DE69232413T2

DE69232413T2 - Verfahren und Vorrichtung zum automatischen Test biologischer Proben

Info

Publication number: DE69232413T2
Application number: DE69232413T
Authority: DE
Inventors: James V. Bacus; James W. Bacus
Original assignee: Cell Analysis Systems Inc
Current assignee: Cell Analysis Systems Inc
Priority date: 1991-09-23
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2012-09-12
Also published as: EP0534247B1; EP0534247A3; CA2077781A1; EP0534247A2; US5473706A; JPH0662406A; DE69232413D1

Description

Die Erfindung betrifft ein System zur Durchführung eines Assays von biologischen Zellproben und insbesondere zum Schaffen einer Anordnung zum Messen von Attributen der Bildbereiche und der Zellen von auf Objektträgern befindlichen Gewebeproben.
Die Diagnose und/oder die Prognose des Zustands eines Patienten beinhaltet oft das Entnehmen einer Zellprobe, beispielsweise einer Gewebemasse, aus dem Patienten. Zwar kann der betreffende Arzt im Hinblick auf die Diagnose und/oder Prognose des Patienten eine gute Intuition beweisen, jedoch ist eine Bestätigung der Diagnose durch eine histologische Untersuchung der dem Patienten entnommenen Zellprobe erforderlich. Die histologische Untersuchung umfaßt Zellmarkierungsvorgänge, die ein relativ leichtes Erkennen der morphologischen Eigenschaften der Zellen in einem Lichtmikroskop ermöglichen. Ein Pathologe trifft nach der Untersuchung der markierten Zellprobe eine qualitative Feststellung bezüglich des Gewebezustands und kommt zu einem Schluß hinsichtlich der Prognose für den Patienten. Zwar hat diese diagnostische Methode eine lange Geschichte, jedoch läßt ihre wissenschaftliche Genauigkeit etwas zu wünschen übrig, da sie sehr auf der subjektiven Beurteilung des Pathologen beruht und extrem zeitaufwendig ist.
Die Alternative zur strikt qualitativen und zeitaufwendigen menschlichen Analyse ist die automatisierte Zellanalyse, bei der der Pathologe spezielle Einrichtungen zur Durchführung der Analyse verwendet. Eine Art von Vorrichtung für die Zellanalyse sind Durchflußzytometrievorrichtungen. Bei der Durchflußzytometrie werden Massentests mit einer Probenzellenpopulation durchgeführt, ohne daß ein Untersuchender in der Lage ist, bestimmte Daten der Population auszuschließen oder einzubeziehen. Die Probe wird "wie sie ist" gemessen, ohne daß wirklich bekannt ist, welche Zellen und wie viele Zellen gemessen werden. Wichtige Einzelzellendaten oder Daten relativ kleiner Zellgruppen gehen bei der Gesamtdurchschnittsbildung einer Probe verloren. Ferner müssen für einen erforderlichen Grad an Genauigkeit relativ große Mengen einer Probe verwendet werden. Wiederum können geringe Veränderungen in einzelnen Zellen oder kleinen Zellpopulationen nicht erkannt werden.
Kommerziell erhältliche Vielzweck-Durchflußzytometer sind sehr kostspielig und können nur flüssige Blutproben oder aufgelöste Gewebeproben verwenden. Darüber hinaus sind Durchflußzytometer nicht in der Lage, mit Standardgewebesektionen zu arbeiten oder herkömmliche Mikroskopobjektträger zu verwenden, bei denen es sich um die bevorzugte Form der Probe in pathologischen Laboratorien handelt.
Zwar ist die Automatisierung der Zellanalyse unter Verwendung von Zellproben auf Mikroskopobjektträgern sehr schwierig, doch wurde sie auf ein interaktives Mensch-Maschine-Niveau automatisiert. Ein derartiges Verfahren und eine derartige Vorrichtung ist in US-A-4741043 beschrieben. Zellproben werden auf Objektträgern angebracht und ein Bediener stellt die Systemoptik ein, um bestimmte Bildbereiche der Zellprobe zu betrachten. Der Bediener wählt und klassifiziert sodann bestimmte Zellobjekte der Probe. Nach dieser Aktion des Bedieners misst die automatisierte Vorrichtung quantitativ bestimmte Attribute der gewählten und klassifizierten Zellobjekte und zeichnet eine digitale Wiedergabe des optischen Bildes auf. Die gemessenen Attribute können objektweise oder akkumuliert ausgegeben werden und die gespeicherten Bildwiedergaben können später zur Ansicht aus dem Speicher ausgelesen werden.
Die Automation der Analyse von Objektträgerproben wie in US-A-4 741 043 beschrieben hat zahlreiche Vorteile gegenüber der historischen rein menschlichen Analyse und der automatisierten Durchflußzytometrieanalyse. Dennoch ist weiterhin eine großer Aufwand an menschlicher Bedienerzeit und Beurteilungsvermögen erforderlich, um ein Gewebesektionsassay abzuschließen. Bei einem automatisierten zytologischen Probenspezifizierungssystem nach WO91/06911 werden die Proben einer automatisierten Untersuchung mit niedriger Auflösung unterzogen, während welcher die Probe angeordnet und der Fokus und/oder der Beleuchtungsgrad bestimmt wird. Anschließend wird die Probe einer automatisierten hochauflösenden Untersuchung unterzogen. Basierend auf den Ergebnissen der hochauflösenden Untersuchung werden primäre, sekundäre und tertiäre Klassifizierungsvorgänge ausgeführt, um bestimmte Aspekte der Probe zu bestimmen. Ein oder sämtliche Klassifizierungsvorgänge können vom Bediener ausgeführt werden. Da sowohl die niedrigauflösende als auch die hochauflösende Untersuchung automatisch erfolgt und auf die gesamte Probe angewandt wird, ist der Klassifizierungsvorgang zeitaufwendig.
Bei einer Vorrichtung zur Zellanalyse nach EP 0 317 319 wird die Probe markiert und zwei separate gefilterte Bilder werden erzeugt. Die gefilterten Bilder werden zu einem kombinierten Bild kombiniert, das dem Bediener angezeigt wird. Die Vorrichtung identifiziert Zellobjekte unter Verwendung von Mustererkennungsverfahren und ein interaktives Programm ermöglicht es dem Bediener derartige identifizierte Zellen zu klassifizieren. Da die Vorrichtung die vollständige Probe untersucht, um Zellobjekte zu identifizieren, ist ein erheblicher Zeitaufwand erforderlich.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zum automatisierten Analysieren von auf Objektträgern befindlichen Zellproben und insbesondere für auf Objektträgern befindliche Gewebeproben zu schaffen, die eine schnelle Untersuchung ermöglicht.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben, die auf Mikroskopobjektträgern angeordnet sind, weist ein interaktives optisches Subsystem zum Betrachten der auf dem Objektträger befindlichen biologischen Probe und zum Erzeugen eines interaktiven Videosignals auf, das dem betrachteten Bild entspricht. Ein automatisiertes optisches Subsystem weist ein Mikroskopobjektiv zum Abtasten von Objektträgern auf, von welchen Bereiche zuvor zum Testen in der interaktiven optischen Einrichtung ausgewählt wurden. Das System weist ferner ein Prozessorsubsystem zum Verarbeiten der interaktiven und automatischen Videosignale der beiden optischen Subsysteme auf. Der Prozessor empfängt das automatische Videosignal und führt biologische Testfunktionen an diesem aus.
Nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben vorgesehen, die ein schwachvergrößerndes interaktives optisches Subsystem zum interaktiven Abtasten der Bereiche der Mikroskopobjektträger, auf denen sich biologische Proben befinden, aufweist.
