DE2721829A1 - Verfahren zur herstellung eines hydrophilen komplexen gels zur immobilisierung mikrobieller zellen - Google Patents

Description

25

" Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen komplexen Gels zur Immobilisierung mikrobieller Zellen "

Priorität: 14. Mai 1976, Japan, Nr. 55 925/76 27. Mai 1976, Japan, Nr. 62 041/76 10. Februar 1977, Japan, Nr. 13 650/77

Enzyme sind biologische Katalysatoren und weisen eine außergewöhnlich hohe Wirksamkeit sowie spezifische Eigenschaften auf. Sie können zur Katalysierung einer Vielzahl von chemischen Reaktionen eingesetzt werden. Derartige enzymatische Reaktionen erfolgen unter _^ ^eren Bedingungen als übliche chemische Reaktionen und führen nicht zur Bildung schädlicher Verbindungen. In diesem Zusammenhang wurde neuerdings der durch die chemische Industrie verursachten Umweltverschmutzung besondere Aufmerksamkeit geschenkt.

Für die chemische Industrie ist es sehr vorteilhaft, Enzyme zu verwenden. Der industrielle Einsatz von Enzymen oder Mikroorganismen erfolgte durch Verwendung löslicher Enzym-

709846/1153

-r-

Zubereitungen oder Mikroorganismen. Jedoch können derartige Biokatalysatoren nur für einen einzigen Reaktions- oder Fermentationsansatz verwendet werden. Wenn es dagegen möglich ist, Enzyme und Mikroorganismen zu stabilisieren und

nach einem billigen Verfahren ohne Aktivitätsverlust wiederzugewinnen, können Biokatalysatoren in der Industrie in erheblich größerem Umfang angewandt werden.

In diesem Zusammenhang bietet sich die Immobilisierung von Biokatalysatoren an. Immobilisierte Enzyme werden immer mehr auf dem Gebiet der Technologie als auch der Medizin und Analytik verwendet. Die meisten Untersuchungen zur Immobilisierung betrafen zellfreie Enzyme, jedoch wandte man sich in den vergangenen Jahren in zunehmendem Maß der Verwendung immobilisierter ganzer mikrobieller Zellen zu. Die letztgenannten Systeme vermeiden eine vor der Immobilisierung erforderliche Isolierung der Zellen sowie Extraktion und Reinigung des Enzyms. Immobilisierte Zellen sind im weiterem Umfang zur Katalyse von Folgereaktionen einsetzbar und ermögliehen eine Regenerierung in situ der nötigen Cofaktoren. Wenn es möglich ist, ein Mehrfach-Enzymsystem im immobilisierten Zustand kontinuierlich zu verwenden, kann das bisher übliche Fermentationsverfahren durch ein anderes unter Verwendung von immobilisierten Zellen ersetzt werden. 25

Die Nachteile eines Verfahrens mit immobilisierten Zellen liegen in den Kosten für die Matrix und im Verlust der katalytischen Aktivität oder in der Schwierigkeit, die Zellen

während der Immobilisierung vollständig zu erhalten. Die meisten mikrobiellen Zellen und Enzyme sind so instabil, daß sie durch die Immobilisierung einen Verlust oder Veränderungen in ihren enzymatischen Aktivitäten erleiden. Es ist sehr schwierig, ein praxisgerechtes Verfahren zur Immobilisierung ohne die vorgenannten Nachteile zu erarbeiten. Deshalb wurden bisher nur wenige leicht und in größerem Umfang einsetzbare Verfahren zur Immobilisierung entwickelt.

Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen werden vier Arten von Verfahren unterschieden:
Verfahren unter Verwendung eines Trägers; Verfahren, bei dem eine Vernetzung bewirkt wird; Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt; Verfahren, bei dem ein Einschluß in Mikrokapseln erreicht wird.

Das Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt, wobei mikrobielle Zellen in der Gelmatrix immobilisiert werden, wird in der Praxis vielfach angewandt'. Jedoch hat dieses bekannte Verfahren eine Reihe von Nachteilen. Bei der Bildung des Gels unter Einschluß mikrobieller Zellen nehmen deren enzymatische Aktivitäten wegen des häufigen Einflußes von Faktoren der Umgebung, wie der Temperatur, des pH-Wertes, der Ionenstärke und des Drucks, deutlich ab. Deshalb besteht ein großes Bedürfnis nach einem neuen Verfahren der Gelbildung, bei dem die Stabilität der Enzyme nicht beeinträchtigt wird. Unter diesem Gesichtspunkt wurden viele Untersuchungen zur Vernetzung und Gelbildung unter Verwendung verschiedener Po-

L 709846/1151

lymerisate durchgeführt. Physikalische Verfahren zur Bildung von Gelen von Polymerisaten, beispielsweise durch Erniedrigen der Temperatur oder Zugabe von Salzen oder nicht-wäßrigen Lösungsmitteln, haben nicht befriedigt, da es im allgemeinen schwierig ist, durch diese reversiblen Reaktionen stabile Gele zu erhalten.

Beispielsweise ist in der JA-PS 50-52276 beschrieben, daß Enzyme in einer Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol eingeschlossen werden können, wobei Enzyme und Polyvinylalkohol in Wasser gelöst, bei vorzugsweise -25 bis -80⁰C verfestigt und bei Raumtemperatur geschmolzen werden, um das die Enzyme einschließende Gel zu bilden. Aber die derart hergestellten Gele werden instabil bei vergleichsweise hohen Temperaturen, wie 60 oder 70⁰C, was dem Reaktionstemperaturbereich von Glucoseisomerase entspricht. Auch die chemischen Verfahren zur Herstellung einer Gelmatrix durch vernetzende Verbindungen verlaufen unter zu harten Bedingungen, so daß sie für die Verwendung biologischer Substanzen nicht geeignet sind. Dies rührt von der hohen Reaktivität der vernetzenden Verbindungen und der hohen Temperatur sowie dem extrem hohen oder niederen pH-Wert bei der Gelbildungsreaktion her. Wird beispielsweise das Geleinschluß-Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamid angewandt, so wird das Monomere Acrylamid mit N,N¹-Methylenbisacrylamid in Anwesenheit eines Katalysators, wie Ammoniumpersulfat, polymerisiert. In diesem Fall wird das Enzym oft durch den hochreaktiven Katalysator desaktiviert. Deshalb müssen der pH-Wert und die Tem-

L .

709846/115Ί -¹

peratur für die Gelbildungsreaktion sorgfältig gewählt werden, um die enzymatischen Aktivitäten zu erhalten (vgl. Biotech. & Bioeng., Bd. 15 (1973), S. 93). DarUberhinaus dürfen die erhaltenen Gele nicht im Bereich der pharmazeutisehen Industrie oder der Lebensmittelindustrie verwendet wer den, da sie noch toxisch wirkendes monomeres Acrylamid enthalten können. In der JA-PS 50-53583 ist beschrieben, daß Enzyme in eine Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol eingeschlossen werden können, wobei Enzyme und der Polyvinylalkohol in Wasser gelöst werden und die erhaltene Lösung mit Borsäure oder Natriumborat gemischt wird, um den gewünschten Geleinschluß der Enzyme zu erhalten. In der Patentschrift wird weiterhin berichtet, daß Enzyme ohne deutliche Denaturierung bei Geltemperaturen unterhalb 45⁰C immobilisiert werden können. Da jedoch die Gele nur in einem alkalischen System gebildet werden, kann dieses Verfahren nur auf im alkalischen Medium stabile Enzyme angewandt werden. Auch muß hierbei die Toxizität von Borsäure berücksichtigt werden. Andere Verfahren unter Anwendung von Vernetzungsreaktionen, wobei energiereiche Strah-Lwüt, wie y-, Elektronen- oder Röntgenstrahlung angewandt wird, sind in der Praxis schwierig durchzuführen, da ein großer apparativer Aufwand erforderlich ist und besondere Vorsicht darauf zu richten ist, die mit energiereichen Strahlen verbundenen physiologischen Wirkungen zu verhindern (vgl. Biotech. & Bioeng., Bd. 15 (1973), S. 607).

709846/1153

Die nach bekannten Geleinschluß-Verfahren erhaltenen immobilisierten Enzyme oder Mikroorganismen sind physikalisch schwach und weisen im nassen Zustand eine besonders niedrige mechanische Festigkeit auf. Deshalb ist es auch schwierig, derartige Gele in kontinuierlichen Umsetzungen über einen längeren Zeitraum zu verwenden. Wird eine Säule mit diesen Gelen für eine kontinuierliche Umsetzung beschickt, so werden sie durch den Wasserdruck zerstört, und es kann keine zufriedenstellende Durchflußleistung für das Reaktionsgemisch erreicht werden.

Weitere Ausführungen auf dem einschlägigen Gebiet sind in Advance in Enzymology, Bd. 3¹* (1971), S. 445, veröffentlicht.

Aus dem vorgenannten Stand der Technik ergab sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines Gels zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit enzymatischer Aktivität zur Verfügung zu stellen, wobei sehr milde Bedingungen angewandt werden und damit die Aktivität der mikrobiellen Zellen nicht

20 beeinträchtigt wird.

