DE2738135A1 - Verfahren zur bestimmung von glucose im blut - Google Patents
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Description
- "Verfahren zur Bestimmung von Glucose im Blut"
- Ein wichtiges, weil besonders spezifisches Verfahren zur Bestimmung von Glucose im Blut, ist das sogenannte Glucoseoxydase-Peroxydase-Verfahren. Dieses Verfahren beruht darauf, daß Giucose in wäßriger Lösung und in Gegenwart von Luftsauerstoff durch Glucoseoxydase zu Gluconsäure oxydiert wird, wobei nebenbei Wasserstoffperoxyd gebildet wird. In Gegenwart von Peroxydase vermag das gebildete Wasserstoffperoxyd gewisse als Chromoqene bezeichnete Stoffe zu oxydieren, die dabei in gefärbte Verbindungen übergehen. Die Stärke der Färbung läßt sich spektralfotometrisch bestimmen und die dabei erhaltenen Werte können zur Berechnung der ursprünglichen Glucosekonzentration verwendet werden.
- Wichtig ist dabei, daß zunächst die Eiweiße aus der Probe beispielweise mit Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder Uranylacetat ausgefällt und durch Zentrifugieren abgeschieden werden und der Überstand von der Fällung abgetrennt wird. Die Fällung der Eiweiße ist nötig, weil bei einer derartigen enzymatischen Bestimmung von Glucose in Blut das anwesende Hämoglobin einerseits wegen seiner hohen Absorption und andererseits auch wegen seiner Oxydasewirkung die Nachweisreaktion beeinträchtigt. Die Fällung nuß außerdem vor einer Weiterverarbeitung abgetrennt werden, da nämlich bei Zusatz der neutralen bis schwach alkalischen Reaktionslösung, welche Glucoseoxydase und Peroxydase enthält entweder eine teilweise Wiederauflölsung der gefällten Eiweiße oder eine Denaturierung bzw. Fällung der zu Nachweis zugesetzten Enzyme erfolgen kann.
- Die Notwendigkeit der Gewinnung eines von der Fällung befreiten Überstandes verkonpliziert das Verfahren. Insbesondere steht es einer heute allgemein geforderten Durchführung der Analyse als Eingefäßreaktion (Küvettentest) entgegen.
- Der Erfindung lag unmher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der oben beschriebenen Art zu schaffen, bei welchen es nicht mehr nötig ist, die gefällten Eiweiße vor Zugabe der Reaktionslösung abzutrennen.
- Es wurde gefunden, daß bei einer besonderen Irt der Eiweißrillung es möglich ist, die Reaktionslösung der Probe nit den gefällten Eiweiß direkt zuzusenden, ohne daß die weitere Bestimmung gestört wird.
- ßonit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestiiiung von Glucose in Blut, durch ausfällen der Eiweiße, Versetzen des Vberstandes nit Gluchoseoxydase Peroxydase und einen Chronogen, spektralfotometrische Bestimmung der Fsrbintensität und Ermittlung des Glucosegehalts aus letzterer, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Ausfällung der Eiweiße zunächst eine Hämolysiersubstanz in einer zur Auflösung der Eiweiße sant Blutzilen ausreichenden Menge zugegeben wird und hierauf eine Fällung durch Zusatz von Quecksilber(II)-ionen in neutraler oder schwach alkalischer Lösung durchgeffihrt wird.
- Die Enteiweißung gliedert sich beim erfindungsgemäßen Verfahren in swei Schritte: 1. Vorbereitende Denaturierung: Es wird eine Hämolysiersubstanz zugegeben, und zwar vorzugsweise als wäßrige Lösung. Als Hämolysiersubstanz kann eine eiweißfällende Säure, wie s.B. Trichloressigsäure, Perchlorsäure oder Sulfosulicylsäure, verwendet werden, die bei Verwendung in höherer Konzentration eiweißfällend wirkt. Die Lösung der eiweißfällenden Säure ist vorzugeweise 5 bis 20 in, insbesondere 10 in (mH . nillinolar).
- 2. Nachfolgende Fällung durch Quecksilber(II)-ionen: Diese wird in neutraler oder schwach alkalischer Lösung durchgeführt. Die Quecksilber (II)-ionen werden vorzugsweise in Porn des Chlorids zugesetzt. Auch der Zusatz der Quesckeilber(II)-ionen erfolgt vorzugsweise als wäßrige Lösung. Diese wäßrige Lösung besitzt vorzugsweise eine Konzentration von 1 bis 5 in, insbesondere 3 in. Es ist zwar möglich, die Probe schwach alkalisch zu wachen, beispielaweise durch Zusatz eines Puffers, Jedoch wird es bevorzugt, die Fällungslösung mit einem eine schwach alkalische Reaktion ergebenden Puffer zu versetzen. Hierzu kann insbesondere K2HPO4 verwendet werden.
- Der Überschuß an Queckeilbar (II)-ionen kann mit einem Komplexbildner maskiert werden, wozu insbesondere Äthylendiamintetraessigsäure oder ein Rodanid dienen können. Der Zusatz eines Komplexbildners kann von Vorteil sein, da Quecksilberionen unter Umständen auf die nachfolgende Nachweisreaktion störend einwirken können.
- denaturieren können.
- Als Chromogen kann beispielsweise Aminophenazon in Verbindung mit Phenol oder aber 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolinsulfonsäure-6)-diammoniumsalz verwendet werden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann das Chromogen bereits mit einer der oben erwähnten Säurelösungen, die für die Hämolysierung dienen, zugegeben werden, da nämlich das Chromogen in saurer Lösung nicht oxydationsempfindlich ist. Die Verwendung von Aminophenazon plus Phenol als Chromogen ist bei einer solchen frühen Zugabe des Chromogenes von Vorteil, weil nämlich Phenol die hämolytische Wirkung der erwähnten zur Hämolysierung zugesetzten Säuren verstärkt.