Nach einem weiteren Ausführungsbeispiel schafft die Erfindung eine Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben, die mehrere Objektträger automatisch ohne Intervention des Bedieners verarbeiten kann.
Nach einem weiteren Ausführungsbeispiel schafft die Erfindung eine Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben, die sowohl einen schwachvergrößernden interaktiven optischen Bereich als auch einen starkvergrößernden automatisierten optischen Bereich für das automatisierte Hochleistungstesten aufweist.
Andere Ausführungsbeispiele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und der Ansprüche in Zusammenhang mit den zugehörigen Zeichnungen.
Fig. 1 ist eine perspektivische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Testen biologischer Proben;
Fig. 1A ist eine teilweise weggebrochene perspektivische Darstellung eines automatischen optischen Eingangssubsystems der Vorrichtung zum Testen biologischer Proben von Fig. 1;
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm der Vorrichtung von Fig. 1;
Fig. 3 zeigt einen Objektträgerhalter und eine zugehörige Steuereinrichtung der Vorrichtung von Fig. 1;
Fig. 4 ist ein Blockdiagramm des Fokus- und des Lichtsteuerbereichs der Vorrichtung von Fig. 1;
Fig. 5 ist eine Draufsicht auf einen Gewebesektionsmikroskopobjektträger zur Verwendung mit der Vorrichtung von Fig. 1;
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der beim Testen der biologischen Proben verwendeten optischen Eigenschaften;
Fig. 7 und 8 sind schematische Darstellungen der vor dem Testen erfolgenden Vorbereitungen der biologischen Probe;
Fig. 9 und 10 sind Flußdiagramme der beim Testen mehrerer biologischer Proben eingesetzten Steuervorgänge;
Fig. 11 zeigt einen Bildbereich einer optisch ungefilterten Gewebesektion;
Fig. 12 zeigt den Bildbereich der Fig. 11, gefiltert durch ein Rot-Filter mit einem um 620 Nanometer zentrierten Passband; und
Fig. 13 zeigt den Bildbereich von Fig. 11, gefiltert durch ein Grün-Filter mit einem um 500 Nanometer zentrierten Passband.
Das offenbarte bevorzugte Ausführungsbeispiel dient dem Testen oder Quantifizieren biologischer Proben, insbesondere Östrogen und Progesteron, in Gewebeproben. Die Verfahren zum Markieren und Messen von Gewebeproben beim Testen auf Östrogen und/oder Progesteron sind im einzelnen in US-A-5 008185 beschrieben. Der Gewebeprobentest erfolgt unter Verwendung eines Zweifarben-Optiksystems zur Verbesserung der optischen Eigenschaften markierter Gewebeproben. Es ist dem Fachmann ersichtlich, daß zahlreiche erfinderische Merkmale des offenbarten Ausführungsbeispiels für andere Arten der Zellanalyse verwendet werden können, beispielsweise DNA-Quantifizierung, und daß andere Arten optischer Vorrichtungen, beispielsweise einfarbige, verwendet werden können.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Testen biologischer Proben, die allgemein mit 10 bezeichnet ist, ist perspektivisch in Fig. 1 und in Fig. 2 als Blockdiagramm dargestellt. Die Vorrichtung 10 weist ein interaktives optisches Eingangssystem 11a auf, das primär zur Verwendung beim Abtasten von Mikroskopobjektträgern mit biologischen Proben mit niedriger Leistung dient, um Bereiche für die spätere Analyse auszuwählen. Ein automatisiertes Testverarbeitungssystem 11b weist ferner einen Bereich der Vorrichtung zum gleichzeitigen Abtasten von bis zu acht Objektträgern bei relativ starker Vergrößerung auf, um biologische Tests auf dem Objektträger auszuführen.
Ein Prozessorsystem 11c empfängt Signale von den optischen Einheiten zur späteren Bildverarbeitung.
Das interaktive optische System 11a weist ein optischen Mikroskop 12 auf, das von beliebigem herkömmlichem Typ sein kann, in diesem Ausführungsbeispiel jedoch ein Riechart Diastar ist. Ein optisches Wandlermodul 14 ist am Mikroskop 12 angebracht, um das optisch vergrößerte Bild der mit dem Mikroskop 12 betrachteten Zellproben zu verbessern. Das optische Wandlermodul 14 weist, wie am besten in Fig. 2 zu sehen, ein Strahlteilerprisma 80 auf, das ungefähr 90% des Lichts in das optische Wandlermodul 14 leitet und die restlichen 10% auf ein Mikroskopokular 76 richtet. Das in das Modul 14 geleitete Licht wird einem dichroitischen Strahlteiler 82 zugeführt, der einen Teil des Lichts an eine Fernsehkamera 20 über ein-Rot-Filter 18 und einen Spiegel 81 reflektiert. Der verbleibende Teil des Lichts wird von einem dichroitischen Strahlteiler 82 gefiltert und einer Fernsehkamera 26 über ein Grün- Filter 24 zugeführt. Der dichroitische Strahlteiler 82 leitet selektiv Licht mit Wellenlängen von mehr als ungefähr 560 Nanometer an das Filter 18 und solches mit einer Wellenlänge von weniger als 560 Nanometer an das Filter 24. Somit wirkt der dichroitische Strahlteiler 82 als ein erstes Farbfilter bevor das Licht die Farbfilter 18 und 24 erreicht. Das Rot-Filter 18 ist ein 620 ± 20 Nanometer Bandpass-Durchlassfilter, das der Kamera 20 ein Bild mit hohem Kontrast liefert. Wie in Fig. 2 dargestellt, erzeugt die Kamera 20 anschließend ein NTSC-Bildsignal, das durch einen optischen Signaleingangsschalter 90a an einen Bildprozessor 90 eines Bildverarbeitungsmoduls 28 geleitet wird (Fig. 2. Das Grünfilter 24 ist ein optisches Durchlaßfilter mit schmalem Bandpass von 500 ± 20 Nanometer, das an eine Kamera 26 ein Bild mit starkem Kontrast liefert. Die Kamera 26 liefert sodann ein NTSC-Bildsignal durch den optischen Signalschalter 90a an einem Bildprozessor 92. Beide Bildprozessoren 90 und 92 enthalten A/D-Wandler zum Wandeln der analogen NTSC-Signale in ein digitalisiertes Pixel-Bild mit einer Auflösung von 384 · 485. Die mittige 256 · 256 Pixel-Array dieses digitalisierten Bilds wird sodann in Datenblockpuffern der Bildprozessoren 90 und 92 gespeichert. Das durch die 256 · 256 Pixel-Array repräsentierte visuelle Bild wird als ein Bildbereich bezeichnet.
Während der Montage der Vorrichtung von Fig. 1, und von Zeit zu Zeit danach, werden die optischen Elemente des Wandlermoduls 14 gegebenenfalls eingestellt, so daß jede Kamera 20 und 26 das selbe optische Bild empfängt und jedes Pixel der von den Prozessoren 90 und 92 erzeugten digitalisierten Pixelarrays den selben Bereich eines betrachteten optischen Bereichs wiedergibt.
Jeder der Bildprozessoren 90 und 92 ist ein Modell AT428 von Data Cube Corporation und weist sechs interne Datenblockspeicher auf. Die Bildprozessoren 90 und 92 sind mit einem Systembus 34 eines Computers 32 verbunden. Die datenblockspeicher der Bildprozessoren 90 und 92 werden in den Adressenraum eines Mikroprozessors 36 im Computer 32 abgebildet, um leichten Zugriff für die Bildverarbeitung zu ermöglichen. Ferner ist ein Bildmonitor 30 mit dem Bildprozessor 92 verbunden und zeigt ein in einem vorbestimmten Datenblockpuffer gespeicherten Zellprobenbildbereich an. Das Speichern einer Bildbereichwiedergabe im vorbestimmten Datenblockpuffer wird im folgenden noch beschrieben.