Hierzu wurde die Bildung homogener komplexer Gele aus Siliciumdioxid und verschiedenen Arten organischer Verbindungen untersucht, da Siliciumdioxid sowohl gegenüber Bio-Organismen harmlos ist als auch billig zur Verfügung steht. Werden ein Siliciuradioxid-Sol und ein Siliciumdioxid-Gel, die in üblicher V/eise hergestellt worden sind, unter verschiedenen Bedingungen mit in V/asser löslichen Polymerisaten

gemischt, so zeigt sich, daß weder ein viel Wasser enthaltendes homogenes komplexes Lyogel oder homogenes transparentes komplexes Lyogel noch ein transparentes komplexes Xerogel erhalten werden kann, obwohl hierbei Polymerisate mit sehr unterschiedlicher Struktur eingesetzt wurden. Wird beispielsweise ein Siliciumdioxid-Sol zu einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (nachfolgend PVA genannt) gegeben, so wird eine Trennung in zwei Schichten beobachtet (5 bis 20 # Siliciumdioxid, 1 bis 5 J* PVA). Oberhalb einem pH-Wert von 5 wird das Gemisch vollständig in zwei Schichten getrennt, wobei die eine das Siliciumdioxid, die andere den PVA enthält. Unterhalb des genannten pH-Wertes ist das Siliciumdioxid in der PVA-Schicht dispergiert und bildet Flocken. Bei keinem pH-Wert wird das gewünschte homogene transparente Sol oder Gel gebildet. Auch kann mit anorganischen Silicaten, wie Wasserglas,keine homogene Lösung mit PVA durch saure Hydrolyse erreicht werden, so daß auch auf diesem Wege das gewünschte homogene transparente komplexe Gel nicht erhalten werden kann.

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die vorgenannte Aufgabe gelöst werden kann, wenn das Verfahren angewandt wird, das in den Ansprüchen gekennzeichnet ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß man ein Tetraalkoxysilan, wie Tetraäthoxysilan, in einer wäßrigen Lösung eines Polymerisats, wie eines Polyvinylalkohole, einer Gelatine, einer Carboxymethylcellulose, einer Stärke

_L oder von Natriumalginat. s^ueg hydrolysiert, wobei sich

ein homogenes komplexes Sol bildet. Dieses wird durch Trocknen in ein in Wasser unlösliches Xerogel überführt. Es wurde weiterhin festgestellt, daß mikrobielle Zellen mit enzymatischer Aktivität durch Einschließen in eine Gelmatrix immobilisiert werden können, ohne die enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen, weil das vorgenannte komplexe Sol unter ganz milden Bedingungen in ein Gel überführt wird.

Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß ein hydrophiles Gel hergestellt werden kann, das in Wasser unlöslich ist, billig hergestellt werden kann und eine hervorragende Verträglichkeit und Affinität gegenüber biologischen Substanzen aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung einer hydrophilen Gelmatrix, die sich gut zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit enzymatischer Aktivität verwenden läßt. Die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisierten mikrobiellen Zellen weisen mehr als 50 % der enzymatischen Aktivität der unbehandelten mikrobieilen Zellen auf. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten mikrobiellen Zellen können sowohl in einem kontinuierlichen Verfahren in einem Säulenreaktor oder in einem unter Rühren durchgeführten Verfahren in einzelnen Chargen eingesetzt werden.

in der Zeichnung ist die Beziehung zwischen dem Umsatz von D-Glucose in D-Fructose und der Anzahl der Verwendungen der Enzymzubereitung angegeben. Die Kurve 1 zeigt die mit immobilisierten Zellen erhaltenen Ergebnisse, Kurve 2 die mit

^L 709846/115? ^J

¹ unbehandelten Zellen erhaltenen Werte.

Erfindungsgemäß wird ein hydrophiles komplexes Gel dadurch hergestellt, daß man aus einem wasserlöslichen Polymerisat und einem Tetraalkoxysilan ein homogenes Sol herstellt, das nachfolgend unter milden Bedingungen in ein Gel überführt wird. Das Tetraalkoxysilan wird in der wäßrigen Lösung des Polymerisats sauer hydrolysiert und bildet dabei ein homogenes Sol. In das so erhaltene Sol werden mikrobielle Zellen mit enzymatischer Aktivität gegeben. Das Gemisch wird dann unter Einstellen des pH-Werts in ein Gel überführt, das in Form eines komplexen Lyogels vorliegt, oder das Gemisch wird nach dem Einstellen des pH-Werts getrocknet, wobei ein in Wasser unlösliches Xerogel erhalten wird. Im Lyogel und im Xerogel liegt die enzymatische Aktivität unverändert vor.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, in Wasser löslichen Polymerisate weisen viele polare Gruppen auf, wie Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino- und Iminogruppen, die mit sau-

ren Hydroxylgruppen von Silikaten starke Wasserstoffbindungen bilden und eine Dehydratation bewirken. Spezielle Beispiele für einsetzbare wasserlösliche Polymerisate sind in nachfolgender Tabelle I angegeben.

^L 709846/1151

1 Tabelle I

(A) Natürliche Polymerisate und deren Derivate:

1. Cellulose, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose,

Äthylcellulose, Hydroxyäthylcellulose. 5 2. Stärke, Hydroxyäthylstärke, Carboxymethylstärke.

3· Andere Polysaccharide, wie Mannen, Dextran, Chitosan, Pullulan, Guar-Mehl, Kernmehl (locust bean gum), Tragant, Xanthan-Mehl, Agar, Natriumarginat, A. Proteine, Gelatine, Albumin.
(B) Synthetische Polymerisate:

Polyvinylalkohol, Polyäthylenglykol, Polyäthylenimin«

Als wasserlösliches Polymerisat werden ein Polyvinylalkohol mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 500 bis 2000 und einem Verseifungsgrad von 70 bis 100 %, eine handelsübliche eßbare Gelatine mit einer Gallertfestigkeit von mehr als 200 g shot/5 Sekunden im Bloom Gerometer oder eine handelsübliche eßbare Carboxymethylcellulose mit einem Carboxylierungsgrad von 0,4 bis 0,8 und einem Natriumgehalt von 7,0

20 bis 8,5 % bevorzugt.

Das in Wasser lösliche Polymerisat wird unter kräftigem Rühren in Wasser bis zu einer Konzentration aufgelöst, bei der die Viskosität der Lösung weniger als 10 000 cP, vorzugsweise weniger als 3000 cP, beträgt. Die vorgenannten Viskositäten werden mit einem Rotor Nr. 3 auf einem B-Viskosimeter bei einer Temperatur von 40⁰C geraessen.

^L 709846/1151

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Tetraalkoxysilane weisen die allgemeine Formel Si(OR)^ auf, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Octyl- und Laurylgruppe, bedeutet. Vorzugsweise stellt R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen dar. Tetraäthoxysilan ist besonders bevorzugt.

Das in Wasser lösliche Polymerisat wird mit dem vorgenannten Tetraalkoxysilan gemischt. Anschließend wird der pH-Wert des Gemisches mit einer sauren Verbindung, die auch ein saures Salz darstellen kann und die enzymatischen Aktivitäten der mikrobiellen Zellen nicht beeinträchtigt, auf einen Wert von unter 3 eingestellt. Spezielle Beispiele für die saure ¹^ Verbindung sind in nachfolgender Tabelle II angegeben.

Tabelle II
(A) Anorganische Säuren: HCl, HNO^, H₃PO^, H₂SO^.

(B) Organische Säuren: Essig-, Glutamin-, Milch-, Malein-, Bernstein-, Ascorbin-, Citronen-, Weinsäure.

(C) Anorganische oder organische saure Salze: AlCl,,

Monoammoniumcitrat. 25

Die erforderliche Menge an Tetraalkoxysilan hängt von dessen Art und den Eigenschaften des wasserlöslichen Polymerisats ab. Die Menge an Siliciumdioxid (das durch saure Hydrolyse

^L 709646/ 1151 ^J

gebildete Siliciumdioxid) im Tetraalkoxysilan soll 5 bis 300 Gewichtsprozent, vorzugsweise 50 bis 200 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des wasserlöslichen Polymerisats, betragen. Liegt die genannte Menge an Siliciumdioxid unter 5 %, nimmt die Löslichkeit des gebildeten Gels in Wasser deutlich zu, während bei einer entsprechenden Menge an Siliciumdioxid von über 300 % das Gel brüchig wird. Die Eigenschaften des Gels hängen vom Gehalt an Siliciumdioxid im Tetraalkoxysilan und/oder der chemischen Struktur des im Wasser löslichen Polymerisats ab. Beispielsweise kann ein PYA mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 500 bis 2000 und einem Verseifungsgrad von 70 bis 100 % verwendet werden, jedoch beträgt im Falle eines vollständig verseiften PVA die Menge an Siliciumdioxid vorzugsweise mehr als 20 %, insbesondere mehr als 50 %, jeweils bezogen wie vorstehend angegeben. Dagegen wird eine geringere Menge an Siliciumdioxid verwendet, wenn ein PVA mit einem niedrigeren Verseifungsgrad eingesetzt wird.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens trennt sich das Gemisch aus dem in Wasser löslichen Polymerisat und dem Tetraalkoxysilan wegen ihrer Unverträglichkeit in zwei Schichten. Nach dem Einstellen des pH-Werts unter 3 durch Zugabe einer sauren Verbindung wird das Gemisch bei Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Erhitzen bis unter 80⁰C, gut gerührt, um die Hydrolyse zu vervollständigen. Je niedriger der pH-Wert und je höher die Temperatur ist, desto schneller verläuft die Hydrolyse; jedoch werden die Reaktionsbedingungen

entsprechend der Art des gewünschten Gels gewählt. Die wäßrige Lösung des PVA und das Tetraäthoxysilan werden in einem solchen Verhältnis gemischt, daß die Menge an Siliciumdioxid im Tetraäthoxysilan 100 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des PVA^ beträgt. Das Gemisch wird bei einem pH-Wert von 3 und bei Raumtemperatur in 2 Stunden vollständig hydrolysiert, wobei ein farbloses transparentes homogenes komplexes Sol erhalten wird. Die Vervollständigung der Hydrolyse kann dadurch bestimmt werden, daß die Phasengrenze zwisehen den beiden sich gebildeten Schichten verschwindet und eine homogene und transparente Lösung erhalten wird. Dabei ändert sich der zunächst spezifische Geruch des Tetraalkoxysilans in einen alkoholischen Geruch.

