DE2805663C3

DE2805663C3 -

Info

Publication number: DE2805663C3
Application number: DE2805663A
Authority: DE
Inventors: Tomoyoshi Tokushima Nishino (Japan)
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-02-10
Filing date: 1978-02-10
Publication date: 1980-11-13
Also published as: DE2805663B2; DK157340B; SE427931B; FR2380296A1; DK157340C; SE7801545L; JPS5836308B2; DK59778A; US4272433A; BE863810A; FR2380296B1; US4221777A; JPS5399320A; GB1580582A; DE2805663A1

Description

-Phe—VaI—GIu—Trp—Leu—Met—Asp—Thr

worin m 0 oder 1 bedeutet als Hapten mit 2 bis 6 Gewichtsteilen eines Proteins als Träger in Gegenwart von 5 bis 10 Molen eines Dialdehyds der allgemeinen Formel (II)

OHC- (CH₂),- CHO

αϊ)

worin π eine ganze Zahl von 1 bis 5 bedeutet, pro Mol des Haptens, umsetzt und das so erhaltene Antigen unter Anwendung üblicher Verfahren reinigt und isoliert

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteinträger ein Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, menschliches Serumalbumin, Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobulin oder menschliches Serumglobuiin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Dialdehyd Malonsäurealdehyd, Bernsteinsäurealdehyd, Glutarsäurealdehyd oder Adipinsäurealdehyd ist

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des Peptids der allgemeinen Formel (I) mit dem Protein als Träger in Gegenwart des Dialdehyds der allgemeinen Formel (H) in wäßriger Lösung oder in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH von 7 bis etwa 10 bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 40⁰C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung 8 bis 9 beträgt

6. Verwendung des gemäß Anspruch 1 hergestellten Antigens zur Herstellung eines Pancreasglucagon-spezifischen Antikörpers.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß das Antigen in einer Menge vor. etwa 0,5 bis etwa 2 mg pro Verabreichung einem Säugetier verabreicht und die Verabreichung alle 2 Wochen während etwa 2 bis 10 Monaten wiederholt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen aus einem Peptid-Protein-Komplex und die Verwendung der Antigene zur Herstellung von Antikörpern.

Ein Antigen ist eine Substanz, welche einen lebenden Organismus zur Bildung eines spezifischen Antikörpers stimuliert und damit spezifisch reagiert. Das heißt, daß ein Antigen eine Substanz ist, welche eine Antigenität zur Bildung eines Antikörpers in vivo und eine Immunoreaktivität zur Umsetzung mit dem Antikörper in vitro aufweist. Typische Beispiele für Antigene sind Fremdproteine, wie Bakterien, Viren, verschiedene Toxine und dergleichen. Andererseits ist ein Antikörper eine Substanz, die im lebenden Organismus, beispielsweise in Säugetieren und dergleichen, aufgrund der Stimulation eines Antigens gebildet wird und die hauptsächlich in Blutserum, insbesondere in der y-Globulinfraktion eines Blutserums vorliegt. Antikörper können mit Antigenen in vitro oder in vivo reagieren.

Antigene haben an ihrer Oberfläche eine oder mehrere bestimmte Gruppen, die mit Antikörpern reagieren können und Antikörper haben an der Oberfläche eine oder mehrere reaktive Gruppen, die sich mit diesen reaktiven Gruppen kombinieren können. Beide Substanzen haben eine komplimentäre Raumstruktur gegeneinander, wie sie von Ehrlich als »Schlüssel- und Schlüsselloch-Verhältnis« bezeichnet wurde und wodurch die Spezifität zwischen Antigenen und Antikörpern erklärlich ist.

Die meisten der in der Natur gefundenen Antigene haben an der Oberfläche ein Mosaik von verschiedenen bestimmten Gruppen und man nimmt bei spezifischen Antikörpern an, daß diese entsprechend den jeweiligen Bestimmungsgruppen gebildet werden.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion, die zwischen Antigenen mit gemeinsamen bestimmten Gruppen und den entsprechenden Antikörpern stattfindet, wird als »Kreuzreaktion« oder »Gruppenreaktion« bezeichnet.

Eine Antigen-Antikörper-Reaktion besteht aus einer ersten Stufe, in welcher das Antigen sich mit dem entsprechenden Antikörper innerhalb einer sehr kurzen Zeit (beispielsweise 20 Sekunden) und sogar bei niedrigen Temperaturen (beispielsweise von O⁰C) unter Bildung eines Konjugates vereint, und einer zweiten Stufe, bei welcher die so erhaltenen Konjugate miteinander unter Agglutination, die mit dem Auge beobachtet werden kann, kombinieren.

Eine der charakteristischen Eigenschaften einer Antigen-Antikörper-Reaktion ist die hohe Spezifität und solche Reaktionen sind deshalb häufig zur Diagnose zahlreicher Krankheiten herangezogen worden.

Die Bestimmung von Hormonen wurde unter Verwendung von Immunoreaktionen, d. h. einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt.

