DE2847202A1 - Verfahren zur bestimmung von triglyceriden - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von triglyceridenInfo
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Description
GEYER, HAGEMANk' & !1ARTNLR
estouchosstraße 60 · Postfach 400745 ■ 80(X) München 40 -Telefon 089/304071* -Telex 5-216136 hage d -Telegramm hageypalrnt -Telekopierer 089/304071
u.Z.: Pat 46/3-78Gh München/ den
30. Oktober 1978
Dr-H/3/mi
American Monitor Corporation, Indianapolis, Indiana, V.St.A.
VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDEN
Beanspruchte Priorität: Datum: 7. Dezember 1977
Land: V.St.A. Az.: 858 187
909824/0617
GEYER, HAGEMANN & PARTNrR
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American Monitor Corporation, München, den
Indianapolis, Indiana, V.St.A. 30. Oktober 1978
u.Z.: Pat 46/3-78Ch Dr.H/3/st
VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei das auf eine Hydrolyse der Triglyceride
zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (System Nikotinamidadenindinucleotid / reduziertes
Nikotinamidadenindinucleotid) gekoppelt wird.
Triglyceride, die Triester der Fettsäuren mit Glycerin darstellen, haben für die Menschheit dadurch eine sehr starke
Bedeutung, daß sie für die im menschlichen Körper ablaufenden biochemischen Vorgänge beachtliche Energiequellen bereitste!-
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len. Etwa 18 % des gesamten Körpergewichts eines Menschens
beste henaus Fettgewebe, das wiederum einen Gehalt von etwa
90 % (Trockengewicht) an Triglyceriden zeigt. Der abbauende Stoffwechsel der Triglyceride liefert die Hauptmenge der
dem menschlichen Körper verfügbar gemachten Körperenergie, wobei lediglich der Glukosestoffwechsel eine Ausnahme macht.
Die Energiequellen in Form der Triglyceride werden mobilisiert und in dem Blutstrom zirkuliert, was zusammen mit Proteinträgermolekülen,
bekannt als Lipoproteine, erfolgt.
Es wurde lange angenommen, daß das Vorliegen von im menschlichen Serum zirkulierenden Triglycerüen erhöhter Konzentration
(Hypertriglyceridaemie) krankhafte Erscheinungen in der Herzkranzarterie zur Folge hat. In der Tat gehen etwa 50 % krankhafter
Veränderungen im Arterienbereich (Artheromatöseläsionen) auf Triglyceride zurück (Böttcher, C.J.F., Boelsa - Van Houte,
E., KAAR, Romeny-Wächter, CC, Woodford, F.P., und Van Gent,
CM., Lancet, ii 1162, 1960, zitiert von Searcy, Ronald L-, in Diagnostic Biochemistry, 487, McGraw-Hill, 1969).
Die bedeutsame Rolle der Triglyceride bei dem Auftreten von Kranzarterienerkrankungen, die lange in den Vereinigten
Staaten von Amerika als hauptsächliche Ursache des VerSterbens und des Auftretens der Arbeitsunfähigkeit und der Be-
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einträchtigung des. Schaffens erkannt worden war, wird durch die Hypertriglyceridaemie gezeigt, die zu einem hohen Prozentsatz
bei Patienten mit bekannten Erkrankungen der Kranzarterie oder mit Herzmuskelinfarkt beobachtet wurde.
Es ist lange erkannt worden, daß die Diätpläne einen außergewöhnlichen
Einfluß auf die Menge an zirkulierenden Triglyceriden ausüben. Somit würde eine v/irksame Messung der
Triglyceridkonzentration den klinischen Mediziner im Hinblick auf den Anteil der Bevölkerung alarmieren, der für die
Hypertriglyeridaemie besonders anfällig ist. Eine derartige Messung würde erstrebenswerterweise auf einen eingeschränkten
oder modifizierten Diätplan bei diesen Personen hinweisen, um auf diese Weise in deren späteren Leben Kranzarterienerkrankungen
auszuschließen oder deren Schwere herabzusetzen.
Die Hypertriglyceridaemie die zusätzlich mit Kranzarterienerkrankungen
verbunden ist, ist auch mit gewissen Arten von Lebererkrankungen ,der Diabetes me.llitus,der Pankreatitisund
Leberstärkeerkrankungen verknüpft.
Eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Untersuchungsmethode
für Triglyceride ist somit von großer Bedeutung, was kaum überschätzt werden kann. Von einem großen Anteil der
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betroffenen Bevölkerung wird diese entscheidende Untersuchung
abgelehnt, was auf die relativ geringe Zahl von Möglichkeiten zurückgeht, die zur Durchführung bekannter Tests verfügbar
ist, was wiederum von technologischen Schwierigkeiten abhängt.
Zwar wurden entsprechend während vieler Jahre eine Vielzahl
von Triglycerid-Bestimmungsmethoden erprobt. Auch wurde in dem medizinischen Bereich seit langem die entscheidende Bedeutung
der Triglycerid-Bestimmungen erkannt. Die bisherigen Bemühungen waren vielzählig und modifiziert, einschließlich
0 vielfältiger und deutlich verschiedener Abweichungen voneinander.
Sämtliche bekannten Verfahren zeigten jedoch mehr oder weniger starke Nachteile.
Die medizinische Forschung hat seit langem erkannt, daß es von außergewöhnlicher Bedeutung ist, Möglichkeiten zur exakten
quantitativen Erfassung der Triglyceridkonzentratxonen zur Lebensverlängerung und Lebensverbesserung, wie oben bereits erwähnt,
aufzuzeigen. Studien im Hinblick auf die Bestätigung des Zusammenhangs der Hypertriglyceridaemie in der Pathogenese
der Kranzarterienerkrankungen haben das in dieser Richtung vorhandene Bedürfnis gestärkt.
Für Triglyceride, die Glieder einer allgemeinen Klasse von Verbindungen, als Lipide oder Fette (andere Hauptbestandteile
dieser Klasse von Verbindungen sind Phospholipide, Cholesterin und Cholesterinester) bekannt, darstellen, sind
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verschiedene Untersuchungsmethoden vorgeschlagen und während vieler Jahre erprobt worden.
Die jüngsten Versuche zur zahlenmäßigen Erfassung der
zirkulierenden Triglyceride umfassen Techniken, die indirekter Natur sind, und Messungen der gesamten Klasse der Lipide
einschließen, was mit den technologischen Schwierigkeiten der tatsächlichen Triglycerid-Bestimmungen zusammenhängt.