Das gebildete Sol kann unterhalb der Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum erhalten werden. Die Eigenschaften des Sols ändern sich nicht, wenn es bei einer Temperatur von 5° C 1 Monat gelagert wird.

Als Komponente des komplexen Sols können verschiedene Arten von in Wasser löslichen Polymerisaten verwendet werden. Das komplexe Sol kann durch Einstellen des pH-Werts oder durch Trocknen leicht in ein Gel überführt werden. Die unter verschiedenen Bedingungen aus dem gleichen in Wasser löslichen Polymerisat erhaltenen komplexen Gele weisen verschiedene Grade an Trübung auf. Beispielsweise wird ein komplexes Sol aus Gelatine und letraäthoxysilan bei einem pH-Wert von unter 4 in ein transparentes Gel überführt. Das Gel mit der

' 0 9.ι fi £ B / 11 5 * ^J

1 stärksten Trübung wird bei einem pH-Wert von 5 erhalten,

während bei einem pH-Wert von über 7 das Gel semitransparent wird.

Die gebildeten komplexen Gele werden üblicherweise in "Lyogele", die viel Wasser enthalten, und "Xerogele", welche wenig Wasser enthalten, eingeteilt. Bei den letzteren ist die Feuchtigkeit des Gels fast vollständig durch Trocknung beseitigt worden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren trennen sich die Komponenten des gebildeten Sols nicht sondern erhalten den homogenen komplexen Zustand während der Verfahrensschritte Solbildung —i Gelbildung —$ Xerogelbildung. Die hergestellten Xerogele sind in Wasser unlöslich oder schwer löslich, weisen jedoch hydrophile Eigenschaften auf.

Wie auch aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich ist, hängen die Eigenschaften der gebildeten Xerogele von der Art des in Wasser löslichen Polymerisats und vom Verhältnis an Siliciumdioxid zum Polymerisat ab. Im allgemeinen nimmt mit zunehmender Menge an Siliciumdioxid die Löslichkeit des Gels in Wasser ab und es steigen Härte und BrUchigkeit. Umgekehrt wird das Gel flexibler mit zunehmender Menge an im Wasser löslichen Polymerisat. Was dessen Einfluß betrifft, beispielsweise im Fall des PVA, so hängen die Eigenschaften des Xerogels vom Verseifungsgrad des PVA ab. Wird ein vollständig verseifter PVA verwendet, beträgt die kleinste erforderliche Menge an Siliciumdioxid 50 ϊί, bezogen auf den PVA. Wird aber ein ähnliches Xerogel unter Verwendung eines

^L -^? 0 9 fU ß / 1 1 5 '■■ ^J

teilweise verseiften PVA (Verseifungsgrad 87 %) hergestellt, so ist die erforderliche Menge an Siliciumdioxid geringer, muß aber noch über 20 % liegen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können mikrobielle Zellen mit enzymetisehen Aktivitäten unter ganz milden Bedingungen dadurch immobilisiert werden, daß sie in eine Matrix aus einem der vorgenannten komplexen Gele eingeschlossen werden. Die mikrobiellen Zellen werden dem vorgenannten homogenen Sol entweder ohne Einstellen des pH-Werts oder unter Verwendung basischer Verbindungen, die auch in Form eines Salzes vorliegen können, zugegeben. Spezielle Beispiele für geeignete basische Verbindungen sind in nachfolgender Tabelle III angegeben.

Tabelle III

(A) Basen: NaOH, KOH, Ca(OH)₂, NH₄OH.

(B) Basische Salze: Na₂CO₃, CH₃COONa, NaHCO₃, K₂CO₃,

K₂HPO₄, Na₂HPO₄, CH₃COOK. 20

Die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren mikrobiellen Zellen sind getrocknete Zellen oder nasse Zellen, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus einer Brühe geerntet worden sind. Es kann auch die Kulturbrühe selbst verwendet v/erden. Diese mikrobiellen Zellen werden in fünf Gruppen unterteilt, nämlich in Bakterien, Actinomyceten, Fungi, Hefe und Algen. Spezielle Beispiele für entsprechende Bakterien, die taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören,

l_ sind die GattungenQ^^^domo^na|,^ Acetobacter, Gluconobacter, j

1 Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Leuconostoc,

Streptococcus, Clostridium, Brevibacterium, Arthrobacter und Erwinia.

Spezielle Beispiele für entsprechende Actinomyceten, die taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören, sind die Gattungen Streptomyces, Nocardia und Mycobacterium (vgl. R.E. Buchran und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage (1974).

Spezielle Beispiele für entsprechende Fungi, die taxonomisch zur Klasse der Phycomyceten, Ascomyceten, Fungi imperfect!, und Bacidiomyceten gehören, zählen beispielsweise zu den Gattungen Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Monascus und Neurosporium (vgl. J.A. von Arx, "The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture" und H. L. Barnett & Barry B. Hunter, "Illustrated Genera of Imperfect Fungi", 3. Auflage (1970)).

Spezielle Beispiele für Hefen, die taxonomisch zur Klasse der Ascomyceten gehören, sind beispielsweise die Gattungen Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Rhodotorula und Kloechera (vgl. J. Lodder, "The

Yeast-A taxonomic study", 2. Auflage (1970)). 25

Spezielle Beispiele für Algen gehören zur Gattung der Einzeller Chlorella und Scedesnus in Grünalgen und Spirulina in Blaugrünalgen (H. Tamiya, "Studies on Microalgae and Photo-

^L 709846/11S?

1 synthetic Bacteria" (1963)).

Die meisten dieser mikrobiellen Zellen sind als Einzeller gewachsene Organismen. Die Zellengrößen der vorgenannten Mikroorganismen sind verschieden, jedoch beträgt der Durchmesser oder die Breite der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen 1 bis 20 u. Die mikrobiellen Zellen können in wasserhaltigen Lösungsmitteln dispergiert werden. Einige Arten der Actinomyceten und der Fungi weisen eine Länge von mehr als 20 u auf. Größere mikrobielle Zellen mit einer durchschnittlichen Länge von 50 bis 100 μ und/oder mikrobielle Zellen mit kugelförmiger Gestalt können in eine erfindungsgemäß hergestellte Gelmatrix auch eingeschlossen werden, jedoch ist dann die Menge der eingeschlossenen ZeI-len geringer. Deshalb werden derartige mikrobielle Zellen vorzugsweise auf eine Größe von unter 20 ^u zerkleinert. Dies geschieht beispielsweise durch mechanische Homogenisierung in Wasser. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten mikrobiellen Zellen der vorgenannten fünf Gruppen weisen mehr als eine enzyraatische Aktivität auf. Die Enzyme werden in fünf Gruppen unterteilt, wie aus nachfolgender Tabelle IV ersichtlich ist.

Tabelle IV

(A) Oxidoreductasen: Glucoseoxidase, Nitritreductase,

Catalast, Phenoloxidase, Monoaminoxidase, Ijtochromreductase.
(B) Transferasen: Glutamatoxaloacetattransaminase,

16-gliedrige Macrolid-3-acyltransferase,

ATB: Nucleosid-5'-monophosphat-pyrophosphotrans-

ferase.

(C) Hydrolasen: Protease, Glucoamylase, α-Amyläse,

Isoamylase, Lipase, Lactase, Penicilllnamidase, alkalische Phosphatase, Aminoacylase, Urease, Cellulase.

(D) Isomerasen: Glucoseisomerase, Alaninracemase.

(E) Lyasen: ß-Tyrosinase, Histidindecarboxylase, Tryptophanase.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme sind intrazellulare Enzyme, die im Inneren von mikrobiellen Zellen, von Mycel oder von Organellen der Bioorganisraen vor-

20 liegen. Unter dem Ausdruck "Aktivität¹¹ ist in diesem Zusammenhang nicht nur enzymatische Aktivität zu verstehen, sondern es werden damit auch andere biologische Aktivitäten, wie Aktivitäten von Inhibitoren, Coenzymen, Antibiotika, Antigenen und Antikörpern , umfaßt.

Der pH-Wert des Gr.uisches aus dem komplexen Gel und den mikrobiellen Zellen soll unter Berücksichtigung der Enzymstabilität oder der Eigenschaften des gebildeten Gels ge-

^L 709846/115? _i

wählt werden, üblicherweise wird der pH-Wert auf 4 bis 8, vorzugsweise 5 bis 7, eingestellt. Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen ist die Einstellung des pH-Wertes in den meisten Fällen nicht erforderlich, da diese Zellen im allgemeinen selbst eine Pufferwirkung aufweisen. Im allgemeinen stellt sich der pH-Wert des vorgenannten Gemisches nach der Zugabe der Zellen auf 5 bis 6,5 ein.

Das Trockengewicht der zuzugebenden mikrobiellen Zellen beträgt weniger als 1000 Gewichtsprozent, vorzugsweise 20 bis 500 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des homogenen komplexen Sols. Nach der Zugabe der mikrobiellen Zellen zum homogenen komplexen Sol wird das Gemisch gut gerührt, um die Zellen homogen zu dispergieren. Die Uberführung des Sols, das die mikrobiellen Zellen enthält, in ein Gel findet bei irgendeiner Temperatur statt. Da jedoch die Enzyme bei höheren Temperaturen instabil sind wird die Gelbildung bei Temperaturen von 0 bis 70⁰C, vorzugsweise 10 bis 40°C, durchgeführt, und ist im allgemeinen in 10 bis

30 Minuten vollständig. Beispielsweise wird das Sol unter kontinuierlichem Rühren in 10 bis 20 Minuten bei einem pH-Wert von 6,0 und bei Raumtemperatur vollständig in ein Gel überführt.

