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DE2539242A1 - Radioimmunologisches analyseverfahren zur bestimmung von digoxin - Google Patents

Radioimmunologisches analyseverfahren zur bestimmung von digoxin

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Publication number
DE2539242A1
DE2539242A1 DE19752539242 DE2539242A DE2539242A1 DE 2539242 A1 DE2539242 A1 DE 2539242A1 DE 19752539242 DE19752539242 DE 19752539242 DE 2539242 A DE2539242 A DE 2539242A DE 2539242 A1 DE2539242 A1 DE 2539242A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
digoxin
digoxigenin
sample
mixture
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19752539242
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Raymond Herrin
Raymond Oslapas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of DE2539242A1 publication Critical patent/DE2539242A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J19/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 by a lactone ring
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
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Description

Im Vergleich, zu herkömmlichen analytischen Methoden bietet die radioimmunoIogisehe Analyse mehrere Vorteile, insbesondere eine außerordentliche Empfindlichkeit und hohe Spezifität. Mit Hilfe der bekannten Analyseverfahren können die sehr geringen Mengen von Digoxin im Serum, welche in der Regel weniger als 5 Nanogramm (ng) pro ml betragen, nur schwierig bestimmt werden« Die radioimmunologischen Analysemethoden beruhen z.B. darauf, daß ein Antikörper in gleichem Maße an markiertes oder unmarkiertes Antigen gebunden wird. Die Konzentration der unmarkierten Form des Antigens in der Lösung bestimmt die relativen Anteile des an den Antikörper gebundenen markierten bzw. unmarkierten Antigens. Man kann eine Eichkurve aufstellen, indem man den radioimmunologischen Test bei konstanter Konzentration des Antikörpers und des markierten Antigens mit Hilfe abgestufter bekannter Mengen des unmarkierten Antigens vornimmt. Wenn man
— 1 —
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dann eine unbekannte Antigenmenge in einer Serumprobe in der gleichen Weise zur Reaktion bringt, läßt sich die Konzentration aus dem erzielten Wert anhand der Eichkurve bestimmen. Der Antigengehalt des Serums kann somit in Nanogramm gemessen werden.
Ein radioimmunologisches Analyseverfahren weist vier Erfordernisse auf: 1) ein hochreines Antigen, 2) einen durch Injektion des Antigens in eine andere Tierart erzeugten spezifischen Antikörper (Antiserum), 3) ein radioaktiv markiertes, gereinigtes Antigen oder Antigenderivat mit einer vorher bestimmten spezifischen Aktivität und 4) ein befriedigendes Verfahren zur Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes vom freien Antigen. Das freie Antigen kann von dem an den Antikörper gebundenen · Antigen getrennt werden; abhängig vom Trennverfahren läßt sich entweder freies oder gebundenes Antigen durch Messung der Radioaktivität bestimmen.
R.S. Yalow und S.A. Berson beschreiben im Journal of Clinical Investigation, Bd. 39 (1960), Seite 1157 die erste vollständige radioimmunologische Analysemethode. T.W. Smith et al. erläutern im New England Journal of Medicine, Bd. 281 (1969)» Seite 1212 einen radioimmunologischen Test für Digoxin, bei dem H-Digoxin als Radio-Indikator (Tracer) verwendet wird. Dieser Tracer benötigt für die Strahlungsintensitätsmessung einen Flüssigkeitsszintillationszähler bzw. das dazugehörige flüssige Medium.
Die Erfindung betrifft einen konkurrierenden radioimmunologischen Test, bei dem nicht-radioaktives Digoxin in einer Serum-
125 probe mit einer konstanten Menge von J -markiertem Tyramin- -Analogem von Digoxin bezüglich der Bindungssteilen an einer begrenzten Digoxin-Antikörpermenge konkurriert. Der (prozentuale) Anteil des an den Antikörper gebundenen, radioaktiv markierten Digoxins verhält sich umgekehrt proportional zur Konzentration des Digoxins in der Serumprobe. Das an den Antikörper gebundene Digoxin (sowohl das radioaktive als auch das nicht-radioaktive) wird vom ungebundenen Digoxin getrennt.
