DE2804920A1 - Verfahren zur herstellung eines antikoerpers anti-hcg, insbesondere zur schwangerschaftsdiagnose - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines antikoerpers anti-hcg, insbesondere zur schwangerschaftsdiagnoseInfo
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Description
280432Q
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers Anti-HCG, insbesondere zur Schwangerschaftsdiagnose,
auf der Grundlage der immunchemischen Bestimmung von
ggf. im Urin enthaltenem Human-Chorion-Gonadotropin·
Bekanntlich beruht die SchwangerSchaftsdiagnose u.a. auf
der Möglichkeit der Entdeckung eines luteinisierenden gonadotropen Hormons, das von der Langhans-Zelle des Choriongewebes
der Placenta erzeugt wird, d.h. des menschlichen Chorion-Gonadotropins, welches im Urin der schwangeren Frau
vorhanden ist.
Bereits seit langer Zeit sind biologische Verfahren zur Schwangerschaftsdiagnose bekannt, die auf der in Tieren bei
Verabreichung von Urin der schwangeren Frau induzierten biologischen Aktivität beruhen. Für diese biologischen
Untersuchungen werden bestimmte Tiere benötigt. Von den auf diesem Gebiet liegenden Tests wurden die nachgenannten
insbesondere entwickelt: Der Test von Ascheim-Zondek, welcher
auf der Erscheinung beruht/ daß das menschliche Chorion-Gonadotropin
(abgekürzt: HCG) die Ausbildung von Blutungsfollikeln und Farbkörperchen in den Eierstöcken vorpubertärer
Mäuse hervorruft. Der Friedman-Test, welcher darauf beruht, daß in pubertäre Kaninchen injizierter Urin
der schwangeren Frau zur Ausbildung von Blutungsfollikeln in den Eierstöcken der Kaninchen führt. Weiterhin ist zu
nennen der Test nach Galli-Mainini, der darauf beruht, daß
die Verabreichung von Urin der schwangeren Frau im Urin des Frosches die Emission von Sperma zur Folge hat.
Alle diese bekannten Tests weisen insbesondere den Nachteil auf, daß sie nur von einem Arzt oder von entsprechend geschultem
Fachpersonal durchgeführt werden können, mehrere
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Tage zu ihrer Durchführung benötigen und Tieropfer erforderlich sind. Außerdem weisen viele Krankenhäuser nicht die
zur Haltung der entsprechenden Versuchstiere benötigten Einrichtungen auf. Ein weiterer, sehr erheblicher Nachteil
ergibt sich daraus, daß die für diese Tests benötigten Tiere bestimmten Bedingungen genügen müssen. Die Mäuse müssen
weiblichen Geschlechts und von genau vorbestimmten!, vorpubertärem Alter sein. Die Kaninchen können dagegen bereits
im pubertären Alter sein, dürfen jedoch noch keinen Kontakt mit männlichen Kaninchen gehabt haben. Der auf dem Einsatz
von Fröschen beruhende Test liefert schließlich jahreszeitlich bedingt zweifelhafte Ergebnisse.
Zur Vermeidung der mit den vorgenannten biologischen Tests verbundenen zahlreichen Nachteile sind in letzter Zeit
Tests entwickelt worden, welche auf der immunologischen Eigenschaft
des menschlichen Chorion-Gonadotropins beruhen. Diese biologischen Verfahren zum Entdecken des im Urin ggf.
vorhandenen Ch-Orion-Gonadotropin-Hormons beruhen darauf,
daß Bakterien, kolloidale Teilchen oder Erythrozyten (rote Blutkörperchen), an denen das lösliche HCG-Antigen adsorbiert
oder gebunden ist, bei Vermischung mit dem speziellen
■HCG-Antiserum in einem bestimmten Verhältnis zu einer
sogenannten "passiven Agglutinationsreaktion" führen, welche in dem Fall, daß die Körperchen aus Erythrozyten bestehen,
als Hämoagglutxnation bezeichnet wird. Wenn in ein Reagenzglas mit halbkugeliger Bodenfläche, das die mit HCG sensibilisierten
und mit dem HCG-Antiserum vermischten Erythrozyten enthält, Urin der schwangeren Frau zugesetzt wird,
reagiert das im Urin enthaltene freie HCG im Wettbewerb mit dem Antiserum und inhibiert dabei die Hämoagglutinationsreaktion.