Einer der wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Anwendung milder Bedingungen bei der Immobilisierung der Zellen, wobei die enzymatischen Aktivitäten während des ganzen Verfahrens ohne deutliche Beein-

_L trächtigung erhalten bleiben. - j

709846/. 115 ~>

Das die mikrobiellen Zellen enthaltende komplexe Gel wird getrocknet und Ln die gewünschte Form überführt. Das Trocknen erfolgt bei Temperaturen unter 75°C. Im Fall der Immobilisierung von Hefezellen ist die Fermentationsaktivität vergleichsweise stabil, so daß das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann. Sollen jedoch instabile Bakterienzellen, beispielsweise Zellen, wie sie für die enzymatische Synthese von L-Tyrosin verwendet werden, immobilisiert werden, wird das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperaturen unter 5⁰C durchgeführt, um die enzymetischen Aktivitäten zu erhalten, wobei insbesondere die Trocknung des Gels vorzugsweise durch Gefriertrocknen erfolgt. Solange die Temperatur im vorgenannten Bereich gehalten wird, ist bei den eingesetzten Enzymen praktisch keine Verminderung der Aktivität zu beobachten. Die Überführung der vorgenannten, immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden Lyogele in verschiedene Formen kann in üblicher Weise erfolgen. Das Formen kann vor oder nach dem Trocknen stattfinden. Hierzu können hydrophile oder hydrophobe organische Lösungsmittel verwendet werden, in denen das komplexe Lyogel fast unlöslich ist. Spezielle Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind in nachfolgender Tabelle V angegeben.

709846/-1153

¹ Tabelle V

(A) Alkohole: Methylalkohol, Äthylalkohol, n-Propyl-

alkoho¹, * -T ;ylalkohol, Äthylenglykol,

Glycerin. ⁵ (B) Ketone: Aceton, Methyläthylketon.

(C) Äther: Dipxan, Tetrahydrofuran.

(D) Alkane: n-Heptan, n-Paraffin.

(E) Aromaten: Benzol, Toluol, Xylol.

(F) Andere: Methylenchlorid. 10

Die Gestalt der im Gel immobilisierten mikrobiellen Zellen kann granulatähnlich mit einem runden Bereich sein und beispielsweise die Form von Kugeln, Granulaten, KUgelchen oder Fäden aufweisen. Werden die geformten immobilisierten mikrobiellen Zellen in einen Säulenreaktor gegeben,so werden in der damit durchgeführten kontinuierlichen Umsetzung gute Ergebnisse erzielt. In einigen Fällen können die geformten immobilisierten mikrobiellen Zellen auch in Form von Filmen, Streifen, unregelmäßigen Granulaten oder Pulvern vorliegen. Der mittlere Durchmesser und/oder die mittlere Dicke der Teilchen des Gels, das die mikrobiellen Zellen enthält, kann 0,2 bis 5 mm, vorzugsweise 0,4 bis 1,0 mm, betragen. Bei geformten Gelen dieser Dicke wird der gewünschte Kontakt zwischen den immobilisierten Zellen und dem Substrat erreicht.

Darüberhinaus wird auch die gewünschte Durchflußgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches durch den Säulenreaktor erhalten.

709846/1153 ORIGINAL INSPECTED

Die gewünschte Form kann mittels Gießen durch einen Spalt hergestellt werden, da das die mikrobiellen Zellen enthaltende komplexe Lyogel einen weichen Teig darstellt. Beispielsweise wird das erfindungsgemäß hergestellte Lyogel durch Gießen durch einen Spalt in ein organisches Lösungsmittel oder in Luft in einen langen Zylinder überführt und anschließend getrocknet. Auch kann das Lyogel durch Eintropfenlassen in ein organisches Lösungsmittel oder in Luft und nachfolgendes Trocknen in runde Granulate überführt werden.

Um die gewünschte Form zu erhalten,können die Lyogele auch sprühgetrocknet werden. Die erhaltenen Granulate weisen eine hohe spezifische Oberfläche und sonstige gute Eigenschaften für eine Verwendung in einem Säulenreaktor auf.

Gute Ergebnisse werden auch durch Gefriertrocknen erreicht. Die enzymatischen Aktivitäten der auf diese Weise erhaltenen Granulate werden in zufriedenstellender Weise erhalten. Dies

trifft sogar bei Anwendung dieses Verfahrens auf wärmeempfindliche mikrobielle Zellen zu, beispielsweise auf Bakterienzellen, die zur enzymatischen Synthese von L-Tyrosin verwendet werden.

Eine andere bevorzugte Form der erfindungsgemäß hergestellten Gele ist der Film, der durch Auftragen des Sols auf die Oberfläche einer Platte erhalten wird. Das Gel in Form eines Films weist gleichfalls eine hohe spezifische Oberflä-

L _l

ehe auf und ist leicht herzustellen. Granulate der immobilisierten raikrobiellen Zellen können durch Pulverisieren erhalten werden. Im allgemeinen bleiben mehr als 80 %, mindestens 50 56, der enzymatischen Aktivitäten der unbehandelten mikrobiellen Zellen in den auf diese Weise erhaltenen Granulaten erhalten.

Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten mikrobiellen Zellen sind stabil und erhalten ihre Aktivitäten über einen längeren Zeitraum, wenigstens für 1 Jahr bei einer Lagertemperatur von 10⁰C, und können für kontinuierlich oder chargenweise arbeitende Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können die immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glucoseisomerase ohne Verlust ihrer Aktivität in einem kontinuierlichen Verfahren unter Verwendung eines Säulenreaktors während 30 Tagen verwendet werden. Bei über einen längeren Zeitraum durchgeführten kontinuierlichen Verfahren können Druckverminderungen selbst bei vergleichsweise hohen Durchflußgeschwindigkeiten und bei verschiedenen Ionenstärken vernachlässigt v/erden.

Die erfindungsgemäß immobilisierten mikrobiellen Zellen können als Katalysatoren in biochemischen Umsetzungen verschiedener Substrate nicht nur in einem Säulenreaktor son-

dem auch in Reaktoren verwendet werden, die chargenweise in Betrieb sind. Bei üblichen absatzweise arbeitenden Verfahren, bei denen gerührt wird, ist ein Austreten von mikrobiellen Zellen aus dem Gel oder eine Zerstörung des

geformten Gels praktisch nicht zu beobachten. Auch kann das in Wasser lösliche Polymerisat aus dem die immobilisierten mikrobiellen Zellen enthaltenden Gel wiedergewonnen und wiederholt verwendet werden, wenn die Aktivität der Zellen nach einem langen Zeitraum der Benutzung abgenommen hat. Das in Wasser lösliche Polymerisat oder das komplexe Sol kann durch Auflösen des Gels in heißem,alkalischem Wasser, beispielsweise in einer wäßrigen Ammoniaklösung, Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren und nachfolgendes Einstellen des pH-Werts wiedergewonnen werden»

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Ie 1Oprozentigcn

50 g einer/wäßrigen Lösung von PVA (Polymerisationsgrad 2000, vollständig verseift) wird mit 20 g Wasser, 5 g Tetraäthoxysilan und 1 g 1 η Salzsäure unter Rühren gemischt. Das trübe Gemisch ändert sich allmählich in 2 Stunden bei Raumtemperatur in ein farbloses,transparentes, homogenes komplexes Sol. Dieses wird mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, wobei ein farbloses, transparentes, homogenes komplexes Lyogel ohne Abtrennung einer der Komponenten entsteht. Das homogene Sol wird auch ohne Neutralisation durch längeres Lagern in ein komplexes Lyogel

Überführt, das auch transparent, homogen und bei Raumtemperatur in Wasser unlöslich ist. Das erhaltene homogene komplexe Lyogel wird durch Belüftung bei Raumtemperatur getrocknet, wobei ein transparentes homogenes komplexes Xerogel erhalten

U -J

709846/1 15**

wird, das in Leitungswasser unlöslich ist. Dieses Xerogel wird durch tstündiges Behandeln mit siedendem Wasser gequollen, ohne daii sich die Komponenten trennen. Las vorstehend durch Neutralisieren und Trocknen mittels Belüftung hergestellte komplexe Xerogel läßt sich zu 50 34 solubilisieren, bezogen auf das Anfangsgewicht des komplexen Xerogels, wobei der Quellungsgrad in siedendem Wasser etwa das 30-fache beträgt. Im Fall des ohne Neutralisation erhaltenen komplexen Sols beträgt die solubilisierte Menge 30 % und der Guellungsgrad in siedendem Wasser etwa das 12-fache.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1, jedoch unter Einsatz von 15 g Tetraäthoxysilan wird ein homogenes komplexes Lyogel gebildet. Der Reaktionsverlauf, das als Zwischenprodukt gebildete Sol und das Aussehen des schließlich erhaltenen Lyogels waren fast entsprechend wie in Beispiel 1. Das mit bzw. ohne Neutralisation hergestellte komplexe Xerogel ist in Leitungswasser unlöslich. Die solubilisierte Menge beträgt weniger als 3 % und der Quellungsgrad in siedendem Wasser weniger als das 3-fache.

Beispiel 3

Gemäß Beispiel 1, jedoch unter Einsatz von 20 g Tetraäthoxysilan wird ein komplexes Lyogel hergestellt, das auch farblos und transparent ist wie das gemäß Beispiel 1 erhaltene Lyogel. Das nachfolgend mit bzw. ohne Neutralisation hergestellte komplexe Xerogel ist härter und brüchiger gegenüber

10 9 8 U 6 /1 1 5 3

mechanischen Einwirkungen als das Lyogel gemäß Beispiel Das Gel.ist in Leitungswasser unlöslich und die solubilisierte Menge beträgt etwa 2 % und der Quellungsgrad in siedendem Wasser etwa das 2-fache.