Pancreasglucagon ist eines der physiologischen Pancreashormone welche eine wichtige Rolle in der

Aufnahme und dem Metabolismus von Zucker dienen und welches die folgende Aminosäuresequenz hat:

NH₂
His—Ser—GIu—GIy—Thr—Phe—Thr—Ser—Asp—Tyr—Ser—Lys—Tyr—Leu—Asp-

13

15

NH₂ NH₂ ISiH₂

- Ser—Arg—Arg—Ala—Glu—Asp—Phe—VaI—Glu—Try—Leu—Met—Asp—Thr

22

Die quantitative Bestimmung von Pancreasglucagon ist in neuerer Zeit auf dem Gebiet der Diagnose, der Pathologie und dergleichen interessant geworden, weil die Bestimmung des Pancreasglucagons im Blut die Diagnose zahlreicher Erkrankungen oder pathologischer Zustände, beispielsweise von Diabetes, ermöglicht.

Die übliche Verfahrensweise zur Bestimmung von Pancreasglucagon wurde unter Anwendung des Radioimmunotests (nachfolgend als RIA-Methode bezeichnet) durchgeführt, bei dem Antikörper, die unter Verwendung von Pancreasglucagon per se oder Antigene, die Pancreasglucagon als Hapten enthalten, verwendet werden. Diese RIA-Methode ist in einigen Fällen erfolgreiche (siehe Unger et al: Proc. Src. Exp. BioLMed. 102,621 (1959)).

Durch weitere Forschungen wurde die Anwesenheit von glucagonähnlichen Substanzen im Verdauungstrakt oder im Darm von Säugetieren gefunden, die sich immunologisch ähnlich verhalten wie Pancreasglucagon und als »gut-GLI« bezeichnet werden (siehe Sutherland et al: J. Biol. Chem. 175, 663 (1964) und Unger et al: Metabolism, 15, 865 (1966)). Es wurde auch festgestellt, daß Antikörper, die unter Verwendung von Pancreasglucagon per se erhalten wurden oder Antigene, die Pancreasglucagon als Hapten enthalten, nicht nur mit Pancreasglucagon sondern auch mit gut-GLI's kreuzreagieren, so daß sie nicht spezifisch gegenüber Pancreasglucagon sind. Dies besagt mit anderen Worten, daß bei der Bestimmung von Pancreasglucagon unter Verwendung der RIA-Methode die oben genannten bekannten Antikörper Werte ergeben, die solche Werte einschließen, die der Reaktion mit gut-GLI's zuzuschreiben sind und daher bei der genauen diagnostischen Bestimmung Fehler ergeben.

Kürzlich wurde berichtet, daß man zufällig Pancreasglucagon-spezifische Antikörper unter Verwendung der vorher erwähnten Antigene gefunden ha? (siehe Diabetes, 17, Suppl. 1,321 (1968)).

Es wurde auch berichtet, daß diese Antikörper, die als »G 58« und »30 K« bezeichnet werden, nur zufällig und sehr selten erhalten werden (siehe Saishin Igaku, Newest Medicine, 30, (11) S. 1901 (1975) und Heading, L.G. Horm. Metab. Res, 1,87—88 (1969)). Daher hat das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern unter Verwendung eines AnH^ -.;. . jlches Pancreasglucagon als Hapten enthält, eine schlecht? Reproduzierbarkeit· und ist für die Praxis ungeeignet

Es wurde das Struktur-Funktions-Verhältnis von Glucagon untersucht (Assan et al: Diabetes, 21, 843 (1972)) durch Synthese verschiedener Peptide, die in Beziehung zu Glucagon stehen, d.h. Ci bis C23 Fragmente und Bestimmung deren biologischer Aktivität, wobei die Erhöhung des Blutzuckerniveaus als Indikator verwendet wurde. Weitere Untersuchungen wurden an Antigenseiten des Glucagonmoleküls unter Verwendung eines Glucagon-spezifischen Antikörpers »K 47« und eines Glucagon-nicht-spezifischen Antikörpers »PVP 8« durchgeführt und diese Untersuchungen haben zu der Annahme geführt, daß wenigstens zwei Antigenstellen in dem Glucagonmolekül vorliegen und daß eine dieser Antigenstellen in dem C-endständigen Teil, insbesondere den C₂₃ bis C₂₉ Fragmenten des Glucagonmoleküls, vorliegt

Über diese Untersuchungen über den Mechanismus des immunologischen Verhaltens von Glucagon oder gut-GLI und die Entwicklung von in der Praxis geeigneten Antikörpern sind keine weiteren Veröffentlichungen ergangen.

Wie vorher festgestellt, sind die bekannten Antikörper entweder gegenüber Pancreasglucagon unspezifisch oder sie werden mit schlechter Reproduzierbarkeit erhalten, so daß ein starkes Bedürfnis vorliegt, Verfahren zu entwickeln, die zur Herstellung von Antikörpern mit Spezifität gegenüber Pancreasglucagon geeignet und industriell durchführbar sind.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon sind, mit hoher Reproduzierbarkeit aufzuzeigen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen, die zur Herstellung von Pancreasglucagon-spezifischen Antikörpern geeignet sind, aufzuzeigen.