Bei dem indirekten Verfahren wird die Menge an Gesamtlipiden gravimetrisch (wobei diese gravimetrische Bestimmung selbst
keine sehr genaue Bestimmungsmethode darstellt) durch Extraktion des Serums mit organischen Lösungsmitteln,Verdampfen
des Lösungsmittels und Wiegen der Menge des extrahierten Lipids bestimmt. Dieses extrahierte Lipoid enthält
zusätzlich zu den Triglyceriden Cholesterin, Cholesterinester und Phospholipide.
Im Anschluß an das oben bezeichnete Vorgehen wird der Analytiker versuchen, so gut es möglich ist, nach anderen
Verfahren den Gehalt des Serums an Phospholipiden, Cholesterin und Cholesterinestern zu ermitteln.
Der Triglyceridgehalt wird dann durch Subtraktion des derartig aufgefundenen Gewichts der Phospholipide, des
Cholesterins und der Cholesterinester von dem relativ ungenau bestimmten Gewicht des gemessenen Gesamtlipids ent-
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sprechend der nachfolgend wiedergegebenen Formeln ermittelt:
Triglycerid = Gesamtlipide - (Phospholipide +
Cholesterin + 1,67 Cholesterinester),
wobei der Zahlenwert 1,67 einen Faktor darstellt, der auf dem durchschnittlichen Molekulargewicht des Cholesterinesters
basiert.Des weiteren gibt es jedoch noch mehrere Hauptnachteile bei dem Verfahren zur Bestimmung des Triglyceridgehalts
auf indirektem Wege.
So war es bei der Bestimmung eines einzelnen Bestandteils, nämlich der Triglyceride, erforderlich, mindestens vier
getrennte Analysen durchzuführen, die mögliche begleitende Meßfehler einschließen. Die Größenordnung aller Meßfehler
der jeweiligen Bestimmungen wird gesteigert oder führt zumindest zu üngenauigkeiten bei der Ermittlung des Triglyceridgehalts.
In einer normalen Situation stellen die Triglyceride zusätzlich lediglich ein Zehntel bis ein Fünftel des gesamten
Lipidgehalts dar. Daher wird, da der tatsächliche Triglyceridgehalt
kleiner wird, die Genauigkeit der Bestimmung extrem schlecht, wenn nicht gar nutzlos oder gefährlich illusorisch.
Die Verwendung eines Faktors, wie desjenigen von 1,67 als Faktor für die Cholesterinester, basierte auf der Annahme, daß
der Fettsäuregehalt der Cholesterinester bei einzelnen Seren
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konstant bleibt, was jedoch, was später noch gezeigt werden wird, nicht für sämtliche Personen Gültigkeit hat. Selbst
bei der Bestimmung der Gesamtlipide werden häufig andere Bestandteile nicht-lipiden Typs in das organische Lösungsmittel
extrahiert, was somit zu einer überbestimmung der gesamten Lipide und folglich auch zu der der Triglyceride führt.
Spätere Auffassungen über Triglyceridtests befassen sich . zentral mit der Bestimmung des Glycerins, das das Ergebnis
einer Hydrolyse oder Verseifung von Triglyceridmolekülen darstellt. Hierbei handelt es sich um die sog. hydrolytischen
Techniken, die hier noch abgehandelt werden.
Viele hydrolytische Verfahren und Modifikationen derselben wurden jahrelang erprobt. Im allgemeinen sind jedoch die
hydrolytischen Verfahren zeitaufwendig und mehrstufig durchzuführen. Zunächst wird dabei die Extraktion der Lipide
aus dem Serum mit einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Die nächste Stufe dieser Verfahren besteht darin, die
Phospho lip ide und andere störende Substanzen aus der Lösungsmittelphase zu entfernen, da sie sonst zu fehlerhaften Ergebnissen
infolge falsch erhöhter nachfolgender Anteile bei der Bestimmung führen. Nach dem Entfernen der Phosphcr
lipide und anderer eventuell störender Substanzen werden die Triglyceride entweder einer Verseifung unter alkalischen Bedingungen
oder einer Umesterung unterzogen.
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Das endgültig nach den beiden Verfahren anfallende Produkt stellt das Ergebnis der Freisetzung eines Mols. Glycerin aus
einem Mol Triglycerid, das im System vorlag, dar. Das derartig freigesetzte Glycerin wird dann nach einer Vielzahl von Farbreaktionen
erfaßt. Darauf wird,ausgehend von der Glycerinbestimmung,
direkt der Triglyceridgehalt der ursprünglichen Probe bestimmt.
Eine der frühesten Ausgestaltungen der hydrolytischen Verfahren ist das nach G. Büx (Biochem. Z. 305:145, 1940), wonach das
Glycerin der Triglyceride und der Phospholipide mit Jodwasserstoffsäure
umgesetzt wird, · um Isopropyljodid zu bilden.
Das erhaltene Jodidprodukt wird dann quantitativ durch Titration bestimmt und daraus die Menge des Glycerins berechnet.
Das bei diesem Verfahren offensichtlich auftretende Problem
besteht darin, daß es deshalb relativ unspezifisch ist, weil die Phospho lip ide, wie auch die Triglyceride, hydrolysiert
werden, so daß erstere unrichtig als zusätzliche Triglyceride erfaßt werden.
Einige Jahre später versuchteE. Van Handel und D.B. Zilversmit
(J. Lab. and Clin. Med., 50:152, 1957) eine Variation, wonach Serumlipide mittels einer Mischung aus Chloroform
und Methanol extrahiert werden und die Phospholipide unter Verwendung eines Zeoliths(Doucil) aus dem organischen Lösungsmittel
entfernt werden. Die in dem Lösungsmittel verbleiben-
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denTriglyceride werden dann hydrolysiert und das freigesetzte Glycerin entsprechend der Verfahrensweise von M. Lambert
und A.O. Neish (Can. J. Research, 28B:83, 1950) zu Formaldehyd
oxidiert. Der derartig gebildete Formaldehyd wird dann mit der Chromotropsäure umgesetzt, um ein violettes Chromophor
zu bilden, das dann spektralphotometrisch quantitativ erfaßt wird.
