DE2724212A1

DE2724212A1 - Verfahren und reagenz zur bestimmung der enzymaktivitaet

Info

Publication number: DE2724212A1
Application number: DE19772724212
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Baba; Atsushi Hattori; Sadamasa Minato; Seigo Ueda; Yuichiro Yabe; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1976-06-01
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1977-12-15
Also published as: US4116774A; CA1097198A; FR2353855A1; JPS52146693A; JPS584560B2; GB1527346A; FR2353855B1

Description

272A212

DA-13 043

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren zur Bestimmung einer Enzymaktivität in einer Substanz, die enzymatische Aktivität aufweist.

Unter den Körperflüssigkeiten wurden bereits Substanzen, die enzymatische Aktivität zeigen, wie Serum, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Magensaft und dergleichen, als verschiedene diagnostische Proben verwendet. Nimmt man den Fall von Serum zur Veranschaulichung, so ist bekannt, daß die Aktivität der in Serum vorkommenden Enzyme, wie Peptidase, Transpeptidase und dergleichen, in Abhängigkeit von den physiologischen und den unter dem Einfluß einer Krankheit vorliegenden Bedingungen eines lebenden Organismus merklich schwanken. So wurden beispielsweise γ-Glutamyltranspeptidase (nachstehend als y.GTPase bezeichnet) und Leucinaminopeptidase (nachstehend als LAPase bezeichnet) in v/eitem Umfang zur Diagnose von Leberkrankheiten angewendet, während Cysteinaminopeptidase (nachstehend als CAPase bezeichnet) für die Diagnose der Placentafunktion in der Schwangerschaft angewendet wurde. Die Bestimmung dieser Enzyme hat sich als wichtiges Diagnoseverfahren erwiesen. Es wird gewöhnlich eingeräumt, daß die kolorimetrische Bestimmung eines Bestandteils in einem lebenden Organismus nur dann durchführbar ist, ohne daß durch die in dem lebenden Körper vorliegenden Pigmente Einfluß darauf zeigen, wenn die zur Bestimmung zu verwendende Wellenlänge nicht weniger als 600 nm beträgt. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Peptidase, Transpeptidase und dergleichen wurde allgemein eine Methode vorgeschlagen, bei der ein Derivat von p-Nitroanilin als Substrat angewendet wird und das durch die enzymatische Reaktion freigesetzte gelbgefärbte p-Nitroanilin kolorimetrisch bestimmt wird, sowie ein v/eiteres Verfahren, bei dem das durch die enzymatische Reaktion freigesetzte β-Naphthylamin zur Bestimmung mit Hilfe einer Diazoreaktion gelb bis rot gefärbt wird. Gelbe Pig-

709850/0953

mente können jedoch in dem Serum vorliegen oder Serum wird rot gefärbt, wenn es teilweise hämolysiert ist und daher kann der Messwert durch die Serum-Bestandteile beeinflußt werden, wenn die Messung mit Hilfe irgendeiner allgemein bekannten Methode durchgeführt wird. Es besteht daher ein außerordentliches Bedürfnis nach der Entwicklung eines Verfahrens, bei dem die kolorimetrische Bestimmung innerhalb des langwelligen Bereiches von nicht weniger als 600 nrn durchführbar ist.

Durch eingehende Untersuchungen mit dem Zweck, die vorstehenden Nachteile zu beseitigen, wurde gefunden, dai3 die Enzymaktivität im Serum ohne störenden Einfluß durch andere Serumbestandteile bestimmt v/erden kann, indem ein Derivat eines aromatischen Amins als Substrat verwendet wird und das aromatische Amin, welches durch die enzyuiatische Reaktion freigesetzt wird, mit Hilfe eines Eisenkomplexes blau oder bläulich-grün gefärbt wird. Es ist zu betonen, daß dieses Verfahren zur Bestimmung einer Enzymaktivität nicht nur im Serum, sondern auch in anderen Substanzen mit beliebiger enzymatischer Aktivität anwendbar ist.

