kürzlich wurde berichtet, dass das erste Translationsprodukt von Insulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre-proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins enthält, vergleiche Cahn, S.J. Keim, P. und Steiner, D.P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA JJ^ 1964 (1976), und Lomedico, P.T. und Saunders, G.P. Nucl.Acids Res. ^ 38I (1976). Die Struktur des Pre-proinsulinmoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden: NHp-(Pre-peptid)-B-Kette-(C-Peptid)-A-Kette-COOH.

Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke. Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organismus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen

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Ursprungs. Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen ausserhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten. Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.

Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch def.-rinierten Medien gezüchtet werden. Die Permentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar. Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Ausserdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten- und erkannten Organismen.

Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, dass die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet ausserdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins

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gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert werden, so dass sie Proteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktioneilen Eigenschaften codieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft Maßnahmen, um die genannten. Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschliesslich Enzym-katalysierter Reaktionen umfasst. Nachstehend werden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizziert.

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-covalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Doxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das j5'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang. Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelformigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Leder, P., Proc. Nati. Acad. Sei. USA §9^ 1408 (1972) und Efstratiadis, A., Kafatos, F.C. Maxam, A.F. und Maniatis, T. Cell. 1i_ 279 (1976).

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Restrictions-endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppeIsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restrictions-endonuclease bezeichnet. Restrictions-endonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelt. Einige Restrictions-endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen·Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R. J_vCrit.Rev. Biochem. Κ± 1235 (1976). Die ErkennungssteIlen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppeIsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segment gekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restrictions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions-endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichen

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kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, H.L.Shine, J. Goodman, H.M. Boyer, H.W. Rosenberg, J., Dickerson, R.E. Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S und Riggs, A.D.,Nature 26?, 748 (1976J,und Scheller. R.H. Dickerson, R.E. Boyer, H.W. Riggs, A.D. und ^Xtakura, K.,Science 196, 177 (1977)·

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder elnsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist,-vergleiche Vogt, V.M.^Eur. J.Biochem. 22i !92 (1975).

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem 3'-Hydroxyl be."w±rkt, . die zum Beispiel von zwei DNS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppeisträngigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind· vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., und Khorana, H.G., Proc. Natl.Acad.Sci., USA §Jj_ 1468 (1970).

Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbin-

CCliPPjSJD.

düngen, einschliesslich der 5 -terminalen Phosphat- in DNS hydrolysiert.

Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid. Als Plasraid bezeichnet man jede autonom DNS-replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtszelle nicht genetisch

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verbunden. Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen, obgleich

bei einigen des Molekulargewicht grosser als 10 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der WirtszeHe aufgrund des grossen Grössenunterschiedes abtrennen. Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachsturnsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Segment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertesplasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fähigkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können, zum Beispiel Gene der Arzneimittelresistenz.

Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben. Das Insulin wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht der Grundlagenforschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Insulin-Gen aus . anderen Organismen, einschliesslich Menschen, übertragen werden.

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Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Ausserdem entwickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man zum Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktioneilen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden. Ähnliche Betrachtungen gelten für den Fall der Wachstumshormone.

Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten

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zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäss veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich zum Beispiel die Möglichkeit zum Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemässen Mikroorganismen und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten, wobei die auf erfindungsgemässe Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetische Information enthaltende Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus.

Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten Pre-proinsulin, des Gens für Ratten-Wachtumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon. Danach kann davon ausgegangen werden, dass die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus wie zum Beispiel eines Wirbeltiers · auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich zum Beispiel der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören. Unter einem

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Mikroorganismus versteht man jeden mikrokopischenlebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und zum Beispiel aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliess»- lich Hefen, bestehen kann. Dn vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von Reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegnwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Strangs erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit Reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit Reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppelteträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man , am beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungsbzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.

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Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuolease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplementäre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5 -Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird. Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend rdsoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch isndonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.

Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschllesslich dem Menschen,und deren Transfer in einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die

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Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert.. Auf gleiche Weise wurde die für Ratten-Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz isoliert, taansferiert und in Bakterien repliziert. Die Methode ist auf den Transfer einer aus menschlichem Zellmaterial isolierten Nucleotidsequenz, zum Beispiel für menschliches Insulin und Wachstumshormon oder andere Iblypeptid hormone anwendbar.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.

Die das erfindungsgemasse Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden:

1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus

Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert: die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst, und eine RNS-ÜberSetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die USA vorgeschrieben, dass mensohliche Gene Jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, Bd. 41, Nr. 131, 7.7.1967, S. 27902-27943. Jedes Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegende

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Verfahren, arbeitet daher vorzugsweise mit der Isolierung der spezifischen mRNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache dass in hochdifferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Punktion hauptsächlich injier Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.

In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen: die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe, und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen anderen im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorge- · sehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird zum Beispiel die Isolierung von Langerhans'sehen Inseln

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aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.

Insulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Ihselzellen ist in diesen Fällen wesentlicbjeinfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zellkulturen. In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Ihselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil.

Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer be-, stimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachstumshormon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-mRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.

2. Extraktion der mRNS

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für

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den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbeeitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien. Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschendejwirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Ihselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.

Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewandt werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein. Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihrer Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus isolierten Langerhans'sehen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässrigen Medien und ihrer Verfügbarkeit. Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidinium-, Carbamoylguanidinium-, Guanylguanidinium-, Lithiumion.und dergleichen. Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Jodid, Perchlorat, Thiocyanat-, Diiodsalicylation und

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dergleichen. Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist zum Beispiel Lithium-diiodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, ausserdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wässrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5-Bi°l^a**en Lösungen.

Thiolverbindungen wie das ß-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in dieser Richtung wirksam, zum Beispiel ß-Merkaptoethanol, Dithiothrelt, Cystein, Propanoldimerkapt^und dergleichen. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in V/asser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ß-Merkaptoethanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.

Bei Uthibierung der RNase während der RNS-Extraktion aus Zellen oder' Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der Denaturierung. Dies erklärt möglicherweise die Überlegen- des Guanidiniumthioncyanats gegenüber dem Hydrochlorid, tratz der Tatsache, dass das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur

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vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird. Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in Bezug auf die Schwellenkonzentration, erhöht von der fünften zur zehnten Potenz; vergleiche Tanford, CA. Adv.Prot.Chem. 2^, 121 (1968). Diese Beziehung ergibt qualitativ, dass ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierung und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches Wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt. Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist.

Die Verwendung eines Disulfidfeindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhindert, die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben. Ferner wird jede, im mRNS-Präparat zurück-

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bleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Dena tür !erdungsmittel und Thiol. Disulfidbindungen spaltende Mittel mit üliiolgruppen sind bei Jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Biiolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen toevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft· Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht. Beim ß-Merkaptoethanol erwiesen sieh Konzentration im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0,2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet.

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Extraktion aus den Zellen kann im Bereich von pH 5*0 bis 8,0 liegen.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind. Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RNS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die Ausfällstufe umgangen und das Homogenäx "direkt auf eine 5*7-molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgtj vergleiche die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C, Biochemistry 13, 2633 (1974). Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für RNase ungünstige Umgebung aufrecht erhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt.