Carlson und Wadstrom (Clin. Chem. Acta., 4:197, 1959)
erprobten ein hydrolytisches Verfahren, das demjenigen von Van Handel und Zilversmit ähnlich ist/ jedoch mit der Ausnahme,
daß Kieselsäure zur Entfernung der Phospholipide zur Anwendung kommt. Zusätzlich ist bei diesem Verfahren ein
besonderer Extraktionsschritt zu vollziehen, um die Fettsäuren aus der organischen Phase zu entfernen.
Dieses Verfahren, wie auch die hydrolytischen Verfahren allgemein, ist ziemlich kompliziert und zeitaufwendig und
erfordert im wesentlichen die nachfolgend wiedergegebenen
Stufen: Extraktion des Serums mit Methanol und Chloroform; Kochen, Inkubation über Nacht und Eindampfen des Chloroformextrakts
auf ein Volumen von etwa 2 Milliliter,' wonach der Chloroformextrakt einer chromatographischen Behandlung unter
Einsatz von Kieselsäure unterzogen wird. Das Chloroformeluat, das die Triglyceride enthält, wird dann eingedampft
und der Rest mit Äthanol und Kaliumhydroxid wieder aufbe-
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reitet. Danach wird 30 Minuten naheam Siedepunkt erhitzt,
um die vorliegenden Triglyceride zu verseifen. Die Mischung wird dann mittels eines Anteils eines Petroleumäthers zur
Entfernung der Fettsäuren extrahiert. Dann wird das Glycerin mit Schwefelsäure extrahiert und mittels Natriumperjodat zum
Formaldehyd oxidiert. Der Überschuß an Perjodat wird dann durch Zugabe von Natriumarsenit zers.tört. Der Formaldehyd
wird dann mit Chromotropsäure zur Umsetzung gebracht, um ein violettes Chromphor zu bilden, das spektralphotometrisch
bei einer Wellenlänge von 570 nm vermessen wird.
Obwohl nachfolgende Modifikationen der oben erörterten
Methodenlehren diese Verfahren etwas verkürzt oder verbessert haben, verhinderten dennoch die extrem lange Untersuchungsdauer
und das außergewöhnlich hohe Maß an technologischer Schwierigkeit die erforderliche Ausnutzung bei den Analysen
von großen Bevölkerungsteilen. Lediglich einige wenige Proben konnten zu einer Zeit behandelt werden, was auf den
lästigen Einsatz von Glasgeräten und Laborvorrichtungen und auch darauf zurückgeht, daß technische Probleme bestehen,um die
Probenintegrität infolge der großen Anzahl von Übertragungsstufen bei den Verfahren beizubehalten.
Zusätzlich erfordern diese Verfahren den Einsatz zahlreicher unbeständiger oder ätzender Reagenzien und schließen das
Eindampfen eventuell explosiver organischer Lösungsmittel.
Somit bedeuten diese Verfahren für den damit befaßten
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Analytiker das Risiko einer wesentlichen Körperverletzung. Der extreme Laboraufwand und die damit verbundenen besonders
hohen Kosten dieser Bestimmungsverfahren stellen natürlich
einen weiteren Nachteil dar und verhindern bzw. verhinderten ihre weitere Verbreitung als klinischer Routinetest.
Aufgrund weitergehender Versuche schlugen H.B. Lofland,
Jr. (Anal. Biochem. 9:393, 1964) zur Beschleunigung des Verfahrensablaufes und zur Verminderung des Ausmaßes der
damit verbundenen technologischen Schwierigkeiten ein hydrolytisches Verfahren zur Bestimmung der Triglyceride vor, bei
dem der letzte Abschnitt der Bestimmung automatisiert durchgeführt wird. Die Serumlipide werden zuerst mittels Isopropanol
extrahiert und die Phospholipide durch Behandlung mit Zeolithen entfernt. Die Extrakte werden dann unter Anwendung
von Alkalien verseift. Dann wird die Reaktion des Glycerids mit Perjodat durchgeführt, um Formaldehyd zu bilden.
Die nachfolgende Bestimmung des Formaldehyds erfolgt mit Chromotropsäure, was mittels automatischer Einrichtungen
geschehen kann.
Später schlugen G. Kessler und H. Lederer (Automation in Analytical Chemistry, herausgegeben von Skeggs, L.T., New
Jersey, Mediad, Seite 341, 1965) eine Modifizierung des
Lofland-Verfahrens vor, wonach das Serum mit Isopropanol
extrahiert und die Phospholipide mittels eines Zeolithe entfernt werden. Bei diesem Verfahren werden die nachfolgende
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Verseifung, die Oxidation zum Formaldehyd und die colorimetrische Bestimmung des Formaldehyds sämtlich anhand automatischer
Einrichtungen durchgeführt. Kessler und Lederer fanden jedoch, daß beträchtliche Mengen an Glukose in die
organische Phase während des Extraktionsprozesses überführt werden können, so daß, wenn sich eine Behandlung mit Perjodat
anschließt, nicht zutreffende positive Reaktionen erhalten werden.
Um dieses Problem zu beheben, wird der Zeolithmit kleinen
Anteilen an Kupfersulfat und Calciumhydroxid kombiniert, um die vorhandene Glukose abzubauen. Außerdem wird der Formaldehyd
durch die Reaktion mit einem ß-Diketon und einem Amin erfaßt, um eine Verbindung des Litidin-Typs zu bilden, die
dann nach einer Fluoreszenztechnik bestimmt wird.
Obwohl die dargelegte Technik einige Vorteile bei dem Triglyceridtest
zeigt, sind mit ihr dennoch schwerwiegende Nachteile verbunden. Als Beispiele seien genannt: Es sind
mehrere unbeständige und ätzende Reagenzien erforderlich. Die Probe muß manuell extrahiert werden. Störende Phospholipide
müssen manuell vor der automatischen Phase der Bestimmungsmethode entfernt werden. Zusätzlich erfordert
die automatische Testeinrichtung eine beträchtliche Aufbauzeit und einen beachtlichen Aufwand bei der Wartung. Obwohl
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die Autoren eine gute Korrelation zu den manuellen Verfahren vorgaben, wurde von anderer Seite später gefunden, daß Seren,
die die Erscheinung der Hypertriglyceridaemie zeigen, offensichtlich
falsch beurteilte Ergebnisse liefern, wenn mit den gleichen Seren verglichen wird, die aufgrund eines manuellen
Verfahrens erfaßt werden (vergl. Claude, J.R., Corre, F.,
und Levallois, C: Clin. Chem. Acta. 19:231 (1968)). Letztere Forscher vermuteten, daß eine bessere Korrelation erhalten
werden kann, indem nicht-verseifte reine Bestimmungsmedien verwendet werden, um die beobachteten Testergebnisse zu
korrigieren. Jedoch verlangt diese Modifikation etwa das Doppelte an Kosten bei der Bestimmung. Des weiteren setzt
sie die Analysengeschwindigkeit herab.
