DE2818842A1

DE2818842A1 - Vorrichtung zum automatischen erkennen von zellen

Info

Publication number: DE2818842A1
Application number: DE19782818842
Authority: DE
Inventors: Ichiro Sawamura; Kosaku Tsuboshima
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1977-04-30
Filing date: 1978-04-28
Publication date: 1978-11-09
Also published as: US4232970A; JPS53135697A; DE2818842C2

Description

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DR.E. ν. PECHMANN SCIIWEIOTäRSTHASSE 2

TELEFON· (089) 66 20 51

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PATENTANWÄLTE

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Anmelder: Olympus Optical Company Limited,

No. 43-2, 2-Chome, Hatagaya, Shibuya-Ku, Tokyo, Japan

Titel; "Vorrichtung zum automatischen

Erkennen von Zellen"

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DR. ING. F. WITESTHOFF SOCO MUrCHEN 9O

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DR. E. ν. PECHMANN DR. ING. D. BEHRENS telefon (089) 66 20 51

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Vorrichtung zum automatisohen Erkennen von Zellen

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum automatischen Diagnostizieren bzw. Erkennen von Zellen, bei der von der Mikroskop-Spektrophotometrie Gebrauch gemacht wird, um Zellen zu untersuchen und automatisch festzustellen, ob die Zellen von Krebs befallen sind oder nicht.

Bei einem zu untersuchenden Stoff ist es mit Hilfe der vorhandenen Menge an Desoxyribonucleinsäure (DNA.) und des Durchmessers eines Zellkerns möglich, festzustellen, ob der Stoff anionoid oder kationoid ist. Bei der Mikroskop-Spektrophotometrie ist es ferner möglich, ein Abtastintegrationsverfahren anzuwenden, um die Menge der im Zellkern vorhandenen DNA zu ermitteln. Zu diesem Zweck wird ein monochromatischer Lichtfleck verwendet, um den Zellkern abzutasten und hierbei das Konzentrationsmuster jedes überstrichenen Teils zu ermitteln. Um die Gesamtmenge an DNA zu erhalten, die im Zellkern vorhanden ist, summiert man die für jeden Teil ermittelten Konzentrationswerte. Ferner ermittelt man bei jedem Teil oder Abschnitt die Strecke zwischen dem ansteigenden Ende und dem abfallenden Ende der Konzentrationskurve, und man kann den Durchmesser des Zellkerns bestimmen, indem man die größte

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Strecke bzw. den größten Durchmesser wählt. Wird dieses Verfahren zum Erkennen von Zellen bei einer Vorrichtung zum automatischen Erkennen von Zellen angewendet, die dazu dient, zahlreiche Proben zu untersuchen, ist es erforderlich, eine hohe Arbeitsgeschwindigkeit beim Nachweisen, Abtasten und Erkennen der Zellen zu erreichen, doch ist es hierbei erforderlich, jeweils die gesamte Zelle abzutasten und die gemessenen ¥erte für die betreffenden Teile jedes einzelnen Zellkerns in Beziehung zu einem bestimmten Zellkern zu setzen, wenn die Menge der in jedem Zellkern enthaltenen DNA ermittelt werden soll. Im Hinblick hierauf ist es erforderlich, eine komplizierte und entsprechend kostspielige Verarbeitungseinrichtung zu benutzen, denn anderenfalls ergibt sich eine Verringerung der Verarbeitungsgeschwindigkeit.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zum automatischen Erkennen von Zellen zu schaffen, bei der ein Mikroskop-Spektrophotometer in Verbindung mit einer automatischen Probenzuführungseinrichtung, einer Probendetektoranordnung und einer Datenverarbeitungseinrichtung verwendet wird, wobei alle diese Einrichtungen automatisch durch eine Recheneinrichtung gesteuert werden, so daß sich dar gesamte ErkennungsVorgang von der Zuführung von Zellen bis zu ihrer endgültigen Erkennung automatisch und mit hoher Geschwindigkeit abspielt, wobei nur ein geringer Kostenaufwand erforderlich ist.