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Die obigen Verfahren führen zur 'Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat. Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadeny!säure. Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv, H. und Leder, P. loc.cit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.

Unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-Ihhibierung nicht erforderlich ist. In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.

J>. Bildung der cDNS

Figur 1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion Reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werdenjkönnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs aufgrund der als· Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die

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mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt. Zweck-, massig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate in ^- Stellung mit ;52_ρ markiert,, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu könnenj vergleiche Efstratiadis, A. et.al., loc.cit. Wie aus der Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nicht-covalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.

Das Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephadex G-LOO" (Hersteller Pharmacia Iac. Uppsala, Schweden) und Ausfällung mit Ethanol.

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden. Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.

Nach der alkalischen Hydrolyse und ansehliessenden Neutralisierung kann die mit 32_p markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.

Die Synthese einer doppeIsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder Reverser Transcriptase.

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Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in^C-Stellung mit 52p markierten Nucleosid-triphosphats. Die Reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Myeloblastosisvirus(das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephatex G-IOO" und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von Verunreinigendem Protein verwenden.

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfugung, die eine spezifische Hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die S 1-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit Basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben. Die Verwendung von Reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesehdoppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis, et.al., loc.cit. beschrieben«

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_ ilk _ ·

Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit sbiipfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coil-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier DeoxynucIeοsid-tr!phosphate. Die Kombination von Exonuclease- und Iblymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender j5'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt.

Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-endonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wiederum auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die ÖDNS zur rekombinieren ist. Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-endonuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H.O. und Wilcox, K.W., J.Mol.Blol.51, 379 (1970) gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton,. J.H., Edgell, M.H. und Hutchinson III, CA. J.Virol.10^ (1972) gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.

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Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstrangs. Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in Figur 1 dargestellte Senquenz, vergleicheHeyneker, H. L., et al. und Scheller, R.H., et al., loc,cit. Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endor.ucleasen ansprechen.

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A.,et al., Biochemistry 12, 50^5 (1975) gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc.cit. beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Erkennungssequenz an jedem Ende. Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind III-Endonuclease führt zur Spaiung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, siehe Figur 1.

4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS

zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene.

/hergestellten
Weise/cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen be-

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stehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdera eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health. Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Komtnittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von BakteriophagenX(vgl. zum Beispiel Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.Α., Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L. und Smithies, 0., Science I96, Ιοί (1977))und Derivate des Plasmids col El (Vgl. zum Beispiel Rodriguez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J., Rutter, CF., Fox. Eds. (Academic Press, NY, 1976) S. 471-477). Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der

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Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von col Elgehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclin· resistenz tragen, und pBR-j51j5, pBR-^15, pBR-316, pBR-317 und pBR-322, die ausser dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Amp .icillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El Verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen eine Hind III-Erkennungsstelle besass.

Wie beim Plasmid, kann auch die Wahl des geeigneten V/irtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-I776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind; vergleiche Curtiss, III, R., Ann.Rev.Microbiol., ^Q, 507 (I976). E. coli RR-I kann verwendet werden, wenn PjJ-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide, sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschliesslich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefen.

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Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkulieren. Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endenuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandt. Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5^!-feerminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination

+4 auf weniger als 1 bis 10 herab.

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Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer 5'-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer j5^f-Hydroxyl-DNS-Endgruppe. Wird die terminale 5'-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. Ist doppeisträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt:

Tabelle 1

Fall

Reaktionsteilnehmer

Ligase-Produkt

-OH- H 0 PO- -OPO-.HJ*" ^ί -³HO-

-OH -OH

•0H -OH

H₂O -,?-0-^J0H-

HO-HO-

3¹

3¹ 5^f

O-P-0

-O-P-0-

3' 5^r

O-P-0

OH HO

_+^H2°

5^f

keine Reaktion

In Tabelle 1 wird die doppeIsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wiedergegeben, wobei die 5'- und 3'-Endgruppen je näch-dem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen. Im Pall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden, Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente

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Bindung erfolgt, während im anderen Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nicht-co\alent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüber—liegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5^f~ Phosphatgruppe, so da-ss keine Bindungsreaktion eintreten kann.

Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS- nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H. G., Proc. Natl.,Sci USA 6J^ 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli.erhaltene Ligase verwenden, vergleiche Modrich, P. und Lehman, I.R., J.Biol.Chem. 245, 3626 (1970).

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Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfragmente wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Pragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5'-terminalen Phosphatgruppen der cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphatgruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 5'-Phosphatgruppe besitzen.

Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, das heisst hinten-an-vorn, statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung werden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.

Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens . wurde Ratteninsulin codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-I776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen gewonnene Heukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes

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DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche V/eise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder HSU I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc. Natl.Acad.Sci USA, jKj_ 56O (1977) ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für jRatten-Proinsulin I und Γ5 von 23 Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.

Auf ähnliche Weise wurde Wachstumshormon von Ratten codierende cDNS isoliert, mit einem Plasmid rekombiniert und in E. coli transferiert. Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorlauferpeptids und einen Teil der 5'-untrans-Iatierten Region enthielten.

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte, oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben,die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten. Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Ratten-Insulingen in E. coli. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide charakterisiert, die Teile von Ratten-Insulingen, Ratten-Wachtumshormongen, menschlichem Insulingen und menschlichem

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Wachstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen.

Beispiel 1

Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Inselzellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hank'scher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasgang. Die Hank'sehe Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung. Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hank¹scher Lösung von O C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Bihibitor verdaut. Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4 ⁰C, falls nichts anderes angegeben. Die Bedingungen bei der Verdauung sind äusserst kritisch. Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hank'scher Lösung werden in ein 30 ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon (Handelsbezeichnung Siliclad, Hersteller Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey) behandelt worden. Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym, (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I., Mackemän, J.D. und Howes, E.L., J.Clin. Invest. 32, 13^3 (1943) - Typ CLS IV, Hersteller Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey)und 1 mg Sojabohnentrypsin-Inhibitor, Hersteller Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C während 25 Min. unter Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute. Ständige Beobachtung war erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kollagenase-Verdauung in optimalem Ausmass verlief. Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung. Nach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min. bei 200 χ G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert

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der Kuchen wurde mit Hank¹scher Lösung gewaschen, dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 ml des HändeIsprodukts Ficoll (Hersteller Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Schweden) mit der Dichte 1,085 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml Picoll der Dichte I,o8o wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml Picoll der Dichte l,060, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min. bei 500 χ G und dann 5 Min. bei 2000 χ G zentrifugiert. Die Acinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzellen stiegen im Gradienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Grosse Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in

Hank¹scher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die überab
stehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Zellkuchen

wurde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.

Die von 200 Ratten zusammengefassten Inselzellen wurden in 4—molarer Guanidiniumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung Tridom, Hersteller: Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs) die 1-molar an ß-Merkaptoethanol und auf pH 5*0 gepuffert war, bei 4 ⁰C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 BiM)I Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und l8 Std. bei 37 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckman-Ultrazentrifuge beil5°c zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrifugierröhrchens.