In "Mikrochimica Acta,"2, Seite 3 (1937) wird berichtet, daß ein aromatisches Amin, speziell ein primäres Amin, mit einem Reagenz, welches aus einem Pentacyanaminferrat durch Behandlung mit Bromwasser erhalten wird, blau oder grün gefärbt wird. Dieses Reagenz eignet sich jedoch nicht als Reagenz für die quantitative Bestimmung und ist so instabil, daß es während der Lagerung Abscheidungen bildet. Es hat sich als unmöglich erwiesen, dieses Reagenz als Diagnosemittel für die praktische Anwendung einzusetzen. Erfindungsgemäß wurde durch weitere Untersuchungen zur Beseitigung dieser Nachteile festgestellt, daß ein stabiles Farbreagenz für ein aromatisches Amin mit quantitativer Färbentwicklung hergestellt werden kann, indem ein Pentacyanaminferrat mit einem Peroxid behandelt wird.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität in einer Substanz, die enzymatische Aktivität

709850/09S3

aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Derivat eines aromatischen primären Amins als Substrat für die Bestimmung der Enzymaktivität verwendet und zur Farbentwicklung ein staT iles Farbreagenz verwendet, das durch Behandlung eines Eisenkomp.exes mit einem Peroxid erhalten wird.

Als Pentacyanamminferrat,das für die Zwecke der Erfindung geeignet ist, lassen sich Natrium- oder Kaliumpentacyanamminferrat nennen. Geeignete Beispiele für Peroxide bzw. Salze von Persäuren, die für die Durchführung der Peroxidbehandlung verwendbar sind, sind Natriumperjodat, Kaliumperjodat, Kaliumpermanganat, Wasserstoffperoxid und dergleichen, wobei Wasserstoffperoxid am stärksten bevorzugt wird.

Zu Beispielen für aromatische primäre Aminderivate, die sich für die Zwecke der Erfindung als Substrat eignen, gehören folgende Derivate :