- 2 6 0 9 8 U / 0 8 1 1
Man bestimmt die Radioaktivität des Komplexes mit einem ein Bohrloch besitzenden γ-Strahlungsintensitätsmesser (Szintillationszähler) . Die Digoxinkonzentration im Serum wird durch Vergleich mit abgemessene Anteile von unraarkiertem Digoxin enthaltenden Standardproben bestimmt. Durch die Verwendung des
125
J -Digoxin-Tyramin-Analogen vereinfacht sich das Verfahren, .da man auf das beim Arbeiten mit H-Digoxin benötigte flüssige Medium zur Strahlungsintensitätsmessung (Szintillationszählung) verzichten kann.
Im erfindungsgemäßen radio immunologischen. Analyseverfahren verwendet man zur !Trennung des gebundenen, markierten Digoxin- -Tyramin-Analogen vom freien Digoxin vorzugsweise Polyäthylenglykol. Man kann für diesen Zweck Jedoch auch Äthanol oder Ammoniumsulfat einsetzen. Nach der Inkubierung des Antigens und Antikörpers fügt man eine vorbestimmte Polyäthylenglykolmenge hinzu und rührt bzw. schüttelt das Gemisch. Anschließend wird das an den Antikörper gebundene Digoxin ausgefällt und abzentrifugiert. Man mißt die im Niederschlag zurückbleibende Radioaktivität, um den an den Antikörper gebundenen Anteil des
J -Digoxin-Tyramin-Analogen zu bestimmen. Dieser Anteil verhält sich zu der in der Serumprobe enthaltenen Menge an unmarkiertem Antigen umgekehrt proportional.
Die Erfindung soll nun anhand der Zeichnung näher erläutert werden.
Pig. 1 zeigt eine gemäß dem Verfahren der Erfindung aufgestellte Eichkurve und veranschaulicht die Grundlagen der radio immunologischen Analyse.
Mit Hilfe des erfindungs gemäß en radioimmunologischen Analyseverfahrens wird das in einer Serumprobe enthaltene Digoxin bestimmt. Das Digoxin konkurriert in der Probe mit einer konstanten Menge eines radioaktiv markierten Digoxin-Tyramin-Analogen hinsichtlich der Bindungsstellen an einer begrenzten Menge von Digoxin-Antikörper. Das Digoxin-Tyramin-Analoge ist 3-O-(4-
60981 4/0811
-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin, dessen Synthese nachstehend beschrieben wird. Das Digoxin-Tyramin-Analoge wird in herkömmlicher Weise mit einem radioaktiven Isotop markiert.
125
Jod-J wird wegen seiner vorteilhaften Halbwertszeit als Markierungsmittel bevorzugt; es können jedoch auch andere Radionuklide, wie Jod ■* , Phosphor-* und Tritium, zur radioaktiven Markierung des Reagens herangezogen werden. Mit Hilfe dieses Tracers wird das Verfahren vereinfacht, da auf das bei herkömmlichen Tracern (wie -Ή-Digoxin) benötigte flüssige Medium zur Messung der Strahlungsintensität verzichtet werden kann.
Das Digoxin-Tyramin-Analoge wird wie folgt hergestellt.
Beispiel 1
Herstellung von 3-0-(4-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin 12-Acetyldigoxigenin
Das 12-Acetylderivat wird nach dem von A. Yamada in Ch. Pharm. Bull., Tokio, Bd. 8 (1960), Seite 18 beschriebenen Verfahren hergestellt. Man versetzt eine Lösung von 2 g Digoxin in 28 ml Pyridin mit 26 ml Essigsäureanhydrid und erhitzt den Ansatz 4 Stunden auf 10O0C (am ölbad). Anschließend dampft man das Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab und befreit den Rückstand durch azeotrope Destillation mit Toluol weitgehend von den letzten Lösungsmittelspuren. Das rohe Pentaacetat wird ohne weitere Reinigung der Verseifung unterworfen. Man löst das Pentaacetyldigoxin in 200 ml Methanol, fügt 200 ml 0,1 η Salzsäure hinzu, kocht das Gemisch 45 Minuten unter Rückfluß und engt es nach Abkühlung auf Raumtemperatur bei vermindertem Druck bis zur Bildung eines Niederschlags ein. Dann extrahiert man das Gemisch mit Chloroform, trocknet den Extrakt über Magnesiumsulfat, filtriert, dampft das Piltrat bei vermindertem Druck ein und kristallisiert den Rückstand aus Aceton/Äther um. Dabei erhält man 472 mg einer ersten Ausbeute (Pp. 273 bis 2780C). Eine zweite Ausbeute von 240 mg (Fp. 270 bis 2830C) erhält man aus der Mutterlauge mit Hilfe von Aceton/Äther/Hexan als Lösungsmittel. Beide Erträge weisen die für die nächste Stufe
- 4 -609814/08 1-1
erforderliche Reinheit auf.