In Kenntnis der Schwierigkeiten dieser bekannten Verfahren und mit der Absicht, den Bestimmungsverfahren Spezifität
zu verleihen und die Anwendung von ätzenden Reagenzien möglichst einzuschränken,wurde von anderer Seite (Eggstein,
M. und Kreutz, F.H., Klin. Wochenschr., Band 44:262, 1966)
versucht, Glycerin enzymatisch zu messen. Diese Verfahren erfassen grundsätzlich die direkte Verseifung des Serums,
das die Triglyceride enthält, mittels Alkalien in Alkohol bei erhöhten Temperaturen, Neutralisation mit Magnesiumsulfat
und anschließende Bestimmung des freien Glyceringehalts in der alkoholischen Lösung entsprechend der folgen-
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den Reaktionsfolge:
Glycerinkinase
1 . Glycerin + ATP
Glycerinphosphat + ADP
Pyruvat-
2. ADP + Phosphoenolpyruvat ► ATP
kinase + Pyruvat
Lactat-
3. Pyruvat + NADH ► Lactat + NAD
A dehydrogenase J^
( absorbiert (farblos
bei 340 nm) bei 340 nm)
Um den tatsächlichen Sachverhalt deutlich darzustellen, sei darauf hingewiesen, daß pro jedes Molekül Triglycerid
ein Molekül Glycerin im Verlaufe der Verseifung gebildet wird, wobei jedes Molekül Glycerin wiederum der Reaktionsfolge unterliegt und ein Molekül NADH zu NAD mit dem ent-
sprechenden Verlust an Absorptionsvermögen umgesetzt wird, wenn mittels eines Spektralphotometers bei 340 nm vermessen
wird.
Obwohl diese Verfahren gegenüber den colorimetrischen Bestimmungen
des Glycerins einige Vorteile zeigen, verlangen sie dennoch, daß das manuelle Verseifungsverfahren in einem getrennten
Rohr bei der Glycerinbestimmung durchgeführt wird. Zusätzlich sind diese Verfahren deswegen zeitaufwendig, weil
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ein Leerversuch. ( der die Gegenwart der Glycerinkinase in
der Reaktionsfolge eliminiert) bei jeder einzelnen Probe
durchgeführt werden muß , um die Effekte der die Reaktionsfolge störenden Substanzen, wie das Enzym Alkaliphosphotase,
auszuschalten. Dieses Enzym stellt einen üblichen Bestandteil des Serums dar und kann im Hinblick auf die verschiedenen
Patienten starken Schwankungen unterliegen. Es zeigt den Effekt der Katalysierung der Umsetzung des ATP zum ADP.
Dieses würde wiederum dazu führen, daß das Phosphoenolpyruvat zum Pyruvat usw. umgesetzt wird , was zu einer Überbewertung
des Glycerins führt.
Ein weiterer Nachteiledes oben beschriebenen Vorgehens
ist darin zu sehen, daß der aus dem Leerversuch sich ergebende, notwendige Faktor die Zeit ansteigen läßt, die
zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, und zudem nahezu eine Verdoppelung des erforderlichen Aufwandes für
ein bereits teueres Reagenzsystem aufwerfen würde.
Die oben aufgezeigten Nachteile sind und waren der Fachwelt bekannt, so daß fortlaufend Abweichungen und Variationen
der Bestimmungsmethode der Triglyceride vorgeschlagen wurden. Bucolo und David glaubten, daß die enzymatische Bestimmung
der Triglyceride vereinfacht wird, indem der alkalische Hydrolyseschritt, der bisher angewandt wurde, durch eine
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enzymatische Hydrolyse ersetzt wird. Diese Autoren erreichen
ihr Ziel dadurch, daß sie sowohl eine Lipase als auch eine Protease verwenden (vergl. Bucolo, G. und David, H.: Clin.
Chem., 19:476 (1973) und Bucolo's U.S.-Patent 3 703 591).
Der von Bucolo und David beschriebene Versuch muß nicht nur als eine wesentliche Abweichung von dem bisherigen Vorgehen,
sondern in der Tat als ein großer Schritt vorwärts angesehen werden, da zum erstenmal die vollständige Triglyceridbestimmung
in einem einzigen Reaktionsbehälter durchgeführt werden konnte, was eine starke Vereinfachung des Bestimmungsverfahrens zur Folge hat.Des weiteren wird nach diesem Verfahren
erreicht, daß eventuelle Störungen durch Phospholipide ausgeschlossen werden, da sich das Enzym Lipase für Fettsäureester
des Glycerins als spezifisch erweist.
Obwohl das bevorzugte Verfahren von Bucolo und David in
dem technischen Bereich der Triglyceridtests einen Fortschritt bedeutet, so zeigt es dennoch deswegen Nachteile, weil es
die spektrophotometrische Beobachtung von NADH und die Umsetzung zu NAD und den begleitenden Verlust an optischer
Dichte bei 340 nm verlangt.
Ein erstes Problem dieses Verfahrens besteht.darin, daß
das System den Farbverlust mißt. Somit wird bei einer Probe,
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die keine Triglyceride enthält, eine sehr große Zahl von spektralphotometrischen Absorptionsbanden erhalten, die
richtig aufzeigen, daß das NADH, das bei 340 nm absorbiert, dennoch vorliegt. Bei Proben mit niedrigem Gehalt an Triglycerid
ist der Farbverlust sehr klein. Daher ist diese Bestimmung bei niedriger Konzentration ungenau, was von der
Art der Fehlerquelle abhängt, die gewöhnlich mit der Berechnung in Zusammenhang steht, die von der Differenz sehr
großer Zahlen abhängt. Diese Schwierigkeit zeigt schließlich den Mangel der Genauigkeit oder mangelhafte Reproduzierbarkeit
bei niedrigen Konzentrationen.
