DE2718718A1 - Somatostatinanaloge und zwischenprodukte hierzu - Google Patents

Description

PFENNING-MAAS CiNiG - LEMKE - SFOTT

EibS!ir^:.irviEaSTR. 299 BÜÜO MÜNCHEN 40

X-4695

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V. St. A.

Somatostatinanaloge und Zwischenprodukte hierzu

709846/0869

Gegenstand der Erfindung sind das Tetradecapeptid L-AIa-D-Ala-L-Cys-D-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (Formel I) sowie dessen pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze und während der Synthese dieses Tetradecapeptids hergestellte Zwischenprodukte .

Somatostatin (das ebenfalls auch als Hemmfaktor für die Freisetzung von Somatotropin bezeichnet wird) ist ein Tetradecapeptid der Formel L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-

I — 1

Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH. Dieses Tetradecapeptid wurde aus Schafshypotalextrakten isoliert und hat sich als Wirkstoff zur Hemmung der Abscheidung von Wachstumshormon (GH) erwiesen, das auch als Somatotropin bekannt ist. Im einzelnen wird hierzu auf Science 179, 77 (1973) verwiesen.

2
D-AIa -Somatostatin ist in Endocrinology 98 (2), 336-343

(1976) beschrieben.

D-Lys -Somatostatin geht aus Molecular and Cellulat Endocrinology 4, 79-86 (1976) hervor.

Das Tetradecapeptid der oben angegebenen Formel I schließt auch die nichttoxischen Säureadditionssalze hiervon ein. Seine Struktur unterscheidet sich von derjenigen des Somatostatins durch die Gegenwart eines D-Lysinrestes in Stellung 4 anstelle eines L-Lyseinrestes sowie durch das Vorhandensein eines D-Alaninrestes in Stellung 2 anstelle eines Glycinrestes. Der Einfachheit halber läßt sich das Tetradecapeptid

2 4

der Formel I auch als D-AIa , D-Lys -Somatostatin bezeichnen.

7übö46/O869

Die Erfindung bezieht sich demzufolge auf eine Verbindung der Formel H-L-Ala-D-Ala-L-Cys-D-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (Formel I) und die pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalze hiervon sowie auf das Zwischenprodukt der Formel R-L-AIa-D-Ala-L-Cys(R₁)-D-Lys(R₂)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R₅)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄J-L-CyS(R₁)-X (Formel II),

R Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe bedeutet,

R₁ für Wasserstoff oder eine Thioschutzgruppe steht, R_ Wasserstoff oder eine «--Aminoschutzgruppe ist,

R^ und R₄ jeweils Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe sind,

R. Wasserstoff oder Formyl darstellt und

für Hydroxy oder einen Rest der Formel

-O-CH —

.=. Harz

steht, bei dem das Harz Polystyrol darstellt,

709846/0869

-Z-

mit der Maßgabe, daß die Substituenten R, R.., R„, R_, R. und R₅ jeweils Wasserstoff sind, falls der Substituent X für Hydroxy steht, und daß ferner die Substituenten R, R₁, R-, R- und R₄ etwas anderes als Wasserstoff bedeuten, falls der Rest X für

Harz

steht.

Das neue Tetradecapeptid der oben angegebenen Formel I wird hergestellt, indem man das entsprechende geradkettige Tetradecapeptid der Formel III

H-L-Ala-D-Ala-L-Cys-D-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

mit einem Oxidationsmittel umsetzt. Bei dieser Reaktion werden die beiden Sulfhydrylgruppen in eine Disulfatbrücke überführt.

Zu pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalzen gehören die organischen und anorganischen Säureadditionssalze, wie sie beispielsweise hergestellt werden aus Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, SuIfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure. Glycolsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Propionsäure. Bevorzugt sind Säureadditionssalze der Essigsäure. Alle oben angegebenen Salze lassen sich in üblicher Weise herstellen.

709846/0869

- V-

Zur Erfindung gehören ferner auch Zwischenprodukte der Formel II, nämlich der Formel R-L-Ala-D-Ala-L-Cys(R..)-D-Lys(R₂)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R₅J-L-LyS(R₃)-L-Thr(R₃) L-Phe-L-Thr(R₃)-L-SCr(R₄J-L-CyS(R₁)-X. Bevorzugte Zwischenprodukte sind dabei folgende:

H-L-Ala-D-Ala-L-Cys-D-Lys-L-Asn-L-

Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (Formel III) sowie

N-(BOC)-L-Ala-D-Ala-L-(PMB)Cys-D-(CPOC)Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-(CPOC)Lys-L-(BzI)Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB)CyS-O-CH₃-O^ />