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Polyadenylierte RNS wurde durch Chroraatographieren des RNS-Gesamtpräparates an 01igo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P. loc.cit. isoliert.

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhans'sehen Inseln von Ratten in cDNS wurde Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 mM Tris-KCl, pH 8,3jait

9 mM MgCl₂, J>Q mM NaCl, 20 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM von jeweils J5 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 250 uM des vierten, in oC-Stellung mit J>2. markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 50-200 Curie/Mol, 20 μg/ml 01igo-dT₁₂ ^g(Hersteller Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 ug/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml Reverser Transcriptase ausgeführt. Das Gemisch wurde I5 Min. bei 45 ⁰C inkubiert. Nach Zusatz von EDTA-NAp bis 25 mM wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit V/asser gesättigtem Phenol extrahiert, dann wurde die wässrige Phase an einer mit Sephadex G-100 gefüllten Säule von 0,3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe in

10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA chromatographiert. Die eluierte Nukleinsäure wurde nach Zusatz von Ammoniumacetat(pH 6,0 bis 0,25 M) mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 pl frisch zubereiteter 0,1-molarer Natriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min. bei 70 C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde mit 1-molarer Natriumacetat lösung, pH 4,5* neutralisiert und das j52_p-cDNS-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst. Proben einsträngiger cDNS wurden auf nativem PoIyacrylamid-Gel nach der Methode von Dingman, C.W., und Peacock, A.C., Biochemistry J^ 659 (I968) analysiert. Die Gele wurden getrocknet und die J52_p-DNS wurde durch

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Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak No-Screen NS-2T-Films (Hersteller: Eastman Kodak Corp., Rochester, New York) ermittelt. Die cDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich. Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards).

Beispiel 2

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene einsträngige cDNS wurde mit Reverser Transcriptase behandelt, um den komplementären Strang herzustellen. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCL₂, 1OmM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-markierten Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 1 mM eines in c^-Stellung mit 352_p markierten Nucleosidtriphosphats mit der spezifischen Wirkung 1-10 Curle/Millimol, 50 ug/ml cDNS und 220 Einheiten/ml Reverse Transcriptase. Das Reaktionsgemisch wurde 120 Min. bei 45 ⁰C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA-Na₂ bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-IOO chromatographiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 cpm wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Es wurde eineheterodisperse. · Bandemit Zentrum um 450 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproben. Proben der DNS-Reaktionsprodukte der Beispiele 1 und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so dass zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden. Die aus der Spaltung der doppeIsträngigen cDNS resultierenden Banden repräsentierten Spaltungsprodukte von im wesentlichen gleicher

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Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNS.

Beispiel 3

Das doppeIsträngige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von2-5 ug/ml mit JO Einheiten Sl-Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml (Hersteller: Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0,03 M Natriumacetat, pH 4,6, 0,35 M Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCl 30 Min. bei 22 ⁰C inkubiert und weitere 15 Min. bei 10 ⁰C. Mit dem Zusatz von Tris-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis 25 mM und S. coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, Herausg. S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Bd. 12A, S. 588 (1967))bis 40 ug/ml wurde die Verdauung gestoppt. Nach der Extraktion des Reaktionsgemisch mit Phenol und Chromatographieren an Sephadex G-IOO wurde die eluierte 3>2_p-cDNS mit Ethanol ausgefällt. Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden, die zur Verknüpfung der stumpfen Enden an chemisch synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren. Hind III-Decamere wurden nach dem Verfahren von Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. und Itakura, K. Science 196, I77 (1977) hergestellt. Die Verknüpfung der Hind III-Decamere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14 ⁰C in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCIg* 1 mM ATP, 10 mM Dithiothreit, mit; 3 mM Hind III-Decamere mit 10^ cpm/pMol und Τ4 DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min. auf 65 ⁰C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Dann wurden KCl bis 50 mM Endkonzentration, ß-Merkaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA bis 0,1 mM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugegeben,· die während 2 Std. bei 37°C

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ausgeführt wurde. Hind III- und Hae III-Endonuclease sind handelsübliche Präparate, erhältlich bei New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Das Reaktionsprodikt wurde durch Gel-Elektrophorese,wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wurde ein Peak beobachtet, der einer Sequenz von etwa 450 Nucleotiden entsprach, ausserdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind III-Decamere beobachtet.

Beispiel 4

Plasraid pMB-9-DNS (Herstellung .-sRodrigues, R. L., Boiler, P., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular und Cellular Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter und CP. Pox, Eds., (Academic Press, New York 1976) S. 471-477) wurde an der Hind III-Erkennungstelle mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase (Typ BAPP, Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Einheit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 25 mM Tris-HCl für pH 8 J50 Min. bei 25 ⁰C inkubiert, dann erfolgt Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besass, und zwar in einem Molverhältnis von ~5 Mol Plasmid zu 1 Mol cDNS. Das Gemisch wurde in 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP 1 Std. bei 14 °C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml Τ4 DNS-Ligase inkubiert.

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren: die Zellen wurden bis zu einer

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8
Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g_Al Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid, 2 mM NaOH, 100 ug/ml Diaminopimelinsäure und 40 Ug₇ ml Thymin enthielt und 37 °C zeigte. Die Zellen wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5 000 χ G bei 5 °C gesammelt, in 20 ml kalter 10-millimolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suspendiert, der 75 mM CaCl₂, l40 mM NaCl und 10 mM Tris pH 7,5 enthielt, und 5 Min. in Eis stehengelassen. Dann wurden die Zellen zentrifugiert und erneut in 0,5 ml Transformationspuffer suspendiert. Die Transformation erfolgte durch Vermischen von 100 ul der Zellsuspension mit 50 ul rekombinierter DNS (1 μg/ml). Das Gemisch wurde 15 Min. bei 0 C inkubiert, dann 4 Min. bei 25 ⁰C und 30 Min. bei 0 ⁰C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen.

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit 5 Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation^em Hind III-Produkt . Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukombination isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2 )ig - 5 ^g DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mM EDTA-Na₂ und 10 % (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt und das Gemisch wurde an 8 % Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das Plasmid pBR-322 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 ,ug/ml Ampicillin enthaltenden Platten.