Folglich setzen sich die nicht agglutinierten Erythrozyten des Antiserums frei ab und bilden am Boden des
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Reagenzglases einen charakteristischen Ring (positive Reaktion) . Die Zugabe von Urin einer nicht schwangeren Frau,
welcher folglich kein freies HCG enthält, hat andererseits keinen Einfluß auf die Hämoagglutinationsreaktion, und die
agglutinierten Erythrozyten setzen sich in einer homogenen Schicht (ohne Ausbildung des charakteristischen Rings) auf
dem Boden des Reagenzglases ab (negative Reaktion). Das Erscheinen der typischen ringförmigen Ablagerung läßt sich
daher zur Bestimmung eines ggf. vorhandenen Schwangerschaftszustands verwenden.
In neuerer Zeit wurden Reagenzien für immunologische Untersuchungen
in Form fester Tabletten auf den Markt gebracht, welche eine genau definierte Konzentration an Reagenz enthalten
und so lange vollkommen reaktionsfrei bleiben, bis sie gelöst und in Berührung mit der zu bestimmenden flüssigen
Substanz gebracht werden.
Vor kurzem wurden auch sogenannte "selbständige" diagnostische Prüfbehälter auf den Markt gebracht, welche zur Ausführung
der Schwangerschaftsdiagnose vermittels der immunchemischen Dosierung des HCG bestimmt sind. Durch den Ausdruck
"selbständig" soll zum Ausdruck gebracht werden, daß der Prüfbehälter sämtliche zur Ausführung des Tests benötigten
Vorrichtungen (Glasgefäß, Tropfenzähler usw.) und Reagenzien enthält. Die auf den Markt gebrachten diagnostischen
Prüfbehälter sollen einem auch keinerlei medizinische Kenntnisse besitzenden Benutzer gestatten, bei Befolgung
der dem Prüfbehälter beigefügten Gebrauchsanweisung den Versuch mit zu erwartenden Ergebnissen auszuführen.
So ist beispielsweise in der US PS 3 579 306 ein selbständiger
Prüfbehälter dieser Art zur Bestimmung des Vorhandenseins des Schwangerschaftshormons beschrieben, der aus
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einem transparenten Behälter mit einem gleichfalls transparenten
Deckel besteht, dessen Seitenwände eine ausreichende Höhe aufweisen, damit er im abgenommenen und gestülpten
Zustand eine Urinprobe aufnehmen kann. Ein an der Bodenwand des Behälters befestigter Spiegel stützt sich mit
einem Rand gegen den benachbarten Boden der Behältervorderwand ab und erstreckt sich diametral quer durch den Behälter,
wobei sein vom Boden entfernter oberer Rand gegen die Behälterrückwand
anliegt. Ein Prüfglas mit Schraubverschlußhals dient zur Aufnahme eines Stopfens mit einem entsprechenden
Innengewinde. Dieses transparente Prüfglas enthält eine feste Tablette aus mit menschlichem Chorion-Gonadotropin
sensibilisierten Erythrozyten, eine feste Tablette aus
menschlichem Chorion-Gonadotropin-Antiserum und eine feste
Tablette eines Puffers. Außerdem enthält der Prüfbehälter einen Tropfenzähler mit zwei Strichmarkierüngen, von denen
die untere die zu entnehmende, vorbestimmte Urinmenge, und die obere die als Lösungsmittel für die vorgenannten Reagenzien
vorbestimmte Entnahmemenge an Wasser angibt. Außerdem weist der transparente Behälter innenseitig eine transparente
Halterung zur Aufnahme des Prüfglases auf, vermittels welcher das untere Ende desselben in einem Abstand
oberhalb des Spiegels gehalten ist, so daß das Ergebnis der nach Zugabe von Urin zu den im Prüfglas enthaltenen
Reagenzien innerhalb des Behälters erfolgenden Reaktion aufgrund der Reflexion am Spiegel von der Behältervorderseite
aus sichtbar ist.
Ein verbesserter diagnostischer Prüfbehälter zur Ausführung
von Schwangerschaftsdiagnosen ist beschrieben in einer
gleichzeitig eingereichten weiteren Patentanmeldung der Anmelderin mit dem Titel "Diagnostischer Prüfbehälter für
Schwangerschaftsdiagnose1· (DT-OS ).