- Durch deh-.Zusatz der erwähnten Hämolysiersäuren wird aufgrund der Denaturierung der Probeneiweiße die Probe vor Abbaureaktionen geschützt und stabilisiert, so daß sie über längere Zeiträume aufbewahrt werden kann, bevor mit der Fällung und der Bestimmung fortgefahren wird.
- In der Folge sei ein Beispiel für mögliche Zusammensetzungen der nötigen Reagenzien angegeben: Hämolysierlösung (1) : 10 mM Trichloressigsäure 20 mM Phenol 0,4 mM Aminophenazon) Chromogsn 8 mM inerte Metalle zur Bildung gelatinöser Hydroxyde und Phosphate, z.B. Mg, Be (als Zentrifugierhilfe) 0,25% Netzmittel Fällungsreagenz (2) : 2 M KHPO4 3 mM HgCl2 Enzymreagenz (3) : 1 KU/ml GOD 250 U/ml POD 100 mM KSCN 2,25% Stabilisator Eine Analyse auf Blutzucker kann wie folgt durchgeführt werden: 2,0 ml Hämolysierlösung (1) werden in eine Küvettenflasche gegeben, worauf 20,um Blut zugesetzt werden und das Ganze durchgemischt wird.
- Dann werden 0,5 ml Fällungsreagenz (2) zugegeben, worauf gemischt und zentrifugiert wird.
- Nun wird eine Leermessung durchgeführt.
- Hierauf wird 1 Tropfen Enzymreagenz (3) zugegeben und durchgemischt.
- Nach 30 bis 60 min wird gemessen und die Differenz aus den beiden Messungen gebildet.
- Die weitere spektralfotometrische Bestimmung erfolgt in üblicher Weise.
- Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Fällung und Messung in ein und derselben Küvette durchgeführt werden kann. DarUber hinaus ist die Mitführung eines Leerwert-Ansatzes nicht erforderlich, da das Chromogen bei Anwesenheit einer der erwähnten für die Hämolysierung dienenden Säure keiner Autoxydation unterliegt. Es kann ein konstanter Korrekturwert vorgegeben werden (z.B. 4 mg% Leerwertabzug).
- Ebenso ist es auch möglich auf die Mitführung eines Standards als Bezugsgröße zu verzichten und die Auswertung mittels eines Berechnungsfaktors vorzunehmen.
Claims (14)
- PATENTANSPRUCHE 1. Verfahren zur Bestimmung von Glucose im Blut, durch Ausfällen der Eiweiße, Versetzen des Überstands mit Glucoseoxydase, Peroxydase und einem Chromogen, spektralfotometrische Bestimmung der Farbintensität und Ermittlung des Glucosegehalts aus letzterer, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung der Eiweiße zunächst eine Hämolysiersubstanz in einer zur Auflösung der Eiweiße samt Blutzellen ausreichenden Menge zugegeben wird und hierauf eine Fällung durch Zusatz von Quecksilber(II)-ionen in neutraler oder schwach alkalischer Lösung durchgefUhrt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hämolysiersubstanz als wäßrige Lösung zugegeben wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hämolysiersubstanz eine eiweißfällende Säure verwendet wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als eiweißfällende Säure Trichloressigsäure, Perchlorslure oder Sulfosalicylsäure verwendet wird.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, daß die eiweißfällende Säure als 5 bis 20 mM-Lösung zugegeben wird.
- 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quecksilber(II)-ionen in Form des Chlorids zugegeben werden.
- 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quecksilber(II)-ionen als wäßrige Lösung zugegeben werden.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Quecksilber(II)-ionen als 1 bis 5 mM-Lösung zugegeben werden.
- 9. Verfahren nach Anspruch 6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung schwach alkalisch gepuffert ist.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung als Puffer K2HPO4 enthält.
- 11, Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Überschuß an Quecksilber-(II)-ionen mit einem Komplexbildner maskiert wird.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Komplexbildner Xthylendiamintetraessigsäure oder ein Rodanid verwendet wird.
- 13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Aminophenazon plus Phenol oder aber 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolinsulfonsäure-6)-diammoniumsalz verwendet wird.
- 14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Eiweißfällung die Reaktionslösung zentrifugiert und die Glycoseoxydase, die Peroxydase und das Chromogen direkt zum Überstand zugegeben werden.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0027236A1 (de) * | 1979-10-15 | 1981-04-22 | Miles Laboratories, Inc. | Ascorbatbeständige Zusammensetzung, Probevorrichtung und Verfahren zum Nachweisen eines Bestandteils in einem flüssigen Probemuster |
| EP0033462A1 (de) * | 1980-02-04 | 1981-08-12 | ELVI S.p.A. | Mit Aminopyrin verbessertes Trinder-Reagenz und Verfahren zum Dosieren von bei enzymatischer Oxydation metabolischer Substrate gebildeten Wasserstoffperoxyds mittels dieses Reagenzes |
-
1977
- 1977-08-24 DE DE19772738135 patent/DE2738135A1/de not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0027236A1 (de) * | 1979-10-15 | 1981-04-22 | Miles Laboratories, Inc. | Ascorbatbeständige Zusammensetzung, Probevorrichtung und Verfahren zum Nachweisen eines Bestandteils in einem flüssigen Probemuster |
| EP0033462A1 (de) * | 1980-02-04 | 1981-08-12 | ELVI S.p.A. | Mit Aminopyrin verbessertes Trinder-Reagenz und Verfahren zum Dosieren von bei enzymatischer Oxydation metabolischer Substrate gebildeten Wasserstoffperoxyds mittels dieses Reagenzes |
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