Ein zweites Problem, das diesen Systemen innewohnt, die das NADH-System bei 340 nm vermessen, liegt darin, was
gut bekannt ist,daß die Lipaemie (Fettanreicherung im Blut) in größerem
Ausmaß bei kleinerer Wellenlänge, wie 340 nm, und im Gegensatz zum Beispiel bei Messungen bei 600 bis 700 nm stört.
Diese Störungen führen zu verstärkten Absorptionsablesungen und verstärken die oben erwähnten, im Zusammenhang mit der
Ungenauigkeit stehenden Probleme.
Das dritte Problem, das sich bei diesem Systemtyp stellt, liegt im Chromophor selbst, der verhältnismäßig unempfindlich
ist, d.h. jede Zwischenumsetzung von NADH/NAD erzeugt einen kleineren Absorptionswechsel, was dazu führt, daß
der Analytiker im Hinblick auf seine Möglichkeiten zur Be-
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Stimmung der Konzentrationsdifferenzen auf die Genauigkeit seines Spektrometers eingeschränkt ist. Dieses steht im Gegensatz
zur Verwendung eines Chromophors hoher Empfindlichkeit,
wobei er in gleichem Ausmaß an spektralphotometrischer Genauigkeit selbst kleinere und damit stärker exakt definierte
Konzentrationsdifferenzen zum Ausdruck bringt.
Des weiteren ist zu dem besonderen Vorschlag von Bucolo und David auf einen anderen Nachteil hinzuweisen, der darin besteht,
daß ihr System in Abhängigkeit von der Art der Störung durch das Enzym Alkaliphosphotase anfällig ist, worin
es in dem vorstehend erwähnten Vorgehen im Hinblick auf die enzymatische Bestimmung von Glycerin ähnlich ist.
Dem bekannten Verfahren von Bucolo und David, dessen Nachteile vorstehend aufgezeigt wurden, liegt die folgende Reaktionsfolge
zugrunde:
Lipase
Triglyceride ^ Glycerin + Fettsäuren
Protease
Glycerin-Glycerin + ATP )> Glycerin-1-phosphat
kinase
+ ADP
Pyruvat-
ADP + Phosphoenolpyruvat ^ Pyruvat
kinase +
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Lactat-
Pyruvat + NADH ► Lactat + NAD
dehydrogenase
Die Erfindung bezweckt die Verbesserung des eingangs beschriebenen
Verfahrens und zielt insbesondere darauf ab, daß eine vollständig enzyxnathische Bestimmung der Triglyceride ohne die
Verwendung einer Protease möglich wird.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei das auf eine Hydrolyse
der Triglyceride zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (Nikotinamidadenindinucleotid /
reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid) gekoppelt wird, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß Eisen mit dem NADH des
NAD/NADH-Systems umgesetzt und der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens zur quantitativen Erfassung des Gehalts
an Triglyceriden herangezogen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich, da es vollständig
enzymatisch abläuft, dadurch aus, daß es
schnell und in einem einzelnen Rohr durchgeführt werden kann, um dadurch große Vorteile zu erzielen, indem eine
große Zahl von Bestimmungen von einem einzigen Techniker in einer vernünftigen Zeitspanne durchgeführt werden kann.
Zusätzlich wird das erfindungsgemäße Verfahren nicht durch
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übliche Störungsquellen bei den Triglyceridbestimmungen beeinträchtigt, wie durch diejenigen, die gewöhnlich durch
Phospholipide und Glukose auftreten. Der Ausschluß von Phospholipiden wird durch die Verwendung des Enzyms Lipase
erreicht, das für Triester von Glycerin starke Spezifität
zeigt. Glukose stellt keine Störungsquelle dar, was auf die milden Reaktionsbedingungen, die bei dem Bestimmungssystem gewählt werden, zurückgeht.
Des weiteren erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nicht
den Einsatz teurer Instrumente oder einer teuren Einrichtung, mit denen Messungen im UV-Bereich zur Vervollständigung der
Bestimmung durchführbar sind.
Des weiteren ermöglicht es die vorliegende Erfindung erstmals, Triglyceride mit genauer Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit
zu bestimmen, was sich im Hinblick auf die Verbesserung der Gesundheit und gar auf das Retten von Leben vorteilhaft auswirkt.
Dabei handelt es sich um Ziele, die zwar auch nach den bekannten Verfahren angestrebt wurden, jedoch nie erreicht
wurden. Obwohl die bekannten Verfahren eine gewisse Anzahl von Nachteilen früherer Bestimmungen behoben, gelang es keinem,
erfolgreich andere Nachteile zu vermeiden oder die positiven Gesichtspunkte und Vorteile zu verwirklichen,die der vorliegenden
Erfindung zuzuordnen sind.
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In diesem Punkt weicht die vorliegende Erfindung von den
bekannten Verfahren ab, bei denen sämtliche Reaktionen in Gegenwart von Eisen durchgeführt werden.
Die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ablaufende Reaktion nutzt eine mit Lipase enzymatisch katalysierte Hydrolyse aus. Das Glycerin, das auf diese Weise
freigesetzt wird, wird zu Dihydroxyaceton und NADH entsprechend den nachfolgend wiedergegebenen Reaktionsabläufen, gemäß
dem Vorschlag verschiedener Autoren (Epstein et al und Bucolo et al, a.a.O.), umgesetzt:
Glycerin-Glycerin + ATP >· Glycerin-1-phosphat + ADP
kinase
NAD + Glycerin-1-phosphat
Glycerin-phosphatd ehydrogenase
Dihydroxyaceton + NADH
ATP = Adenosintriphosphat; ADP = Adenosindiphosphat; NAD = Nikotinamidadenindinucleotid und
NADH = Nikotinamidadenindinucleotid (reduzierte
Form)
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Die vorliegende Erfindung weicht von dem Stand der Technik des weiteren aufgrund der folgenden Reaktionen ab:
(1) NADH + Fe3+
(2) Fe2+ + 3 AMB-610- ^Fe (AMB-61O)3
(Absorption bei 610 niti)
Darin bedeuten:
PMS = Phenozin-rnethosulfat und AMB-610 = 9- (2-Pyridyl)-acenaphthofi ,2-eJ-astriazinsulfonat.
