DE2822462A1

DE2822462A1 - Verfahren zur durchfuehrung eines konkurrierenden immuntests auf freies oestriol

Info

Publication number: DE2822462A1
Application number: DE19782822462
Authority: DE
Inventors: John Christopher Edwards
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1977-05-24
Filing date: 1978-05-23
Publication date: 1978-12-07
Also published as: US4208400A; GB1582794A

Description

Verfahren zur Durchführung eines konkurrierenden Immuntests auf freies Oestriol

Die Erfindung bezieht sich auf die neue Verwendung eines Steroids zur Blockierung der Wirkung Steroid-bindender Proteine in Schwangerschaftsserum- und Plasmaproben, wodurch die Störung bei einem direkten Radioimmuntest auf nicht-konjugiertes Oestriol unter Verwendung eines spezifischen Antioestriolserums minimal gehalten wird.

Oestriol kommt im Serum und im Plasma als Gemisch der unkongugierten Form zusammen mit einer Reihe von Konjugaten des als Glucuronide und Sulfate vorhandenen Oestriols vor. Die nicht-konjugierte Form macht nur etwa 10 % der Gesamtmenge an Oestriol einschließlich der Konjugate aus.

Bislang war es nicht möglich, das nicht-konjugierte oder ungebundene Oestriol direkt in Serum- oder Plasmaproben nach dem Radioimmuntest zu messen, da gegen Oestriol gebildete Antisera gewöhnlich mit einigen der Konjugate des Oestriols Kreuzreaktionen eingehen. Die Kreuzreaktion von Oestriol-3-sulfat z.B. ist 10 bis 30 % im Vergleich mit Oestriol, und die umlaufenden Mengen dieses Konjugats sind

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;%<;ijcal ro iio( Ij vif dar. urn ebundene Oestriol,

Da die derzeit veTwr mieten Antisera nicht zwischen Oestriol und einigen der Ociji ri öl-i; on ,jugate, zu unterscheiden vermögen, findet bei den einzigt-n bekannten Radioimmuntests auf ungebundenes OestrJbJ eine Extraktion des Oestriols aus dem Serum- oder J'lanmaproben unter Verwendung eines organischen Lösungsmittel.'? und Entfernen des organischen Lösungsmittels durch Abdampfen und erneutes Lösen des Oestriols in einer geeigneten gepufferten Lösung zur Bestimmung durch den Radioimmuntest statt.

Es wurde nun gefunden, daß durch sorgfältiges Prüfen von Antisera, erzeugt durch immunisieren von Kaninchen mit an Rinder-Serumaibumin gebundenem Oestriol, en möglich ist, ein hu 1" Oestriol spezifisches Anti serum zu finden, das nicht wesentlich mit OoslrinJ-Konjugaten kreuzreagiert und den dire]-ten Radioimnmntf; ^{- ungebundenen Oestriols in Serum- oder Hasmaproben avw( _> \ < IH-. i>rr Ten1 wird so durchgeführt, daß in ILuiiütstoffrfiJji ( Jk η ,](■ y\ Jrobe oder Lüandaid, 'AOO ul ei- !irr gopufferten L< >.' im/ von ' - I-markicric.in Ocniriol und i'U" ]ii einer Vc-(IuII]IIII]/' ti cn ijpezifisclien Aiii ioestrioJ serums in einer ßepuiici In. i-onung pipettiert werden. Nach dem Minchen werden die TW hrrhen (»0 min bei Raumtemperatur stehengelassen, boo }il /.Minoniumsulfatlösung werden dann in jedes Röhrchen gegeben und der Inhalt gründlich durchmischt, liach dem Zentrifugieren worden die überstehenden Flüssigkeiten entfernt und die Radioaktivität in den Niederschlägen gemessen. Standardlo'aungen von Oestriol in männlichem Serum werden zur Erstellung einer Dosis/Ansprech-Kurve herangezogen, und unbekannte !Toben werden ausgehend von dieser Kurve interpoliert.

Ein besonderes Problem mit dem direkten Radioimmuntest ungebundenen Oestriols in der Schwangerschaft entsteht durch dir erliöhte Menge an in Schwangerschafts serum und -plasma vorhandenen Stfi'oid-Mndenden Proteinen. Die Steroid-binden-

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1 25 den Proteine reagieren mit Oestriol und I-markiertem Oestriol während des Tests, und das Steroid-Protein-gebun-

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dene I-markierte Oestriol wird zusammen mit dem Antikör-

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per-gebundenen I-markierten Oestriol durch das Trennsystem der Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Die Standards männlichen Serums enthalten keine abnorm hohen Werte an Steroid-bindenden Proteinen. Folglich führt der direkte Oestrioltest in Schwangerschaftsserum- oder Plasmaproben zu höherer Radioaktivität in der gefällten "gebundenen" Fraktion (aufgrund des zusätzlichen bindenden Proteins) als in den Standard-Oestriollösungen in männlichem Serum.