Der Erfindung liegen Untersuchungen zur Herstellung von Antikörpern zugrunde, die ζιτ Bestimmung von Pancreasglucagon unter Verwendung der RIA-Methode geeignet ist und in industriellen Massen zur Bestimmung von Antikörpern mit hoher Spezifität gegenüber Pancreasglucagon geeignet sind. Während dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß die Antigenität gegenüber Schweinepancreasglucagon, das eine Aminisäuresequenz hat, die vollständig identisch ist mit der von menschlichem Glucagon, in der Qs bis C29 oder Cig bis C29 Aminosäuresequenz vorliegt.

Aufgrund dieser Feststellung wurden weitere Untersuchungen zur Herstellung eines Antigens, welches die vorgenannten Peptide als Hapten enthält und von Antikörpern mit hoher Spezifität gegenüber Pancreasglucagon unter Verwendung solcher Antigene durchfuhrt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antigens aus einem Peptid-Protein-Komplex, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Gewichtsteil

eines Peptids der allgemeinen Formel (I)

NH₂ NH₂ NH₂

H—(arg)„—Ala—Glu—Asp—Phe—Val—Glu—Trp—Leu—Met—Asp—Thr

worin m 0 oder 1 bedeutet, als Hapten mit 2 bis 6 Gewichtsteilen eines Proteins als Träger in Gegenwart von 5 bis 10 Molen eines Dialdehyds der allgemeinen Formel (II)

OCH—(CH₂J_n-CHO

worin η eine ganze Zahi von i bis 5 bedeutet, pro Mol des Haptens, umsetzt und das so erhaltene Antigen unter Anwendung üblicher Verfahren reinigt und isoliert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erhaltenen Antigens zur Herstellung eines Pancereasglucagon-spezifischen Antikörpers, indem man das Antigen in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 2 mg pro Verabreichung einem iiäugetier verabreicht und die Verabreichung alle 2 Wochen während etwa 2 bis 10 Monaten wiederholt.

F i g. 1 und 2 zeigen die Molekulargewichtsverteilung bzw. das UV-Absorptionsspektrum des gemäß Beispiel

1 erhaltenen Produktes;

F i g. 3 und 4 zeigen die Molekulargewichtsverteilung bzw. das UV-Absorptionsspektrum des gemäß Beispiel

2 erhaltenen Produktes;

F i g. 5 ist eine grafische Darstellung der Immunoreaktivität des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antikörpers;

Fig.6 ist eine grafische Darstellung, welche die Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper zeigt;

F i g. 7 ist eine grafische Darstellung, die das Bindungsverhältnis (in %) von GA-10 mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweine-gut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen zeigt;

F i g. 8 ist eine grafische Darstellung, welche das Bindungsverhältnis {%) des Antikörpers (1) mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweinegut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen zeigt;

F i g. 9 ist eine grafische Darstellung, welche das Bindungsverhältnis (%) des Antikörpers 30 K mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweinegut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verünnungen zeigt

Es werden die üblichen Abkürzungen für Aminosäurereste unter Verwendung der Aminosäurenomenklatur gemäß IUPAC nachfolgend verwendet zur Bezeichnung der als Hapten erfindungsgemäß verwendeten Peptide.

Die Verwendung der Peptide gemäß der Formel (I) als einen Hapten ist bei der vorliegenden Erfindung wesentlich. Bei den gemäß der allgemeinen Formel (I) beschriebenen Peptiden entspricht das Peptid, bei dem m gleich 1 ist (nachfolgend als GCTR-I bezeichnet) dem "Gis bis Cm Fragment von Schweine-Pancreasglucagon und das Peptid, bei dem m gleich 0 ist (nachfolgend als GCTR-2 bezeichnet) entspricht dem Cig bis C_M Fragment von Schweine-Pancreasglucagon. Beide Peptide sind bekannte Verbindungen (siehe W. W. Bromer, A. Staub et al: »The Amino Acid Sequence of Glucagon«, Journal of the American Chemical Society, 5. Juni 1957).

Bei der vorliegenden Erfindung können GCTR-I und GCTR-2 einzeln oder als Mischung verwendet werden, ίο Die durch die allgemeine Formel (II) bezeichneten Dialdehyde dienen als Verbindungsglied zwischen dem Hapten und dem Protein.

(II) Geeignete Beispiele für Dialdehyde der allgemeinen

Formel (II) die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen Malonsäurealdehyd, Bernsieinsäurealdehyd, Glutarsäurealdehyd, Adipinsäurealdehyd und dergleichen ein.

Alle Proteine, wie sie üblicherweise zur Herstellung von Antigenen verwendet werden, können bei der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet werden.

Typische Beispiele für solche Proteine, die als Träger geeignet sind, sind Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Menschenserumalbumin, Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobulin, Menschenserumglobulin und dergleichen.

Geeignete Beispiele für Pufferlösungen sind 0,2 r Natriumhydroxid — 0,2 m Borsäure — 0,2 m Kaliumchlorid-Pufferlösung, eine 0,2 m Natriumcarbonat-, 0,2 m Borsäure-, 0,2 m Kaliumchlorid-Pufferlösung, eine 0,05 m Natriumtetraborat-0,2 m Borsäure-0,05 m Natriumchlorid-Pufferlösung oder eine 0,1 m Kaliumdihydrogenphosphat-0,05 m Natriumtetraborat-Pufferlösung.