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Bekanntlich ist die Zuverlässigkeit derartiger Schwangerschaftsdiagnosen
in einem hohen Grade von der Empfindlichkeit und der Spezifizität der verwendeten Reagenzien abhängig.
Unter Empfindlichkeit ist in diesem Zusammenhang die Mindestmenge an HCG zu verstehen, welche die Versuchsreagenzien entdecken können, wobei zu bemerken ist, daß
die HCG-Konzentration im Urin der schwangeren Frau mit der Zeit zunimmt, es sei denn, es treten pathologische Komplikationen
auf, wie z.B. eine drohende Fehlgeburt oder eine Extrauteringravxdxtät. In diesen Fällen liegen die HCG-Werte
unter den Normalwerten, wohingegen sich im Choriongewebe der Placenta entwickelnde Neoplasien im Gegensatz dazu
wesentlich über den Normalwerten liegende Konzentrations-Spitzenwerte
an HCG hervorrufen. Von der Empfindlichkeit des Tests hängt offensichtlich der Mindestzeitraum ab, welcher
nach Ausbleiben der Menstruation abgewartet werden muß, bevor eine ggf. eingetretene Schwangerschaft diagnostiziert
werden kann. Unter Spezifizität ist ganz allgemein die Eigenschaft der Reagenzien zu verste-hen, selektiv mit HCG
und nicht mit anderen Hormonen (wie z.B. dem LH-Hormon) zu reagieren, welche gleichfalls im Urin vorhanden sein und
einen Test zu hoher Empfindlichkeit in der Weise beeinflussen können, daß mehrdeutige oder fälschlicherweise positive Ergebnisse
erhalten werden. Allgemein wird als Idealwert für die Empfindlichkeit eines Schwangerschaftstests eine internationale
Einheit pro Milliliter angesehen.
Die Beschaffenheit der bis jetzt verwendeten Reagenzien, d.h. der mit HCG sensibilisierten Erythrozyten und des
HCG-Antiserums ermöglichen keinen Schwangerschaftstest, welcher die erwünschte Empfindlichkeit und Genauigkeit aufweist.
In der Tat liegt die Empfindlichkeit der bis jetzt bekannten Tests im allgemeinen nicht unter 1 I.E./ml, wohingegen
das Vorhandensein anderer Hormone als Chorion-
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Gonadotropin die Genauigkeit der bekannten Tests sehr empfindlich stört und somit zu mangelnder Unterscheidbarkeit
führt.
Ein weiterer Nachteil der derzeit bekannten Tests besteht darin, daß der (keinesfalls unter 2 Stunden betragende)
Zeitraum zwischen der Vermischung der Reagenzien mit der zu untersuchenden Urinprobe und der Ausbildung der Ablagerung
verhältnismäßig lang ist. Da der die Reagenzien und die Urinprobe enthaltende Behälter (Reagenzglas, Ampulle
oder Prüfglas) in absoluter Ruhe belassen werden muß und keinen Stößen, Schwingungen oder dgl. ausgesetzt sein darf,
durch welche die Zuverlässigkeit des Tests beeinträchtigt werden könnte, ist ohne weiteres ersichtlich, daß es äußerst
wünschenswert wäre, über einen entsprechenden Test zu verfügen, welcher in einem wesentlich kürzerem als dem vorgenannten
Zeitraum ausgeführt werden kann, um die Wahrscheinlichkeit für VersuchsStörungen herabzusetzen.