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- 6ο -

Beispiel 5

Nach der Eluierung aus dem Gel wurde DNS markiert durch Inkubation mlfrf- P-ATP und dem Enzym Polynucleotidkinase unter den von Maxam und Gilbert loc.cit. beschriebenen Bedingungen. Das Enzym katalysiert die Übertragung einer radioaktiven Phosphatgruppe von ι- P-ATP auf die 5'-Enden der DNS. Das Enzym war aus E. coil nach der Methode von Panet, A., et al, Biochemistry 12, $04-5 (1973) erhalten worden. Die so markierte DNS wurde mit Hae III-Endonuclease nach der Vorschrift von Beispiel 2 gespalten, und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw. 135 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschrieben Bedingungen an einem Polyacrylamid-Gel voneinander getrennt. Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach der Methode von Maxam und Gilbert, loc.cit., Die Sequenz der folgenden Tabelle 2 bezieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergehnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und Plasmid-Vektoren aus col El wie pMB-9 und pBR-322. Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schätzungsweise 50 bis 120 Nucleotiden Länge unbestimmt und das Poly-dA-Segment am 3'-Ende ist von verschiedener Länge. Diese Sequenz entspricht dem derzeitigen Wissensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die Notwendigkeit zu geringfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen

können. Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-

mit
Proinsulin I beginnt der mit 1 bezeichneten Triplett-Stellung und endet mit der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung. Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestrichelter Linie unterstrichene Sequenz:

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Tabelle 2

/unbestimmt/ _{GCC CTG CTC GTC CTC TGG GA(J ccc} ^_{0 CCT GCT CAG GCT ττϊ GTC MA CAG CAC CTT TCT}

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mit gestrichelter Linie unterstrichen = Bereiche vorhandener Unsicherheit ho

ro ro cn ο>

Beispiel 6

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis 4 isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das einer geeigneten Quelle entstammt, zum Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen Insulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4 erzeugt, mit einer die A- und B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der Α-Kette lautet: "T ίο

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-A-Sii-

Tyr-Cys-Asn Die Aminosäuresequenz der Kette B lautet:

1 10

j Phe-Val-Asn-Glu-Kis-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val- ^;; 20 30

,Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

Die Aminosäuresequenzen werden ausgehend vom Ende. mit freier Aminogruppe beziffert, vergleiche Smith, L. P., Diabetes 21, (Erg.2), 458 (1972).

Beispiel 7

Bei Genen nicht-menschlichen Ursprungs erfordern die US-Sicherheitsbestimmungen nicht die Isolierung einer cDNS

Dei so hoher Reinheit wie menschlicher cDNS. Es ist daher

möglich, die das gesamte Ratten-Wachstumshormon-Strukturgen enthaltende cDNS zu isolieren, indem man elektrophoretisch abgetrennte DNS der erwarteten Länge von etwa 800 Basenpaaren (entsprechend der bekannten Aminosäurelänge des Wachstumshormons) isoliert. Als Quelle für Ratten-Wachstumshormon-mRNS wurden gezüchtete Hypophysenzellen von Ratten

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(sub-Klon des Zellstamms GH-I, zu beziehen bei der American Type Culture Collection) verwendet, vergleiche Tashjian, A.H., et. al., Endochrinology 82, ^42 (1968). Werden diese Zellen unter normalen Bedingungen gezüchtet, so macht die Wachstumshormon-mRNS nur 1 bis 3 % der gesamten Poly-A-enthaltenden RNS aus. Die Menge an Wachtumshormon-mRNS wurde jedoch über die Menge anderer mRNS in der Zelle erhöht durch die synergistische Einwirkung von Thyroidhormonen und Glucocorticoidera.

Die RNS wurde aus 5 x 10 -Zellen gewonnen, die in einer Suspensionskultur gezüchtet und zur Produktion von Wachsturnshormon disponiert wurden durch Zusatz von 1 mM Dexamethason und IO mM L-Triiodthyronin zum Medium 4 Tage vor dem Sammeln der Zellen. Die polyadenylierte RNS wurde aus der cytoplasmisehen Membranfraktion der gezüchteten Zellen isoliert, siehe dazu Martial, J.Α., Baxter, J.D., Goodman, H.M. und Seeburg, P.H., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 74^ l8l6(1977), und Bancroft, P.C., Wu., G. und Zubay, G., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 70, J5646 (I975). Die mRNS wurden dann im wesentlichen nach der Vorschrift der Beispiele 1, 2 und 3 weiter gereinigt und in doppeisträngige cDNS transcribiert. Nach der Fraktionierung der Gel-Elektrophorese wurde eine schwache aber deutliche Bande entsprechend einer DNS mit etwa 800 Basenpaaren Länge beobachtet.

Die Behandlung der gesamten, durch Transcription aus der mRNS der gezüchteten Hypophysenzellen erhaltene cDNS mit Hhal-Endonuclease ergab zwei DNS-Hauptfragmente (nach elektrophoretischer Trennung) entsprechend etwa ^20 Nucleotiden (Fragment A) und 240 Nucleotiden (Fragment B). Die Nuieotidsequenzanalyse der Fragmente A und B gemäss der Vorschrift von Beispiel 5' ergab, dass diese Fragmente tatsächlich Portionen der codierenden Region für Ratten-Wachstumshormon waren, und zwar auf der Basis der bekannten

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Aminosäuresequenz für Ratten-Wachstumshormon und durch Vergleich mit anderen bekannten Wachstumshormonsequenzen; vergleiche Wallis, M. und Davies, R.V.N., Growt Hormone And Related Peptides (Herausg. Copecile, A. und Muller, E.E.), S. 1-14 (Elsevier, New Yoek, 1976), und Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5j_ Erg. 2, S.120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C, 1976). Wird die doppeisträngige cDNS mit 8OO Basenpaaren nach der vorstehend beschriebenen elektrophoretischen Isolierung analog mit Hhal-Endonuclease behandelt, so erhält man unter den Hauptspaltprodukten zwei Fragmente, die in der Länge den Fragmenten A und B entsprechen.

Da die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren nicht unter Rückgriff auf die Behandlung mit Restriktions-Endonuclease gereinigt wurde, musste die DNS zwecks Entfernung ungepaarter einsträngiger Enden behandelt werden. In der Praxis entfernt man diese ungepaarten Enden vor der elektrophoretischen Trennung in 25 ul 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl₂J10 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM ATP und 200 uM von jedem der Nucleotide dATP, dTTP, dGTP und dCTP. Das Gemisch wurde mit einer Einheit E.coli DNS-Polymerase I bei 10 ⁰C 10 Min. inkubiert, um alle hervortretenden 5'-Enden zu entfernen und alle hervortretenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist ein handelsübliches Produkt (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana).

An die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren wurden chemisch synthetisierte Hind III-Bindeglieder nach der Vorschrift von Beispiel 3 addiert. Das Plasmid pBR-322 mit einem Ampicillin-Resistenzgen und einer einzigen Hind III-Stelle im Tetracyclin-Resistenzgen wurde mit Hind III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase nach der Vorschrift von Beispiel 4 vorbehandelt. Das so behandelte Plasmid wurde

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mit der Ratten-Wachstumshormoh-cDNS mit den 800 Basenpaaren in einer DNS-Ligase-Reaktion gemäss Beispiel 3 kombiniert. Das Gemisch zur Ligase-Reaktion wurde zur Traniormierung einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen, die gemäss Beispiel 3 behandelt worden waren, verwendet. Die rekombinierten Kolonien wurden aufgrund ihres Wachstums auf Ampicillin enthaltende Nährplatten und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 ug/ml Tetracyclin ausgesondert. 10 derartiger Kolonien wurden erhalten, die das Plasmid mit einer Insertion von etwa 800 Basenpaaren enthielten. Die Freisetzung erfolgte durch Hind HI-Spaltung.