Entsprechend dem Konzept der vorliegenden Erfindung können sämtliche genannten Reaktionen innerhalb eines einzelnen
Reaktionsbehälters durchgeführt werden.
Die vorstehend wiedergegebenen Reaktionen (1) und (2),die
erfindungsgemäß zusätzlich zu verwirklichen sind, führen zu dem besonders vorteilhaften und sehr angestrebten Effekt der
starken Anhebung der Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode,
und vermindern auch die Störungen, die normalerweise auftreten, wenn auf Blutfett zu untersuchende Proben analysiert werden
sollen. Diese stark erhöhte Empfindlichkeit geht auf das
weitaus größere Absorptionsvermögen des Eisen/Chromophor-
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Komplexes gegenüber NADH zurück.
Der Anstieg der Empfindlichkeit ist etwa sechsmal so groß
im Vergleich zu der zitierten Alternative von Bucolo und David.
Da das anfallende Eisenchromophor einen Absorptionspeak bei 610 nm zeigt, wird die Störung bei"lipemischen" Proben
gegenüber jenen Methoden stark reduziert, die eine Messung bei niedrigeren Wellenlängen, wie 340 nm, erfordern.
Dieser außergewöhnliche Vorteil des sechsfachen Anstiegs der Empfindlichkeit, der aufgrund der zusätzlichen Reaktionsschritte unter Heranziehung von Eisenionen erreicht wird,
ist so groß, daß bei der Beurteilung der Natur und der Vorzüge der Erfindung bei rückschauender Betrachtung die Frage
einen nützlichen Gesichtspunkt darstellen kann, wieso die Erfindung sowohl aufgrund der Vorschläge von Bucolo und
David als auch der anderen bekannten Vorschläge nicht nahe-]ag, weil insbesondere auf dem medizinischen Gebiet in vielerlei
Hinsicht sehr aktiv unter großem Aufwand Forschung und Entwicklung mit unvergleichlich großem kommerziellen Interesse
betrieben wird, insbesondere auch im Hinblick auf die Tatsache, daß die Verwendung von Eisen im Redoxzustand bekannt war
und in der Vergangenheit zur Verbesserung der quantitativen Bestimmung verschiedener Analysen ausgenutzt wurde.
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Nach alledem bestand ein starkes Bedürfnis nach einer besseren Bestimmungsmethode für Triglyceride. Es gab verschiedene
bekannte Vorschläge, nach denen NADH als Reaktionsprodukt gebildet wird, wobei dieses NADH als meßbar bekannt
war.
Dennoch war man trotz vielfältiger Bemühungen nicht auf die Erfindung gestoßen,noch hatte man die bekannten Verfahren
so abgewandelt, daß man zu erfindungsgemäß wesentlichen Maßnahmender
Eisenreduktion in einer Reaktion mit NADH und der Verwendung eines Eisenchromophors gelangte, wobei dieses
Vorgehen insofern vorteilhaft ist,weil es die Beobachtung und Ausmessung einer angestrebten hohen Wellenlänge ermöglicht.
Wenn eine derartige rückschauende Betrachtung angestellt wurde, so
ist hervorzuheben, daß jeder nachfolgende Schritt bei der Herstellung von NADH, insbesondere ein zusätzlicher Schritt
unter Umfassen einer Eisenreaktion mit einem Eisenchromophor, als nicht naheliegend angesehen würde, sondern ganz im Gegenteil
wäre ein solches Abweichen sehr stark als widersprüchlich angesehen worden. Das läßt sich auf die bereits vor
langem berichtete und weitbekannte Tatsache zurückführen, daß Eisen (III)-Ionen im allgemeinen einen inhibierenden Effekt
auf die katalytische Wirksamkeit von Enzymen zeigen, was insbesondere für das Enzym Lipase gilt, weshalb davon auszugehen
war, daß seine mögliche Verwendung in einem Bestimmungs-
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system ausgeschlossen ist, das mittels Lipase aktiviert
wird (Laboreur, P. und Laborousse, M., Bull. Soc. Chem.
Biol. 48:747, 1966). Die vorliegende Erfindung überwindet das aufgezeigte Vorurteil aufgrund des genannten inhibierenden
Effekts und gestattet die Anwendung einer einzigartigen Kupplungsreaktion bei einem Bestimmungsverfahren.
Des weiteren gilt für das Verfahren von Bucolo und David, das, im Gegensatz zur Erfindung, die Gegenwart von Protease
zur Bewirkung der vollständigen Hydrolyse verlangt, daß die Gegenwart von Eisen in dem Bestimmungsgystem ebenfalls stark
im Widerspruch zu der Tatsache stehen würde, daß es gut bekannt ist, daß die Gegenwart von Schwermetallen, wie Eisen,
irreversible Inhibierungen der Proteasen im allgemeinen und von Chymotrypsin insbesondere hervorruft (Burgmeyer, H.V-,
Methods of Enzymatic Analysis, (New York Academic Press, 1965), Seite 972).
Bei derartig bedeutsamen Einwänden gegen das von der Erfindung
vorgeschlagene.Konzept, selbst wenn die vorliegende Erfindung mit dem Verfahren nach Bucolo und David verglichen
wird, wobei es sich offensichtlich um den nächstliegenden Stand der Technik im Hinblick auf die Abweichungen
gemäß der Erfindung handelt, ist ersichtlich, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um keine nahegelegte
Abweichung von dem nächstliegenden Stand der
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Technik handelt. Der Gegensatz zu dem Verfahren von Bucolo und David scheint bei der Betrachtung der Vorzüge und der
Vorteile und der Natur der vorliegenden Erfindung bedeutsam.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird eine aliquote Menge eines Triäthanolaminpuffers,
mit einem Gehalt an einem Eisen(II)-Indikator, wie 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho[j/2-e J-as-triazinsulfonat,
bei einem pH-Wert von 9,4 in ein Glasfläschchen gegeben, das Lipase, Adenosintriphosphat, Glycerin-3-phosphatdehydrogenase
und Glycerinkinase enthält. Eine Serumprobe, die Triglyceridsenthält, wird dann zu der oben genannten
Lösung zusammen mit einer Lösung, die ein Elektronenüberführungsmittel (wie Phenazin-methosulfat, Phenazinmethylsulfat;
"metho" = Vorsilbe für eine Ifethylgruppe,die an dem C-Atcm
einer Seitenkette oder an einem Ringatom gebunden ist), Nikotinamidadenindinucleotid (oxidiert) und Eisen(III)-Ionen
enthält.