Der Einfluß der Steroid-bindenen Proteine in dem Testsystem ist am besten zu beobachten durch Messen von "Blindwerten" von Schwangerschaftsproben und durch Vergleichen mit "Blindwerten" männlichen Serums. Der Blindwert der Probe ist der in der Fällung in Abwesenheit von Antiserum gefundene Prozentsatz an Gesamtradioaktivität. D.h., in dem oben beschriebenen Testsystem wird die Pufferlösung des Antiserums durch Puffer allein ersetzt.

Blindwert gesammelter männlicher Seren = 9,0 Vj Blindwert gesammelter Schwangerschafts-

seren = 13,7 '/ό

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß der Einfluß des bindenden Proteins in den Schwangerschaftsproben durch Zugabe von Progesteron herabgesetzt werden kann, das mit dem bindenden Protein reagiert, aber geringe Kreuzreaktion mit dem Antiserum zeigt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren obiger Art, bei dem

a) ein Gemisch einer Standardmenge einer zu testenden Oestriol-haltigen Probe, einer Standardmenge eines markierten Oestriols und einer Standardmenge eines Oestriol-Antikörpers, die nicht zur Umsetzung mit allem vorhandenen freien Oestriol und markierten Oestriol ausreicht, hergestellt,

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b) das Gemisch inkubiert, wodurch ein Teil des freien Oestriols und ein Teil des markierten Oestriols an den Antikörper gebunden werden, deren Anteil von den Ausgangskonzentrationen an freiem und markiertem Oestriol abhängt,

c) der Teil des freien und des markierten, an den Antikörper gebundenen Oestriols von dem nicht so gebundenen Teil getrennt und die Konzentration des gebundenen markierten Oestriols und/oder des ungebundenen markierten Oestriols gemessen wird,

das sich dadurch auszeichnet, daß im Ausgangsgemisch Progesteron in einer für eine Umsetzung mit dem Hauptanteil von in der zu testenden Probe vorhandenen Steroid-bindenden Proteinen ausreichend großen, aber nicht so großen Menge vorgesehen wird, daß eine Umsetzung mit mehr als einem geringen Teil des Antikörpers zu Oestriol eintritt, wodurch nahezu das gesamte im Ausgangsgemisch vorhandene unkonjugierte Oestriol für die Reaktion mit dem Oestriol-Antikörper zur Verfügung steht und nahezu der gesamte im Ausgangsgemisch vorhandene Oestriol-Antikörper für die Reaktion mit freiem und markiertem Oestriol zur Verfügung steht.

Das markierte Oestriol ist vorzugsweise radioaktiv markiert

125 125 und kann vorteilhafterweise das 2-Jod-, 4-Jod- oder

¹²⁵2,4-Dijod-Derivat gemäß der DE-OS 2600465.9 sein.

Vorzugsweise liegt das Progesteron in einer solchen Menge vor, daß der Einfluß der nicht-spezifischen, Steroid-bindenden Proteine um wenigstens 75 % reduziert wird, aber der Einfluß des Oestriol-Antikörpers um nicht mehr als 10 % herabgesetzt wird. Es wurde gefunden, daß eine Progesteron-Konzentration im Bereich von 1 bis 20 μg/ml unbekannten Serums im allgemeinen angemessen ist. Ist das Serum um einen Faktor von etwa 20 verdünnt, wie in dem hier beschriebenen Test, kann es bequemer sein, die Progesteron-Konzentration von 0,05 bis 1,0 μg/ml der inkubierten Testlösung zu be-

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rechnen.

Im folgenden Beispiel wurde Progesteron bequemerweise dem Testcystem (in den angegebenen Konzentrationen) in der gepufferten Lösung des !-markierten Oerstriols zugefügt.