(RGH-DNS)
Die Ratten-Wachstumshormon-DNfi/mit 800 Basenpaaren wurde

in präparativen Mengen aus dem rekombinierten Klon pRGH-1 isoliert und die Nucleotidsequenz wurde. wie in Beispiel 5 beschrieben, ermittelt. Die Nucleotidsequenz umfasste Teile der 5'-untranslatierten Region des Ratten-Wachsturnshormons und eine Sequenz von 26 Aminosäuren, die im Proteinvorläufer des Wachstums^9r^oni%r Sekretion gefunden wird. Die aus der Gen-Sequenz gefolgerte mRNS-Sequenz zeigt folgende Tabelle 3· Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt gut überein (mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8) mit der Teilsequenz des Ratten-Wachstumshormons gemäss Wallis und Davies, loc.cit., die die Reste 1-4-3, 65-69, IO8-II5, 133-143 und 150-190 aufweist.

Tabelle 3

DNS-Nucleotidsequenz eines Stranges, der die gesamte Ratten-Wachstumshormon codierende Sequenz enthält. Die entsprechenden Aminosäuren werden, zusammen mit ihrer Stellungsnummer in Bezug auf das Amino-Ende aufgeführt. Negativ bezifferte Aminosäuren entsprechen der Sequenz von Pro-Wachstumshormon. Die entsprechende mRNS-Sequenz ist die gleiche, lediglich wird in der mRNS T durch U ersetzt:

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Tabelle

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2322568

Beispiel 8

Die Isolierung von menschlicher Wachstumshormon-mRNS erfolgt im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 7* lediglich ist das biologische Ausgangsmaterial menschliches Hypophysentumorgewebe. Fünf benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren, und von denen jeder 0,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4-molarer Gunidiniumthiocyanat-Lösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5*0 gepuffert worden war, bei 4 ⁰C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mmol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und l8 Std. bei 57 000 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckmann-Ultrazentrifuge bei 15 °C zentrifugiert. Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenrohres. Die weitere Reinigung mit einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose- Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispiäen 1, 2 und 5· Etwa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon,wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers in Niederschlagsmaterial aus Ant!wachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen; vergleiche Roberts, B.E. und Patterson, B.M., Proc.Nat.Acad.'Sci. USA 70, 23J5O (I973).

der
Die Herstellung/cDNS von menschlichem Wachstumshormon erfolgt

im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben. Die cDNS

wird durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, und das zu einer

_ /entsprechenden Stellung

etwa oOO Nucleotiden Länge/wandernde Material wird: zur

Klonierung ausgewählt. Diese Fraktion wird mit DNS-Polymerase I, wie in Beispiel 6 beschrieben _v behandelt, dann erfolgt End-Addition der Hind III-Bindeglieder. Die cDNS wird dann mit dem mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pBR-j522 und DNS-Ligase rekombiniert. Mit der rekombinierten DNS wirdE.coli X-transformiert und ein die Wachstumshormon-DNS

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enthaltender Stamm wird ausgewählt. Dieser Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, die DNS wird daraus isoliert und ihre Nucleotidsequenz wird bestimmt. Die klonierte

cLx6 Wachstumshormon-DNS enthält die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codierenden Nucleotide. Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen V/achs tumshormons sind

^! H-N-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-10 20

Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-

Die restliche Sequenz zeigt die Tabelle 4:

Tabelle 4-

Nucleotidsequenz eines Stranges von menschlicher Wachstumshormon-DNS. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz des menschlichen V/achs tumshormons, beginnend am Amino-Ende. Die DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für menschliches Wachstumshormon, lediglich ersetzt in der mjRNS TJ das T.

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03850/0718

Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches regulatorisches Protein eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Information in eine» Mikroorganismus ausgeführt werden, in welchem die unbegrenzte Replikation möglich ist. Das offenbarte Verfahren kann auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulingens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt werden. Ebenso kann menschliches Wachstumshormongen und können andere Proteingene isoliert, transferiert und in einem Mikroorganismus repliziert werden. Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde. Offenbart werden neue Mikroorganismen, die abgewandelt sind, so dass sie eine NucetLotidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist. Die Beispiele illustrieren die Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsulin I in einen Stamm von Escherichia coli und am Transfer von Ratten-Gen für Wachstumshormon an einem Stamm von E. coli. Die Sequenz des Hauptstücks des transferierten Gens wurde in jedem Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass sie die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I bzw. Ratten-Wachstumshormon codiert.

Der hier beschriebene Mikroorganismus wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31392 hinterlegt. Weiterhin wurde das Plasmid enthaltende Ratten-Insulingen» das unabhängig auf andere Mikroorganismen-Stämme übertragen werden kann, unter der Hinterlegungsnummer 40003 bei der ATCC hinterlegt.

Für: The Regents of the University of California Berkeley, Caji V.St.A.

809850/0716

Dr.H.JiWolff Rechtsanwalt

Claims (1)

1. Patentansprüche: 2822568

   2. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus Insulin codiert.

   3· DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Nucleotidsequenz, die die Α-Kette des menschliehen Insulins codiert und besteht aus j5»—-ggl₁atm₂gtl gaj₄caj tgk tgk acl qr s atm tgk qr X₁₃TY₁₃TAK₁₄GAJ₁₅X₁₆TY₁₆GAJ₁₇AAK₁₈TAK₁₉TGK₂₀AAk₂₁—3·

   worin

   A = Deoxyadenyl,
   G β Deoxyguanyl,
   C = Deoxycytosyl,
   T « Thymidyl,
   J=A oder G,
   'K = T oder C,
   L = A, TC oder G,
   M = A, C oder T,
   X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G und C, falls Y_n = C

   oder T,
   γ = A, G, C oder T, falls X=C und A oder G, falls

   X_n - T,
   W=C oder A, falls Z=G oder A, und C, falls Z= C

   oder T,
   Z_n = A, G, C oder T, falls W_n = C, und A oder G, falls

   ^Wn - ^A'

   809850/0716

   2 Γι *") - ι Γ Λ A υ λ.: ο ο 8

   QR_n » TC, falls S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S=T oder C,

   S_n = A, G, C oder T, falls QR = TC, und T oder C, falls QR = AG

   und d'ie tiefestellte η ale Äminosäurestellung im menschlichen Insulin, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Arainosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert sind.

   DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch J₃ gekennzeichnet durch eine weitere Nucleotidsequenz, die die B-Kette von menschlichem Insulin codiert und besteht aus

   DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die für die A- und B-Ketten von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenzen durch eine Nucleotidsequenz (N„Ν,Ν ) innerhalb der Teilsequenz 5' ACL^_n (N N, N J-GCL₁ 3¹ verknüpft sind,

   JyJ a D C J X

   wobei N ,

   N. und N A, T, G oder C bedeuten können

   D O

   und j eine beliebige ganze Zahl von 0 bis 100 darstellt, vorausgesetzt, dass N N.N weder TAJ noch TGA bedeutet.

   'DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch J5, der in einen Stamm eines Mikroorganismus transferiert und dort repliziertworden ist.

   DNS-Transfer-Vektor nac h Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus aus einem Bakterium und der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid bestehen.

   809850/0716

   ORIGINAL

   INSPECTED

   2822^88

   8. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium aus Escherichia coli X-I776 oder Escherichia coli RR-I und das Plasmid aus pMB-9 oder pBR-322 bestehen.

   9· DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 4, der in einen Stamm eines Mikroorganismus transferiert und dort repliziert worden ist.

   10. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus aus einem Bakterium und der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid bestehen.

   11. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium aus Escherichia coli X-I776 oder Escherichia coli RR-I und das Plasmid aus pMB-9 oder pBR-322 bestehen.

   12. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 5» der in einen Stamm eines Mikroorganismus transferiert und dort repliziert worden ist.

   13· DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus aus einem Bakterium und der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid bestehen.

   14. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium aus Escherichia coli X-I776 oder Escherichia coli RR-I und das Plasmid aus pMB-9 oder pBR-322 bestehen.

   15. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine für die Aminosäuresequenz von Rattenproinsulin I codierende Nucleotidsequenz, bestehend aus

   809850/0718 OWG^AL INSPECTED

   5' TTT GTC AAA CAG CAC CTT TGT GGT CCT CAC CTG GTG GAG GCT CTG TAC CTG

   GTG TGT GGG GAA CGT GGT TTC TTC TAC ACA CCC AAC TCC CGT CGT GAA GTG GAG GAC CCG CAA GTG CCA CAA CTG GAG CTG GCT GGA GGC CCG GAG GCC GGG GAT CTT CAG ACC TGG GCA CTG GAG GTT GCC CGG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAT CAG TGC

   TCC ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC GAA CTG GAG ACC TAC TGC AAC 3¹

   worin A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl und T = Thymidyl.

   16. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch I5, gekennzeichnet durch das Plasmid pBR-322, das in Escherichia coli RR-I transferiert und dort repliziert worden ist.

   17. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus . Wachstumshormon codiert.

   18. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch IJ, gekennzeichnet durch eine die Aminosäuresequenz vcn menschlichem Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz, die besteht aus

   * -TTK₁CCL₂ACL₃ATM₄CCL₅X₆Ty₆QR₇S₇W₈GZ₈X₉TY₉TTK₁₀GAK₁ J₁AAK₁₂GCL₁₃ATGX₁₅Ty₁₅

   W₁₆GZ₁₆GCL₁₇CAK₁₈W₁₉GZ₁₉X₂₀Ty₂₀CAK₂₁CAJ₂₂X₂₃TY₂₃

   CCL₂₄TTK₂₅GAK₂₆ACl₂₇TAK₂₈CAJ caj_ TTK₃₁CAJ₃₂GAJ₃₃ACL₃₄TAK₃₅ATh₃ CCL₃₇AAJ₃₈GAJ₃₉CAJ₄₀^U₄₁TAK₄₂QR₄₃S₄₃TTK₄₄X₄₅TY₄₅CAJ₄₆AAK₄₇CCl₄₈C₁U₄₉ ACL₅₀QR₅₁S₅₁X₅₂Ty₅₂TCK₅₃TTK₅₄QR₅₅S₅₅GAJ₅₆QR₅₇S₅₇ATM₅₈CCL₅₉ACL₆₀CCL₆₁QR₆₂S₆₂

   808850/0716

   _ 2622568

   ^X124^TY\₂4^ATGGGL126^27^GZ127^X123^TY12S^GAJ129^GAK130^GGL131⁽i^R132^SL32^CCL133 ^W134^GZ134^ACL135^GGL136^C^i37^A'ⁿ'^l138^TTK139^AÄJH0^CAJl41^ACLl42^TAK143^QX144^S144

   3 , worin

   A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = Thymidyl, J=A oder G, K = T oder C, L=A, TC oder G, M = A, C oder T,

   X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n == C

   oder T,
   Y_n = A, G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G, falls

   X_n=T,
   W=C oder A, falls Z=G oder A, und C, falls Z_n = C

   oder T,
   Z_n = A, G, C oder T, falls W_n = C, und A oder G, falls

   W_n=A,
   QR = TC, falls S = A, G, C oder T, und AG , falls

   S_n β τ oder C,
   S_n = A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C, falls

   QR_n - AG

   und die tiefgestellten Ziffern η die Aminosäurestellung im menschlichen Wachtumshormon, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bezeichnen, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert werden.

   809850/0718

   19· DNS-Transfer-Vektor nach. Anspruch l8, der in einen Stamm eines Mikroorganismus transferiert und dort repliziert worden ist.

   20. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor aus pMB-9 oder pBR-322 und der Mikroorganismus aus dem Bakterium Escherichia coil X-1776 oder Escherichia coli PlR-I bestehen.

   21. Veränderter Mikroorganismus, der eine Nucleotidsequenz mit der Struktur eines Gens eines höheren Organismus enthält, die durch Transkription an einem Gen des höheren Organismus entstanden ist.

   22. Mikroorganismus nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus . Insulin codiert.

   2J. Mikroorganismus nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus menschliches Insulin codiert.

   2k. Veränderter Mikroorganismus, der eine Nucleotidsequenz enthält, die die Α-Kette von menschlichem Insulin codiert

   und besteht aus
   I₅.—GGL₁ATM₂GTL₃GAJ₄CAJ₅TGK₆TGK₇ACl₈QR₉S₉A-TH₁₀TGK₁₁QR₁ .X₁₃TY₁₃TAK₁₄GAJ₁₅X₁₆TY₁₆GAJ₁₇AAK₁₈TAk₁₉TGK₂₀AAK₂₁-3·

   worin

   A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = Thymidyl, J=A oder G, K=T oder C, L=A, TC oder G,

   809850/071*

   — Ύ "

   M = A, C oder T,

   X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n =

   C oder T,
   Y_n = A, G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G, falls

   X_n = T,
   W_n = C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls Z_n = C

   oder T,
   Z = A, G, C oder T, falls W = C, und A oder G, falls

   W_n=A,
   QR_n = TC, falls S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S_n =

   T oder C,
   S_n = A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C, falls

   QR_n = AG

   und die tiefgestellten Ziffern η die Aminosauresteilung in menschlichem Insulin,dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert sind.

   25. Mikroorganismus nach Anspruch 24, verändert so dass er eine weitere Nucejlotidsequenz enthält, die die B-Kette von menschlichem Insulin codiert und besteht

   aus

   I 5'—

   ₀-3 ·.

   26. Mikroorganismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die für die A- und B-Ketten des menschlichen Insulins codierenden Nucleotidsequenzen durch eine Nucleotidsequenz

   (N_aN_bN_o). in der Teilsequenz 5' ACL₅₀(N_aN_bN ). GCL₁-y

   verbunden sind, wobei N , N. und N A, T, G oder C be-

   et, Ό O

   deuten können und j eine beliebige ganze Zahl von 0 bis 100 darstellt, worausgesetzt, dass NNN weder TAJ.noch TGA bedeutet.

