DE2612725B2 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Description

Cholesterin-Oxidase

Choiester'mesterase

Peroxidase

p-Aminophenazon

Phenol

Puffer

oberflächenaktives Mittel

gekennzeichnet durch einen Gehalt von wenigstens einem Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen.

5. Reagenz nach Anspruch 4, bestehend aus

0,05 bis 5 U Cholesterin-Oxidase

0,2 bis 2 U Cholesterinesterase

0,03 bis 3 U Peroxidase

0,5 bis 3 mM p-Aminophenazon

2 bis 15 mM Phenol

0,05 bis 1 % oberflächenaktives Mittel

0,2 bis 1,0 M Phosphatpuffer pH 7 bis 8

gekennzeichnet durch 2 bis 10 Volumen-% Methanol.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Cholesterin und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die enzymatische Bestimmung des Cholesterins mit Hilfe von Cholesterin-Oxidase ist bekannt. Hierbei wird das Cholesterin mit Sauerstoff in Gegenwart der Oxidase zu Cholestenon und H2O2 oxidiert. Die Reaktionsprodukte lassen sich dann nach verschiedenen Methoden bestimmen.

Eine bekannte Methode zur Bestimmung von H₂O₂ besteht in der oxidativen Kupplung mit p-Amino-phenazon und Phenol und in Gegenwart von Peroxidase (Ann. CHn. Biochem. 6 (1969) 24). Bei dieser Reaktion wird ein Chromogen gebildet mit einem Absorptionsmaximum bei 500 nm, welches sich leicht mit einem Photometer quantitativ bestimmen läßt.

Es ist bekannt, diese H₂O₂-Bestimmungsmethode auch im Rahmen der Cholesterin-Bestimmung mit Cholesterin-Oxidase anzuwenden (CHn. Chem. 20, 470 bis 476 [1974]). Diese Methode erlaubt eine Bestimmung des Cholesterins mit einfachen Mitteln. Es wurde jedoch festgestellt, daß in vielen Fällen bei diesem Verfahren starke Abweichungen auftraten, die auf der Bildung

einer Trübung beruhen. Es erwies sich zwar als möglich, in sehr vielen Fällen die durch die Trübung, die mit bloßem Auge zumeist nicht feststellbar ist, hervorgerufenen Fehler zu beseitigen, indem gegen einen Probenleerwert gemessen wurde. Bei einem gewissen %-Satz der untersuchten Seren traten jedoch Trübungen auf, die auch durch einen Probenleerwert nicht eliminiert werden konnten, so daß das Verfahren hierbei völlig versagte. Der Grund hierfür lag in unterschiedlichen Trübungen in Probe und Probenleerwert, so daß stets zu hohe Cholesterinwerte erhalten werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diesen Mangel des oben beschriebenen Verfahrens zu besritigen.

Die Lösung dieser Auigbe gelingt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin mit Cholesterin-Oxidase und Cholesterinesterase in Gegenwart von Peroxidase, p-Aminophenazon, einem oberflächenaktiven Mittel und Phenol, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Bestimmungsansatz wenigstens ein Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen zugesetzt wird. Bevorzugt wird Methanol verwendet. Aber auch Äthanol, Propanol, Isopropanol und die Butanole können verwendet werden.

Die Höhe des Alkanolzusatzes variiert, je nach den zu berücksichtigenden Gegebenheiten. Stets zuverlässige Ergebnisse werden bei einem Zusatz von 2 bis 10 Volum-% Alkanol, bezogen auf das Gesamtvolumen des Testansatzes, erzielt. Besonders bevorzugt werden dabei 7 bis 8% Methanol bzw. 4 bis 6% der höheren Alkanole eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, bei der Cholesterin-Bestimmung in der Regel auf den Probenleerwert völlig zu verzichten. Bei denjenigen Fällen, in denen bisher die Trübungen so stark waren, daß die Bestimmung überhaupt nicht durchgeführt weiden konnte, werden erfindungsgemäß zuverlässige Ergebnisse erhalten, wenn ein Probenleerwert mitgeführt wird.

Das Verfahren der Erfindung ist sowohl zur Bestimmung von freiem als auch von gebundenem (verestertem) Cholesterin anwendbar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Durchführung der Bestimmung von Cholesterin. Ein derartiges Reagenz enthält Cholesterin-Oxidase und Cholesterinesterase sowie Peroxidase, p-Aminophenazon, Phenol, Puffer, oberflächenaktives Mittel und ist erfindungsgemäß gekennzeichnet durch einen Gehalt von wenigstens einem Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen.