Das automatische optische Wandlermodul 11b weist, wie am besten in Fig. 2 zu sehen, ein Strahlteilerprisma 80a auf, das ungefähr 90% des Lichts in das optische Wandlermodul 14a leitet und die verbleibenden 10% in ein Mikroskopokular 76a leitet. Das in das Modul 14a geleitete Licht wird einem dichroitischen Strahlteiler 82a zugeführt, der einen Teil des Lichts an eine Fernsehkamera 20a über ein-Rot-Filter 18a und einen Spiegel 81a reflektiert. Der verbleibende Teil des Lichts wird von einem dichroitischen Strahlteiler 82a gefiltert und einer Fernsehkamera 26a überein Grün-Filter 24a zugeführt. Der dichroitische Strahlteiler 82a leitet selektiv Licht mit Wellenlängen von mehr als ungefähr 560 Nanometer an das Filter 18a und solches mit einer Wellenlänge von weniger als 560 Nanometer an das Filter 24a. Somit wirkt der dichroitische Strahlteiler 82a als ein erstes Farbfilter bevor das Licht die Farbfilter 18a und 24a erreicht. Das Rot-Filter 18a ist ein 620 ± 20 Nanometer Bandpass-Durchlassfilter, das der Kamera 20a ein Bild mit hohem Kontrast liefert. Wie in Fig. 2 dargestellt, erzeugt die Kamera 20a anschließend ein NTSC-Bildsignal, das durch einen optischen Signaleingangsschalter 90 an einen Bildprozessor 90 eines Bildverarbeitungsmoduls 28 geleitet wird (Fig. 2). Das Grünfilter 24a ist ein optisches Durchlaßfilter mit schmalem Bandpass von 500 ± 20 Nanometer, das an eine Kamera 26a ein Bild mit starkem Kontrast liefert. Die Kamera 26a liefert sodann ein NTSC-Bildsignal durch den optischen Signalschalter 90a an einem Bildprozessor 92.
Der Mikroprozessor 36 des Computers 32 ist ein Intel 80486 Mikroprozessor, der mit dem Systembus 34 verbunden ist. Der optische Schalter 90a wählt unter Steuerung durch den Mikroprozessor 36 das Signal von der interaktiven Einheit 11a oder der automatischen Einheit 11b zum Zuführen an die Bildprozessoren 90 und 92. Ein Direktzugriffspeicher 38 und ein Festwertspeicher 40 sind ebenfalls mit dem Systembus 34 zum Speichern von Programmen und Daten verbunden. Ein Laufwerkscontroller 42 ist über einen lokalen Bus 44 mit einem Winchester-Laufwerk 46 und einem Diskettenlaufwerk 48 zum sekundären Informationsspeichern verbunden. Vorteilhafterweise ist der lokale Bus 44 mit einem bewegbaren Medien-Massendatenlaufwerk 45 wie einem optischen "Write-Once-Read-Many-Times-"Laufwerk (WORM) für die Bildbereichsaufzeichnung und-wiedergabe verbunden.
Eine Videoumwandlungskarte 50, in diesem Ausführungsbeispiel eine VGA-Karte, ist mit dem Systembus 34 zum Steuern eines Befehlsmonitors 52 verbunden, der mit der VGA-Karte 50 verbunden ist. Betriebsinformationen wie Auswahlmenüs und Analyseberichte werden auf dem Monitor 52 angezeigt. Ein Tastaturprozessor 54 ist mit dem Systembus 34 verbunden, um Signale von einer mit dem Tastaturprozessor 54 verbundenen Tastatur 56 zu interpretieren. Eingangssignale an den Mikroprozessor 36 werden ebenfalls durch eine Handsteuervorrichtung (Maus) 13 mit einer Steuertaste 15 erzeugt. Signale von der Maus 13 und deren Taste 15 werden an den Bus 34 über das Maus- Intertace 17 übertragen. Ein Drucker 58 ist über den Systembus 34 zur Kommunikation mit dem Mikroprozessor 36 verbunden.
Das automatisierte Bildeingabesubsystem 11b der Vorrichtung 10 führt eine automatisierte X-Y-Objektträgerpositionierung, Bildfokussierung, Lichtstärkeneinstellung und Lichtfarbenausgleichsfunktion durch. Die X-Y-Objektträgerpositionierungssteuervorrichtung ist in den Fig. 1, 1A, 3 und 4 dargestellt und weist einen Objektträgerhalter 62a auf, der in der Lage ist, acht Mikroskopobjektträger 101 bis 108 nebeneinander zu halten. Der Objektträgerhalter 62a ist bewegbar an der Platte 65a des Mikroskopobjektivs 64a mittels einer Objektträgerbasis 63a gehalten. Der Bereich des Objektträgerhalters 62a, der in bezug auf ein Mikroskopobjektiv 64a positionierbar ist, wird durch einen X-Position-Schrittmotor 110 und einen Y-Position-Schrittmotor 11 gesteuert, die mechanisch an der Basis 63a angebracht sind. Die Schrittmotoren 110 und 111 sind von bekanntem Typ und reagieren auf Impulssignale von einem Objektträgerpositionscontroller 60. Die tatsächlichen X- und Y-Positionen des Objektträgerhalters 62 werden von einem X-Positionssensor 68 und einem Y-Positionssensor 66 erkannt, die im wesentlichen kontinuierlich Positionsinformationen an den Objektträgerhalterpositionscontroller 60 übertragen. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel weisen der Objektträgerhalter 62, die Basis 63 und die Positionssensoren 66 und 68, die mit 110 und 111 bezeichnete Grenzschalter aufweisen, eine kommerziell erhältliche Einheit von Marzhauser Wetzlar GmbH Modell EKBB-S4 mit Steuereinheiten des Modells MCL-3 auf.
In Reaktion auf geeignete Schrittmotorsteuersignale ist die Objektträgerhalterbasis 63a in der Lage, im wesentlichen sämtliche Objektträger 101 bis 108 unter dem Objektiv 64a zu plazieren. Der Objektträgerpositionscontroller 60 ist mit dem Systembus 34 durch einen Kommunikationspfad 61 verbunden. Der Mikroprozessor 36 überträgt, wie im folgenden erörtert, Befehle an den Objektträgerpositionscontroller 60, die eine X- und eine Y-Position unter dem Mikroskopobjektiv 64a angeben. Der Objektträgerpositionscontroller 60 reagiert auf derartige Befehle durch Übertragen der geeigneten Impulssignalgruppen an den X- und den Y-Schrittmotor 110 und 111, um den Objektträgerhalter 62a in die gewünschte X-Y-Position zu bringen. Die tatsächliche Position des Objektträgerhalters 62a wird von dem Objektträgerpositionscontroller 60 während und nach der Bewegung geprüft. Der Objektträgerpositionscontroller 60speichert ebenfalls intern die X- und Y-Positionen des Objektträgerhalters 62a, wobei die interne Aufzeichnung vom Mikroprozessor 36 über den Bus 34 und den Kommunikationspfad 61 gelesen werden kann.
Die Vorrichtung 10 weist ferner einen Fokus- und Lichtcontroller 73 auf, der die Lichtstärke und die Farbbalance der Lichtquelle 84a sowie den Fokus des dem Mikroskop 12 gelieferten Bildbereichs steuert. Der Mikroprozessor 36 kommuniziert mit dem Fokus- und Lichtcontroller 73 über den Systembus 34 und einen Kommunikationspfad 74, um die Fokus- und Lichteigenschaften zu steuern. Fig. 4 ist ein Funktionsblockdiagramm des Fokus- und Lichtcontrollers 73 und seiner Verbindung mit dem Objektiv 64a und dem Bus 34. Das Objektiv 64a weist einen Fokus-Schrittmotor 82a auf, der von dem Fokus- und Lichtcontroller 73 durch den Schrittmotorcontroller 73a gesteuert wird, um die Auflage 62a anzuheben oder abzusenken, und so die vom Objektträgerhalter 62a getragenen Mikroskopobjektträger 101 bis 108 zu heben oder zu senken. Der Mikroprozessor 36 weist eine Fokusroutine auf, die periodisch während der Gewebeanalyse abgearbeitet wird. Beim Eintreten in die Fokusroutine prüft der Mikroprozessor 36 eine digitale Wiedergabe eines Bildbereichs der Bildprozessoren 90 und 92 und gibt einen Befehl an den Fokus- und Lichtcontroller 73 aus, um die Auflage um einen bestimmten Betrag zu heben oder zu senken. Der Fokus- und Lichtcontroller 73 überträgt in Reaktion darauf an den Fokusschrittmotor 82a elektrische Signale zum Implementieren der erforderlichen Auflagebewegung. Durch fortgesetztes Prüfen der Qualität des Bildbereichs und Einstellen der vertikalen Position des Objektträgerhalters 62a fokussiert der Mikroprozessor 36 die Oberseite des Objektträgers unter dem Objektiv 64a.