Bei den oben angegebenen Formeln für die Zwischenprodukte steht der Substituent R entweder für Wasserstoff oder für eine alpha-Aminoschutzgruppe. Geeignete alpha-Aminoschutzgruppen für den Substituenten R sind die in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen. Eine Reihe derartiger Gruppen wird in Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, Editor, Plenum Press, New York, 1973, im Kapitel 2 von J. W. Barton beschrieben. Einzelbeispiele solcher Schutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl (BOC), tert.-Amyloxycarbonyl, 2-(p-BiphenyIyI)isopropyloxycarbonyl(BpOC), Adamantyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Triphenylmethyl (Trityl) oder p-Toluolsulfonyl. Vorzugsweise handelt es sich bei der alpha-Aminoschutzgruppe des Substituenten R um tert.-Butyloxycarbonyl.

709846/0869

-S-

Der Substituent R₁ stellt entweder das Wasserstoffatom der Sulfhydrylgruppe des Cysteins dar oder ist eine Schutzgruppe für den Sulfhydrylsubstituenten. Einzelbeispiele solcher Schutzgruppen sind p-Methoxybenzyl, Benzyl, p-Tolyl, Benzhydryl, Acetamidoraethyl, Trityl, p-Nitrobenzyl, tert.-Butyl, Isobutyloxymethyl sowie die verschiedenen anderen Tritylderivate. Bezüglich weiterer derartiger Schutzgruppen wird auf Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie "Synthese von Peptiden", Bände 15/1 und 15/2, (1974), Stuttgart, verwiesen. Die als Substituenten R₁ bevorzugte Sulfhydrylschutzgruppe ist ein p-Methoxybenzyl.

Der Substituent R₂ bedeutet entweder das Wasserstoffatom an der C-Aminofunktion des Lysinrestes oder eine geeignete <£-Aminoschutzgruppe. Als Gruppen dieser Art eignen sich die oben im Zusammenhang mit den alpha-Aminoschutzgruppen beschriebenen Gruppen. Einzelbeispiele typischer derartiger Gruppen sind Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbor.yl, Cycloheptyloxycarbonyl oder p-Toluolsulfonyl.

Wie aus dem folgenden hervorgeht, erfordert die Herstellung des Tetradecapeptids der oben angegebenen Formel I eine periodische Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe von der an der Peptidkette vorhandenen endständigen Aminosäure. Die einzige Grenzbedingung in Bezug auf die Identität der £-Aminoschutzgruppe am Lysinrest ist somit, daß diese derart beschaffen sein muß, daß sie unter den zur selektiven Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe angewandten Bedingungen nicht gespalten wird. Eine entsprechende Auswahl der alpha-Amino- und der £-Aminoschutzgruppen bereitet dem Peptidchemiker keine

709846/0869

Schwierigkeiten und ist abhängig von der relativen Leichtigkeit, mit der sich eine besondere Schutzgruppe abspalten läßt. So sind beispielsweise Gruppen, wie 2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbonyl (BpOC) und Trityl, sehr labil und können sogar in Gegenwart einer schwachen Säure abgespalten werden. Zur Abspaltung anderer Gruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl, tert,-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder p-Methoxybenzyloxycarbonyl, braucht man mittelmäßig starke Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure. Zur Abspaltung wiederum anderer Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbony1, Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl oder Isopropyloxycarbonyl, werden sogar noch stärker saure Bedingungen benötigt. Für eine Abspaltung dieser letztgenannten Gruppen sind stark saure Bedingungen erforderlich, wie beispielsweise der Einsatz von Bromwasserstoff, Fluorwasserstoff oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Unter den stärker sauren Bedingungen werden selbstverständlich auch alle labilere Gruppen abgespalten. Zu einer geeigneten Auswahl der Aminoschutzgruppen gehört daher der Einsatz einer Gruppe an der alpha-Aminofunktion, die labiler ist als die als S-Aminoschutzgruppe verwendete Gruppe, zusammen mit Spaltbedingungen, die so ausgelegt sind, daß sie zu einer selektiven Entfernung von lediglich der alpha-Aminofunktion führen. Der Subsituent R₂ sollte hierfür vorzugsweise Cyclopentyloxycarbonyl sein, wobei in Verbindung damit die alpha-Aminoschutzgruppe der Wahl, die sich für jede an die Peptidkette zu addierende Aminosäure einsetzen läßt, tert.-Butyloxycarbonyl ist.