Die Mischung wird dann bei einer Temperatur von 37'0C einige
Zeit einer Inkubation unterzogen und die erhaltene blaue Farbe, die das Triglycerid wiedergibt, dann in einem
Spektralphotometer einer Wellenlänge von 610 niu vermessen.
Die erhaltene Absorption wird aufgezeichnet und verwendet, um den Triglyceridgehalt der ursprünglichen Probe durch Vergleich
mit der Absorption einer Standardlösung von Tri-
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glycerid, die in einer identischen Weise wie die Serumprobe behandelt wurde, zu ermitteln. Das vorstehend ausführlich
beschriebene erfindungsgemäße Verfahren bedeutet ersichtlich einen großen Fortschritt im Vergleich zu dem
bekannten Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, da es die angewandten Techniken vereinfacht und daher
einem größeren Anteil der Bevölkerung einen bedeutenden und für die Vorbeugung entscheidenden Testversuch bereitstellt.
Die stärkere Bereitstellung einer zuverlässigen 0 Triglyceridbestimmungsmethode ermöglicht es wiederum, daß viele
Personen gesünder, intensiver und langer leben können.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher
erläutern.
2,0 Milliliter 0,128 m Triäthanolaminpuffer (pH 9,4) mit
einem Gehalt an 9- (2-Pyridyl) -acenaphto/_1,2-eJ-as-triazinsulfonat
werden in einer Konzentration von 1,6 mmol/1 in ein lyophilisiertes Glasflaschen gegeben, das 18 μπιοί
Adenosintriphosphat, 20, 5 μπιοί MgSO., 660 Einheiten Lipase,
3 internationale Einheiten Glycerin-3-phosphatdehydrogenase
(3 I.U.) und 0,29 internationale Einheiten Glycerinkinase enthält. Alle genannten Verbindungen befinden sich in der
lyophilisierten Form, um eine maximale Stabilität zu gewähr-■ leisten. _ 31 _
American Monitor Corp»Ba±|Don/
Pat 46/3-78Ch τττπτσ ^
Pat 46/3-78Ch τττπτσ ^
- an -
2!ü dieser Mischung wird eine 20 Mikroliter (0,02 Milliliter) Probe
des Serums gegeben, das Triglyceride enthält. Zu dieser Mischung wird dann eine aliquote Menge von 1,5 Milliliternder
Lösung gegeben, die 47 Mikromol/1 Phenazinmetbosulfat,
27 mmol/1 Nikotinamidadenindinucleotid (oxidiert)
und 0,466 mmol/1 Eisen(III)-Ionen enthält.
Die anfallende Lösung wird dann sorgfältig gemischt und bei einer Temperatur von 37 0C 2O Minuten lang einer Inkubation
unterzogen (nach der Zugabe der Lösung, die Phenazinmethosulfat enthält, wird es bevorzugt, daß
die Lösung von der Einstrahlung starken Lichts oder Sonnenlichts bewahrt bleibt). Nach Abschluß der 20-minütigen Inkubationsdauer
wird die Absorption der Mischung in einem Spektralphotometer bei 610 nm gegen ein Blindreagenz vermessen,
das in gleicher Weise wie die serumreaktionsmischung hergestellt wird t was jedoch mit der Ausnahme geschieht,
daß 20 Mikroliter destilliertes Wasser für die Serumprobe eingesetzt werden.
Der Triglyceridgehalt der Serumprobe wird dann berechnet, indem die gemessene Absorption zu der Absorption, die mittels
einer Lösung bekannten Triglyceridgehalts festgestellt wurde und die in der gleichen Weise wie die Serumprobe behandelt
wurde, in Vergleich gesetzt wird.
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-Yi-
Unter den oben beschriebenen Bedingungen wird eine lineare Reaktion (d.h. die gemessene Absorption verändert sich
direkt mit der Konzentration des Triglycerids in der ursprünglichen Serumprobe) bis zu einer Konzentration von
etwa 500 mg/dl Triglycerid beobachtet. Da ein langsamer, jedoch kontinuierlicher Anstieg der Absorption in allen
Rohren vorliegt, einschließlich des Rohrs mit dem Blindreagenz, wird es empfohlen, daß der Analytiker zwischen den
Testablesungen zur Erzielung optimaler Ergebnisse das Spektrometer mit dem Rohr mit dem Blindreagenz auf Null
(re-zero) einstellt. (Eine Einheit der Lipaseaktivität stellt die Menge des Enzyms dar, die 1 μπιοί Fettsäure pro Minute
bei einem pH-Wert von 8,9 bei 25 0C freisetzt).
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung, die für ein automatisch betriebenes Instrument besser geeignet ist, wird
eine 7 Mikroliter Serumprobe in einem Reaktionsbehälter verteilt. In diesen Behälter werden gleichzeitig folgende
aliquote Mengen gegeben: 0,5 Milliliter einer aliquoten Menge eines Reagenzes, das 36 mmol/1 Adenosintriphosphat,
40,9 mmol/1 MgSO4, 1.318.000 Einheiten/1 Lipase, 6.040 internationale Einheiten/1 Glycerin-3-phosphatdehydrogenase
und 570 internationale Einheiten/1 Glycerinkinase enthält,
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eine aliquote Menge von 1,5 ml eines Reagenzes, das 47 [imol/l
Phenazinmethosulfat, 0,466 mmol/1 Eisen(III)-Ionen und 27,3
mmol Nicotinamidadenindinucleotid (oxidiert) enthält, und
eine aliquote Menge von 1,5 ml eines 0,17 molaren Triäthanolpuffers (pH 9,4), der 2,1 mmol/1 9-(2-Pyridyl)-acenaphto-U 12-eJ-as-triazinsulfonat
enthält. Die Lösung wird dann gemischt und bei einer Temperatur von 37 0C während etwa
15 Minuten einer Inkubation unterzogen. Die endgültige Absorption der Mischung wird dann spektralphotometrisch bei
610 nm gemessen. Die in der ursprünglichen Probe enthaltene Menge an Triglycerin wird wie im Beispiel 1 berechnet. Unter
diesen Bedingungen wird eine lineare Absorptionsreaktion in den Serumproben, die bis zu 1.000 mg/dl Triglyceride
enthalten, demonstriert.