Der Mikroprozessor 36 speichert ferner einen Zielwert der Lichtstärke, die während der Gewebeprobenanalyse beizubehalten ist. Dieser gespeicherte Lichtstärkenwert dient dem Mikroprozessor 36 zusammen mit einer Stärkefunktion zum Regeln der Lichtstärke der Lichtquelle 84a. Wenn die Stärkefunktion des Mikroprozessors 36 aktiv ist, wird die Lichtstärke der Bildbereiche der Bildprozessoren 90 und 92 bestimmt. Jede Abweichung von dem gespeicherten Lichtstärkewert wird durch Übertragen von Stärkesteuerbefehlen an den Fokus- und Lichtcontroller 73 korrigiert, der durch Steuern eines Spannungsreglers reagiert, welcher die an die Lichtquelle 84a angelegte Spannung entweder erhöht oder verringert. Der Spannungsregler 83 kann beispielsweise ein standardmäßiger drehbarer Spannungsregler sein, der durch einen Schrittmotor gedreht wird, der unter Steuerung durch elektrische Signale vom Fokus- und Lichtcontroller 73 arbeitet.
Die bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ausgeführte Analyse basiert auf einem Zwei-Farben-System. Für die Messgenauigkeit ist es wichtig, daß die von den Kameras 20 und 26 betrachteten zwei Farben im wesentlichen die gleiche Stärke haben. Der Mikroprozessor 36 weist eine Farbausgleichsfunktion auf, die zum Angleichen der Stärken der von der Lichtquelle 84 an die Kameras 20 und 26 gelieferten roten und grünen Farbe dient. Mit dem Objektiv 64a ist ein Kondensator 85a verbunden, der durch einen Schrittmotor 86a gesteuert ist, welcher elektrisch mit dem Fokus- und Lichtcontroller 73 verbunden ist. In der Farbausgleichsfunktion erkennt der Mikroprozessor Farbungleichheiten durch Vergleichen des Bildbereichs des Bildprozessors 90 mit demjenigen des Bildprozessors 92. Der Mikroprozessor 36 sendet Farbausgleichseinstellbefehle an den Fokus- und Lichtcontroller 73 in Reaktion auf eine Farbungleichheit und erreicht über wiederholten Vergleich und Farbausgleichseinstellungsbefehle einen Farbausgleich, der für eine Gewebeprobenanalyse geeignet ist.
Fig. 5 zeigt einen Repräsentations-Objektträger, beispielsweise 102, der zur Analyse gemäß dem Ausführungsbeispiel vorbereitet ist. Der Objektträger 102 weist an einem Ende eine dunkle Konturlinie 87 eines Rechtecks auf. Das Rechteck 87, das im wesentlichen an der selben Stelle auf alle Objektträger gedruckt ist, dient der Identifizierung der Anordnung von Gewebeproben während der Fokus- und Lichteinstellroutinen und während der Objektträgervorbereitung.
Das Verfahren zum Quantifizieren von Kernproteinen nach dem vorliegenden Ausführungsbeispiel weist das Vorsehen von Zellprobenobjekten 88 auf dem Objektträger 102 und das Markieren mit einem optischen Verbesserungsfaktor auf, der sich spezifisch mit dem Kernprotein bindet. Die Markierung wird sodann mit dem Bildanalysesystem 10 betrachtet, um die optische Dichte der Markierung für die Stärkemessung zu bestimmen und für die Verteilungsmessung die Bereiche zu lokalisieren, in denen die Markierung gefunden wird. Da die Stärke der Markierung sich auf die Menge der Kernproteine bezieht, erlaubt die Messung der verschiedenen optischen Dichten der Markierung eine direkte Messung der Menge an Protein. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Kontrollzellenobjekte 89 auf einem Referenzbereich des Objektträgers 102 angebracht, um eine optische Normalisierungs- oder Referenzdichte für die Markierung zu erhalten. Ferner können eine oder mehrere Gegenmarkierungen verwendet werden, um die mehreren Eigenschaften der Zellobjekte zu unterscheiden.
Keine tatsächlichen Markierungen außer dem Rechteck 87 sind auf den Objektträgern 101-108 zum Unterscheiden der Kontrollzellenobjekte 89 von der Probe 88 vorgesehen. Jedoch sollte der Objektträger derart vorbereitet sein, daß die Kontrollzellenobjekte 89 die (durch die gestrichelte Linie 91 in Fig. 5 dargestellte) Längsmittellinie des Objektträgers überlappen und daß die Kontrollzellenobjekte 89 dem Rechteck 87 näher sind als die Probe 88. In ähnlicher Weise sollte die Probe 88 die Längsmittellinie überlappend und weiter vom Rechteck 87 als die Kontrollzellenobjekte 89 angeordnet sein.
Bei einem bestimmten Ausführungsbeispiel verwendet das Markierungsverfahren vorzugsweise ein sensitives Peroxidase-Antiperoxidase-Verfahren zur Sichtbarmachung von Östrogen- oder Progesteronrezeptoren in Proben durch Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen diese Rezeptoren gerichtet sind. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens auf mikroskopischer Ebene ist in den Fig. 7 und 8 gezeigt. Zwei Bereiche einer menschlichen Tumorprobe, die eine Zellpopulation enthält, deren Östrogenrezeptoren gemessen werden sollen, werden auf die beiden separaten Bereiche des Objektträgers 14 verbracht und beispielsweise durch Gewebekleber in geeigneter Weise befestigt. Die separaten Sektionen werden sodann in separaten Spülungen aus Formalin, Methanol und Aceton fixiert und anschließend mit einem blockierenden Reagens behandelt, um ein nichtspezifisches Binden der nachfolgenden Reagenzien zu verhindern.
Der zu messende Teil der Probenzellen 88 wird mit einem primären Antikörper inkubiert, einem monoklonalen Antikörper (Ratte) gegen menschlichen Östrogenrezeptor im Probenbereich des Objektträgers. Dieser Antikörper ist bei 128 dargestellt und verbindet sich spezifisch mit den Östrogenrezeptorstellen ER dieses Gewebeteils. Der Referenzbereich 89 der Probe wird mit einen normalen Ratten-IgG zur Kontrolle inkubiert, das bei 130 dargestellt ist. Der Zweck des Kontrolle 130 ist die Auswertung des Grades der Verbindung der Immunoperoxidase-Reagenzien dieses Verfahrens mit den nicht-spezifischen Stellen NS der Probe, um eine Hintergrundmessung zu erhalten.
Beide Gewebesektionen 88 und 89 auf dem Objektträger 102 werden sodann mit einem Brücken-Antikörper inkubiert, einem Anti-Ratten-Immunoglobulin (Ziege), das in beiden Figuren bei 132 dargestellt ist. Der Brücken-Antikörper 132 verbindet sich mit dem Ratten-Antikörper 128 gegen den menschlichen Östrogenrezeptor in der Probensektion 88 und mit jedem gebundenen normalen Ratten-IgG 130 in der Kontrollsektion 89.