Nr. Chemische Bezeichnung Struktur

1 L-Glutaminsäure-y-p- _Ύ dimethylaminoanilid

2 L-Glutaminsäure-γ-ρ- _{Y ri}„ _m/\__t diäthylaminoanilid Y-GIu-NH-^Jp _v "?>5'2

L-Glutaminsäure-Y-p- Y

methoxyanilid ν

L-Glutaminsäure-γ-ρ-hydroxyanilid

X=/

OH

S-Benzyl-L-cystein- _R _ p-dimethylaminoanilid S-Bz-Cys-NH

yy
p-dimethylaminoanilid

S-Benzyl-L-cysteinp-hydroxyanilid

709850/0953

7 S-Benzyl-L-cystein- S-Bz-Cys-NH-^ \-OCH,
p-methoxyanilid · \ / ο

8 L-Leucin-p-dimethyl- Leu-NH-^ Y-N(CH-,).,
aminoanilid \ / 3 2

9 L-Leucin-p-hydroxy- Leu-NH-V V-OH
anilid \ /

10 L-Leucin-p-methoxy- Leu-NHH/ VOCH,
anilid \ / 3

11 N-Benzyl-L-tyrosinp-dimethylaminoanilid

Die vorstehend unter Ziffer 1, 2, 3 und k genannten Aminderivate sind neue Substanzen, die nach dem in der japanischen Patentanmeldung 63783/1976 beschriebenen Verfahren hergestellt werden können. Nach diesem Verfahren wird Glutaminsäureanhydrid mit geschützter Aminogruppe mit p-substituiertem Anilin, vorzugsweise unter Erhitzen und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels, umgesetzt und anschließend die Amino-Schutzgruppe nach einer in der Amidsynthese üblichen Methode entfernt. Die vorstehend unter Ziffer 5, 6, 7, 8, 9 und 10 angegebenen Verbindungen sind ebenfalls neue Substanzen, die gemäß JA-PA 63784/1976 hergestellt werden können, d.h. durch Umsetzung einer Aminosäure
A-CH(CH₂).X.COOH (A = eine geschützte Aminogruppe; X = eine Isopropyl- oder Benzylthiogruppe) mit p-substituiertem Anilin in Gegenwart eines Aktivators, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, oder
durch Umsetzung eines reaktiven Derivats dieser Aminosäure mit
p-substituiertem Anilin,und anschließendes Entfernen der Amlnoschutzgruppe nach in der Amidsynthese üblichen Methoden.
Das vorstehend unter Ziffer 11 genannte Aminderivat
ist eine neue Substanz, die nach dem in der Japanischen Patentanmeldung 63785/1976 beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann. Bei diesem Verfahren wird eine Aminosäure A-CH(R)COOH (R = die
Seitenkette einer basischen α-L-Aminosäure oder einer aromatischen

709850/0953

α-L-Aminosäure) mit p-substituierten Anilin in Gegenwart eines Aktivierungsmittels umgesetzt oder man setzt ein reaktives Derivat dieser Aminosäure um. Anschließend wird die Schutzgruppe der Aminogruppe entfernt und die Acylierung zur Einführung der geeigneten Acylgruppe durchgeführt.

Gemäß einer praktisch besonders geeigneten Ausführungsform kann ein weit stabileres Eisenkomplex-Reagenz hergestellt v/erden, indem der Eisenkomplex mit einem Alkalimetallhydrogencarbonat, wie Natriumhydrogencarbonat, Lithiumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, und einem niedermolekularen Dextran vermischt wird. Der Eisenkomplex eines solchen Reagenzgemisches wird durch Gefriertrocknung äußerst stabil und es wird daher bevorzugt, das Gemisch in die Form einer gefriergetrockneten Zubereitung zu bringen, nachdem es als Reagenz für die Färbungsreaktion zubereitet worden ist.

Auch in den Fällen, in denen die beschriebene Farbreaktion zur Bestimmung einer Enzymaktivität in Serum angewendet werden soll, kann die Farbentwicklung in der vorstehend erläuterten, bekanntermaßen angewendeten alkalischen Lösung, wie sie in der vorstehend genannten Literatur beschrieben ist, durch Verunreinigungen des Serums wesentlich beeinflußt werden und daher wird es schwierig, einen linearen Zusammenhang zwischen der Menge des zu bestimmenden Amins und der gemessenen Absorption zu erreichen, wodurch äußerst nachteilige Wirkungen bei der Bestimmung der Enzymaktivität verursacht werden. Um diesen Nachteil zu beseitigen, ist es wünschenswert, bei der Farbentwicklung einen schwach sauren Puffer einzusetzen. Der pH-Wert des zu verwendenden Puffers beträgt 3,0 bis 7,0, wobei der bevorzugteste pH-Wert 4,0 bis 5,5 beträgt. Was die Art des Puffers betrifft, können alle üblicherweise verwendeten schwach sauren Puffer eingesetzt werden, am stärksten bevorzugt wird jedoch ein Puffer, der Milchsäure, Zitronensäure, Oxalsäure oder dergleichen enthält.Die Konzentration des Puffers ist 0,01 bis 1 molar, vorzugsweise 0,05 bis 0,4 molar.

B«ei der Bestimmung der Enzymaktivität nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die aromatischen Aminderivate ausgewählt und als Substrat für die einzelnen Enzyme angewendet, welche spezifisch

709850/0953

- IC

auf die speziell ausgewählten Arainderivate einwirken. So wird beispielsweise zur Bestimmung von γ-GTPase ein γ-L-Glutamylderivat angewendet, zur Bestimmung von CAPase ein S-Benzyl-L-cysteinylderivat und zur Bestimmung von LAPase wird ein L-Leucyl· derivat angev/endet. Nachdem die enzymatische Reaktion zwischen dem Jeweils gewählten Substrat und dem Serum 30 Minuten lang durchgeführt worden ist, wird das auf diese Weise freigesetzte aromatische Amin durch Färbentwicklung mit dem Reagenz bestimmt. Als aromatische Amine, die durch diese Reaktionen freigesetzt werden, lassen sich nachstehende Verbindungen nennen :

p-Anisidin

p-Aminodiphenylamin Valiamin-Blau B-Salz 8-Aminochinolin

N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin N,N-Diäthyl-p-phenylendiamin p-Aminophenol

H_xCO

H,CO-/ \-NH-/ V-NH₂

NH.