Zugesetzte Konzentration (μβ/ιηΐ)

Blindprobe männ lichen Serums	Blindprobe von Schwan- geschafts- serum	Co
9,0	13,8	67,6
8,8	13,4	67,1
9,0	11,5	66,9
8,8	1ü,0	66,6
8,5	10,3	62,3

0,009

0,09

0,9

9,0

(Co .ist der Prozentsatz an Gesamtradioaktivität in der Fällung im Radioiiimruntestsystem in Abwesenheit von Oestriol).

l-rogesteron verminderte den Unterschied r.uisdini den Blindwerten mann] i eben üerums und von .'!ohv/anppri'clini" t rfua'um von 4,8 auf 1,U¹ '. . Dieser Untersohird v/urdr (if>nn ir: ^ciii.syfjtein als vernachJä.'3nigbai' angenommen. Dan iiitiejd i-(.i/^Tte eine sehr geringfügige Koalition mit dem AntJiieruni bei liohen Steroid-KoiiKentrationen, Wie aus dem Abia-Ll den Co-V/erte zu ersehen. Eine Konzentration von 0,4 ug Progonteron/ml gepufferter Losung des markierten Oestriols, d.h. etv/a 0,2 ]ig Progesteron pro ml der inkubierten Testlösung, wurde als niedrigste Konzentration gewählt, die die Wirkung der bindenden proteine wirksam blockierte und folglich in einem Testsystem auf Oestriol verwendet werden konnte.

Beispiel Radioimmuntest ungebundenen Oestriols

20 μΙ-Proben von Standard-Üestriollösungen in männlichem Humanserum oder unbekannter Schwangerschaftt-serumproben werden in Püasükröhrchen pipettiert. In jeder; Ifohrchen

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werden 200 ul Phosphatpuffer mit 10 % Pferdeserum, Natriumazid (1 mg/ml), Gelatine (1 mg/ml), Progesteron (0,4 ug/ml)

1 PR

und ein I-markiertes Oestriol-Derivat (etwa 0,3 uCi/ml) gegeben. Nach dem Vermischen werden in jedes Röhrchen 200 μΐ des Phosphatpuffers enthaltend Pferdeserum, Natriumazid und Gelatine, und enthaltend eine Verdünnung eines speziell ausgewählten Antiserums, das gegen an Albumin gebundenes Oestriol gebildet wurde, gegeben. Der Inhalt der Röhrchen wird wieder gemischt, und dann werden die Röhrchen 60 min bei Raumtemperatur gelassen, 500 ul einer Ammoniumsulfatlösung (35 Gew./Vol.-Prozent in Wasser) werden dann in jedes Röhrchen gegeben, und nach dem Mischen werden die Röhrchen zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten werden dann abgesaugt und die Radioaktivität der Niederschläge in den Röhrchen in einem Gamma-Zähler gemessen.

Ergebnisse	Zählimpulse
Oestriol-Standard	in 100 see
(ng/inl)	96196
0	96318
0	65612
1,25	65545
1,25	37322
5,3	37457
5,3	25818
12,5	25736
12,5	19791
29,0	18136
29,0

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Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zur Durchführung eines konkurrierenden Immuntests auf freies Oestriol, "bei dem

a) ein Gemisch einer Standardmenge einer zu testenden Oestriol-haltigen Probe, einer Standardmenge eines markierten Oestriols und einer Standardmenge eines Oestfiol-Antikörpers, die nicht zur Umsetzung mit allem vorhandenen freien Oestriol und markierten Oestriol ausreicht, hergestellt,

dadurch gekennzeichnet, daß im Ausgangsgemisch Progesteron

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in einer für eine Umsetzung mit dem Hauptanteil von in der zu testenden Probe vorhandenen Steroid-bindenden Proteinen ausreichend großen, aber nicht so großen Menge vorgesehen wird, daß eine Umsetzung mit mehr als einem geringen Teil des Antikörpers zu Oestriol eintritt, wodurch nahezu das gesamte im Ausgangsgemisch vorhandene unkonjugierte Oestriol für die Reaktion mit dem Oestriol-Antikörper zur Verfügung steht und nahezu der gesamte im Ausgangsgemisch vorhandene Oestriol-Antikörper für die Reaktion mit freiem und markiertem Oestriol zur Verfügung steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als markiertes Oestriol radioaktiv markiertes Oestriol verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

12*5 als radioaktiv markiertes Oestriol das ^J 2-Jod-,

-ιός -ipc

■^4-Jod- oder ^2,4-Di;jod-Derivat des Oestriols verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Progesteron-Konzentration von 0,05 bis 1,0 μg/ml des inkubierten Gemische durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß als zu testende Probe eine Serum-Probe verwendet und bei einer Progesteron-Konzentration von 1 bis 20 pg/ml der Serumprobe gearbeitet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Oestriol-Antikörper ein solcher, der mit Oestriol-Konjugaten keine wesentliche Kreuzreaktion eingeht, verwendet wird.

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