Der Anteil des Haptens, des Dialdehyds und des Trägers beim erfindungsgemäßen Verfahren hängt von den Bedingungen ab. Es wird ein Gewichtsverhältnis des Trägers zum Hapten von etwa 2:1 bis etwa 6 :1 und vorzugsweise 3 :1 bis etwa 5 :1 und ein Molverhältnis des Dialdehyds zum Hapten von etwa 5:1 bis etwa 10:1 angewendet.

Nach Beendigung der Umsetzung können die so erhaltenen Antigene isoliert und gereinigt werden unter Anwendung üblicher Verfahren, beispielsweise durch Dialyse, Gelfiltration, fraktionierte Ausfällung und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Antigene können gelagert werden, beispielsweise durch Lyophilisierung.

Die erfindungsgemäßen Antigene enthalten durchschnittlich 5 bis 15 Mole Peptid pro Mol des verwendeten Proteins.

so Das oder die vorstehend beschriebene(n) Antigen(e) können als Ausgangsmaterial zur Herstellung von gegenüber Pancreasglucagon hochspezifischen Antikörpern verwendet werden. Antigene enthaltend 9 bis 12 Mole Peptid pro Mol Protein werden bevorzugt, weil sie zur Herstellung von Antikörpern mit einem höheren Grad geeignet sind.

Zur Herstellung von Antikörpern werden die Antigene Säugetieren nach üblichen Verfahren (siehe Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 347 (1968) verabreicht und dann werden die im lebenden Organismus gebildeten Antikörper gesammelt Die Erfindung schließt ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper ein.

Säugetiere, die zur Herstellung von Antikörpern gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind nicht besonders limitiert und schließen ein Rinder Schweine, Pferde, Kaninchen, Meerschweinchen und dergleichen, wobei Kaninchen und Meerschweinchen

wegen der Einfachheit der-Handhabung bevorzugt sind.

Zur Herstellung von Antikörpern wird eine vorbestimmte Menge des Antigens mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine vorbestimmte Konzentration, beispielsweise 0,5 bis 2 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wird dann mit einem vollständigen »Freund's« Adjuvant vermischt unter Ausbildung einer Dispersion, die dann dem Säugetier verabreicht wird. Die so erhaltene Dispersion wird beispielsweise einem Kaninchen intradermal in einer Dosis von etwa 0,5 bis etwa 2 mg Antigen verabreicht. Anschließend kann eine Dosis von 0,5 bis 2 mg einmal alle 2 Wochen während 2 bis 10 Monaten, vorzugsweise 4 bis 6 Monaten, wiederholt werden.

Die Gewinnung der Antikörper kann erfolgen, indem man dem immunisierten Tier nach Bildung einer großen Menge des Antikörpers nach der letzten Verabreichung der das Antigen enthaltenden Dispersion, im allgemeinen 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung, Blut entnimmt und das so erhaltene Blut zur Trennung des Antiserums (Antikörper) zentrifugiert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es aufgrund der Besonderheit des verwendeten Antigens möglich, konstant Antikörper mit ausgezeichneter Spezifität gegenüber Pancreasglucagon herzustellen.

Die erfindungsgemäß hergestellten Antikörper weisen eine hohe Spezifität gegenüber Pancreasglucagon auf und sind geeignet zur ganz genauen Bestimmung von menschlichem Pancreasglucagon unter Anwendung der RIA-Methode.

In den nachfolgenden Beispielen sind alle Teile, Prozente, Verhältnisse und dergleichen auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

6 mg GCTR-I wurden in 0,2 ml einer 0,2 η Kaliumhydroxid-Lösung in Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Zu der Lösung wurde 1 ml eines 0,2 η Natriumhydroxid-0,2 m Borsäure-0,2 m Kaliumchlorid-Puffers mit dem pH 9 (nachfolgend der Einfachheit halber als »Pufferlösung« bezeichnet) gegeben und dazu wurde tropfenwei' se 1 ml der Pufferlösung mit 20 mg darin gelöstem Rinderserumalbumin (nachfolgend als »BSA« bezeichnet) und 1 ml einer 0,05 m Glutaraldehyd-Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung machte 3 ml aus und wurde unter Rühren bei Raumtemperatur 24 Stunden umgesetzt

Aus dem so erhaltenen Produkt wurden 0,5 ml eines aliquoten Teils herausgenommen und dazu wurden 0,5 ml einer 2°/oigen Natriumdodecylsulfat-Lösung (nachfolgend als »SDS« bezeichnet) gegeben. Nach Erhitzen der Mischung auf 100° C zum Auflösen des beim Abkühlen gebildeten Niederschlags, wurde die Mischung einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-75 filtriert und mit einer l°/oigen SDS-Lösung zur Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung äquilibriert Die Gelfiltration wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Bestimmung:

Verwendete Säule:

Elutionsgeschwindigkeit:

Elutionslösung:

optische Dichte bei 280 nm (OD₂₈o) 1 χ 40 cm 3 mm/h

1% SDS-Lösung enthaltend 0,5 m NaCl.

Die erhaltenen Ergebnisse sind aus F i g. 1 ersichtlich. In Fig. 1 gibt die Ordinate die optische Dichte und die Abszisse die Fraktionszahl an. Die Menge jede Fraktion war 1 ml.