Ein Ratten-PAP-Komplex 134 wird beiden Sektionen 88 und 89 der Probe hinzugefügt und verbindet sich mit dem Anti-Ratten-IgG-Brücken-Antikörper bei 132. Nach diesem Schritt wird eine Lösung, die Wasserstoffperoxid und Diaminobenzidin (DAB) und 4 N HCl enthält, der Proben- und der Kontrollsektion zugesetzt. Die Reaktion der Peroxidase mit Wasserstoffperoxid wandelt das vorhandene gebundene DAB in ein rötlich-braunes Ausfällprodukt um. Der Anteil des Ausfällprodukts und seine Position sind durch die Bindepositionen des PAP-Komplexes und durch die Brücken- und die primären Antikörper sowie die Positionen und Mengen der Östrogenrezeptoren in der Probe beeinflußt.
Die Konzentrationen, der zeitliche Ablauf und die chemischen Zusammensetzungen der Reagenzien, die in diesem Markierungsverfahren verwendet werden, sind im genannten Patent US-A-5 008185 genauer beschrieben. Vorzugsweise ist der monoklonale Antikörper, der zum Verbinden mit den Östrogenrezeptorstellen dient, einer der an der University of Chicago entwickelten und mit H222 sP2 und H226 sP2 bezeichneten Antikörper, und derjenige, der zum Verbinden mit dem Progesteronrezeptor dient, ist ein Antikörper, der kommerziell von Transbio Sarl, 6 Rue Thiers, Paris, Frankreich erhältlich und mit mPRI bezeichnet ist.
Das DAB Ausfällprodukt wird sodann durch die Bildanalyse mittels der Vorrichtung 10 visualisiert, um die Quantifizierung der Östrogenrezeptoren in der Probe festzustellen. Im allgemeinen läßt das braune Ausfällprodukt licht nicht gut durch und zeigt sich als dunkle Bereiche in den Zellen der Probe. Die optische Dichte und damit die Pixelintensität hängt direkt mit der Menge des DAB Ausfällprodukts und mit der Menge an Östrogenrezeptor zusammen, der die Antikörper gebunden hat. Um den Kernbereich jeder Zelle besser sichtbar machen zu können, wird eine Gegenmarkierung aus Methyl-Grün hinzugefügt. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß sowohl die primäre Markierung aus DAB Ausfällprodukt als auch die Gegenmarkierung aus Methyl- Grün für den Kern jeder Zelle spezifisch sind. Dies bedeutet, daß Reste und andere Zellteile im Mikroskopbild heller erscheinen und unterschieden werden können.
Anschließend wird ein Doppelkameraverfahren verwendet, um die mit DAB und die mit Methyl-Grün markierten Bereiche voneinander zu unterscheiden. Die Rot- und Grün-Filter 18 und 24 bilden jeweils monochrome Bilder der Zellobjekte an ihren jeweiligen Kameras 20 und 26, die in der Vorrichtung 10 gespeichert werden können. Diese Bilder, eines vom Rot-Filter und eines vom Grün-Filter, dienen dem Trennen der primären markierten Bereiche von den Kernbereichen und zum Trennen der Kernbereiche von anderen Zell- oder Feldteilen.
Die Ergebnisse und die Vorteilhaftigkeit des dualen Filterns eines gegenmarkierten Zellbildes sind eingehender in Fig. 6 dargestellt. Der Prozentanteil an Licht, das durch die mit Methyl-Grün markierten Kerne durchgelassen wird, ist in der Kurve A als Funktion der Lichtwellenlänge dargestellt. Der Prozentanteil der Lichttransmission von Diaminobenzidin (DAB) ist in der Kurve B als Funktion der Lichtwellenlänge dargestellt. Die Bandbreite der vom Grün-Filter durchgelassenen Lichtwellenlängen ist im Band C dargestellt, während die Bandbreite der vom Rot-Filterdurchgelassenen Lichtwellenlängen im Band D dargestellt ist.
Wenn ein Bild einer gegenmarkierten Zellpopulation oder Probe durch das Grün-Filter 24 gefiltert wird, sind im wesentlichen alle Bereiche, die mit Methyl- Grün markiert sind, unsichtbar. Dies ist darin begründet, daß die Methyl-Grün- Kurve A eine relative Transmissionsspitze nahe diesem Wellenlängenband hat, während die Diaminobenzidin-Kurve B in diesem Band relativ non-transmissiv ist. Somit können die Bereiche mit einer primären DAB-Markierung von den Kernbereichen getrennt werden. Am anderen Ende der Kurve ist das Band D des Rot-Filters an einer Stelle angeordnet, an der genau das Gegenteil eintritt. Die Methyl-Grün-Kurve A hat ein relativ non-transmissives Tal in dieser Bandbreite, während die Diaminobenzidin-Kurve B ebenfalls relativ non- transmissiv ist. Auf diese Weise erscheinen die Kernbereiche, die sowohl die primäre Markierung als auch die Gegenmarkierung aufweisen, dunkler als andere Zellteile und können leicht erkannt werden.
Aufgrund der relativen Unterschiede in der Lichtübertragung zwischen der primären Markierung und der Gegenmarkierung in den beiden gefilterten Bandbreiten ist der mit Methyl-Grün markierte Bereich während einer Filterung relativ zu anderen Bereichen der Zelle verbessert, und die Bereiche, die Diaminobenzidin-Ausfällprodukt aufweisen, sind in bezug auf die Methyl-Grün- Bereiche während des anderen Filterns hervorgehoben. Somit sind die Kernbereiche der Zellobjekte zusammen mit den Bereichen optisch hervorgehoben, die DAB Ausfällprodukte aufweisen.
Fig. 11 zeigt einen optischen Bildbereich einer Gewebeprobe, wie sie unter dem Mikroskopobjektiv 64 vorliegt. Bei dem Bild von Fig. 11 sind die Objekte 200, 202 und 204 grüne Zellkerne, wobei die Kerne 202 und 204 braune Bereiche 206 und 208 aus DAB Ausfällprodukt aufweisen. Der Kern 200 enthält keinen Östrogenrezeptor und weist daher kein DAB Ausfällprodukt auf. Die Objekte 210, 212 und 214 sind verschiedene andere Zellteile oder Reste der Gewebesektion. Fig. 12 zeigt den vom Rot-Filter 18 an die Kamera 20 und deren zugehörigen Bildprozessor 90 gegebenen Bildbereich. In Fig. 12 ragen die Kerne 200, 202 und 204 wegen der Gegenmarkierung und der Filterung heraus, während die DAB Bereiche nicht sichtbar sind. Fig. 13 zeigt den Bildbereich, der vom Grün-Filter 24 an die Kamera 26 und deren zugehörigen Bildprozessor 92 gegeben wird. In Fig. 13 ragen die Östrogenrezeptorbereiche 206 und 208 heraus, so daß deren Fläche und Dichte leicht messbar ist. Die gestrichelten Linien der Fig. 13 zeigen die Grenzen der Kerne 200, 202 und 204, die zu Referenzzwecken dargestellt sind. Wie zuvor erörtert ist ein Monitor 30 zur Darstellung von Bildbereichen der zellprobe verfügbar. Soll ein Bildfeld angezeigt werden, berechnet der Mikroprozessor 36 ein zusammengesetztes Bild durch Summieren des Bildbereichs des Bildprozessors 90 (des Typs von Fig. 12). Bei dem Bildbereich des Bildprozessors 92 (des Typs von Fig. 13) wird das zusammengesetzte Bild vom Mikroprozessor 36 im vorbestimmten Datenblockpuffer des Bildprozessors 92 gespeichert, der die Quelle der Bilder des Monitors 30 ist.
Zwar zeigt die Anwendung ein geeignetes und vorteilhaftes Verfahren zum Unterscheiden zwischen den beiden Bereichen mit Gegenmarkierung, jedoch ist ersichtlich, daß verschiedene andere Markierungs- oder optische Hervorhebungsverfahren und Filterverfahren existieren, die zum optischen Hervorheben eines bestimmten Bereichs oder Teils gegenüber einem anderen Zellteil dienen können. Zur Quantifizierung der dargestellten spezifischen hormonellen Rezeptoren (Progesteron- und Östrogenrezeptoren) ist es wichtig, den Kernbereich, der Rezeptoren enthält, an dem Vorhandensein des Diaminobenzidin-Ausfällprodukts zu erkennen.
Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden bis zu acht Objektträger in einem automatischen Analysedurchlauf analysiert. Einer der acht Objektträger (101) ist ein Kalibrierungsobjektträger und die anderen sieben Objektträger werden vorzugsweise unter Verwendung von Gewebesektionen aus derselben Gewebemasse vorbereitet. Der Kalibrierungsobjektträger 101 wird auf die gleiche Weise vorbereitet wie alle anderen Objektträger, jedoch werden die verwendeten Gewebesektionen aus einer Standard-Gewebemasse mit bekannten Mengen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren entnommen. Vorzugsweise werden alle acht in dem selben Durchlauf zu analysierenden Objektträger entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren als Charge fixiert und markiert, so daß alte im wesentlichen gleich vorbereitet werden
Beim Abschluß der Fixierung und der Markierung der Objektträger 101 bis 108 werden diese in den Objektträgerhalter 62a eingeführt, der jeden Objektträgeran einer bestimmten Position auf dem Objektträgerhalterfestlegt. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist der Kalibrierungsobjektträger 101 am weitesten links angeordnet und die Objektträger 102 bis 108 sind in beliebiger Folge in den verbleibenden sieben Objektträgerpositionen angeordnet. Sämtliche Objektträger sind derart ausgerichtet, daß deren gedrucktes Rechteck 87 sich auf der Oberseite befindet, wie in Fig. 3 dargestellt. Der Objektträgerhalter wird sodann in die Objektträgerhalterbasis 63 eingesetzt, wobei die gedruckten Rechtecke vom Mikroskop 12 weg gerichtet sind. Nach dem Platzieren des Objektträgerhalters gibt der Bediener durch die Tastatur 56 an, daß die Analyse beginnen soll.
Ein Flußdiagramm der automatisierten Analyseroutine ist in den zusammenhängenden Fig. 9 und 10 dargestellt. Die Routine beginnt bei einem Schritt 136 mit einer Aufforderung seitens der Vorrichtung auf dem Befehlsmonitor 52 zur Eingabe von Patienteninformationen. Wenn die Patientenbezeichnung durch Bedienerinteraktion mit der Tastatur 56 abgeschlossen ist, beginnt der automatisierte Teil des Analysevorgangs und der Bediener kann andere Aufgaben wahrnehmen.
Zu Beginn fordert der Mikroprozessor 36 über Steuersignale, die über den Systembus 34 an den Objektträgerhalterpositionscontroller 60 gesendet werden, die Bewegung des Objektträgerhalters 62a an die maximalen X- und Y-Positionen, wie durch einen Punkt 120 auf der oberen linken Seite des Objektträgers 102 und einen Punkt 121 auf der unteren linken Seite des Objektträgers 108 angegeben. Es erscheinen keine wirklichen Markierungen auf dem Objektträger, um die Punkte 120 und 121 anzugeben, jedoch sind diese Punkte durch den maximalen Verfahrweg des Objektträgerhalters 62a gegeben. Die X- und Y- Werte der Punkte 120 und 121 werden aus den Positionssensoren 110 und 111 gelesen, so daß die Positionsbereiche des Objektträgerhalters 62a dem Mikroprozessor 36 bekannt sind. Da die Objektträger 101 bis 108 an vorbestimmten Positionen gehalten werden, kann der Mikroprozessor 36 die X- Adresse der Längsmitte jedes Objektträgers 101 bis 108 leicht berechnen, und da die Position des Rechtecks 87 auf jedem Objektträger ebenfalls bekannt ist, kann die Y-Position jedes Rechtecks 87 mit ausreichender Genauigkeit berechnet werden. Die Objektträger-Referenzpositionen werden im Schritt 140 berechnet. Die Analyseroutine geht anschließend zum Schritt 142 über, in dem der Mikroprozessor 36 die Bewegung des Objektträgerhalters 62 zum Positionieren der nahen Mitte des Rechtecks 87 des Objektträgers 101 unter das Objektiv 64a fordert.
Die automatisierte Analyseroutine des vorliegenden Ausführungsbeispiels wird unter Verwendung eines einzelnen 40X-Objektivs durchgeführt, das eine geringe Feldtiefe in der Größenordnung einiger weniger Mikrometer hat. Zwar sind der Objektträgerhalter und die Objektträger relativ präzise, jedoch garantieren sie nicht unbedingt, daß die Oberfläche der Objektträger stets optimal fokussiert sind, wenn sie im Mikroskopobjektiv 64a zu sehen sind. Mit dem Beginn der Analyse jedes neuen Objektträgers wird daher die Vorrichtung unter Verwendung einer Linie 79 des Objektträgerrechtecks 87 zunächst fokussiert. Nachdem die anfängliche Fokussierung auf die Linie 79 erreicht ist, wird die Vorrichtung während der Analyse periodisch neu fokussiert, um genaue Bildbereiche zu liefern.
Im Schritt 144 wird der Objektträger 101 derart bewegt, daß sich der Objektträger entlang der imaginären Mittellinie 91 (Fig. 5) bewegt, bis die Linie 79 erkannt wird. Die Linie 79 ist ausreichend breit und deutlich, daß sie auch mit einem schlecht fokussierten Objektiv erkennbar ist. Mit der Bewegung des Objektträgers 101 überwacht der Mikroprozessor 36 die Pixelarray des Bildprozessors 90, welche den dem Objektiv vorliegenden aktuellen Bildbereich entspricht. Der Mikroprozessor stoppt die Objektträgerbewegung, wenn die Linie 79 im Bildbereich des Bildprozessors 90 auftritt, und führt eine Fokusroutine am inneren Rand der Linie 79 aus. Bei der Fokusroutine analysiert der Mikroprozessor 36 nacheinander die Schärfe des Bildbereichs des Bildprozessors 40 und stellt die Mikroskopauflage auf die Objektiventfernung mittels des Fokus- und Lichtcontrollers 73 ein. Wenn der Mikroprozessor 36 einen genauen Fokus erkennt, geht der Ablauf zum Block 126 über, in dem der Objektträger an einen Punkt innerhalb des Rechtecks 87 zurück bewegt wird. Das Rechteck 87 muß von jeglichem Gewebe oder anderen Verunreinigungen frei sein. Daher kann der Lichtpegel- und Farbausgleich mittels der beschriebenen Einrichtungen erfolgen, während der dargestellte Bildbereich aus dem Rechteck 87 kommt.
Nach dem Ausgleich des Lichtpegels und der Farben geht die Routine zum Schritt 150 über, in dem der Objektträger bewegt wird, um aufeinanderfolgende Bildfelder entlang der Mittellinie 91 auf der Suche nach einem ersten Bildbereich, der eine Referenz-Gewebeprobe 89 zeigt, zu betrachten. Der Objektträger wird derart bewegt, daß das Objektiv 64a einen durch eine Suchpfadlinie 94 in Fig. 5 dargestellten Wegverfolgt. Periodisch wird die Objektträgerbewegung angehalten, das Objektiv 64a wird durch den Mikroprozessor 36 fokussiert und anschließend wird das aktuelle Bildfeld des Bildprozessors 90 analysiert, um festzustellen, ob die Kontrollprobe gefunden wurde. Ein Bildbereich der Kontrollprobe 89 wird im Schritt 152 als ein Bildbereich mit Analysewert erkannt. Ein Bildbereich wird im Schritt 152 als einen Analysewert aufweisend erkannt, wenn der Bereich des Kernmaterials im Bildbereich des Bildprozessors 90 einen vorbestimmten Schwellenwert übersteigt, der im Mikroprozessor 36 gespeichert ist. Der Mikroprozessor 36 analysiert jede Bildbereich-Pixelarray des Bildprozessors 90, die das Kernbild der Bildbereiche wiedergeben. Wenn der Kernbereich eines Bildbereichs den im Mikroprozessor 36 gespeicherten Schwellenwert übersteigt, hat der Bildbereich Analysewert und der Ablauf geht zum Schritt 154 über, in dem Attribute des Bildbereichs gemessen und aufgezeichnet werden.