   809850/0716

   27« Mikroorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die die Α-Kette von menschlichem Insulin codierende Nucleotidsequenz sich auf einem DNS-Transfer-Vektor befindet.

   28. Mikroorganismus nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid pMB-9 oder pBR-322 und der Mikroorganismus aus Escherichla coil bestehen.

   29. Mikroorganismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die die B-Kette des menschlichen Insulins codierende Nucleotidsequenz sich auf einem DNS-Transfer-Vektor befindet.

   30. Mikroorganismus nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet?] dass der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid pMB-9 oder pBR-322 und der Mikroorganismus aus Escherichia coil bestehen.

   51. Mikroorganismus nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz sich auf einem DNS-Transfer-Vektor befindet.

   32. Mikroorganismus nach Anspruch yi, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Transfer-Vektor aus einem Plasmid pMB-9 oder pBR-322 und der Mikroorganismus aus Escheriehia coil bestehen.

   33· Mikroorganismus nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus Wachtumshormon codiert.

   34. Mikroorganismus nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen des höheren Organismus menschliches Wachstumshormon codiert.

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   35· Veränderter Mikroorganismus, der eine Nucleotidsequenz enthält, die die Aminsäuresequenz von menschlichem Wachtumshormon codiert und besteht aus 5'-TrK₁CCL₂ACL₃ATJi₄CCL₅X₆TY₆QR₇S₇W₈GZ₈X₉TY₉TTK₁₀GAiC₁₁AAK₁₂GCL₁₃ATGX₁₅TY₁₅

   CCL₂₄TTK₂₅GAK₂₆ACl₂₇TAK₂₈CAJ₀ GAJ₃ TTK₃J^CAJ₃₂GAJ₃₃ACL₃₁, TAK₃₅ATJt₃₆ CCL₃₇AAJ₃₈GAJ₃₉CAJ₄₀AAJ₄₁TAK₄₂QR₄₃S₄₃TTK₄₄X₄₅TY₄₅CAJ₄₆AAK₄₇CCl₆₈CAJ₄₉ ACL₅₀QR₅₁S₅₁X₅₂TY₅₂TGK₅₃TTK₅₄QR₅₅S₅₅GAJ₅₆QR₅₇S₅₇ATM₅₈CCL₅₉ACL₆₀CCL₆₁Or₆₂S₆₂

   ^X124^TY124^ATGGGLi26^W127^GZ127^X128^12S^GAJ129^GAK130^GGL13lQ^R132^S132^CCL133 ^W134^GZ134^ACL135^GGL136^CAJl37^Arai38^Tr"l39^AAJ140^CAJ141^ACL142^TAK143^QR144^S144

   ^X157^TYl57^AAJ158^AAK159^TAK160^GGL161^X162^162^X163^W163^TAKI64^TGK165^16A^

   CTL₁₈₀CAJ₁₈₁TGK₁₈₂W₁₈₃GZ₁₈₃QR₁₈₄S₁₈₄GTL₁₈₅GAJ₁₈₆GGl₁₈₇QR₁₈₃S₁₈₃TGK₁₈₉GGL₁₉₀TTK₁₉₁ tagctgcccgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggcc - 3'

   worin .

   A= Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = üiyinidyl, J=A oder G, K = T oder Ό, L=A oder TC, G

   M = A, C oder T, , _

   /und C-, X_n m T oder C, falls Y_n = A oder 0; falls Y_ß » C oder T,

   Y = A, G, C oder T, falls X - C, und A oder G, falls ** ^{= T}' 809850/0716

   W=C oder A, falls Z=G oder A, und C, falls Z =

   C oder T,
   Z_n = A, G, C oder T, falls W_n = C, und A oder G, falls

   W_n = A,
   QR_n = TC, falls S_n = A, G, C oder T,und AG, fall« S_n =

   T oder C
   S_n = A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C, falls

   QR_n = AG

   und die tiefgestellten Ziffern η die Arainosäuresteilung im menschlichen Wachstumshormon, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert sind.

   36. Verfahren zur Herstellung eins DNS-Transfer-Vektors mit einer Insulin codierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) aus der Bauchspeicheldrüse eines Insulin produzierenden Organismus Inselzellen isoliert, welche Insulin codierende m RNS enthalten,

   (b) aus den Inselzellen die mRNS in Gegenwart von RNase-Inhibitor extrahiert, so dass der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

   (c) die von Protein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

   (d) eine doppeisträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz aufweist, wobei man eine cDNS mit Insulin "codierender

   Nucleotidsequenz erhält,

   (e) einen DNS-Transfer-Vektor mit reaktionsfähigen Enden, die miteinander oder mit doppeisträngiger cDNS verbunden werden können, bereitstellt, und

   (f) den DNS-Transfer-Vektor und die doppeis trängige cDNS mit der Insulin codierenden Nucleotidsequenz miteinander verbindet.

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   2822588

   37· Verfahren zur Isolierung von Inselzellen, die mRNS enthalten, die in Bezug auf die Insulin codierende Nucleotidsequenz angereichert ist, dadurch gekennzeichnet, dass man

   speichel-Inselzellen und andere Zellen enthaltendes Bauch-^drüsengewebe mit einem hydrolytischen Enzym und einem Trypsin-Inhibitor behandelt zur Freisetzung der Inselzellen von den anderen Zellen, das so behandelte Gewebe fraktioniert, um von anderen Zellen und Zellrückständen im wesentlichen freie Inselzellen zu gewinnen, und die mRNS, die an Insulin codierender Nucleotidsequenz angereichert ist, aus den Inseln isoliert.

   38. Verfahren nach Anspruch 37* dadurch gekennzeichnet, dass man als hydrolytisches Enzym ein empirisch ausgewähltes Kollagenase-Präparat verwendet.

   39· Verfahren nach Anspruch 37* dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit dem hydrolytischen Enzym in Silikonbeschichteter Glasapparatur ausführt.

   40. Verfahren nach Anspruch 37* dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit dem hydrolytischen Enzym in Kunststoffapparatur ausführt.

   41. Verfahren nach Anspruch 36* dadurch gekennzeichnet, dass der RNase-Inhibitor ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.

   42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass man als chaotropes Kation Guandinium und als chaotropes Anion Thiocyanation verwendet.

   43. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mittel zum Spalten von Disulfidbindungen ß-Merkaptoethanol verwendet.

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   44. Verfahren nach Anspruch J6, dadurch gekennzeichnet, dass man als RNase-Inhibitor 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendet.

   45. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens vorbehandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den

   Enden
   reaktionsfähigen Herstellende Reaktion katalysiert

   unter Ausnahme der vorbehandelten reaktionsfähigen Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden werden. '

   46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Phosphatase verwendet.