Wenn es daher einen neuen Antikörper, nämlich einen Human-Chorion-Gonadotropin-Antikörper
gäbe, würde dieser Antikörper bei Verwendung in Kombination mit einer Probe mit Human-Chorion-Gonadotropin
sensibilisierter Human-Erythrozyten, die
nach bekannten Verfahren hergestellt werden können, einen Schwangerschaftstest erlauben, der nicht mit den vorstehend
beschriebenen Nachteilen der bekannten Tests behaftet ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers Anti-HGG (Anti-Huinan-Chorion-Gonadotropin)
zu schaffen, der bei Einsatz mit den anderen, im allgemeinen für den Schwangerschaftstest verwendeten
und auf der iramunchemischen Bestimmung des Human-Chorion-Gonadotropins
beruhenden Reagenzien die Aus-
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führung eines nicht mit den vorgenannten Nachteilen behafteten Tests gestattet, der gegenüber den bekannten Schwangerschaftstests
höhere Empfindlichkeit und bessere Bestimmbarkeit ermöglicht. Darüber hinaus soll außerdem der Zeitraum
zwischen der Vermischung der verschiedenen Reagenzien mit der zu analysierenden Urinprobe und der Ausbildung eines
Niederschlags im Vergleich zu dem für bekannte Tests benötigten Zeitraum wesentlich verringert sein und insbesondere nur
eine Stunde betragen-
Das zur Lösung der gestellten Aufgabe vorgeschlagene Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers Anti-HCG, der insbesondere
zur Schwangerschaftsdiagnose auf der Grundlage der immunchemischen Bestimmung von ggf. im Urin enthaltenem Human-Chorion-Gonadotropin
geeignet ist, ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß
a) eine Emulsion aus menschlichem Chorion-Gonadotropin hergestellt
wird, indem das menschliche Chorion-Gonadotropin in einer sterilen physiologischen 0,8 bis 1 %-igen Natriumchloridlösung
aufgelöst, komplettes Freundsches Adjuvans zugesetzt und emulgiert wird,
b) die Emulsion Kaninchen eingeimpft wird auf dem Wege einer ersten Injektion, die nach etwa 48 Tagen von einer zweiten
Injektion (Wiederholungsimpfung) gefolgt ist,
c) die immunologische Reaktion in einem Abstand von etwa 14 Tagen nach der zweiten Injektion kontrolliert wird,
d) das Blut von den die optimale immunologische Reaktion zeigenden Kaninchen abgenommen, zur Gerinnung gebracht und
geschleudert wird, das überstehende Serum mit Natriumazid versetzt und einer sterilen Filtrierung unterworfen
wird,
e) lyophilisierter Urin hergestellt wird, indem der Urin
der in der Menopause befindlichen Frau Dialysen mit destil-
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liertem Wasser unterworfen, filtriert und auf etwa 1/10
des ursprünglichen Volumens eingedampft, dann abgekühlt,
mit Äthanol versetzt, filtriert und der Lyophilisierung unterworfen wird,
f) dem in Verfahrensschritt d) erhaltenen Serum 1 Vol-%
menschliches, maskulines Serum und 0,5 Gew.-% des in Verfahrensschritt e) erhaltenen lyophilisierten Urins zugesetzt
werden,
g) das in Verfahrensschritt f) erhaltene Serum auf stabilisierten menschlichen Erythrozyten, die vorsichtshalber
mit einer Natriumchlorid und Natriumazid enthaltenden
physiologischen Lösung gewaschen worden sind, zur Adsorption gebracht und eine Suspension ausgebildet wird,
h) diese Suspension unter langsamer Agitation etwa 60 Minuten
lang stehen gelassen und dann zur Abscheidung der Zellen geschleudert wird, wobei das auf diese/ernaltene
Serum während etwa 30 Minuten auf 55 bis 60 0C abgekühlt
wird,
i) das Antiserum in einer Diäthylalkylesterzellulose enthaltenden Säule fraktioniert und
1) die das / -Globulin enthaltende Fraktion des Antiserums
steril filtriert, abgefüllt und lyophilisiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im nachfolgenden anhand
eines lediglich zur Veranschaulichung gedachten Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Herstellung der HCG-Emulsion.
Eine Ampulle der Größe 3 von 10 000 I.E. HCG-Sigma wird in ml einer 0,9 %-igen physiologischen, sterilen Natriumchloridlösung
aufgelöst. Dieser Lösung werden 15 ml komplettes Freundsches Adjuvans zugesetzt. Das ganze wird
dann vermittels einer Spritze in eine Emulsion übergeführt.
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Die Emulsion wird 60 Minuten lang stehen gelassen, wobei es nicht zu einer Phasentrennung kommen darf.
Beimpfen von Kaninchen.
Männlichen Kaninchen mit einem Körpergewicht von etwa 3,5 kg in einem Alter von etwa 120 Tagen (die vorsichtshalber stabuliert
worden sind) werden mit 1500 I.E. HCG (entsprechend 1,5 ml Emulsion) in beide gluaei maximi beimpft. Im Abstand
von 48 Tagen nach der ersten Injektion erfolgt eine zweite Wiederholungsimpfung mit der gleichen Menge der Hormonemulsion.