3-Chlorformyldi^oxigenin
712 mg (1,648 mMol) 12-Acetyldigoxigenin werden in 50 ml Methylendichlorid eingetragen. Man fügt 50 /ul wasserfreies Dimethylacetamid hinzu und leitet durch, das Gemisch 7 Stunden lang abwechselnd Phosgen und Sticksio'ff hindurch., wobei man den Reaktionskolben im Eisbad kühlt. Danach, dampft man das Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab und reibt den Rückstand mit Äther an. Hierauf wird der Äther abgedampft und der Rückstand in Aceton gelöst. Die Lösung wird mit Aktivkohle (Holzkohle) und einem Filterhilfsmittel behandelt. Dann versetzt man die klare Lösung bis zur schwachen Trübung mit Äther, wonach man das Gemisch filtriert und auf Raumtemperatur abkühlen läßt. Die erste Ausbeute beträgt 318 mg (Fp. 1440Cj Zersetzung), die zweite Ausbeute 81 mg (Fp. 1430C; Zersetzung) und die dritte Ausbeute 25 mg (Fp. 1420C; Zersetzung). Die erste Ausbeute ergibt eine annehmbare Elementaranalyse; alle drei Erträge (insgesamt 424 mg; Gesamtausbeute 51,9 i°) eignen sich für die nächste Synthesestufe.
12-Acetyl-3-O-(4-hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin Man versetzt ein auf 50C abgekühltes Gemisch von 200 mg (1,44 mMol) Tyramin in 50 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran mit 355 mg (0,717 mMol) 3-Chlorformyldigoxigenin. Der Ansatz wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und löst den Rückstand in einem Chloroform/Wasser-Gemisch. Die Chloroforms chi eht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der beim anschließenden Eindampfen erhaltene Rückstand wird an 40 g Magnesiumsilikat chromatographiert. Das gewünschte Produkt wird mit 10 $> Methanol/Benzol eluiert. Man erhält 325 mg Produkt; dieses ergibt eine korrekte Elementaranalyse.
3-0-(4-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin Eine Lösung von 200 mg 12-Acetyl-3-O-( 4-hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin in 20 ml 50prozentigem wäßrigem Methanol wird
- 5 -60981 4/081 1
mit 2 ml Triäthylamin versetzt und danach 25 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend dampft man die Lösung bei vermindertem Druck bis zur Bildung eines Niederschlags ein. Man extrahiert das Gemisch gründlich mit Äthylacetat, wäscht den Extrakt mit Wasser, trocknet ihn über Magnesiumsulfat und dampft das Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab. Der Rückstand (147 mg) wird durch präparative DünnschichtChromatographie gereinigt. Man löst das gereinigte Produkt in einer sehr geringen Menge Methanol und läßt die Lösung stehen. Dabei fällt ein amorpher Feststoff (54 mg) mit einer durch Dünnschichtchromatographie bestimmten Reinheit von mehr als 90 $> aus.
Nachstehend wird ein Verfahren zur Durchführung der radioimmunologischen Analyse beschrieben, bei dem folgende Reagentien
verwendet werden:
1 ?·■»
1) Eine Lösung des J -Digoxin-Tyramin-Analogen in einem Alkohol-Phosphat-Kochsalz-Puffer mit einer Radioaktivität von etwa
1 Mikrocurie pro Ampulle.
2) Digoxin-Standardproben zur Aufstellung einer Eichkurve in Form von fünf Ampullen mit einem Geha.lt von 0, 0,5, 1,0, 2,0 bzw. 4,0 Nanogramm Digoxin pro ml normalem menschlichem Serum; als Konservierungsmittel dient 0,2 <$> Natriumazid.
3) Ein Digoxin-Anti serum, erhalten aus Kaninchen in einem Phosphat-Kochsalz-Puffer mit einem Gehalt von 0,1 # Puffer-Serum- -Albumin; als Konservierungsmittel dient 0,2 fo Natriumazid.
4) Eine I8prozentige Polyäthylenglykollösung in 0,09 m Barbitalpuffer.