Erfindungsgemäß ist diese Aufgabe durch die Schaffung einer automatischen Vorrichtung zum Erkennen von Zellen gelöst, die ein Mikroskop aufweist, ferner eine dem Mikroskop zugeordnete Abtastbühne, einen Probenträger zum automatischen Zuführen einer Probe zu der Abtastbühne, eine automatische Fokussiereinrichtung, eine Detektoranordnung zum Ermitteln der Lichtabsorption der Probe sowie eine Recheneinrichtung. Hierbei steuert die Recheneinrichtung die genannten Einrich-

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tungen und verarbeitet automatisch die der Detektoranordnung entnommenen Informationen, so daß der gesamte Erkennungsvorgang von der Zufuhr von Zellen bis zu der Erkennung der Zellen automatisch abläuft.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine Schrägansicht einer Ausführungsform einer gemäß der Erfindung verwendeten Vielfachabtasteinrichtung;

Fig. 2 eine vergrößerte Stirnansicht des Anschlusses der Vielfachabtasteinrichtung nach Fig. 1;

Fig. 3 eine graphische Darstellung von zwei Beispielen für Konzentrationskurven, die mit Hilfe der Stirnfläche der Vielfachabtasteinrichtung gewonnen werden können, wenn diese zum Abtasten eines Zellkerns benutzt wird;

Fig. 4 bis 6 jeweils eine Darstellung zur Veranschaulichung der Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 7 das Blockschaltbild der Vorrichtung;

Fig. 8 das optische System des bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Mikroskops;

Fig. 9 die vergrößerte Vorderansicht einer Probenkassette und eines Probenträgers, die Bestandteile der Vorrichtung bilden;

Fig.10 einen möglichen Plan, nach dem bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Probe abgetastet werden kann;

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Pig. 11 das Blockschaltbild einer Aus gabeschaltung, der Eingangssignale von Lichtaufnahmeelementen zugeführt werden, die zu der Vielfachabtasteinrichtung gehören; und

Fig. 12 einen Verteilungsplan mit mehreren verschiedenen Bereichen, denen Meßergebnisse zugeordnet werden, um eine Diagnose zu erstellen.

In Fig. 1 ist eine Vielfachabtasteinrichtung dargestellt, die einen Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung bildet. Hierzu gehören ein massiver Anschluß 1 und ein optisches Faserbündel 2 mit mehreren einzelnen Fasern 2a, 2b usw. Die einen Enden 3a, 3b> 3c usw. sind gemäß Fig. 2 auf einer geraden Linie angeordnet und festgelegt. Die Stirnfläche des massiven Anschlusses 1 ist so angeordnet, daß das Objektiv des Mikroskops ein vergrößertes Bild erzeugt. Ferner sind gemäß Fig. 1 mehrere Lichtaufnahmeelemente 4a, 4b vorhanden, die jeweils gegenüber dein anderen Enden 3a¹, 3b', 3c¹ usw. der einzelnen optischen Fasern angeordnet sind, welche voneinander getrennt sind. Wird die Vielfachabtasteinrichtung benutzt, um gemäß Fig. 4 eine Probe S in Gestalt eines Zellkerns dadurch abzutasten, daß gemäß Fig. 2 eine Bewegung in Richtung des Pfeils herbeigeführt wird, erzeugen die Enden 3a, 3b, 3c der betreffenden Fasern das in Fig. 3 dargestellte Muster.

Es sei angenommen, daß die Probe S nach Fig. 4 eine zylindrische Form, einen runden Querschnitt und eine bestimmte Dicke hat. Die Menge M des in der zylindrischen Probe enthaltenen Stoffs ist dann als das Produkt der Konzentration des Stoffs C und des Volumens V des zylindrischen Körpers gegeben. Die Extinktion A des Stoffs wird durch das Produkt eines Extinktionskoeffizienten E, der Konzentration C und der Probendicke d dargestellt. Bezeichnet man den Durchmesser des zylindrischen

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Körpers mit L, erhält man somit die Menge M des in der Probe enthaltenen Stoffs als einen zu AL proportionalen Wert. Wenn der massive Anschluß 1 der Vielfachabtasteinrichtung mit den Stirnflächen 3a, 3b usw. der einzelnen Fasern gemäß Fig. 4 in Richtung des Pfeils bewegt wird, um eine Abtastung durchzuführen, erhält man die in Fig. 5a bis 5c dargestellten Konzentrationskurven. Die Menge des Stoffs, der in den verschiedenen Teilen vorhanden ist, welche durch die einzelnen Fasern 3a, 3b, 3c usw. abgetastet werden, ergibt sich auf der Basis der Extinktion der verschiedenen Teile in der Form kAaLa bzw.