   47. Verfahren nach Anspruch 45* dadurch gekennzeichnet, dass die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktions-Endonuclease behandelter Plasmid-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen und der zur Vorbehandlung bestimmte Teil die Plasmid-DNS enthält, so dass die End-an-Ende-Verknüpfung der Plasmid-DNS ohne Neukombination mit der nicht-plasmiden DNS verhindert wird.

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   2822588

   48. Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) Hypophysenzellen, die Wachstumshormon codierende mRNS enthalten, isoliert,

   (b) die mRNS aus den Hypophysenzellen extrahiert in Gegenwart eines RNase-Inhibitors, wodurch der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

   (c) die von Protein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

   (d) eine doppeIsträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz besitzt, wobei man eine cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz erhält,

   (e) einen DNS-Transfer-Vektor bereitstellt, der zur Bindung miteinander oder mit doppelsträngiger cDNS

   . befähigte reaktionsfähige Enden besitzt, und

   (f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppeisträngigen cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz verbindet.

   49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass* man einen RNase-Inhibitor verwendet, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.

   50. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass man als chaotropes Kation Guanidiniumion und als chaotropes Anion Thiocyanation verwendet.

   51. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass man als Disulfidbindungen spaltendes Mittel ß-Merkaptoethanol verwendet.

   8 0 9 85 0/0716 _r inspected

   52. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man als RNase-Inhibitor 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 0,2-molares ß-Merkaptoeihanol verwendet.

   53· Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden,bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und die DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehanc&ten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den Enden herstellende Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden warden.

   54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Phosphatase verwendet.

   55· Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktions-Endonuclease behandelter Plasmid-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen und der zur Behandlung bestimmte Teil die Plasmid-DNS enthält, so dass die End-an-Ende-Verknüpfung der DNS ohne Neukombination mit der nicht-plasmiden DNS verhindert wird.

   8 098 50/0716 _0B!GINAl inspected

   - I₅ -

   56. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, der eine Insulin codierende Nucleotidsequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) aus der Bauchspeicheldrüse eines Insulin produzierenden Organismus Inselzellen isoliert, die Insulin codierende mRNS enthalten,

   (b) die mRNS aus den Inselzellen extrahiert in Gegenwart eines RNase-Inhibitors, wodurch RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

   (c) die von Protein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

   (d) eine doppeisträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz aufweist, so dass man eine cDNS mit einer Insulin codierenden Nucleotidsequenz erhält,

   (e) einen DNS-Transfer-Vektor bereitstellt, der zur Verbindung miteinander oder mit einer doppelsträngigen cDNS befähigte reaktionsfähige Enden besitzt,

   (f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppelstränglgen cDNS verknüpft, die eine Insulin codierende Nucleotidsequenz besitzt, und

   (g) einen Mikroorganismus mit diesem mit der cDNS verbundenen DNS-Transfer-Vektor vermischt.

   57. Verfahren zur Isolierung von Inselzellen, die mRNS enthalten, welche an Insulin codierender Nucleotidsequenz angereichert ist, dadurch gekennzeichnet, dass man Inselzellen und andere Zellen enthaltendes Gewebe der Bauchspeicheldrüse mit einem hydrolytischen Enzym und einem Trypsin-Inhibitor behandelt zur Befreiung der Inseln von den anderen Zellen, das so behandelte Gewebe fraktioniert, um von anderen Zellen und Zellrückständen im wesentlichen freie Inselzellen zu gewinnen, und die mRNS, die an Insulin

   809850/071S

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   codierender Nucleotidsequenz angereichert ist, aus den Inselzellen isoliert.

   58· Verfahren nach Anspruch 57* dadurch gekennzeichnet, dass man als hydrolytisches Enzym ein empirisch ausgewähltes Kollagenase-Präparat verwendet.

   59· Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit hydrolytischem Enzym in Silikonbeschichteter Glasapparatur ausführt.

   60. Verfahren nach Anspruch 57* dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit hydrolytischem Enzym in Kunststoffapparatur ausführt.

   61. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass man einen RNase-Inhibitor verwendet, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.

   62. Verfahren nach Anspruch 6l, dadurch gekennzeichnet, dass man als chaotropes Kation Giainidinium-Hffld als chaotropes Anion Thocyanation verwendet.

   63. Verfahren nach Anspruch 6l, dadurch gekennzeichnet, dass man als Disulfidbindungen spaltendes Mittel ß-Merkaptoethanol verwendet.

   64. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass man als RNase-Inhibitor 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendet.

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   - ¹⁷ " 28225S8

   65. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzende! DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens behandelt,"das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppe befähigt ist, und die DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den Enden herstellende Reaktion, katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden werden.

   66. Verfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Phosphatase verwendet.

   67. Verfahren nach Anspruch 65* dadurch gekennzeichnet, dass die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch mit Restriktions-Endonuclease behandelter Plasmid-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen, und der zur Behandlung bestimmte Teil die Plasmid-DNS enthält, so dass die End-an-Ende-Verknüpfung der DNS ohne Neukombination mit der nicht-plasmiden DNS verhindert wird.

   68. Verfahren.zur Herstellung eines Mikroorganismus mit einer Wachtumshormon codierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) Hypophysenzellen isoliert, die Wachstumshormon codierende mRNS enthalten,

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   (b) die mRNS aus den Hypophysenzellen in Gegenwart eines RNase-Inhibitors extrahiert, so dass RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

   (c) die von Protein, DNS und anderen RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,

   (d) eine doppeisträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz besitzt, wobei man cDNS mit einer Wachstumshormon

   codierenden Nucleotidsequenz erhält,

   (e) einen DNS-Transfer-Vektor bereitstellt, der zur
   Verbindung miteinander oder mit doppeisträngiger
   cDNS befähigte reaktionsfähige Enden besitzt,

   (f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppe1strängigen
   cDNS mit Wachstumshormon codierender Nucleotidsequenz verbindet und

   (g) einen Mikroorganismus mit dem mit der cDNS verbundenen DNS-Transfer-Vektor vermischt.

   69. Verfahren nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, dass man einen RNase-Inhibitor verwendet, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält.

   70. Verfahren nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass man als chaotropes Kation Guanidiniumion und chaotropes Anion Thiocyanatanion verwendet.

   71. Verfahren nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass man Disulfidbindungen spaltendes Mittel ß-Merkaptoethanol

   . verwendet.

   72. Verfahren nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, dass man als RNase-Inhibitor ^-molares Guadidiniumthiocyanat und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendet.

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   73· Verfahren nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, dass man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den Enden herstellende Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verknüpft werden.

   74. Verfahren nach Anspruch 73* dadurch gekennzeichnet, dass man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Phosphatase verwendet.

   75. Verfahren nach Anspruch 73» dadurch gekennzeichnet, dass die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktions-Endonuclease behandelter Plasmid-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen und der zur Vorbehandlung bestimmte Teil die Plasmid-DNS enthält, so dass die End-an-Ende-Verknüpfung der Plasmid-DNS ohne Neukombination mit der nicht-plasmiden DNS verhindert wird·

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