Aus den in F i g. 1 gezeigten Ergebnissen win ersichtlich, daß das Reaktionsprodukt zwei ausgeprägt Peaks bei Fraktionen 14 und 17 (Fraktion I) unc Fraktionen 18 bis 21 (Fraktion II) zeigte. Fraktion (I hatte ein Molekulargewicht von etwa 75.000 oder mehr welches höher ist als das Molekulargewicht von Motilir (ungefähr 2.700) und Fraktion (II) hatte ein Molekular

ίο gewicht ähnlich dem Molekulargewicht von Motilin Beide Fraktionen (I) und (II) hatten ein Molekularge wicht welches höher ist als das Molekulargewicht vor GCTR-I (etwa 1.000).

Dann wurden Fraktionen (I) und (II) unter Erwärmer in einer 2%igen SDS-Lösung bis zu einer Konzentratior von 0,5 mg/ml aufgelöst. Nach dem Auflösen wurde jede Lösung in eine Zelle von 1 cm Länge gegeben und die UV-Absorption bei einer Wellenlänge im Bereich vor 140 bis 300 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind ir F i g. 2 gezeigt.

In F i g. 2 gibt die Ordinate die optische Dichte unc die Abszisse die Wellenlänge (nm) an. Die Bezeichnun gen 1 und 2 bezeichnen das Absorptionsmuster dei Fraktionen (I) bzw. (II). Die Bezeichnungen 3 und ^ geben das Absorptionsmuster von BSA bzw. GCTR-1 an, die unter den gleichen Bedingungen gemesser wurden wie im Falle der Fraktionen (I) und (II).

Aus den in Fig.2 gezeigten Ergebnissen wire ersichtlich, daß Fraktion (I) (Kurve 1) ein Absorptions muster zeigt, das unterschiedlich vom Absorptionsmuster von BSA und GCTR-I ist. Unter Berücksichtigung der in F i g. 1 hinsichtlich der Molekulargewichtsverteilung gezeigten Ergebnisse wurde festgestellt, dat Fraktion (I) dem Peptid-Protein-Komplex (d. h. GCTR 1-BSA) entspricht. Andererseits zeigte die Fraktion (ΙΓ (Kurve 2) ein Absorptionsmuster der gleichen Art wie GCTR-I (Kurve 4). Aufgrund der in Fig. 1 gezeigter Ergebnisse wurde festgestellt, daß Fraktions (II) einerr Dimeren von GCTR-I, wie es durch Behandlung mi:

Glutaraldehyd gebildet wird, entspricht.

Ein anderer aliquoter Teil des Produktes (etwa 2,5 ml wurde einer Gelfiltration in gleicher Weise wie vorhei angegeben unterworfen und die Fraktionen, die dei Fraktion (I) entsprachen wurden gesammelt und mil 0,6% Natriumchlorid-Lösung bei 4°C 24 Stunder dialysiert und dann lyophilisiert, wobei man ein weiße; Pulver des GCTR-I-BSA-Komplexes in einer Menge von 17,3 mg erhielt. Der so erhaltene Komplex war eir Komplex aus 1 Mol BSA mit durchschnittlich 11 Moler GCTR-I daran gekuppelt. Das Bindungsverhältnis (%' wurde wie folgt bestimmt.

Zunächst wurde eine Standardkurve für die Konzentration von GCTR-I gegenüber UV-Absorption gemessen, und zwar basierend auf der Tatsache, daß die F i g. 1 nicht die Anwesenheit von nicht umgesetztem BSA zeigte; und die Menge von Fraktion (II) wurde aus dieser Standardkurve berechnet Dann wurde die Menge der Fraktion (II) von der Menge des anfangs zugegebenen GCTR-I abgeleitet Die erhaltene Menge von GCTR-I wurde entsprechend der Menge vor GCTR-I, welches an BSA gebunden war, angenommen.

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 6 mg GCTR-2 anstelle von GCTR-I verwendet wurden. Das so erhaltene Produkt wurde einer Gelfiltration unter der gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben

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unterworfen und die Molekulargewichtsverteilung wurde wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in den F i g. 3 und 4 gezeigt. Aus den Ergebnissen in F i g. 3 wird ersichtlich, daß das Reaktionsprodukt zwei ausgeprägte Peaks (Fraktion I' und II') ähnlich wie bei den Ergebnissen des Beispiels 1 aufwies. Fraktionen (Γ) und (ΙΓ) entsprachen dem GCTR-2-BSA-Komplex bzw. einem Dimeren von GCTR-2, beide hatten annähernd die gleiche Molekulargewichtsverteilung wie Fraktion (I) bzw. Fraktion (I Γ).

Fraktion (Γ) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 dialysiert und lyophilisiert, wobei man ein weißes Pulver des GCTR-2-BSA-Komplexes in einer Menge von 17,8 mg erhielt. Der so erhaltene Komplex enthielt durchschnittlich 10 Mole GCTR-2 pro Mol BSA.