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kAblib bzw. kAcLc , wobei k eine Konstante ist; La, Lb und Lc bezeichnen die Länge der verschiedenen Abschnitte a, b und c bzw. die Strecken zwischen dem ansteigenden und dem abfallenden Ende der zugehörigen Kurve, während Aa, Ab und Ac die maximale Extinktion in den Abschnitten a, b und c bezeichnen. Gemäß Fig. 6a bis 6c entsprechen die genannten Werte der Menge des Stoffs, die in zylindrischen Körpern enthalten ist, deren Durchmesser mit La bzw. Lb bzw. Lc gegeben ist. Gemäß der Erfindung beruht die diagnostische BesiL mmung der Zellen auf

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der Größe AL , wobei auf eine noch zu erläuternde Weise von der Länge L jedes Abschnitts und der maximalen Extinktion A des betreffenden Abschnitts Gebrauch gemacht wird.

Fig. 7 zeigt den Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum automatischen Erkennen von Zellen. Hierzu gehört ein Mikroskop 11 mit einem weiter unten beschriebenen optischen System, und dieses Mikroskopet einer Abtastbühne 12 zugeordnet, die durch eine Einrichtung 13 gesteuert wird. Dem Mikroskop 11 ist eine Anordnung 14 mit einer Probenkassette und einem Probenträger zugeordnet, die durch eine Einrichtung 15 gesteuert wird; diese Anordnung ist weiter unten näher beschrieben. Ferner ist dem Mikroskop 11 eine automatische Fokussiereinrichtung 16 zugeordnet, zu der ein Abtastfühler 16a, eine arithmetische Schaltung 16b mit einer Steuereinrichtung sowie eine Brennpunkteinstelleinrichtung 16c gehören. Ferner ist ein

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Fühler 17 mit mehreren Fasern vorhanden, der den Elementen 4a, 4b usw. nach Fig. 1 entspricht und an eine Signalverarbeitungseinrichtung 18 angeschlossen ist. Die Signalverarbeitungseinrichtung ist mit einer Schnittstelle 19 verbunden, die ihrerseits an einen Miniaturrechner 20, einen Fernschreiber 21 und eine Schalttafel 22 angeschlossen ist.

Gemäß Fig. 8 gehören zum optischen System des Mikroskops 11 eine Lichtquelle 25, bei der es sich z.B. um eine Halogenlampe handeln kann, und ein Interferenzfilter 26, das dazu dient, monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge, von 546 Mikrometer durchzulassen, das vom Zellkern in einem maximalen Ausmaß absorbiert wird. Ferner gehören zu dem optischen System eine Kondensorlinse 27, ein Objektiv 29, wobei eine Probe 28 zwischen der Linse 27 und dem Objektiv 29 angeordnet werden kann, ein Okular 30, zwei halbdurchlässige Prismen 31 und 32 sowie zwei Lichtaufnahmeelemente 33 und 34, die mit feinen Öffnungen 35 und 36 versehen sind. Zwischen den Prismen 31 und 32 ist ein Galvanometerspiegel 37 angeordnet. Während des Gebrauchs der Vorrichtung fällt das Licht der Lichtquelle 25 durch die Kondensorlinse 27 auf die Probe, um sie zu beleuchten. Hierbei kann die Probe durch das Okular 30 beobachtet werden, und ein Bild der Brobe wird durch das halbdurchlässige Prisma 31 reflektiert. Der massive Anschluß 1 der Vielfachabtasteinrichtung ist dort angeordnet, wo durch das Objektiv 29 ein vergrößertes Bild der Probe fokussiert wird. Die automatische Fokussiereinrichtung 16 wird durch die Lichtaufnahmeelemente 33 und 34 gesteuert, denen Licht zugeführt wird, das durch die feinen Öffnungen 35 und 36 fällt, welche vor und hinter der Bildebene des Objektivs 29 angeordnet sind. Die Lichtaufnahmeelemente 33, 34 und der Galvanometerspiegel 37 bilden zusammen den Abtastfühler 16a nach Fig. 7. Zur automatischen Fokussierung wird das Bildfeld mit dem Galvanometerspiegel 37 abgetastet, und die Ausgangssignale der Lichtauf nahmeeIe-