Kontrolle der immunologischen Reaktion.
Im Abstand von 14 Tagen nach der zweiten Injektion werden
etwa 5 ml Blut aus der Ohrrandvene des Kaninchens entnommen. Das Blut wird nach Koagulation und Unterbrechung der Koagulation
mit Hilfe eines Glasstabs mit 6000 U/min geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wird vom Koagulat abgetrennt.
1 ml zentrifugiertes Serum wird in einem Glaskolben auf 1000 ml verdünnt, indem dieser mit einer Lösung aufgefüllt wird,
die die folgende Zusammensetzung (auf 100 ml) aufweist:
Binatriumphosphat Na7HPO4
(Artikel Merck 6586) 0,194 g
Monokaliumphosphat KH2 PO4
(Artikel Merck 4873) 0,101 g
(Artikel Merck 4873) 0,101 g
Saccharose (Art. C.Erba RPE) 5,000 g
Natriumazid (Art. Merck 6688) 0,100 g
Äthylendiamintetraes s igs äure-
Natriumsalz (Titriplex III Merck) 0,150 g
Rindeiweißserum (Fraktion V) 0,200 g
Destilliertes Wasser, aufgefüllt auf 100 ml Blutentnahme
Den eine optimale immunologische Reaktion zeigenden Kaninchen wird das Blut vollständig vermittels intracardialer
Punktur entnommen. Das von den Kaninchen getrennt entnommene Blut wird 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur koagulieren
gelassen, und nach Unterbrechung des Koagulations-
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Vorgangs vermittels eines Glasstabs in einer gekühlten Zentrifuge (Temperatur + 4 0C) bei 6000 U/min geschleudert.
Das überstehende Serum wird mit 0,1 Natriumazid versetzt und nach steriler Filtrierung mit einem Miniporenfilter in
einem sterilen Behälter aufgefangen. Es wird im gefrorenen Zustand (Temperatur -20 0C bis -30 0C) aufbewahrt.
Reinigung. "
Herstellung des lyophilisierten Urins.
2 1 Urin einer nüchternen, in der Menopause befindlichen Frau werden 24 Stunden lang mit destilliertem Wasser dialysiert,
nacheinander filtriert und bis auf 1/10 des ursprünglichen Volumens eingedampft. Nach Abkühlung werden 15 Vol-% Äthanol
auf 95 % zugesetzt und nach Filtrierung einer Lyophilisierung unterworfen.
Behandlung mit lyophilisiertem Urin.
Behandlung mit lyophilisiertem Urin.
Dem im gefrorenen Zustand aufbewahrten sterilen Serum werden werden nach Auflösung 1 Vol-% männliches, menschliches Serum
und 0,5 Gew.-% lyophilisierter Urin zugesetzt, und das ganze wird bei + 4 0C 48 Stunden lang stehen gelassen.
Absorption auf stabilisierten Zellen.
250 ml Serum werden mit 30 ml zuvor 5 Mal mit einer 0,9 % Natriumchlorid und 0,1 % Natriumazid enthaltenden physiologischen
Lösung gewaschenen stabilisierten Zellen behandelt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird 60 Minuten lang
einer lang^-samen Agitation ausgesetzt, dann werden die Zellen
durch Zentrifugieren ausgeschieden, und das Serum wird 30 Minuten lang bei + 56 0C behandelt.
Säulenfraktionierung.
Säulenfraktionierung.
Eine Säulenfraktionierung erfolgt in einer Diäthylalkylesterzellulose
enthaltenden Säule. Sterile Filtrierung, Abfüllen und Lyophilisierung.
Die auf diese Weise erhaltene, das /"-Globulin enthaltende
Fraktion des Antiserums wird steril filtriert und in Fläschchen aus neutralem Glas abgefüllt und dann auf einem Sa-
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ccharoseträger lyophilisiert. Entsprechend einem bevorzugten Lyophilisierungsverfahren erfolgt die Lyophilisierung des
Antikörpers in der Weise, daß jedes Fläschchen bzw. jede Ampulle in einwandfreier Schichtung ausgehend von seinem
Boden eine Schicht aus lyophilisiertem Antikörper in Pufferlösung mit Saccharoseträger und eine Schicht aus mit HCG
sensibilisierten, auf Saccharose gehaltenen und lyophilisierten Erythrozyten enthält. Vorzugsweise beträgt das volumetrische
Verhältnis in der Ampullle zwischen der lyophyilisierten Antikörperschicht und der Schicht aus lyophilisierten,
mit HCG sensibilisierten männlichen Erythrozyten etwa 3:1.