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1, jedoch unter Einsatz von 2 g Tetraäthoxysilan in 5 g einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 87) wird ein homogenes komplexes Lyogel hergestellt, dessen Aussehen dem Lyogel gemäß Beispiel 1 sehr ähnlich ist. Das nachfolgend mit bzw. ohne Neutralisation erhaltene komplexe Xerogel ist in Leitungswasser unlöslich. Die solubilisierte Menge beträgt weniger als 9 % und der Quellungsgrad in siedendem

15 Wasser weniger als das 6-fache.

Beispiel 5

Beispiel 4 wird wiederholt, jedoch unter Einsatz von 10 g Tetraäthoxysilan und 5 g einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polyraerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 87). Die wesentlichen Merkmale der Reaktion und das Aussehen des erhaltenen komplexen Sols sowie des nachfolgend gebildeten komplexen Lyogels sind fast gleich wie in Beispiel 1. Das mit bzw. ohne Neutralisation erhaltene komplexe Xerogel ist in Leitungswasser unlöslich. Die solubilisierte Menge beträgt etwa 4 % und der Quellungsgrad in siedendem Wasser etwa das 2,5-fache.

■7 0 9 B U Π / 1 1 5

1 Beispiel 6

2 g Tetraäthoxysilan werden unter Rühren bei Raumtemperatur in ein Gemisch von 20 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1100, vollständig verseift) und 0,5 g Aluminiumchlorid gegeben. Das Rühren wird etwa

2 Stunden fortgesetzt, wonach ein farbloses transparentes homogenes komplexes Sol erhalten wird. Dieses wird durch Belüften zu einem Film eines transparenten homogenen komplexen Xerogels getrocknet. Der Film ist sogar in siedendem Wasser unlöslich und behält dabei seine ursprüngliche Gestalt. Das vorgenannte Sol wird mit 1 η Ammoniumhydroxidlösung neutralisiert, wobei das Sol weiß und trübe wird. Durch nachfolgendes Trocknen mittels Belüften wird ein semitransparentes Xerogel erhalten. Dieses ist in Leitungswasser unlöslich

15 und oehält seine Gestalt in siedendem Wasser.

Beispiel 7

100 g 5prozentige wäßrige Lösung von Gelatine wird mit 66 g Wasser verdünnt, dann unter Erhitzen gerührt und mit 15 g Tetraäthoxysilan versetzt. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf höchstens 3 mit verdünnter Salzsäure wird das Gemisch

3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wonach es transparent wird. Das derart gebildete homogene komplexe Sol wird bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich ein transparentes homogenes komplexes Lyogel bildet. Bei diesem wird der pH-Wert mit verdünnter wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, wobei das komplexe Gel bei einem pH-Wert von etwa 4,5 trüb und bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 6 sehr trüb, Jedoch

L· -

709846/115?

bei Erreichen eines pH-Werts von über 7 semitransparent wird. Die Homogenität bleibt erhalten, und es ist keine Abtrennung einer wäßrigen Schicht zu beobachten. Der pH-Wert beeinflußt die Lagerzeit zur Bildung des komplexen Lyogels. Durch Trocknen des homogenen komplexen Sols und des homogenen komplexen Lyogels werden homogene komplexe Xerogele mit verschiedenen Trübheitsgraden in Abhängigkeit vom pH-Wert erhalten (transparent im sauren Bereich, weißlich-trüb bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 6 und semi transparent bei einem pH-Wert von/öj. Das Xerogel ist bei Raumtemperatur in Wasser unlöslich und quillt in siedendem Wasser ohne seine ursprüngliche Gestalt zu verlieren.

Beispiel 8

100 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Stärke wird mit 66 g Wasser verdünnt, unter Rühren erhitzt und mit 15 g Tetraäthoxysilan versetzt. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 3 mit verdünnter Phosphorsäure wird das Gemisch bei Raumtemperatur weitere 2 Stunden gerührt, wonach sich ein transparentes homogenes komplexes Sol bildet. Dieses wird mit verdünnter Natronlauge neutralisiert. Nach etwa 30 Minuten Lagerzeit wird ein homogenes komplexes Lyogel erhalten. Wird entweder das homogene komplexe Sol ohne Neutralisieren durch Belüften getrocknet oder das homogene komplexe Lyogel nach dem Neutralisieren durch Belüften getrocknetμο wird ein weißlich trübes Xerogel erhalten, das gegenüber mechanischen Einwirkungen brüchig ist. Nur eine kleine Menge Stärke wird aus dem Xerogel in Leitungswasser extrahiert, während 50 % in

709846/1151

siedendem Wasser extrahiert werden. In beiden Fällen bleibt die ursprüngliche Gestalt erhalten. Ein Quellen erfolgt besonders in siedendem Wasser.

5 Beispiel 9

100 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Carboxymethylcellulose wird mit 66 g Wasser verdünnt. Das Gemisch wird bei einer Temperatur von 45⁰C gerührt und dann mit 20 g Tetraäthoxysilan versetzt. Anschließend wird der pH-Wert des Gemisches mit 1 η Salzsäure auf 3 eingestellt. Das Gemisch wird dann etwa 2 Stunden weiter gerührt, wonach sich ein transpa rentes homogenes komplexes Sol bildet. Nach dem Einstellen des pH-Werts des Sols auf 6,0 mit 1 η wäßriger Ammoniumhydroxidlösung und Trocknen durch Belüften wird ein transparentes homogenes komplexes Xerogel erhalten. Dieses ist unlöslich und quillt nicht in Wasser bei Raumtemperatur. Sogar in siedendem Wasser ist es fast unlöslich. Der Quellungsgrad ist etwa das 2-fache.

²⁰ Beispiel 10

100 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung eines Polyacrylate wird mit 66 g Wasser verdünnt und mit 15 g Tetraäthoxysilan versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei es allmählich in ein transparentes homogenes komplexes Sol übergeht. Dieses wird mit 17 g 1 η wäßriger Amraoniumhydroxidlösung neutralisiert und zur Überführung in ein semitransparentes komplexes Lycgel stehengelassen. Das ohne Neutralisation gebildete homogene komplexe Sol und das

L mit Neutralisation hergestellte homogene komplexe Lyogel _j

■7098A6M15-?

werden jeweils getrocknet. Es werden die entsprechenden weißen halbtransparenten Xerogele erhalten. Etwa die Hälfte des so gebildeten Xerogels wird in siedendem Wasser gelöst, während die andere Hälfte in Form eines weichen, in siedendem Wasser unlöslichen Hydrogels zurückbleibt.

Beispiel 11

100 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung eines Polyäthylenglykols (Nr. 4000) wird mit 66 g Wasser verdünnt und mit 15 g Tetraäthoxysilan versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 1 g 1 η Salzsäure bildet sich aus dem Gemisch nach 3 Stunden ein farbloses und transparentes homogenes Sol. Dieses wird mit 1 η wäßriger Ammoniumhydroxidlösung neutralisiert und 3 Stunden gelagert, wobei ein farbloses transparentes homogenes komplexes Lyogel entsteht. Dieses wird durch Trocknen in ein farbloses transparentes homogenes komplexes Xerogel überführt. In siedendem Wasser lösen sich 50 % des gebildeten Xerogels zu einem trüben Gel. Das feste Xerogel ist leicht zerstörbar.

Beispiel 12

100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 231,5 Teilen destilliertem Wasser, 28,5 Teilen Tetraäthylsilan und 1 Teil 1 η Salzsäure gemischt. Nach mehr als 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird ein transparentes homogenes Sol mit einem pH-'./ert von 3 erhalten, das 5 fr Feststoff (nachfolgend "PVA-SiO₂-SoI" genannt) enthält. 1 Teil

^L 7098^6/1153

,

handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 2 Teilen Wasser suspendiert und anschließend mit dem PVA-SiO₂-SoI gemischt. Nach dem homogenen Dispergieren der Hefe wird der pH-Wert des Gemisches mit wäßriger 1 η Ammoniumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Das Gel wird dann in eine Petrischale gegossen und sofort bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält einen Hefezellen enthaltenden gelblich-braunen Film. Bin 1 g der immobilisierten Hefezellen enthaltender Teil des Films wird entnommen und

¹^ bei 30⁰C in 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Glukose inkubiert, um einen Fermentationstest durchzuführen. Nach wenigen Minuten beginnt eine starke Gasentwicklung, die nach 30 Minuten auf der ganzen Oberfläche des Films beobachtet wird. Der Film quillt etwas und verändert seine Farbe, jedoch bleibt seine Gestalt unverändert. Die Gasentwicklung hält 30 Stunden an. Der Reaktionsverlauf wird durch Messen des Gewichtsverluste des Films durch Freisetzen von Kohlendioxid abgeschätzt. Bei der Reaktion wird ein leichter Geruch festgestellt, wie er bei alkoholischer Fermentation bekannt ist. Eine Zunahme der Trübheit der Glukoselösung, die durch Austreten von Hefezellen aus dem Film verursacht würde, ist kaum zu beobachten. Vielmehr bleibt das Gemisch fast transparent. Zur Kontrolle wird die gleiche Reaktion unter Verwendung von 1 g getrockneter Hefezellen durchgeführt, die Jedoch nicht immobilisiert worden sind. Zu Beginn der Reaktion wird dabei eine etwas größere Menge an Kohlendioxid freigesetzt als bei den immobilisierten Zellen, jedoch war nach 30 Stunden Inkubation die Geschwindigkeit der Kohlendioxidentwick-

L -

709846/115 ■?

lung in beiden Medien etwa gleich. Daraus ist ersichtlich, daß die^ Aktivität der Hefezellen in der unbehandelten und der immobilisierten Form fast gleich ist und somit eine Inaktivierung der Enzyme durch das Verfahren der Immobilisierung der Hefezellen nicht verursacht wird. Da jedoch die nicht-immobilisierten Zellen im Reaktionsmedium suspendiert werden müssen ist für die Weiterführung der Reaktion leichtes Rühren erforderlich. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die nach dem erfindungsgeniäßen Verfahren immobilisierten mikrobiellen Zellen eine Ferrnentationsaktivität aufweisen, die derjenigen von unbehandelten Zellen gleich ist.