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mente 33 und 34 werden der arithmetischen Schaltung 16b zugeführt, durch welche die Brennpunkteinstelleinrichtung 16c gesteuert wird, mittels welcher die Fokussierung bewirkt wird. Ist das Mikroskop genau fokussiert, ergibt sich dort, wo die beiden feinen öffnungen angeordnet sind, eine gleich große Defokussierung, so daß die arithmetische Schaltung 16b ein Vergleichsausgangssignal erzeugt. Wird jedoch das Mikroskop nach der einen oder anderen Seite defokussiert, vergrößert sich der berechnete Kontrastwert desjenigen Lichtaufnahmeelements, welches auf der Defokussierungsseite liegt. In diesem Fall wird eine Bühnen-Feineinstellschaltung benutzt, um die Fokussiereinrichtung 16c so zu verstellen, daß die Bühne in der entgegengesetzten Richtung bewegt wird, bis die beiden Lichtaufnahmeelemente gleich große Ausgangssignale liefern. Die Defokussierung, die als Folge einer Bewegung der Bühne eintritt, wird innerhalb der Tiefenschärfe des Objektivs automatisch verfolgt bzw. ausgeglichen.

Fig. 9 zeigt die Konstruktion der Probenkassette und des Probenträgers. In einer Kassette 40 können mehrere Proben 41 angeordnet werden; jede dieser Proben kann mittels eines Trägers 42 nach rechts bewegt und auf der mit gestrichelten Linien angedeuteten .Bühne 43 des Mikroskops angeordnet werden. Sobald die Messung einer Probe abgeschlossen ist, wird die Kassette 40 in senkrechter Richtung bewegt, bevor die nächste Probe auf die Bühne 43 überführt wird.

Nachdem die Probe auf der Bühne bzw. dem Objekttisch 43 angeordnet worden ist, wird sie in der in Fig. 10 dargestellten Weise bewegt, um eine Abtastung durchzuführen und die verschiedenen Teile der Probe auszumessen. Nachdem die Probe auf dem Objekttisch an einer bestimmten Stelle angeordnet worden ist, bewirkt die Bewegung des Objekttisches eine Verlagerung von dem Bereich A zu dem Bereich B. In der Zwischenzeit bewirkt die automatische Fokussiereinrichtung die ge-

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wünschte Fokussierung. Da die Fokussierung abgeschlossen ist, wenn die Probe den Bereich B erreicht, kann eine Abtastung des Bereichs B in der durch Pfeile angedeuteten Weise erfolgen, um die Extinktion und die Länge jedes Zellkerns zu ermitteln, der sich innerhalb des Bereichs befindet. Bei der Abtastung wird der Objekttisch gemäß Fig. 10 in der Querrichtung ebenso bewegt, wie es in Fig. 2 durch einen Pfeil angedeutet ist. Danach wird der Objekttisch senkrecht um einen Betrag bewegt, welcher der Länge des massiven Anschlusses der Vielfachabtasteinrichtung entspricht, woraufhin eine Abtastung in der entgegengesetzten Richtung erfolgt, usw. Danach wird die Probe vom Bereich B zum Bereich C verlagert, um die Abtastung zu wiederholen, und danach wird nacheinander auf die Bereiche D und E übergegangen. Schließlich erfolgt die Rückkehr zu dem Bereich A, um eine Abtastspektrophotometrie des Zellkerns durchzuführen, der sich in dem Bereich A befindet, wodurch die spektrophotometrische Ausmessung der Probe abgeschlossen wird.

Fig. 11 zeigt die Ausgabeschaltung, die den einzelnen Lichtaufnahmeelementen zugeordnet ist, welche gegenüber den einzelnen optischen Fasern angeordnet sind. Das photometrische Ausgangssignal wird einem Vorverstärker 46 zugeführt, der einen hohen Eingangswiderstand aufweist, welcher die Schwankungen der Durchlässigkeit von Faserbündel zu Faserbündel sowie die Empfindlichkeitsunterschiede der einzelnen Lichtaufnahmeelemente ausgleicht. Von dem Verstärker 46 aus wird das Signal einem analogen Multiplexer 47 zugeführt, der nacheinander ein Kanalsignal einer Abfrage- und Halteschaltung 48 zuführt, an die ein Analog/Digital-Wandler 49 angeschlossen ist. Das Signal wird in der Schaltung 48 gespeichert, bis es in ein digitales Signal verwandelt wird. Das umgewandelte Signal wird einem Speicher des Miniaturrechners eingegeben, während die Kanaltrennung durch einen Ausgangsimpuls der Steuereinrichtung 13 nach Fig. 7 bewirkt wird, wobei die-

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ser Aus gangs impuls in Abhängigkeit vondsr Bewegung des Objekttisches erzeugt wird. Die beschriebenen Arbeitsschritte einschließlich der Verlagerung des Objekttisches zum Zweck der Abtastung und der Überführung der Probe aus der Kassette auf den Objekttisch werden sämtlich durch den Miniaturrechner 20 nach Fig. 7 gesteuert.