Zur Darstellung dieser Folge aus lyophilisierten Schichten
werden folgende Verfahrensschritte ausgeführt: Zunächst
wird der in Lösung befindliche Antikörper abgefüllt. Dann erfolgt ein erster Gefriervorgang unter Erhalt einer auf dem
halbkugeligen Boden der Ampulle gefrorenen ersten Antikörperschicht. Anschließend wird die Suspension aus Erythrozyten
auf die gefrorene erste Antikörperschicht eingefüllt. Es erfolgt ein zweites Gefrieren unter Erhalt einer zweiten gefrorenen
Schicht. Schließlich erfolgt eine fortschreitende Lyophilisierung unter Erhalt des geschichteten Lyophilisats.
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Claims (5)
1) die das ^"-Globulin enthaltende Fraktion des Antiserums
steril filtriert, abgefüllt und lyophilisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Abfüllen und Lyophilisieren des Antikörpers in folgenden Verfahrensschritten erfolgt: Abfüllen des in Lösung befindlichen
Antikörpers, erstes Gefrieren unter Erhalt einer auf dem halbkugeligen Boden einer Ampulle gefrorenen ersten
Antikörperschicht, Einfüllen der Suspension aus Erythrozyten auf die gefrorene erste Antikörperschicht, zweites
Gefrieren unter Erhalt einer zweiten gefrorenen Schicht, und nacheinander erfolgende Lyophilisierung unter Erhalt eines
geschichteten Lyophilisats.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abfüllen des in Lösung befindlichen Antikörpers und anschließend
der Suspension aus menschlichen Erythrozyten in einem volumentrischen Verhältnis erfolgt, das so bemessen
ist, daß zwischen der Schicht aus lyophilisiertera Anti körper und der Schicht aus sensibilisierten menschlichen
Erythrozyten ein etwa 3:1 betragendes volumetrisches Verhältnis erhalten wird.
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4. Schwangerschaftsdiagnose-Mittel, welches aus einer Schicht aus dem nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen lyophilisierten
Antiserum in Pufferlösung mit Saccharoseträger und einer anderen Schicht aus mit HGG sensibilisierten, auf
Saccharose gehaltenen und lyophilisierten Human-Erythrocyten
besteht.
5. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen
lyophilisierten Antiserums als Reagenz zur Schwangerschaftsdiagnosa.
303*1* /060,5
ORlGSWAL INSPECTED
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2917577A IT1143768B (it) | 1977-10-31 | 1977-10-31 | Procedimento per la produzione di un anticorpo anti-hcg,particolarmente utile per la diagnosi della gravidanza |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2804920A1 true DE2804920A1 (de) | 1979-05-03 |
Family
ID=11226487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19782804920 Pending DE2804920A1 (de) | 1977-10-31 | 1978-02-06 | Verfahren zur herstellung eines antikoerpers anti-hcg, insbesondere zur schwangerschaftsdiagnose |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2804920A1 (de) |
| FR (1) | FR2407475A1 (de) |
| IT (1) | IT1143768B (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3579306A (en) * | 1969-01-22 | 1971-05-18 | Organon | Diagnostic test device |
| IL44675A (en) * | 1974-04-21 | 1977-10-31 | Rafa Labor Ltd | Method for the determination of the concentration of lh and a serodiagnostic composition therefor |
| BE786564A (fr) * | 1971-07-23 | 1973-01-22 | Upjohn Co | Procede de purification des gamma globulines |
| FR2213711A5 (en) * | 1973-01-08 | 1974-08-02 | Prugnaud Robert | Diagnostic test for pregnancy - by identification of high level of chorionic gonadotrophin in urine |
-
1977
- 1977-10-31 IT IT2917577A patent/IT1143768B/it active
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1978
- 1978-02-06 DE DE19782804920 patent/DE2804920A1/de active Pending
- 1978-06-27 FR FR7819111A patent/FR2407475A1/fr active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1143768B (it) | 1986-10-22 |
| FR2407475B1 (de) | 1983-06-24 |
| FR2407475A1 (fr) | 1979-05-25 |
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