Aus diesen Reagentien kann eine Prüfausrüstung hergestellt werden; eine Ausrüstung für 100 Tests beinhaltet:
125 eine Ampulle (10 ml) mit der Lösung des J -Digoxin-Tyramin- -Analogen mit einer Aktivität von etwa 1 Mikrocurie pro Ampulle; als Konservierungsmittel dient 0,2 $ Natriumazid; fünf Ampullen (jeweils 1,5 ml) mit Digoxin-Standardproben mit einem Gehalt von 0, 0,5, 1,0, 2,0 bzw. 4,0 Nanogramm Digoxin/ml normalem menschlichem Serum; drei Ampullen (jeweils 10 ml) mit Digoxin-Anti serum mit einem Gehalt von 0,2 $> Natriumazid als
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3154 >
Konservierungsmittel; eine Flasche (200 ml) 18prozentige PoIyäthylenglykollösung in 0,09 m Barbitalpuffer; und 100 Teströhr chen.
Der Test wird wie folgt durchgeführt. Mindestens 6 Stunden nach Verabreichung einer Dosis Digoxin wird dem Patienten eine Blutprobe entnommen. Man läßt das- Blut gerinnen und trennt das Serum ab. Wenn der radio immunologische Test mehr als 24 Stunden nach der Abtrennung des Serums vorgenommen wird, soll man letzteres im eingefrorenen Zustand aufbewahren. Wenn der Test durchgeführt wird, soll das Serum auf Raumtemperatur gebracht werden·
Bei der Analyse einer Probenreihe soll gleichzeitig eine Eichkurve aufgestellt werden. Alle Reagentien der Prüfausrüstung einschließlich der Polyäthylenglykol-Reagentien und der Serumproben werden auf Raumtemperatur gebracht. Die gesamte Ausrüstung soll bei 2 bis 80C aufbewahrt werden, wenn sie nicht gebraucht wird. Die für die Analyse verwendeten Röhrchen werden wie folgt bezeichnet:
a) die Röhrchen 1 und 2, welche aliquote Mengen der Lösung des
J -Digoxin-Tyramin-Analogen enthalten, werden zur Bestimmung
der Gesamt-Radioaktivität des Tracer-Reagens verwendet;
b) die Röhrchen 3 bis 12, welche bekannte Mengen von Digoxin enthalten, dienen zur Aufstellung der Eichkurve. Es enthalten: die Röhrchen 3 und 4 0 Nanogramm (ng) Digoxin/ml; die Röhrchen 5 und 6 0,5 ng Digoxin/mlj die Röhrchen 7 und 8 1,0 ng Digoxin/ ml j die Röhrchen 9 und 10 2,0 ng Digoxin/ml und die Röhrchen 11 und 12 4,0 ng Digoxin/mlj
c) die Röhrchen 13 ff. enthalten die zu analysierenden Serumproben (zweifach).
Man pipettiert jeweils 0,1 ml der bekannten Digoxininengen in die Röhrchen 3 bis 12 und jeweils 0,1 ml der zu testenden Proben (zweifach) in die Röhrchen ab Nummer 13· In jedes der Röhrchen (sowohl mit den Standard- als auch den unbekannten Proben) werden dann 0,3 ml Digoxin-Antiserum gegeben. Die Röhrchen werden zur Durchmischung der Reagentien geschüttelt. Dann gibt man jeweils 0,1 ml des J^-Digoxin-Tyramin-Analogen in die Röhrchen und schüttelt diese neuerlich zur Vermischung der Reagen-
- 7 -6 0 9 8 1 U I 0 8 1 1
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tien. Danach werden alle Röhrchen etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 300C) inkubiert. Anschließend werden die das markierte Reagens enthaltenden Röhrchen (1 und 2) beiseitegelegt. In die übrigen Röhrchen werden jeweils 2 ml einer I8pro~ zentigen Polyäthylenglykollösung eingegeben. Der Inhalt der Röhrchen wird etwa 10 Sekunden gründlich durchgemischt und anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur und 2700 bis 3300 UpM zentrifugiert. Danach dekantiert man die überstehende Lösung ab und bestimmt die im Niederschlag zurückbleibende Radioaktivität mit Hilfe eines herkömmlichen, ein Bohrloch aufweisenden Szintillationszählers.