HO-

-NH.

709850/0953

Die Wellenlänge und Absorption, welche bei der Farbreaktion ier vorstehend angegebenen aromatischen Amine mit einem peroxidbehandelten Natriumpentacyanamminferrat gemessen wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

TABELLE__1
Farbreaktion verschiedener aromatischer Amine

Amine	p-Anisidin	_λ max (ran)	OD 660*
p-Aminodiphenylamin	695	0,51
Valiamin-Blau B-Salz	655	0,62
8-Aminochinolin	655	0,38
N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin	660	0,18
N,N-Diäthyl-p-phenylendiamin	700	0,58
p-Aminophenol	700	0,58
700	0,52

* Absorption der Färbung einer 0,2 mM Aminlösung.

Es ist somit ersichtlich, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Enzymaktivität im langwelligen Bereich bestimmt werden kann, ohne daß Störungen durch andere Substanzen eintreten.

Gemäß einer AusfUhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können praktische Farbentwicklungsvorgänge in der nachstehend ge zeigten Weise durchgeführt werden : 1 Volumteil des Farbreagenzes, das den Eisenkomplex enthält, wird in 50 Volumteilen einer 0,2 mo-

709850/0953

laren Pufferlösung (pH 4,5) mit 1,0 % Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zur Bildung einer die Reaktion unterbrechenden und farbbildenden Lösung gelöst und das 5-fache Volumen dieser Lösung wird zu einer Enzymreaktionslösung gegeben. Das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und danach kolorimetrisch bestimmt. Wenn die Enzymaktivität in Serum bestimmt werden soll, so wird gleichzeitig eine Blindprobe für das Reagenz gemessen, die der gleichen Behandlung zur Farbentwicklung unterworfen wird, wobei jedoch Wasser anstelle des Serums verwendet wird. Dann kann die Aktivität aus der Differenz der Absorption (ßOD) zwischen dem Meßwert bei Verwendung von Serum und dem Meßwert der Blindprobe bestimmt werden. Die Farbreaktionslösung ist blau bis bläulich grün gefärbt, d.h. in einer Farbe, die im langwelligen Bereich von nicht weniger als 600 na bestimmt wird. Bei diesem Verfahren ¹^iTd daher keinerlei Einfluß durch Pigmente im Serum beobachtet, noch wird die Färbung des Serums selbst gemessen. Selbst in Fällen, in denen mehrere Serumproben bestimmt werden, kann daher in zufriedenstellender Weise eine bloße Reagenz-Blindprobe unter Verwendung von Wasser verwendet werden. In der nachstehenden Tabelle 2 sind einige Beispiele für erfindungsgemäß gemessene Enzymaktivitäten angegeben.

709850/0953

TABELLE^

Enzymaktivitäten. gemessen unter Verwendung verschiedener aromatischer Aminderivate als Substrat (37⁰C)

Enzym Substrat Km	Y-GIu-NH-/ Vn( CH^)₂ Y-GIu-NH-/ \-N(C₂H₅)₂ Y-GIu-NH-/ Λ-ΟΗ Y-GIu-NH-/ ^-OCH₅	0,55 mM 0,83 0,75 0,75	V max
* 1 γ-GTPase	S-Bz-CyS-IiH-/ \-N(CH^)₂ S-Bz-Cys-HH-/ \-0H S-Bz-Cys-NH-/ \-CCH₅	0,35 0,42 1,07	1,00 ♦* 0,70 0,39 0,37
* 2 CAPase	Leu-NH-/ \-N(CH,)₂ ' ' ' Leu-NH-/ \-CH Leu-NH-/ VoCH₅	0,56 0,43 0,75	1,00 ** 1,57 0,29
* ¹ LAPase	Bz-Oiyr-NH-/ Vn(CH₃)₂	0,61	1,00 1,52 1,98**
Chyrao- trypoin	0.Ϊ8