Beispiel 3

7 mg der jeweils nach Beispiel 1 und 2 erhaltenen Komplexe wurden in 1,8 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 2,7 ml des vollständigen Freund's Adjuvants wurden unter Ausbildung einer Dispersion zugegeben. Die so erhaltene Dispersion wurde intradermal durch Injektion Kaninchen in einer Dosierung von 1 ml/Kaninchen gegeben. Nach 2 Wochen wurde jedem Kaninchen weitere 1 ml der Dispersion verabreicht. Dann wurde eine frisch hergestellte Dispersion aus 3 mg Antigen, 3 ml einer physiologischen Kochsalzlösung und 3 ml des vollständigen Freund's Adjuvants intradermal 3,5 Monate in 2-Wochen-Abständen zum Immunisieren der Versuchstiere gegeben. 10 Tage nach der letzten Verabreichung der Dispersion wurde das Blut von den Versuchstieren gewonnen und zentrifugiert, wobei man unter Abtrennung des Antiserums den erfindungsgemäßen Antikörper erhielt.

Die Aktivität des so erhaltenen Antikörpers wurde wie folgt gemessen.

Bestimmung der Antikörperaktivität

Jeder der Antikörper, d. h. Antikörper (I), hergestellt unter Verwendung des Antigens, das gemäß Beispiel 1 erhalten wurde und Antikörper (II), hergestellt unter Verwendung des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Antikörpers, wurden anfangs mit physiologischer Kochsalzlösung auf Konzentrationen von 10-', 10-², 10"³, 10-⁴ und ΙΟ-⁵ verdünnt. Zu je 100 μΐ der verdünnten Lösung wurden 100 μΐ ¹²⁵J-GIucagon und 300 μΐ eines 0,5 m Phosphatpuffers mit dem pH 7 (enthaltend 0,5 Gew.-% BSA, 0,1 Gew.-% NaN₃ und 0,14 m NaCl) gegeben und die Mischung wurde bei 4°C 48 Stunden inkubiert und der erhaltene Komplex aus ¹²⁵J-Glucagon und Antiserum wurde von nicht-umgesetztem oder freiem ¹²⁵-J-Glucagon unter Verwendung von dextranbeschichteter Holzkohle und Zentrifugieren bei 4° C mit einer Geschwindigkeit von 3.000 Upm während 15 Minuten abgetrennt Die Radioaktivität des so erhaltenen Komplexes wurde gemessen zur Bestimmung des Bindungsverhältnisses (%) von ¹²⁵J-Glucagon und Antiserum bei jeder Konzentration.

Die erhaltenen Ergebnisse werden in F i g. 5 gezeigt In F i g. 5 gibt die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵J-GIucagon und Antiserum an und die Abszisse bezeichnet die ursprüngliche Verdünnung des geprüften Antiserums. Die Ziffern 1 und 2 bezeichnen die Antikörper (I) bzw. (II).

Aus den Ergebnissen der F i g. 5 ist ersichtlich, daß der Grad der Verdünnung des Antiserums, bei welchem das Bindungsverhältnis (%) des Antiserums und ¹²⁵]-Glucagon 50% beträgt, d.h. die Aktivität (JD₅₀) des Antikörpers folgende ist:

Antikörper Aktivität (J D50)

1
II

etwa 50.000
etwa 25.000

Bestimmung der Pancreasglucagon-Spezifität

Diese Bestimmung wurde durchgeführt, basierend auf dem Prinzip, daß das Verhältnis der markierten Glucagonbindung zu einem Glucagonantikörper zu einer unmarkierten Glucagonbindung zu dem Glucagonantikörper identisch dem Verhältnis der Konzentration des markierten Glucagons zu dem des unmarkierten Glucagons in der Lösung ist und daß, wenn die Konzentration des markierten Glucagons feststeht, die Menge des markierten gebundenen Glucagons (B) abnimmt, während die Menge an freiem markierten Glucagon (F) sich erhöht in dem Maße wie die Konzentration an unmarkiertem Glucagon (des zu messenden Glucagons) ansteigt. Pancreasglucagon (Standardglucagon, Konzentration: lOpg/ml bis 100 ng/ml), Hunde-gut-GLI (Verdünnung: 1 :9 bis 1 :2187) und Schweine-gut-GLI (Verdünnung 1 :9 bis 1 :2187) wurden als Proben und ¹²⁵J-Glucagon (10.000 cpm) als markiertes Glucagon verwendet.

200 μΐ der obengenannten Glucagonproben, 200 μΐ ¹²⁵J-Glucagon und 200 μΙ des Antikörpers (I). erhallen gemäß Beispiel 3 (Aktivität etwa 50.000) und 100 μΐ Trasylol (hergestellt von BAYER AG, 1.000 KIU) wurden miteinander vermischt und 48 bis 72 Stunden bei 4°C inkubiert. Die so behandelte Mischung wurde aufgetrennt in gebundenes markiertes Glucagon (B) und freies markiertes Glucagon (F) unter Verwendung von dextranbeschichteter Holzkohle (^ciehe M. Boyns, L. Vanhaelst und J. Goldstein; Horm. Metan. Res., 3, 409 (1971) worauf anschließend die Radioaktivität gemessen wurde. Das Bindungsverhältnis (BO) entsprechend der Aktivität des verwendeten Antikörpers (I) wurde als 100% angegeben und der Prozentsatz des gebundenen markierten Glucagon (B) der Proben bei jeder Konzentration und jedem Grad der Verdünnung wurde darauf bezogen.