Die Werte werden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wie folgt bestimmt. Man berechnet den mittleren Wert der Radioaktivität für die beiden Röhrchen 1 und 2, welche die Gesamt- -Radioaktivität des Tracer-Reagens repräsentieren. Der Anteil des an den Antikörper gebundenen, radioaktiv markierten Digoxin- -Tyramin-Analogen errechnet sich für jede Standardprobe oder unbekannte Probe wie folgt:
«irr^^on^THrnT^ Radioaktivität des Niederschlags in cpm .. 1nn * gebundenes Digoxin » *~ x
cpm= counts per minute = Zahl der pro Minute vom Zählgerät
registrierten Lichtblitze
Man zeichnet auf linearem Koordinatenpapier eine Eichkurve (vgl. Fig. 1), indem man die prozentualen Anteile des gebundenen Digoxins auf der Ordinate und die verschiedenen Konzentrationen der Digoxin-Standardproben auf der Abszisse aufträgt. Durch Verbindung der Meßpunkte mit Geraden erhält man die Eichkurve.
Für eine unbekannte Probe ist der an den Antikörper gebundene Prozentanteil des radioaktiv markierten Digoxins (Tab.I und Fig.1: "gebundener Proζentanteil") auf der Ordinate aufzusuchen. Von diesem Punkt aus wird eine Horizontale zur Kurve gelegt. Vom erhaltenen Schnittpunkt legt man eine Vertikale zur Abszisse; der dabei gefundene Schnittpunkt entspricht der Konzentration
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des Serumdigoxins in der unbekannten Probe.
Tabelle I erläutert ein typisches erfindungsgemäßes Analyseverfahren. Die Röhrchen 1 und 2 repräsentieren die Gesamt- -Radioaktivität des Tracer-Reagens;
die Röhrchen 3 bis 12 enthalten bekannte Digoxinmengen, deren Werte zur Aufstellung der Eichkurve gemäß Fig. 1 herangezogen werden;
die Röhrchen 13 bis 22 enthalten die zu testenden unbekannten Proben.
6098U/081 1
Tabelle
Röhr-
chen-Nr.		 Konzentration
oder Nr, der unbe
kannten Probe		 cpra =10304 gebundener
Proζentanteil
1
2		 Gesamt-Zählergebnig]Q151 6100
6203
Durchschnittswert : 5541
5365
3
4		 0,0
0,0		 4273
4277		 59,2
60,2
5
6		 0,5
0,5		 2316
2410		 53,8
52,1
7
8		 1,0
1,0		 1316
1334		 41,5
41,5
ο 9
10		 2,0
2,0		 1804
1849		 22,5
23,4
(JD
ei		 11
12		 4,0
4,0		 6525
6695		 12,8
12,9
>
ο		 13
14		 Nr.14
Nr. 14		 2589
2625		 17,5
17,9
OO
—Λ 		15
16		 Nr. 15
Nr. 15		 5230
5002		 63,3
65,0
17
18		 Nr.16
Nr.16		 2523
2502		 25,1
25,5
19
20		 Nr.17
Nr.17		 50,8
48,5
21
22		 Nr.18
Nr.18		 24,5
24,3
durchschnittli- ng/ml aus eher gebundener der Eichkurve Prozentanteil
Durchschnitt swert für ng/ml
59,7 52,9 41,5 22,9 12,9 17,7 64,1 25,3 49,6
3,08
3,00		 3,04
nicht meßbar
1,88
1,86		 1,87
0,60
0,68		 0,64
1,92
1,94		 1,93
3154 263.9242
Tabelle II erläutert die Treffsicherheit, Genauigkeit und Eeproduzierbarkeit des erfindungs gemäß en Analyseverfahrens.
Tabelle II Leistungsfähigkeit der Analyse
Eine Überprüfung der erfindungsgemäßen Methode und Prüfausrüstung ergibt folgende Merkmale:
Treffsicherheit ' .
Drei Serumproben mit niedrigem bis hohem Digoxingehalt (in ng/ml) werden anhand von Eichkurven untersucht, .die nach der erfindungsgemäßen Methode bzw. mit Hilfe einer U.S.P.-Eichsubstanz aufgestellt wurden.
Eichsubstanz
Proben
1		 (ng/ml)
2		 3 Mittelwert
0,70 1,95 3,80
0,70 1,95 3,70
100 # loo io 97,3 # 99,1 #
U. S.P.-Eichsubstanz
125 · J —Digoxin—
-Tyramin-Analoges Treffsicherheit
Genauigkeit
Drei Serumproben mit niedrigem bis hohem Digoxingehalt (in ng/ml) werden in fünf verschiedenen Labors anhand 43 getrennter Tests analysiert.