709850/0953

* 1 : γ-GTPase und LAPase wurden in dem gleichen Serum gemessen,

das von einem Patienten mit einer Leberfunktionsstörung stammte.

* 2 : CAPase, bestimmt in dem gleichen Serum einer schwangeren

Frau.

** : Vmax angegeben auf der Basis, daß der mit dem Derivat von

^H2^N~\ y-N(CH₃)₂ erhaltene Wert 1,00 beträgt.

V /

*** : Vmax, angegeben als Anzahl der Mol des gespaltenen Substrats (nMol/min/mg Chymotrypsin).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der nachstehenden Beispiele ausführlicher erläutert. Die Erfindung ist Jedoch nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Zu einer Lösung von 2 g Natriumpentacyanamminferrat in 20 ml Wasser wurden 60 ml 0,3 %ige Wasserstoffperoxidlösung und dann 20 ml 10 %ige NatriumhydrogencarbonatlÖsung gegeben. Danach wurden 4 g niedermolekulares Dextran zugesetzt, um eine Vorrats-Farbreagenzlösung herzustellen. Eine die Reaktion unterbrechende Farbreagenzlösung wurde hergestellt, indem 1 ml der Farbreagenz-Vorratslösung mit 50 ml 0,2 m Milchsäurepuffer mit einem pH-Wert von 4,5 (mit einem Gehalt an 1 % Natriumchlorid) vermischt wurde.

Eine Substratlösung wurde durch Auflösen von 150 mg L-Glutaminsäure-Y-p-dimethylaminoanllid in einem Gemisch von 6 ml Methylcellosolve mit 4 ml 0,125 η Chlorwasserstoffsäure hergestellt.

Dann wurde eine Pufferlösung durch Lösen von 0,8 g Glycylglycin, 0,5 g Natriumchlorid und 0,5 g eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Tween 80 der Atlas Powder Co., USA) in 100 ml Wasser und Einstellen des pH-Werts mit 6 η Natriumhydroxid auf

709850/0953

8,3 hergestellt. Die Substratlösung wurde mit der Pufferlösung vermischt, um einen Substratpuffer zu erhalten.

In ein Reagenzglas wurde 1 ml des Substratpuffers gegeben und nach dem Erhitzen auf 37°C wurde 0,05 ml menschliches Serum zu-

o gesetzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37 C durchgeführt und dann wurden 5 ml der die Reaktion unterbrechenden Farbreagenzlösung zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde die Absorption bei 660 nm gemessen. Außerdem wurde eine weitere Probe als Blindprobe zubereitet und in gleicher Weise wie vorstehend behandelt, mit der Abänderung, daß 0,05 ml Wasser anstelle des menschlichen Serums zugesetzt wurde. Die Absorption wurde dann in gleicher Weise gemessen, wobei ein Blindwert erhalten würde. Dann wurde die Aktivität von γ-GTPase in dem menschlichen Serum aus der Differenz zwischen dem Meßwert und dem Blindwert bestimmt.

Beispiel 2

Eine Substratlösung wurde durch Auflösen von 100 mg S-Benzyl-L-cystein-p-hydroxyanilid in einem Gemisch von 3 ml Dioxan mit 2 al 0₉16 η Chlorwasserstoffsäure hergestellt. Dann wurde ein Substrat« puffer durch Vermischen von 100 ml eines 0,1 m Triäthanolamin-Zitronensäure-Puffers (pH 7,4), der 1,25 % Tween 80 enthielt, alt der Substratlösung, hergestellt.