Die Ergebnisse sind in F i g. 6 angegeben. In F i g. 6 bedeutet die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) (B/BO χ 100) und die Abszisse die Konzentration des Pancreasglucagon (ng/ml) und den Grad der Verdünnung mit GLI. In Fig.6 bedeutet der Buchstabe (a) Pancreasglucagon und die Buchstaben (b) bzw. (c) bezeichnen Hunde-gut-GLi bzw. Schweine-gut-GLI.

Aus den Ergebnissen in F i g. 6 ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Antikörper eine Kurve, welche die Reaktivität mit Pancreasglucagon zeigt ergibt, die klar unterscheidbar ist von Kurven, bei denen die Reaktivität mit Hunde- und Schweine-gut-GLI's gezeigt wird. Daraus läßt sich schließen, daß der erfindungsgemäße Antikörper mit GLI's nicht kreuzreagiert und eine

bo ausgezeichnete Spezifität gegenüber Pancreasglucagon hat

Wenn dagegen ein Antikörper mit einer niedrigen Spezifität gegenüber Pancreasglucagon verwendet wird, überschneiden sich die Reaktivitätskurven von Hunde- und Schweine-gut-GLI's mit der Kurve, welche die Reaktivität mit Pancreasglucagon anzeigt, und die Reaktivität mit diesen GLI's ist eingeschlossen in die Reaktivität mit Pancreasglucagon und dadurch erfolgt

eine unkorrekte Bestimmung des Pancreasglucagonniveaus.

Beispiel 4

Diese Bewertung wurde basierend auf dem Verfahren der RIA-Methode durchgeführt, bei welcher markiertes Glucagon und unmarkiertes Glucagon zum Vergleich umgesetzt werden mit einer vorbestimmten Menge eines Glucagonantikörpers in der Antigen-Antikörper-Reaktion.

Standardpancreasglucagon (Rinder- oder Schweinepancreasglucagon; Konzentration: 10 pg bis 100 ng/ml) und Hunde- und Schweine-gut-GLl's (Verdünnung: 1 :9 bis 1:2187) wurden als Versuchsproben verwendet. Eine Mischung aus 200 μΐ jeder Probe, 200 μΐ von ¹²⁵]-Giucagon-Lösung (enthaltend 15pg ^:25j-Glucagon; 10.000 cpm) und 200 μΐ eines jeden Versuchsantikörpers (Antikörper (I) erhalten gemäß Beispiel 1,30 K und GA-10) und 100 μΐ Trasylol (1000 KIU) wurden 48 bis 72 Stunden bei 4° C inkubiert und das erhaltene gebundene markierte Glucagon und das freie markierte Glucagon wurden mittels dextranbeschichteter Holzkohle getrennt und anschließend wurde die Radioaktivität jeweils bestimmt.

Das Verhältnis (B/T) von gebundenem markiertem Glucagon (B) zu gesamtem markiertem Glucagon (T), wobei kein Standardglucagon zum System zugegeben wurde, wurde als 100% bezeichnet und das Bindungsverhältnis (%) bei jeder Konzentration wurde gemessen.

Die erzielten Ergebnisse sind in den F i g. 7 bis 9 angegeben. In den F i g. 7 bis 9 bezeichnet die Ordinate das Bindungsverhältnis (B/BO χ 100) und die Abszisse die Konzentration an Pancreasglucagon (ng/ml) und den Grad der Verdünnung von gut-GLI's. Die Buchstaben (a), (b) und (c) bezeichnen Standardpancreasglucagon, Hunde-gut-GLI bzw. Schweine-gut-GLI. Die Beziehung zwischen der Konzentration von Pancreasglucagon und dem Verdünnungsgrad wurde wie in F i g. 6 gezeigt festgehalten. Das heißt, daß unter Verwendung des Antikörper GA-10 der in gleicher Weise hergestellt wurde wie gemäß Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß sirupöse Glucagonfibrile anstelle von GCTR-I verwendet wurden, die Konzentration von Pancreasglucagon und der Verdünnungsgrad von GLI so bestimmt wurden, daß beide Verdünnungskurven miteinander überlappten.

Die so festgestellte Beziehung zwischen der Konzentration von Pancreasglucagon und dem Verdünnungsgr^d von GLI wird auch in den F i g. 8 und 9 gezeigt.

Aus den in Fig.8 erkennbaren Ergebnissen sieht man, daß Antikörper (ί) eine Immuncrcaktivität mit Pancreasglucagon aufwies, die deutlich unterscheidbar ist von der Reaktivität mit gut-GLI. Daraus folgt, daß Antikörper (I) gemäß der Erfindung eine niedrige Kreuzreaktivität aufweist und hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon ist Aus den Ergebnissen der Fig.9 ist ersichtlich, daß 30 K eine Reaktivität mit Pancreasglucagon aufwies, die deutlich unterscheidbar ist von der Reaktivität mit gut-GLI. Daher hat 30 K eine niedrige Kreuzreaktivität mit gut-GLI und ist hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon.