Dieses Beispiel wird wie das Beispiel 1 durchgeführt, wobei
jedoch die Ausnahme erfolgt, daß 1,6 mmol/1 Bathophenanthrolinsulfat
für 1,6 mmol/1 9-(2-Pyridyl)-acenaphthojH ,2-eJ-astriazinsulfonat
eingesetzt wird.
Dieses Beispiel wird wie das Beispiel 1 mit der Ausnahme durchgeführt, daß 1,6 mmol/1 Ferrozine für 1,6 mmol/1
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9-(2-Pyridyl)-acenaphtho/j, 2-eJ-as-triazinsulfonat eingesetzt
werden(Perrozine stellt den Handelsnamen der
Hach Chemical Co., of Amex, Iowa dar). Wie in Aldridge Catalog - Handbook of Organic and Biochemicals, Seite 385
(1977-8) ausgewiesen wird, ist ihm die folgende Benennung zuzuschreiben: Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-p,p'-disulfonsäure
in Form des Trihydrats).
(Ähnlich wie bei den Ausgestaltungen des Beispiels 3 und 4 kann der Eisenchelatbildner (iron chelator) (wie Bathophenanthrolinsulfonat
und Ferrozine) auf äquimolarer Grundlage für das im Beispiel 2 genannte 9-(2-Pyridyl)-acenaphthol
j_1, 2-e"]-as-triazinsulfonat, wie im Beispiel 2
angeführt, gesetzt werden).
Anhand der gegebenen Lehre wird es dem Fachmann ohne weiteres möglich sein, ohne den Rahmen der Erfindung
zu verlassen, diese vielfältig zu modifizieren. Zum Beispiel kann die genaue Anzahl der Einheiten der Lipase bei
begleitendem Anstieg der Inkubationszeit herabgesetzt werden, um die vollständige Hydrolyse zu bewirken.
Ähnlich kann die genaue Zusammensetzung des Puffers, der
in den erwähnten Bestimmungssystemen optimiert worden ist, geringfügig und in Abhängigkeit vom Typ und dem angestrebten
pH-Wert ohne schwerwiegende Beeinträchtigungen des Bestimmungssystems modifiziert werden.
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Claims (13)
- PATENTANWÄLTE "°Dostouchesstraße 60 · Postfach 400745 ■ 8000München 40- telefon 089/304071* -Telex 5-216136 hagc d ·Tflof-Mnim li.i^cypatcnl ■ Telekopiercr 089/504071American Monitor Corporation, München, denInianapolis, Indiana, V.St.A. 30. Oktober 1978u.Z.: Pat 46/3-78Ch Dr.H/3/stVERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDENPatentansprüche1 Λ Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei las auf eine Hydrolyse der Triglyceride zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (System Nikotinamidadenindinucleotid/reduziertes Nikotinamidadenindinucleotide) gekoppelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß Eisen mit dem NADH des NAD/NADH-Systems umgesetzt und der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens zur quantitativen Erfassung des Gehalts an Triglyceriden herangezogen wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eisen in der Reaktionsmischung des NAD/NADH-Systems enthalten ist.
- 3. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten durch enzymatische Hydrolyse der Triglyceride unter dem Einfluß von Lipase, durch Umsetzen des auf diese Weise gebildeten Produkts zu Glycerin-1-phosphat mittels Adenosin-triphosphat (ATP) und des Enzyms Glycerinkinase (GK) und durch Umsetzung des Glycerin-1-phosphate zu Dihydroxyacetonphosphat unter Vernwendung des Enzyms Glycerin-phosphatdehydrogenase (GPDH) bei gleichzeitiger Reduktion des Nikotinamidadenindinucleotids (NAD) zur reduzierten Form NADH, dadurch gekennzeichnet, daß das derartig gebildete NADH mit909824/0617- 2 -ORIGINAL INSPECTEDsich in der oxidierten Form (Fe(III)) befindende Eisen zur Bildung reduzierten (Fe(II)) Eisens umgesetzt, die Reaktion durch ein Elektronenüberführungsmittel vermittelt und das reduzierte Eisen mit einem Eisenchelatbildner umgesetzt wird, um ein Chromophor starker Intensität.zu bilden, und danach die in der Bioflüssigkeit vorhandene Menge an Triglycerid durch Messen der Chromophormenge quantitativ erfaßt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, 0 daß als Elektronenüberführungsmittel Phenazin-methosulfat' eingesetzt wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner 9-(2-Pyridyl)-acenaphthoD / 2-e] -as-triazinsulfonat eingesetzt wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner Bathophenanthrolinsulfonat eingesetzt wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner das Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1 ^^-triazin-pip' in der Trihydratform eingesetzt wird.
- 8. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten, in denen die Triglyceride enzymatisch unter Verwendung des Enzyms"Lipase hydrolysiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß Eisen und Lipase in der gleichen Reaktionsmischung eingebracht werden und anschließend der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens bei der quantitativen Erfassung des Gehalts der Triglyceride herangezogen wird.American Monitor Corporation - 3 -Pat 46/3-78Ch909824/0617
- 9. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten, wobei die jeweilige Probe einer Umsetzung unterzogen wird, um die reduzierte Form des Nikotinamidadenindinucleotids (NADH) als Reaktionsprodukt zu bilden, und die derartig gebildete Menge des NADH ein Maß für die ursprünglich in der Probe enthaltenen Triglyceride darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß das NADH mit sich in der oxidierten Form (Fe(III)) befindenden Eisen zur Bildung reduzierten (Fe(II)) Eisens umgesetzt, die Reaktion durch ein Elektronenüberführungsmittel vermittelt und das reduzierte Eisen mit einem Eisenchelatbildner umgesetzt wird, um ein Chromophor starker Intensität zu bilden, und danach die in der Bioflüssigkeit vorhandene Menge an Triglyceriden durch Messen der Chromophormenge quantitativ erfaßt wird.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenüberführungsmittel Phenazinmethosulfat eingesetzt wird.
- 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho [i , 2-e"]-as-triazinsulfonat eingesetzt wird.
- 12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner Bathophenanthrolinsulfonat eingesetzt wird.
- 13. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner das Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-p,p'-disulfonsäure in der Trihydratform eingesetzt wird.American Monitor Corporation - 4 -Pat 46/3-78Ch909824/0617
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