Ein besonders bevorzugtes Reagenz enthält

0,05 bis 5 U Choiesterin-Oxidase

0,2 bis 2 U Cholesterinesterase

0,03 bis 3 U Peroxidase

0,5 bis 3 mM p-Aminophenazon

2 bis 15 mM Phenol

0,05 bis 1 % oberflächenaktives Mittel

0,2 bis 1,0 M-Phosphatpuffer pH 7 bis 8

und ist gekennzeichnet durch 2 bis 10 Volumen-% Methanol.

2 bis 5 ml des obigen Reagenz reichen aus für eine Bestimmung inklusive Probenleerwert. Für größere Ansätze werden entsprechende Vielfache verwendet.

Zur Durchführung des Verfahrens wird das erfindungsgemäße Reagenz mit Ausnahme der Chlolesterin-Oxidase mit der zu untersuchenden Probe versetzt, so

daß sich ein Gesamtvolumen zwischen 2 und 3 ml ergibt und dann in einem Photometer die Extinktion in einem geeigneten Bereich, beispielsweise bei 546 nm bestimmt. Danach wird die Cholesterin-Oxidase zugesetzt und nach einer bestimmten Zeit die Extinktionsdifferenz bestimmt, weiche ein Maß für die im Serum vorhandene Cholesterinmenge ist
Folgende Beispiele beschreiben die Erfindung weiter:

Beispiel 1

Zu 5 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, der 0,2% Hydroxypolyäthoxy-dodecan als oberflächenaktives Mittel, 7,5% Methanol, 1OnM Phenol und ImM 4-Aminophenazon enthält, werden 0,05 ml eines lipaemischen Serums sowie 0,02 ml (= 1 U) Cholesterinesteraselösungund 0,02 ml (2 U) Peroxidase gegeben. Es wird nun die Probe geteilt, und zu der einen Hälfte der Lösung (2,5 ml) werden 0,02 ml Cholesterinoxidase-Lö sung(= 2 U) hinzugefügt

Nach Inkubation der beiden Lösungen (mit und ohne Cholesterinoxidase) bei 37° C für 15 min bzw. bei Raumtemperatur für 30 min. wird die Lösung mit Cholesterinoxidase gegen die ohne Cholesterinoxidase bei 546 nm gemessen. Die dabei gemessene Extinktionsdifferenz ist ein Maß für die im Serum vorhandene Cholesterin-Konzentration, die durch Bezug auf einen mitgeführten Cholesterin-Standard berechnet wird.

Der Cholesteringehalt für eine typische Probe ergab 367 mg Cholesterin/100 ml, die Vergleichsbestimmung mit der Katalase-Methode (Z. f. CHn. Chem. CHn. Biochem. 12,403-407/1974)369 mg Cholesterin/100 ml.

Wird dieser Versuch jedoch in Abwesenheit von Methanol durchgeführt, so entsteht eine Trübung, die die Messung der Extinktion bei 546 nm — und damit die Bestimmung der Cholesterin-Konzentration — unmöglich macht.

Beispiel 2

Zu 2 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, der 0,2% Hydroxypolyäthoxy-dodecan, 7,5% Methanol, 1OmM Phenol und 1 mM 4-Aminophenazon enthält, werden 0,02 ml Serum sowie 0,02 ml (= 1 U) Cholesterinesterase, 0,02 ml (2 U) Peroxidase sowie 0,02 ml (= 0,2 U)

Cholesterinoxidase-Lösung gegeben. Nach Inkubation bei 37° C für 15 min. bzw. bei Raumtemperatur für 30 min. wird diese Lösung bei 546 nm gegen einen Reagentien-Leerwert (d.h., anstatt Probe wird Wasser in den Bestimmungsansatz eingesetz) gemessen. Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe wird unter Bezug auf einen mitgeführten Cholesterin-Standard ermittelt.

Der Cholesteringehalt für eine typische Probe ergab 253 mg Cholesterin/100 ml, die Vergleichsbestimmung

mit der Katalase-Methode 251 mg Cholesterin/100 ml. Wird dieser Versuch jedoch in Abwesenheit von Methanol durchgeführt, so werden um 15% höhere Cholesterinwerte gefunden.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin mit Cholesterin-Oxidase und Cholesterinesterase in Gegenwart von Peroxiaase, p-Aminophenazon, einem oberflächenaktiven Mitte! und Phenol, dadurch gekennzeichnet, daß dem Bestimmungsansatz wenigstens ein Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Methanol zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 10 Volumen-% Alkanol, bezogen auf das Gesamtvolumen des Testansatzes, zugesetzt werden.

4. Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, enthaltend