Wenn andererseits ein nicht-spezifischer Antikörper verwendet wird, dann nähert sich die Reaktivität mit Pancreasglucagon der Reaktivität mit gut-GLI, so daß die Kurven, welche Pancreasglucagon betreffen und welche gut-GLI betreffen, miteinander überlappen. Aus den in den F i g. 8 und 9 ersichtlichen Ergebnissen ergibt

sich, daß Antikörper (I) gemäß der Erfindung und der bekannte Antikörper 30 K annähernd das gleiche Spezifitätsniveau gegenüber Pancreasglucagon aufweisen.

Beispiel 5

Die Kreuzreaktivität tier verschiedenen Peptidhormone der Tabelle 1 wurden mit der von Standardpancreasglucagon unter Verwendung des Antikörpers (I) nach dem Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben wurde, verglichen. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. In der nachfolgenden Tabelle 1 wurde die Kreuzreaktivität, die für Standardpancreasglucagon gemessen wurde, mit 100% bezeichnet und das Verhältnis der beobachteten Werte für andere Peptid-'hormone zu dem des Standardpancreasglucagons wurde gemessen.

Tabelle 1

Kreuzreaktivität von Antisera, die spezifisch gegenüber Pancreasglucagon sind im Vergleich zu anderen Peptidhormonen

Probe	Kreuzreaktivität (%)
Standardpancreasglucagon	100
Hund-gut-GLI	0,64
Schweineinsulin**)	<0,01
Schweinesecretin*)	<0,01
Schweine-CCK-PZ**)	<0,01
M enschliches Gastrin*)	<0,01
'Schweine VIP*)	<0,01
Schweinemotilin*)	<0,01
Schweinesomatostatin*)	<0,01
Schweine-LH-RH*)	<0,01
Schweinesubstanz-P*)	<0,01
Schweineneurotension*)	<0,01

Anmerkung:

*) Synthetische Peptide.
**) Extrakte.

CCK-PZ = Cholecystokinin-pancreozymin.
VIP = Vasoaktives Intestinalpeptid.
LH-RH = Luteinbildendes Hormon-abgebendes Hormon.

Aus dem Ergebnis der obigen Tabelle 1 ist ersichtlich, daß der Antikörper (I) gemäß der Erfindung eine sehr niedrige Kreuzreaktivität mit anderen Peptidhormonen, beispielsweise Insulin, Somatostatin, Gastrin, Secretin, CCK-PZ, VTP, LH-RH, Motilin und dergleichen aufwies. Obwohl Pancreasglucagon zu der Secretinfamilie vom strukturellen Gesichtspunkt gesehen, gehört, zeigt der Antikörper gemäß der Erfindung praktisch keine Kreuzreaktivität mit Secretin, VIP und dergleichen und deshalb ist der erfindungsgemäße Antikörper im wesentlichen nicht-reaktiv mit anderen ähnlichen Peptidhormonen.

Beispiel 6

30 männliche Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 4 kg wurden mit GCTR-I in gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben immunisiert, wobei man die Antikörper (III) bis (XXVI) erhielt. Es wurde die

Spezifität dieser Antikörper gegenüber Pancreasglucagon in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt, mit der Ausnanrr.e, daß bei den 'Vergleichsproben Hunde-gut-GLl verwendet wurde.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. In der Tabelle 2 wurde das Pancreasglucagonäquivalent, das erhalten wurde durch Messung von Hunde-gut-GLI mit GA-IO als 100% definiert und die durch Messung von Hunde-gut-GLI mit den Antikörpern erhaltenen Werte und die Prozentsätze dieser Werte werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Unterschied der IRG*)-Werte von kombiniertem Hunde-gut-Extrakt gemessenn jeweils mit Antiglucagon-Kaninchenserum

Antiserum

Hunde-gut-GLI
(ng/ml PG äquivalent)

Antiserum GA-10

x 100

GA-10	44,0
30K	0,29
Antikörper
III	0,36
IV	0,48
V	0,66
VI	0,29
VII	0,26
VIII	0,37
IX	0,25

100,0 0,64

0,82 1,09 1,50 0,64 0,59 0,84 0,57 14

Antiserum

Hunde-gut-GLI (ng/ml PG äquivalent)

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

XXV

XXVI

0,32 0,21 0,61 0,43 0,27 0,53 0,36 0,11 0,13 0,39 0,46 0,33 0,23 0,14 0,17 0,28 0,62

IGR*) Immunoreaktives Glucagon.

Antiserum GA-10

0,72

0,48

1,39

0,98

0,61

1,2

0,82

0,25

ΰ,30

0,89

1,05

0,75

0,52

0,32

0,39

0,64

1,41

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die Antikörper III bis XXVI gemäß der Erfindung alle gegenüber Pancreasglucagon eine Spezifität aufweisen, die gleich oder besser als die von 30 K ist. Daraus folgt, daß nach dem Verfahren der Erfindung Antikörper erhalten werden in guter Reproduzierbarkeit, die gegenüber Pancreasglucagon nicht weniger spezifisch sind als 30 K, welches als das bestbekannte Mittel hinsichtlich der Spezifität gegenüber Pancreasglucagon gilt.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren znr Herstellung eines Antigens aus einem Peptid-Protein-Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Gewkäitstefl eines Peptids der allgemeinen Formel (I)

NH₂
—AIa—Gin—Asp

NH₂