In ein Reagenzglas wurde 1 ml des Substratpuffers gegeben und nach dem Erwärmen auf 37°C wurde 0,05 ml menschliches Serum zugesetzt. Die Reaktion erfolgte 30 Minuten bei 37°C und dann wurden 5 ml der in Beispiel 1 hergestellten die Reaktion unterbrechenden Farbreagenzlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Farbentwicklung durchzuführen. Dann wurde die Absorption bei 660 nm gemessen. Außerdem wurde eine weitere Probe als Blindprobe vorbereitet und in gleicher Weise wie vorstehend behandelt, mit der Abänderung, daß 0,05 ml Wasser anstelle des menschlichen Serums zugegeben wurde. Die Ab-

709850/0953

sorption wurde in gleicher Weise gemessen, wobei ein Blindwert erhalten wurde. Die CPAase-Aktivität in dem menschlichen Serum wurde dann aus der Differenz zwischen dem Meßwert und dem Blindwert bestimmt.

Beispiel 3

Eine Substratlösung wurde durch Lösen von 100 mg L-Leucin-p-hydroxyanilid in einem Gemisch aus 3 ml Methylcellosolve und 2 ml 0,25 η Chlorwasserstoffsäure hergestellt. Durch Vermischen von 100 ml eines 0,1 m Triäthanolamin-Chlorwasserstoffsäure-Puffers (pH 8,0), der 0,5 % Tween 80 enthielt, mit der Substratlösung wurde ein Substratpuffer erhalten.

In ein Reagenzglas wurde 1 ml des Substratpuffers gegeben und nach dem Erwärmen auf 37⁰C wurde 0,05 ml menschliches Serum zugefügt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37⁰C vorgenommen und dann wurden 5 ml der die Reaktion unterbrechenden Farbreagenzlösung, die gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Farbentwicklung durchzuführen. Dann wurde die Absorption bei 660 nm gemessen. Außerdem wurde eine weitere Probe als Blindprobe zubereitet und in gleicher Weise wie vorstehend behandelt, mit der Abänderung, daß 0,05 ml V/asser anstelle des menschlichen Serums zugesetzt wurde. Durch Messung der Absorption dieser Blindprobe in der vorstehend angegebenen Weise wurde ein Blindwert erhalten. Dann wurde die LAPase-Aktivität in dem menschlichen Serum aus der Differenz zwischen dem Meßwert und dem Blindwert bestimmt.

Beispiel 4

Eine Substratlösung wurde durch Lösen von 30 mg N-Benzyl-L-tyrosin-p-dimethylaminoanilid in 5 ml Aceton hergestellt. Dann wurde ein Substratpuffer hergestellt, indem 100 ml 0,1 m tris-Puffer-

709850/09B3

lösung (pH 7,8), die 5mM Calciumchlorid und 1 % Tween 80 enthielt, mit der Substratlösung vermischt wurden.

In ein Reagenzglas wurde 1 ml des Substratpuffers gegeben und nach dem Erwärmen auf 37⁰C wurde 0,05 ml einer Chymotrypsin enthaltenden Lösung zugefügt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37°C vorgenommen und danach wurden 5 ml der die Reaktion unterbrechenden Farbreagenzlösung, die gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde die Absorption bei 660 nm gemessen. Außerdem wurde eine weitere Probe als Blindprobe zubereitet und in gleicher Weise wie vorstehend behandelt, mit der Abänderung, daß anstelle der Chymotrypsin enthaltenden Lösung 0,05 ml Wasser zugesetzt wurde. Die Absorption wurde in gleicher Weise gemessen, wobei ein Blindwert erhalten wurde. Dann wurde die Chymotrypsinaktivität aus der Differenz zwischen dem Meßwert und dem Blindwert bestimmt.