Beispiel 13 Es wird das gleiche PVA-SiO₂-SoI wie in Beispiel 12 einge-

¹^ setzt. 4 Teile handelsüblicher getrockneter Hefe (Saccharorayces cerevisiae) wird in 5 Teilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird in 20 Teilen PVA-SiO₂-SoI eingemischt, und das erhaltene Gel auf eine Platte aufgetragen und durch Belüftung getrocknet, wobei ein gelblich-brauner, Hefezellen

²⁰ enthaltender Film erhalten wird. Ein 1 g immobilisierter

Zellen enthaltender Streifen des Films wird zerkleinert und bei 30⁰C in 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung inkubiert, um eine Fermentation gemäß Beispiel 12 durchzuführen. Eine große Menge Kohlendioxid wird bereits in der

²^ Anfangsphase der Inkubation freigesetzt, wie es bereits beim Kontrollversuch in Beispiel 12 beobachtet worden ist. Nach Beendigung der Fermentation wird der Film aus dem Reaktionsmedium genommen und in weitere 50 g einer 5prozentigen wäß-

L -J

709846/1 153

rigen Glukoselösung getaucht, wobei in gleichem Umfang das Freisetzen von Kohlendioxid beobachtet wird wie im Kontrollversuch gemäß Beispiel 12 mit nicht behandelten Zellen. Die vorgenannte Fermentation wird fünfmal wiederholt, wobei der in Glukoselösung getauchte Film jedesmal etwa die gleiche Fermentationsaktivität zeigt. Eine entsprechende Fermentation wird unter Verwendung von 1 g nicht-immobilisierter Zellen durchgeführt, um die hierbei erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen zu vergleichen, die mit immobilisierten Zellen erhalten worden sind. In beiden Tests werden die Hefezellen durch Zentrifugieren aus dem Medium abgetrennt und dann erneut in dem Medium suspendiert. Bei jedem Test beträgt die Menge an freigesetztem Kohlendioxid aus 50 g einer 5prozenti-

gen wäßrigen Glukoselösung mehr als 85 §6 d. Th. 15

Beispiel 14

100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 2000, Verseifungsgrad 88) werden mit 181 Teilen Wasser, 18 Teilen Tetraäthoxysilan und 1. Teil 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über 2 Stunden gut gerührt, wobei ein homogenes transparentes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einem Feststoffgehalt von 5 % erhalten wird. Daneben werden 2 Teile handelsübliche getrocknete Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) in 4 Teilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 20 Teilen des vorher erhaltenen PVA-SiO₂-SoIs gemischt und gut gerührt. Das so erhaltene Gel wird auf eine Platte aufgetragen und durch Belüften bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich ein gelblich-

L brauner, 1 g Hefezellen enthaltender Film bildet.

709846/11b3

Dieser Film wird gemäß Beispiel 12 einem Fermentationstest unterzogen. Die Fermentation verläuft mit einer Geschwindigkeit, die zwischen den Geschwindigkeiten liegt, wie sie gemäß Beispiel 12 und 13 festgestellt worden sind. Das bedeutet, daß die Menge an freigesetztem Kohlendioxid in der Anfangsphase der Reaktion etwas geringer als die Menge ist, die mit nicht-immobilisierten Zellen erhalten worden ist, Jedoch die bis zur Endphase der Reaktion erreichte Menge an Kohlendioxid 85 % d. Th. beträgt. Dieses Ergebnis entspricht fast dem unter Verwendung der nicht-immobilisierten Zellen erhaltenen Ergebnis.

Beispiel 15 100 Teile handelsüblicher Gelatine, die für die Verwendung in Lebensmitteln vorgesehen ist, werden mit 15 Teilen Tetraäthoxysilan, 66 Teilen Wasser und 5 Teilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird bei etwa 50⁰C über 2 Stunden gerührt, wobei ein transparentes homogenes komplexes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einem Gehalt an Feststoff von 5 % erhalten wird. Daneben werden 2 Teile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe in 3 Teilen Wasser suspendiert, und die erhaltene Suspension in 20 Teile des vorher erhaltenen PVA-SiO₂-SoIs gegeben. Nach gutem Rühren wird das erhaltene Gel auf eine Platte aufgetragen und bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält einen gelblich-braunen, immobilisierte Hefezellen enthaltenden Film, der zerbrechlicher und spröder war als die gemäß den Beispielen 12 bis 14 erhaltenen Filme. Ein 1 g der immobilisierten Zeilen enthaltener Streifen des

L -I

709846/115-*

hergestellten Films wird zerkleinert und in 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung getaucht, wonach der Fermentationstest gemäß Beispiel 14 durchgeführt wird. Während der Fermentation werden mehr als 85 % der Theorie an Kohlendioxid freigesetzt, wobei ein Austreten von mikrobiellen Zellen aus dem Film nicht beobachtet werden kann. Daraus ist zu entnehmen, daß die Hefezellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stark immobilisiert werden.

Beispiel 16 Gemäß Beispiel 12 wird ein PVA-SiO₂-SoI hergestellt. Eine Probe von Erwinia herbicola (ATCC 21434), einem ß-Tyrosinase bildenden Stamm, wird im nachfolgend angegebenen Nährmedium

gezüchtet. 15

L-Tyrosin

KH₂PO₄

MgSO₄

Pyridoxin HCi

Glycerin

Fumarsäure

L-Phenylalanin

DL-Alanin

Glycin

Mononatriumglutamat

Aji-eki

Zn⁺⁺

25 JV^ .

pH-Wert ?,5

0,2	g/100 ml
0,05	η
0,05	η
0,01	π
0,6	Il
0,7	Il
0,2	Il
0,4	η
0,3	η
0,45	η
1,0	η
2,0	ppm
2,0	ppm

709846/115 Ί

-Xt-

4 g (Trockengewicht 1 g) der kultivierten Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe abgetrennt und gemäß Beispiel 12 immobilisiert, wobei jedoch die Gefriertrocknung angewandt wird. Alle Verfahrensstufen werden bei Temperaturen unter 5°C durchgeführt. Die enzymatische Aktivität der durch die vorgenannten immobilisierten Zellen gebildeten ß-Tyrosinase wird durch Messen der Menge an synthetisiertem L-Tyrosin im nachfolgend angegebenen Medium bestimmt, wobei 20 mg immobilisierter Bakterienzellen verwendet werden.

Medium zur Bildung von L-Tyrosin

Natriumpyrivat	pH-Wert	3,0	g
Ammoniumacetat	5,0	g
EDTA	0,3	g
Natriurasulfit	0,2	g
Pyridoxalphosphat	0,01	g
Phenol	0,1	g
Wasser	Rest bis 100	ml
8,0

Wie aus nachfolgender Tabelle VI ersichtlich ist, beträgt die relative Aktivität der gemäß vorstehendem Beispiel immobilisierten Bakterienzellen zur Synthese von L-Tyrosin etwa 85 % oder mehr, verglichen mit der Aktivität im Kontrollversuch unter Verwendung von nicht-immobilisierten Bakterienzellen.

709846/1153

KJ

(Jl

Tabelle VI

	Kontrolle	Nasse Bakterien
		zellen,
	Versuch 1	g
		4
Ό	Versuch 2
αο	Versuch 3	4
	Versuch 4	4
	Versuch 5	4
σι
	4
	4

H-O, PVA-SiO,
^d Sol,
g g

NH₄OH-Ib" sung, g

Mengenverhältnis getrockneter Zellen/
gesamter Feststoff

relative Aktivität, %

7	40
7	20
7	10
7	6,7
7	4 0

0,4

0,2

0,1

0,067

0,04

1/3
1/2
2/3
3/4
5/6

100 90,4 89,0 85,6 84,2 88,3

JZ '

ISJ

OO CO

Aus Tabelle VI ist ersichtlich, daß die Aktivität immobilisierter Bakterienzellen hervorragend ist. 1 g der gemäß Versuch 3 in Tabelle VI erhaltenen immobilisierten Bakterienzellen werden in eine Säule gegeben, der kontinuierlich mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/Stunde das Reaktionsgemisch zur Synthese von L-Tyrosin zugeführt wird. Ein gleich bleibender Zustand in dieser L-Tyrosin-Synthese wird in der Säule nach 12 Stunden kontinuierlicher Zuführung des Reaktionsmediums erreicht. Dieser Zustand wird auch W 24 Stunden nach Beginn der Zuführung des Reaktionsmediums aufrechterhalten, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit bei etwa 0,6 mg/ml gehalten wird.