Im Speicher des Miniaturrechners 20 gespeicherte Daten die-

nen dazu, den Wert von kAL aus der Strecke L und der maximalen Extinktion A jedes Abschitts jeder Zelle bzw. jedes einzelnen Zellkerns innerhalb des abgetasteten Bereichs zu berechnen. Die berechneten Werte werden sortiert und vier Bereichen 1, II, III und IV entsprechend den Werten von L und

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AL zugeordnet, wie es in Fig. 12 gezeigt ist. Der Bereich I repräsentiert diejenigen Zellkerne, zu denen Werte von L

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und AL gehören, die beide unter dem Schwellenwert C liegen. Zu dem Bereich II gehört ein Wert von L, der unter dem Schwel-

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lenwert liegt, während AL den Schwellenwert überschreitet. In dem Bereich III überschreitet der Wert von L den Schwellen-

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wert, während der Wert von AL unter dem Schwellenwert liegt. Der Bereich IV gilt für diejenigen Zellkerne, bei denen die

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Werte für L und kAL beide den Schwellenwert überschreiten. In Fig. 12 ist ein weiterer Bereich V für Daten dargestellt, deren Werte Randwerte R überschreiten, und die daher irreführend sind, so daß sich eine genaue Ermittlung nicht durchführen läßt. Die Anzahl der Proben, die auf die verschiedenen Bereiche entfallen, wird ermittelt, und ihr prozentualer Anteil an der Gesamtzahl ermöglicht es, zu entscheiden, ob die Probe anionoid oder kationoid ist. Eine solche Entscheidung ist möglich, wenn erkennbar ist, daß z.B. die Anzahl der Proben, die auf den Bereich IV entfallen, einen bestimmten Prozentsatz überschreitet, durch eine anionoide Probe angezeigt wird. Natürlich ist es erwünscht, den Schwellenwert auf statistischer Basis mit Hilfe einer Anzahl von Grundversuchen zu ermitteln, um eine falsche Beurteilung der Probe zu vermeiden.

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Das berechnete Ergebnis wird gemäß Fig. 7 durch den Fernschreiber 21 ausgegeben, der den Anteil der Anzahl der Proben in jedem der Bereiche an der Gesamtzahl sowie die Tatsache ausdruckt, daß die Probe anionoid (+) oder kationoid (-) ist.

Gemäß der vorstehenden Beschreibung ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung zum automatischen Erkennen von Zellen eine einfache und schnelle Verarbeitung der Daten, die beim Ausmessen von Zellen gewonnen werden, denn die Diagnose kann auf der Basis der Größe kAL erfolgen, die mit Hilfe der Strecke L und der maximalen Extinktion A jedes abgetasteten Abschnitts einer zu untersuchenden Zelle berechnet wird. Die Steuerung des Mikroskops, die Zufuhr von Proben, die Abtastung durch Bewegen des Objekttisches, die automatische Brennpunktnachführung, die Steuerung der Detektoranordnung und die Verarbeitung der Daten werden durch den Rechner automatisch gesteuert. Auf diese Weise ist die Beurteilung von Zellen schnell durchführbar, und die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere für Massenuntersuchungen, bei denen große Mengen von Proben verarbeitet werden müssen.

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Claims

ANSPRUCH

Vorrichtung zum Erkennen von Zellen mit Hilfe eines Mikroskops, gekennzeichnet durch ein Mikroskop (11) mit einem bewegbaren Abtast-Objekttisch (12), einen Probenträger (14) zum automatischen Zuführen einer Probe zu dem Objekttisch, eine automatische Fokussiereinrichtung (16) zum Fokussieren des Mikroskops gegenüber der Probe, eine Detektoranordnung (1, 2, 3, 4) zum Ermitteln der Extinktion der Probe sowie eine Recheneinrichtung (20) zum automatischen Steuern der genannten Einrichtungen (12, 14, 16) und zum automatischen Verarbeiten der mit Hilfe der Detektoranordnung gewanngaaiDaten derart, daß eine automatische Beurteilung bzw. Identifizierung der als Proben zugeführten Zellen durchgeführt wird.

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