7O985&/O951

Claims

PATENTANWÄLTE SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHUBIfL-HOF1F EBBINGHAUS FINCK MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN SO POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O1 D-8OOO MÖNCHEN 95 KARL LUDWIG SCHIFF DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER DIPL. INQ. PETER STREHL DIPL. Ch17M. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF DIPL. ING. DIETüR EBBINGHAUS DR. ING. DIETER FINCK TELiFON (Οββ) 48 2Ο6« TELEX E-23 665 AlIRO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN 27. Mai 1977 SANKYO CO., LTD. DA-13 043 Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Enzymaktivität PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität in einer Substanz mit enzymatischer Aktivität durch Behandlung eines Substrats für das Enzym mit der enzymhaltigen Substanz und Bestimmung des Reaktionsprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat ein Derivat eines primären aromatischen Amins verwendet und das gebildete Reaktionsprodukt mit Hilfe eines Farbreagenz bestimmt, das aus einem mit einem Peroxid behandelten Eisenkomplex besteht.

709850/0983

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität einer Peptidase oder Transpeptidase bestimmt und als Derivat des aromatischen primären Amins ein Säurearaid verwendet, dessen Säurekomponente unter der Einwirkung der betreffenden Peptidase abgespalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 pder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Derivat des aromatischen primären Amins eine der folgenden Verbindungen verwendet :

L-Glutaminsäure-y-p-dimethylaminoanilid, L-Glutarains äure-γ-p-di äthylaminoanilid, L-Glutarainsaure-y-p-methoxyanilid,

L-Glutaminsäure-y-p-hydroxyanilid,

S-Benzyl-L-cystein-p-dimethylaminoanilid, S-Benzyl-L-cystein-p-hydroxyanilid,

S-Benzyl-L-cystein-p-methoxyanilid,

L-Leucin-p-dimethylaminoanilid,

L-Leucin-p-hydroxyanilid,

L-Leucin-p-inethoxyanilid oder

N-Benzyl-L-tyrosin-p-dimethylaminoanilid.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Eisenkomplex Natriumpentacyanamminferrat oder Kaliumpentacyanamminferrat verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e -

709850/0953

kennzeichnet , daß man als Peroxid Natriumperjodat, Kaliumperjodat, Kaliumpermanganat oder Wasserstoffperoxid ve *- wendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man eines der in Anspruch 3 angegebenen Aminderivate in Kombination mit einem mit Wasserstoffperoxid behandelten Natriumpentacyanamminferrat verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man den Eisenkomplex mit einem Alkalimetallhydrogencarbonat und niedermolekularem Dextran vermischt.

Θ. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eisenkomplex eine gefriergetrocknete Zubereitung, die außerdem mit Natriumhydrogencarbonat und einem niedermolekularen Dextran vermischt ist, verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als Substanz mit Enzymaktivität menschliches Serum verwendet und die Bestimmung der Enzymaktivität in Gegenwart eines schwach sauren Puffers mit einem pH-Wert von 3,0 bis 7,0 durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eines der angegebenen aromatischen primären Amin-

27?A212

derivate verwendet und als Eisenkomplex eine gefriergetrocknete Zubereitung von Natriumpentacyanamminferrat,das mit Wasserstoffperoxid behandelt worden ist, im Gemisch mit Natriumhydrogencarbonat und niedermolekularem Dextran verwendet.

11. Mittel zur Bestimmung der Enzymaktivität in einer Substanz, vorzugsweise einer Körperflüssigkeit, mit enzymatischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet , daß es (a) ein aromatisches primäres Aminderivat als Substrat, (b) eine gefriergetrocknete Zubereitung aus einem Gemisch aus einem mit einem Peroxid behandelten Eisenkomplex, einem Alkalimetallhydrogencarbonat und niedermolekularem Dextran, (c) einen schwach sauren Puffer mit einem pH-Y/ert von 3,0 bis 7,0 und (d) einen der Substanz, deren Enzymaktivität bestimmt werden soll, angepaßten Puffer enthält.

709850/09S3