Beispiel 17

Ein PVA-SiOp-SoI wird mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 hergestellt. Gemäß Beispiel 16 werden 4 g Bakterienzellen (Trockengewicht 1 g) mit ß-Tyrosinase-Aktivität in 6 g Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 20 g des vorgenannten Sols homogenisiert, das vorher auf 5°C abgekühlt worden ist. Nach dem Einstellen des pH-Werts mit 1 η wäßriger Ammoniumhydroxidlösung auf 7,0 wird das Gel in Jeweils Aceton, Methylchlorid und Iso-Propanol extrudiert, wobei die Lösungsmittel in einem Kühlbad aus Trockeneis und Aceton gekühlt werden. Die extrudierten Gele werden unmittelbar anschließend gefriergetrocknet, wobei ein Präparat von immobilisierten Bakterienzellen in granulierter Form erhalten wird. Die Bildung von L-Tyrosin wird unter Verwendung von jeweils 40 mg der vorgenannten granulierten Produkte untersucht.

L -

709846/11S^

Wie aus nachfolgender Tabelle VII ersichtlich ist, beträgt die relative Aktivität der immobilisierten Bakterienzellen für die Bildung von L-Tyrosin jeweils mehr als 50 % im Vergleich zu der Aktivität, die mit kO mg nicht-immobilisierter

Bakterienzellen erreicht worden ist. Im Fall der Verwendung von Methylenchlorid wird eine relative Aktivität von 70 % erreicht. Während der Bildung von L-Tyrosin wird ein Austreten von Bakterienzellen aus dem granulierten Produkt nicht

beobachtet. 10

-709846/

Tabelle VII

Nasse Bakterienzellen, g

H₂O,
g

PVA-SiO₂-SoI, g

Lösungsmittel

Mengenverhältnis getrocknete Zellen/ gesamter Feststoff

Relative

Aktivität, %

Versuch Versuch

Versuch

20 20

Aceton

Methylenchlorid

Isopropanol

1/2 1/2

1/2

54,0 70,5

61,1

CO K) CO

! Beispiel 18

100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 231,5 Gewichtsteilen destilliertem Wasser, 28,5 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan und 1 Gewichtsteil 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird über 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt , wobei ein transparentes homogenes komplexes Sol mit einem Gehalt an Feststoff von 5 % und einem pH-Wert von etwa 3 gebildet wird. 5 Gewichtsteile handelsüblicher mikrobieller Zellen von Glukoseisomerase (Hersteller: Nagase Sangyo Co., Ltd.; Handelsname: GI-I50; taxonomische Bezeichnung: Streptomyces albus) werden in 10 Gewichtsteilen Wasser suspendiert, nachdem das Mycel in einem Homogenisator 3 Minuten bei 18000 U/min zerkleinert worden ist. Die erhaltene Suspension wird in 20 Gewichtsteile des mit 1 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellten komplexen Sols gegeben und darin durch Rühren dispergiert. Das gebildete Gel wird in eine Petrischale gegossen und bei einer Temperatur von 55°C durch Belüften getrocknet, wobei ein brauner, immobilisierte Zellen enthaltender Film erhalten wird. Der Film wird in einer Reibschale zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm in ein feines Granulat überführt. Die so hergestellten immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glukoseisomerase weisen eine spezifische Aktivität von 925 Einheiten/g auf, wobei die Aktivität der Glukoseisomerase 88 % der ursprünglichen Zellen beträgt.

709846/1153

Die Einheit eines Enzyms ist definiert als diejenige Menge des Enzyms, uxe 1 mg D-Fructose unter den folgenden Bedingungen bildet:

Das Reaktionsgemisch enthält 0,1 Mol D-Glukose und 0,005 Mol MgSO^₊ -7H₂O, und die Reaktion wird 1 Stunde bei einer Temperatur von 70⁰C und einem pH-Wert von 7_f2 durchgeführt.

Granulierte immobilisierte Zellen mit einem Gehalt von 1 g getrockneten Zellen v/erden in 100 ml einer AOprozentigen Lösung von D-Glukose, die 0,005 Hol MgSO^ enthält, 24 Stunden bei einer Temperatur von 7O⁰C inkubiert. Nach der Inkubation werden die immobilisierten Zellen durch Filtration abgetrennt und sechsmal hintereinander für die gleiche Reaktion verwendet, um die Stabilität der Enzymaktivität in den immobilisierten Zellen zu überprüfen. Unter den gleichen Bedingungen wird 1 g (Trockengewicht) nicht-behandelter (nicht-immobilisierter) Zellen inkubiert. Das Ergebnis ist in der Zeichnung erläutert. In dieser ist eine graphische Darstellung gezeigt, in der auf der Ordinate das Verhältnis der Gewichtsprozente von D-Fructo-

se zur gesamten Menge an Feststoff im Reaktionsgemisch und auf der Abszisse die Anzahl der Verwendungen der Enzymzubereitung aufgetragen sind. Aus der Zeichnung ist ersichtlich, daß die Menge der gebildeten Fructose nach sechsmaliger Verwendung der immobilisierten Zellen auf etwa die Hälfte gegenüber dem

Anfangs zustand zurückgeht, während dies im Fall der nicht-behandelten Zellen bereits nach zweimaliger Verwendung zutrifft.

709846/1153

¹ Beispiel 19

50 g von.gemäß Beispiel 18 hergestellten immobilisierten Zellen von Glukoseisomerase werden in eine Säule mit den Abmessungen 2,5 cm χ 20 cm gegeben, wobei das Volumen der immobilisierten Zellen 80 ml beträgt. Die Säule wird auf einer Temperatur von 65°C gehalten und zur kontinuierlichen Isomerisierung einer 60prozentigen Lösung von D-Glukose verwendet, wobei diese Lösung 0,005 Mol MgSO^ enthält und einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt SV 1. Die umgesetzte Lösung wird gesammelt. Der Prozentsatz an D-Fructose im Verhältnis zum Feststoffgehalt der umgesetzten Lösung wird 30 Tage lang auf etwa 50 % gehalten und dann allmählich vermindert, bis er nach 38 Tagen weniger als 25 % ist.

Die Durchflußgeschwindigkeit SV 1 bedeutet, daß vom Reaktionsgemisch in 1 Stunde das gleiche Volumen durch die Säule fließt, das auch die inmobilisierten Zellen in der Säule belegen.

20 Beispiel 20

Gemäß Beispiel 18 hergestellte immobilisierte mikrobielle Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität werden in einen Säulenreaktor gegeben, wobei der Druckabfall durch fließendes Wasser gemäß der Methode von T. Fukushima et al. (vgl.

immobilized Enzyme Technology", (1975), S. 225) gemessen wird. Der mittlere Durchmesser der immobilisierten mikrobiellen Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität beträgt 0,099 cm. Der Durchmesser des Säulenreaktors D ist 1,24 cm,

709846/1153

die Länge L der Reaktionszone 6,4 cm. Durch den Reaktor wird Wasser mj.t einer Geschwindigkeit von V = 58 cm/Stunde geführt, wobei die Aufstrom-Methode angewandt wird. Es wird festgestellt, daß der Druckabfall Δ P/L 0,315 m Wassersäule/m Reaktionszone beträgt. Die als Vergleich in einem unter Verwendung von Polyacrylamid hergestellten Gel immobilisierten mikrobiellen Zellen mit Glukoseisomerase haben einen Druckabfall von /\ P/L = 5,438 m Wassersäule/ m Reaktionszone unter

Anwendung der gleichen Bedingungen.
10

Beispiel 21 Gemäß Beispiel 18 wird ein komplexes Sol hergestellt. Glukoseoxidase bildende fadenförmige Fungi (Aspergillus niger

bei 30⁰C
IAM2020) werden 3 Tage/in einem Schüttelkolben gezüchtet, wo-

bei das nachfolgend angegebene Nährmedium verwendet wirdi

Lösliche Stärke 3,0 %

Pepton 0,5 %

Fleischextrakt 0,3 %

KH₂PO₄ 0,01 %

0,01 %

FeSQ₄ 0.001 ^CA

pH-Wert 6,0

Aus der Kulturbrühe wird durch Filtration geerntet. 4 g der nassen Zellen (entsprechend 1 g Trockengewicht) werden in 10 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung suspendiert, wobei ein pH-Wert von 7,0 vorliegt. Das Kycel wird in einem Homogenisator 3 Minuten bei 18 000 U/min zerkleinert. Die erhaltene

709846/1153

Suspension wird in 10 g des oben genannten PVA-Si(^-SoIs gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Genisch wird dann in eine Petrischale gegossen und bei Raumtemperatur belüftet, wobei 1,5g eines gelblich-braunen Films von immobilisierten Zellen erhalten wird. 1 g nicht immobilisierter nasser Zellen weist 240 Einheiten an Glukoseoxidaseaktivität auf, während 1 g der hergestellten immobilisierten Zellen einen entsprechenden Wert von 510 Einheiten an Aktivität haben. Die Wiedergewinnung von Glukoseoxidaseaktivität durch dieses Verfahren der Immobilisierung beträgt 87 %/g der Zellen.

Eine Einheit der Glukoseoxidaseaktivität bedeutet die Menge an Enzym, die 1 uMol Glukose in 1 Minute oxidiert.

15 Beispiel 22

100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine Temperatur von 50⁰C erwärmt, um rührbar zu werden, und anschließend mit 15 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan, 66 Gewichtsteilen Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden gerührt, wobei sich ein durchsichtiges homogenes komplexes Sol bildet. Dieses weist einen Feststoffgehalt von 5 % und einen pH-Wert von etwa 3 auf. Daneben werden Zellen von Nitritreductase bildender Chlorella fusca 4 Tage bei 25°C und Belüftung im nachfolgend angegebenen Nährmedium gezüchtet:

709846/1153

Glycerin 0,3 %

Na-Nitrit 0,25 %

KH₂PO₄ 0,13 %

MgSO₄ 0,24 %

KCl 0,16 %

FeSO₄ 0,0002 %

pH-Wert 6 ,8

Die gezüchteten Zellen werden durch Filtration geerntet. 6 g der nassen Zellen (entsprechend 1 g Trockengewicht) werden in 10 ml Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit 10 ml Gelatine-Si0₂-Sol gemischt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird anschließend in eine Petrischale gegossen und gefriergetrocknet, wobei 2,1 g eines dunkelgrünen Films erhalten werden.1 g nicht-immobilisierter nasser Zellen weisen 2,6 Einheiten an Nitritreductaseaktivität auf, während der entsprechende Wert für 1 g immobilisierter Zellen 6,2 Einheiten beträgt. Die Wiedergewinnung der Nitritreductaseaktivität mittels dieses Verfahrens der Immobilisierung beträgt 83 % pro g der Zellen.