Im Schritt 154 wird der digitalisierte Bildbereich des Bildprozessors 90 analysiert, um einen Kerngrenzlevelwert für das Kernmaterial im Bereich zu erkennen. Das Kerngrenzlevel, das beim Quantifizieren der Probe 88 verwendet wird, wird im Speicher 38 gespeichert. Im Schritt 154 mißt der Mikroprozessor 36 ferner das digitalisierte Bildfeld des Bildprozessors 92, um einen Antikörpermarkierungsschwellenwert zu erkennen. Dieser Schwellenwert ist erforderlich, um den Beitrag der nicht-spezifischen Markierung der Kontrollzellen und den Beitrag des Gegenmarkierungs-Methyl-Grün zur gesamten vom Instrument erkannten Markierung zu bestimmen. Dieser Antikörpermarkierungsschwellenwert ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Antikörper-Negativ-Markierungszellen und Antikörper-Positiv-Markierungszellen. Nach der Bestimmung wird der Antikörpermarkierungsschwellenwert im Speicher 38 gespeichert. Beim Abschluß der Messung und der Aufzeichnung im Schritt 154 wird der Schritt 156 ausgeführt, bei dem die digitalen Bildbereiche beider Bildprozessoren 90 und 92 im Speicher gespeichert werden. Die digitalen Bildbereiche können vorteilhafterweise im Massendatenlaufwerk 45 gespeichert werden.
Der Suchpfad 93 (Fig. 5) beginnt mit dem Rechteck 87 und setzt sich entlang der Mittellinie 91 fort, bis am Punkt 93 ein erster Bildbereich mit Analysewert erkannt wird. Wenn der Mikroprozessor 36 den ersten Kontrollzellenobjektbildbereich erkennt, verändert sich das Suchbewegungsmuster für Bildbereiche unter Anleitung durch den Mikroprozessor 36 und folgt einem hin und her über die Kontrollprobe verlaufenden überstreichenden Muster wie in Fig. 5 durch die Linie 94 dargestellt. Beim Überqueren der Referenzprobe 89 werden nachfolgende Bildbereiche der Probe analysiert und für jedes Bild wird der Analysewert, das Kerngrenzlevel und der Antikörpermarkierungsschwellenwert aktualisiert. Ferner werden beide digitalen Bilder jedes Bildbereichs mit Analysewert im Speicher gespeichert. Die Bildbereiche der Kontrollprobe 89 werden weiter analysiert, bis die gesamte Kernfläche der Bildbereiche mit Analysewert 5000 Quadratmikrometer übersteigt. Wenn das Übersteigen des Schwellenwerts von 5000 Quadratmikrometer im Schritt 158 erkannt wird, wird der Objektträgerhalter derart bewegt, daß das Objektiv 64 zur Mittellinie 91 zurück und nach unten geführt wird (Schritt 160), bis ein erster Probenbildbereich am Punkt 96 der Fig. 5 erkannt wird. Ähnlich wie im Schritt 152 wird der einen Analysewert habende Bildbereich im Schritt 164 des Ablaufdiagramms (Fig. 10) basierend auf der im Bildbereich enthaltenen Kernfläche erkannt.
Wenn im Schritt 164 ein Bildbereich mit Analysewert gefunden wird, geht der Ablauf zum Schritt 166 über, in dem Attribute des Probenbildbereichs gemessen und aufgezeichnet werden. Die im Schritt 166 gemessenen und aufgezeichneten Attribute umfassen die optische Dichte der DAB Bereiche 206 und 208 und einen Vergleich der Gesamtkernfläche im Bildbereich mit der Fläche der DAB Bereiche 206 und 208. Nach dem Messen und Aufzeichnen der Bildbereichattribute im Schritt 166 werden die digitalisierten Wiedergaben des Bildfelds ebenfalls im Speicher gespeichert. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die gesamte Probe 88 von der Vorrichtung wie durch die Linie 94 (Fig. 5) dargestellt abgetastet. Der Abschluß des Abtastens der Gewebeprobe 88 wird im Schritt 170 erkannt.
Wenn, wie bei dem vorliegenden Beispiel der Fall, die aufgezeichneten Daten den Kalibrierungsobjektträger 101 betreffen, wie im Schritt 171 erkannt, werden Kalibrierungswerte berechnet und zur späteren Verwendung bei der Analyse gemessener Attribute anderer Objektträger 102 bis 108 verwendet. Nach dem Speichern der Kalibrierungswerte im Schritt 173 geht der Ablauf zum Schritt 172 über, um festzustellen, ob sämtliche Objektträger im Schritt 172 analysiert wurden. Da dies im vorliegenden Beispiel nicht der Fall ist, wird der Objektträger zum Positionieren des Objektivs im Rechteck 87 des nächsten Objektträgers in der Objektträgergruppe bewegt, bei dem es sich um den Objektträger 102 handelt. Bei dem vorliegenden Beispiel werden die Objektträger 102 bis 108 sequentiell wie der Kalibrierungsobjektträger 101 analysiert, mit der Ausnahme, daß die in deren Probenbereichen 88 gemessenen Daten nicht als Kalibrierungsdaten, sondern als Analyseergebnisse gespeichert werden. Wenn der letzte Objektträger 108 vollständig analysiert ist, ist das Flußdiagramm der Fig. 9 und 10 abgeschlossen und die akkumulierten Analyseergebnis Daten stehen zur Ausgabe als Berichte zur Verfügung, wie im einzelnen in dem genannten Patent US-A-5 008 185 beschrieben.
Die Vorrichtung 10 weist die interaktive optische Einrichtung 11a auf, welche das Mikroskop 12 mit mehreren Revolverobjektiven, einschließlich einem Niedrigleistungsobjektiv, aufweist. Das Mikroskop 12 ist mit einer manuell betätigbaren Auflage zum Tragen eines Mikroskopobjektträgers mit einer auf diesem befindlichen biologischen Probe versehen. Die manuell betätigbare Auflage kann vom Bediener bewegt werden, um verschiedene Bereiche des Objektträgers unter das Objektiv des Niedrigleistungsobjektivs zu verbringen. Wenn der Bediener einen interessanten Bereich findet, wird dieser Bereich durch die Positionssensoren 12a, die in US-A-S 018 209 offenbart sind, lokalisiert und werden durch das Betätigen einer Taste der Maustastatur oder dergleichen markiert, um der Prozessoreinrichtung zu signalisieren, daß die Koordinaten dieses Bereichs gespeichert werden sollen, so daß der Bereich später mit Hochleistung durch die automatische optische Einrichtung 11b untersucht werden kann. Der Objektträger kann somit schnell manuell mit niedriger Leistung abgetastet werden, wobei die interessanten Bereiche ausgewählt und anschließend in den Objektträgerhalter 62a zusammen mit anderen Objektträgern angeordnet werden, um mit hoher Leistung mittels des Objektivs 64a unter Verwendung der zuvor beschriebenen automatischen Hochgeschwindigkeitsverarbeitung untersicht zu werden. Die Abtastung mit schwacher Vergrößerung durch das interaktive System 11a ermöglicht es, leere Bereiche und Bereiche, die nicht von Interesse sind, zu vermeiden, um den Zeitbedarf der automatischen optischen Einrichtung 11b zu verringern. Das System 10 bietet daher den Vorteil der Kombination der interaktiven, schnellen Abtastung mit niedriger Leistung und des Speicherns von Koordinaten mit einem automatischen Hochleistungstest für die volle diagnostische Behandlung der biologischen Probe.
Nach Abschluß des Hochleistungstests können die Bilder aus dem WORM- Laufwerk 45 zur zusätzlichen Bearbeitung oder zum Löschen aus den Tests, Statistiken und dergleichen aufgerufen werden. Das System erlaubt somit eine vor dem Test erfolgende Bearbeitung der Bereiche durch die Verwendung des Niedrigleistungsmikroskops und eine Bearbeitung der Bereiche nach dem Test mit einem neuerlichen Testen durch Aufrufen der Bilder aus dem WORM- Laufwerk 45.