- 11 -
60981 4/0811
CD
OJ-*
Probe mit geringem Gehalt: Mittelwert (ng/ml)
Standardabweichung
Probe mit mittlerem Gehalt: Mittelwert (ng/ml)
Standardabweichung
Probe mit hohem Gehalt: Mittelwert (ng/ml)
Standardabweichung Anzahl der Bestimmungen:
Tabelle II (Fortsetzung)
Labor
2 3 4 5
0,62 0,63 0,64 0,60 0,57
0,12 0,05 0,09 0,08 0,11
2,00 1,90 2,00 1,90 2,00
0,22 0,08 0,06 0,17 0,19
3,70 3,70 3,70 3,40 3,90
0,30 0,17 0,17 0,38 0,16
vereinigte Daten
0,61 0,10
. 1,97 0,17
3,71 0,29
43
Heproduzierbarkeit
Zwei Proben werden im selben Labor von zwei Laboranten jeweils wiederholt analysiert; jede Testreihe besteht aus 15 in gleicher Weise durchgeführten Einzeltests.
Laborant I A.K. 9 f Laborant II A.K ,89
,54
Probe gebundener „
Tfe-Anteil D#J 		2,
2,		 35
28*		 gebundener
^-Anteil		 S.A. 2
2
1
2		 44,1 + 1
21,5 + O		 ,0
,5		 43,6 +
20,1 +		 1,26
0,51
*nur 14 Einzeltests; S.A,=Standardabweichung; A.K.=Abweichungskoeffizient
Was die Empfindlichkeit betrifft, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens Digoxinkonzentrationen von etwa 0,25 ng/ml bis hinauf zu etwa 4 ng/ml bestimmt werden.
Die erfindungsgemäß bestimmte Digoxinkonzentration dient in Verbindung mit anderen dem Arzt bekannten Daten und Symptomen zur Unterstützung der Diagnose". Als angenäherte Toxizitätsschwelle wurde ein Digoxingehalt von 2 ng/ml angenommen; (H.M.Park et al., Clin. Evaluation of Radioimmunoassay of Digoxin, J. of NFCL. Med., Bd. 14 (1973), Seite 531). Der Digoxinspiegel hängt jedoch unter anderem stark vom jeweiligen Patienten bzw. seinem Allgemeinzustand, der Nierenfunktion, der Toleranz und/oder Empfindlichkeit des Patienten gegenüber dem Wirkstoff, der nach der Verabreichung des Digoxins verstrichenen Zeit und der Dosis ab. Die Analysenwerte sollen daher im Zusammenhang mit der am Patienten erstellten Diagnose beurteilt werden.
6098 14/0811

Claims (8)

1.!Verfahren zur Bestimmung des Digoxingehalts einer Serumprobe, dadurch. gekennzeichnet, daß man . -
a) der Serumprobe Digoxin-Antikörper und eine Tracermenge von radioaktiv markiertem 3-0-(4-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin-Reagens beimischt,
b) das Gemisch inkubiert, um die Bindung des in der Probe enthaltenen Digoxins und des radioaktiv markierten Reagens an den Digoxin-Antikörper zu gestatten,
c) das Gemisch mit einem Fällmittel versetzt, um die Bildung eines Niederschlags zu fördern und dadurch das gebundene, markierte Digoxin vom freien Digoxin zu trennen,
d) die überstehende Flüssigkeit vom gebildeten Niederschlag abtrennt, und
e) die im Niederschlag zurückbleibende Radioaktivität mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Hilfe bekannte Digoxinmengen enthaltender Proben eine Eichkurve aufstellt und anhand dieser Kurve aus der in Stufe· (e) gemessenen Radioaktivität den Digoxinanteil der Probe bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fällmittel Polyäthylenglykol, Äthanol oder Ammoniumsulfat verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fällmittel Polyäthylenglykol verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- 14 -
60981-4/0811
6. 3-Chlorformyldigoxigenin und 3-O-(4-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)· -digoxigenin.
7. 3-O-(4-Hydroxyphenäthylcarbamoyl)-digoxigenin.
8. Diagnostische Testausrüstung zur Bestimmung des Vorhandenseins
von Digoxin in einer Serumprobe, bestehend aus
125
a) einer Lösung von mit J markiertem 3~0-(4-Hydroxyphen-
äthylcarbamoyl)-digoxigenin mit einer Radioaktivität von etwa 1 Mikrocurie pro Ampulle,
b) mehreren Lösungen mit vorbemessenen, bekannten Konzentrationen von Digoxin,
c) einer Lösung von Digoxin-Antiserum, und
d) einer Polyäthylenglykollösung.
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