Eine Einheit der Nitritreductaseaktivität bedeutet die Menge an Enzym, die 1 ^iMol Nitrat in 1 Minute bei einer Temperatur

von 30⁰C reduziert.
25

Beispiel 23

100 Gewichtsteile einer wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 221 Ge-

709846/1153

wichtsteilen destilliertem Wasser, 36 Gewichtsteilen Tetrapropoxysilan und 3 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird unter Rühren über 2 Stunden auf eine Temperatur von 50⁰C erhitzt, wobei sich ein transparentes homogenes komplexes Sol bildet, das etwa 5 % Feststoff enthält.

1 Gewichtsteil handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe (Oriental Yeast Co., Ltd.) wird in 2 Gewichtsteilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird durch Rühren gut im vorgenannten Sol dispergiert. Der pH-Wert wird mit 1 η wäßriger Natriuinhydroxidlösung auf etwa 6 eingestellt. Dann wird das Gemisch in eine Petrischale gegossen und sofort bei einer Tem peratur von unter 30⁰C belüftet, wobei ein gelblich-brauner Film erhalten wird. In 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Glukose wird bei 30⁰C ein Fermentationstest durchgeführt, wobei ein Teil des erhaltenen Films, der 1 g der getrockneten Zellen enthält, verwendet wird. Die Fermentation verläuft gut, und es wird die Bildung von Kohlendioxid beobachtet. Dessen Menge beträgt etwa 80 # d. Th. Während der Re- aktion wird das Austreten von Zellen aus dem Film nicht beobachtet, weshalb das Reaktionsgemisch während der ganzen Fermentation nicht trübe wird.

Beispiel 24

100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 27 Gewichtsteilen destilliertem V/asser, 27 Gewichts teilen Tetramethoxysilan und 2 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt.

709846/1153

Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein homogenes transparentes Sol bildet, das 5 % Feststoff enthält. 2 Gewichtsteile handelsüblicher mikrobieller Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität (Hersteller: Nagase Sangyo Co., Ltd.; Handelsname: GI-1150; taxonomische Bezeichnung: Streptomyces albus) werden gemäß Beispiel 1 in 20 Teilen des vorgenannten komplexen Sols immobilisiert. Die Wiedergewinnung der Aktivität nach diesem Verfahren der Immobilisierung beträgt 82 %.
10

Beispiel 25

100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine Temperatur von 50⁰C erhitzt, um sie rührbar zu machen, und mit 13 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan, 85 Gewichtsteilen destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird über 2 Stunden gerührt, wobei sich ein transparentes homogenes komplexes Sol bildet, das etwa 5 % Feststoff enthält. 2 Gewichtsteile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe werden in 3 Gewichtsteilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird in 20 Gewichtsteilen des vorgenannten Sols unter Rühren eingemischt, wobei sich eine homogene Lösung bildet. Das Geraisch wird in eine Petrischale gegossen und belüftet. Man erhält einen gelblichen Film, der brüchig ist und leicht zerstört wird. Unter Verwendung eines 1 g der getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten Films wird ein Fermentationstest durchgeführt. Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid beträgt mehr als 80 % d. Th. Es wird kein Austreten

L _j

709846/1153

von Zellen beobachtet, was zeigt, daß die Immobilisierung sehr gut ist.

Beispiel 26

100 Gewichtsteile 5prozentiger Carboxymethylcellulose, die als handelsüblicher Zusatz für Lebensmittel verwendet wird, werden mit 27 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan, 118 Gewichtsteilen destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Geraisch v/ird mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein komplexes Sol erhalten wird. Dieses ist homogen, aber trüber als das unter Verwendung eines PVA erhaltenen Sols. 3 Gewichtsteile einer handelsüblichen getrockneten Hefe (Oriental Yeast Co., Ltd.) werden gemäß Beispiel 23 mit 20 Teilen des vorgenannten Sols immobilisiert. Der erhaltene Film mit immobilisierten Zellen ist ziemlich spröde und wird in trockener Form leicht zerstört. Unter Verwendung eines 1 g der getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten Films wird gemäß Beispiel 23 ein Fermentationstest durchgeführt. Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid beträgt mehr als 85 % d. Th., wobei kein Austreten von Zellen aus dem Film beobachtet wird.

Beispiel 27

100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von

Carboxymethylcellulose, die als Zusatz für Lebensmittel Im Handel erhältlich ist, werden mit 195 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan, 125,5 Gewichtsteilen destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Es wird gemäß Bei-

L -J

709846/1153

spiel 23 ein komplexes Sol erhalten. Die Eigenschaften des hergestellten Films sind fast die gleichen, wie sie in dem gemäß Beispiel 25 erhaltenen Film festgestellt werden. Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid im Fermentationstest beträgt mehr als 80 % d. Th., wobei v/ie beim Verfahren gemäß Beispiel 23 kein Austreten von Zellen beobachtet wird.

70984G/1153

Claims (10)

" Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen komplexen Gels zur Immobilisierung mikrobieller Zellen " Priorität: 14. Mai 1976, Japan, Nr. 55 925/76 27. Mai 1976, Japan, Nr. 62 041/76 10. Februar 1977, Japan, Nr. 13 650/77 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen komplexen Gels zur Immobilisierung mikrobieller Zellen, dadurch gekennzei chnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohols, einer Gelatine oder einer Carboxymethylcellulose mit einem Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel

Si(OR)₄

mischt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, das erhaltene Gemisch durch Zugabe einer sauren Verbindung zu einem homogenen komplexen Sol

; η p. ⁰L δ / π ζ ^

ORIGINAL INSPECTED

1 hydrolysiert und dieses anschließend in ein Gel ÜVerifi

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel Si(OR)^ einsetzt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohole und Tetraäthoxysilan einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetraalkoxysilan in einer solchen Menge einsetzt, daß das Gewicht des in ihm enthaltenen Siliciumdioxids 5 bis 300 % beträgt, bezogen auf das Trockengewicht des Polyvinylalkohole, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das homogene komplexe Sol mit einer basischen Verbindung

20 in ein hydrophiles komplexes Gel überführt.

6. Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen komplexen Xerogels gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene homogene komplexe Sol durch Trocknen in ein

25 Xerogel überführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel Si(ORK ein-

^L 7Ö98A6/1153

setzt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß

man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohole und Tetraäthoxysilan einsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetraalkoxysilan in einer solchen Menge einsetzt, daß das Gewicht des darin enthaltenen Siliciumdioxids 5 bis 300 % des Trockengewichts des Polyvinylalkohole, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das homogene komplexe Sol mit einer basischen Verbinduni in ein hydrophiles komplexes Xerogel überführt.

11. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobiel-Ie Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen Xerogels gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem homogenen komplexen Sol mikrobielle Zellen homogen dispergiert und nachfolgend das Gemisch aus dem Sol und den mikrobiellen Zellen durch Trocknen in ein Gel überführt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel Si(OR)^ einsetzt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.

709846/1151

Γ * "1

-A-

13· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine.wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohols und Tetraäthoxysilan einsetzt.

1A. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetraalkoxysilan in einer solchen Menge einsetzt, daß das Gewicht des darin enthaltenen Siliciumdioxids 5 bis 300 % des Trockengewichts des Polyvinylalkohols, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man mikrobielle Zellen einsetzt, die eine Breite von etwa 0,5 bis 1,5 ju und eine Länge von etwa 1 bis 20 ji aufweisen.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch aus dem Sol und den mikrobiellen Zellen bei Temperaturen von 0 bis 70⁰C trocknet.

17- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

man das Sol mit den mikrobiellen Zellen bei einem pH-Wert von

A bis 8 mischt.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiellen Zellen in einer Menge von 20 bis 1000 %

(Trockengewicht), bezogen auf das Sol, einsetzt.

19. Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen komplexen Xerogels mit immobilisierten mikrobiellen Zellen gemäß An-

709846/1153

spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiellen Zellen in dem Sol homogen dispergiert und das Gemisch aus dem Sol und den mikrobiellen Zellen durch Gießen in ein organisches Lösungsmittel und Trocknen in ein Gel überführt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel Si(OR)^ einsetzt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohols und Tetraäthoxysilan einsetzt.

22. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetraalkoxysilan in einer solchen Menge einsetzt, daß das darin enthaltene Siliciumdioxid 5 bis 300 5» des Trockengewichts des Polyvinylalkohols, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose beträgt.

23· Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man mikrobielle Zellen einsetzt, die eine Breite von etwa 0,5 bis 1,5 μ und eine Länge von 1 bis 20 u aufweisen.

24. Verfahren nach Anspruch I9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch aus dem Sol und den mikrobiellen Zellen bei Temperaturen von 0 bis 70⁰C trocknet.

25. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das Sol mit den mikrobiellen Zellen bei einem pH-Wert von 4 bis 8 mischt.

26. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiellen Zellen in einer Menge von 20 bis 1000 % (Trockengewicht), bezogen auf das Sol, einsetzt.

709846/1