Claims

1. Vorrichtung zum automatisierten Testen von auf einem Objektträger (101-108) befindlichen biologischen Proben (88), mit:

- einer ersten optischen Einrichtung (11a) mit einer Betätigungseinrichtung, die es dem Bediener ermöglicht manuell mit der optischen Einrichtung zu interagieren und eine biologische Probe (88) auf dem Objektträger (101-108) in das Sichtfeld zu verbringen, eine zugehörige Kameraeinrichtung zum Erzeugen eines ersten Videosignals, das einem betrachteten Bild entspricht, einer Einrichtung, die es dem Bediener ermöglicht, ein Signal zu erzeugen, wenn eine interessante Probe in dem betrachteten Bild auftritt,

- einer Sensoreinrichtung (12a), die zum Erkennen der Positionen interessanter Proben ausgebildet ist, und einer Einrichtung, die zum Speichern dieser Positionen als vorgewählte Bereiche des Objektträgers ausgebildet ist,

- einer von der ersten optischen Einrichtung getrennten zweiten optischen Einrichtung (11b), die automatisch arbeitet und zum Lokalisieren und Abtasten der Bereiche eines Objektträgers (101-108), die zuvor vom Bediener unter Verwendung der ersten optischen Einrichtung (11a) vorausgewählt wurden, und zum Umwandeln der abgetasteten Bilder in ein zweites Videosignal, ausgebildet ist,

- einer Verarbeitungseinrichtung (11c), die zum Verarbeiten wenigstens des zweiten Videosignals ausgebildet ist, um eine Angabe zu liefern, aus der ein Ergebnis des Tests bezüglich der biologischen Probe gewonnen werden kann.

2. Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben nach Anspruch 1, ferner mit einer Einrichtung zum automatischen Anpassen einer effektiven Spektralcharakteristik von Licht, das zu dem zweiten Videosignal verarbeitet wird.

3. Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben nach Anspruch 1 oder 2, bei der die erste optische Einrichtung (11a) ein schwach vergrößerndes System ist.

4. Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben nach einem der Ansprüche 1-3, bei der die zweite optische Einrichtung (11b) einen Objektträgerhalter (62) aufweist, der mehrere Objektträger (101- 108) aufnehmen kann, so daß die Vorrichtung mehrere Objektträger (101-108) automatisch ohne Eingriff seitens des Bedieners verarbeiten kann.

5. Vorrichtung zum automatisierten Testen von biologischen Proben nach Anspruch 3, bei der die zweite optische Einrichtung (11b) ein stark vergrößerndes System für automatisierte Hochleistungstests ist.