Die Reste R₃ und R. bedeuten zusammen jeweils Wasserstoff oder getrennt eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin oder Serin. Typische derartige Schutzgruppen sind beispielsweise C.-C.-Alkyl, wie Methyl, Äthyl oder tert.-Butyl, Benzyl, substituiertes Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, o-Chlorbenzyl oder p-Chlorbenzyl, Cj-C-j-Alkanoyl, wie Formyl, Acetyl oder Propionyl,

709846/0869

?718718

sowie Triphenylmethyl (Trityl). Sind die Substituenten R₃ und R. jeweils Schutzgruppen, dann ist die Schutzgruppe der Wahl in beiden Fällen vorzugsweise jeweils Benzyl.

Die Gruppe R₅ bedeutet entweder Wasserstoff oder Formyl, wobei der letztgenannte Rest eine Schutzgruppe für die Gruppe

NH des Tryptophanrests ist. Mit einer solchen Schutzgruppe kann wahlweise gearbeitet werden, und der Rest R₅ kann daher entweder Wasserstoff (N-ungeschützt) oder Formyl (N-geschützt) sein.

Die Gruppe X bedeutet die endständige Carboxylgruppe der Tetradecapeptidkette und kann Hydroxyl sein, wobei es sich hierbei um eine freie Carboxylgruppe handelt. Darüberhinaus kann X auch den festen Harzträger bedeuten, an den der endständige Carboxylrest des Peptids während seiner Synthese gebunden ist. Dieses feste Harz hat die Formel

Bedeutet der Substltuent X eine Hydroxylgruppe, dann stehen die Substituenten R, R₁, R₂, R₃, R. und R₅ jeweils für Wasserstoff. Steht der Substituent X für den festen Harzträger, dann handelt es sich bei den Substituenten R, R-, R₂/ R3 und R. jeweils um eine Schutzgruppe.

Bei den oben angegebenen Formeln kommen den genannten Abkürzungen folgende und normalerweise allgemein verwendete Bedeutungen zu:

709846/0869

Ala - Alanin

Asn - Asparagin

Cys - Cystein

GIy - Glycin

Lys - Lysin

Phe - Phenylalanin

Ser - Serin

Thr - Threonin

Thr - Tryptophan

DCC - NiN'-Dicyclohexylcarbodiimid

DMF - Ν,Ν-Dimethylformamid

BOC - tert.-Butyloxycarbony1

PMB - p-Methoxybenzyl

CPOC - Cyclopentyloxycarbonyl

BzI - Benzyl

BpOC - 2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbony1

Die Auswahl der bestimmten Schutzgruppen zur Herstellung der Verbindung der Formel I bewegt sich zwar innerhalb des üblichen Fachwissens eines mit der Synthese von Peptiden vertrauten Chemikers, doch ist dabei darauf zu achten, daß die geeignete Auswahl der Schutzgruppen abhängig ist von den besonderen Folgereaktionen, die durchgeführt werden müssen. Die Schutzgruppe der Wahl muß daher eine Gruppe sein, die sowohl gegenüber den verwendeten Reagenzien als auch unter den bei den Nachfolgestufen der Reaktionsfolge angewandten Bedingungen stabil ist. Wie oben bereits in etwa erläutert, muß es sich bei der jeweils einzusetzenden Schutzgruppe beispielsweise um eine Gruppe handeln, die unter den zur Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe des endständigen Aminosäurerests des Peptidfragments während der Vorbereitung der Kupplung des nächstfolgenden Aminosäurefragments an die Peptidkette angewandten Bedingungen intakt bleibt. Es ist ferner auch wichtig, daß man als Schutzgruppe eine solche Gruppe auswählt, die während des Aufbaus der Peptidkette intakt bleibt und sich nach beendeter Synthese des gewünschten Tetradecapeptids leicht entfernen läßt. Alle diese Dinge liegen jedoch im Rahmen des durchschnittlichen Können eines Peptidchemikers.

709646/0869

7718718

Aus den obigen Ausführungen ergibt sich, daß man das Tetradecapeptid der Formel I durch Festphasensynthese herstellen kann. Diese Synthese erfordert einen sequentiellen Aufbau der Peptidkette, beginnend am endständigen Kohlenstoffatom des Peptids. Hierzu bindet man beispielsweise Cystein zuerst mit seiner Carboxylfunktion an das Harz, indem man ein aminogeschütztes, S-geschütztes Cystein mit einem chlormethylierten Harz oder einem Hydroxymethylharz umsetzt. Die Herstellung eines Hydroxymethylharzes wird in Chem. Ind. (London), 38, 1597-1598 (1966) beschrieben. Entsprechende chlormethylierte Harze sind von Lab Systems, Inc., San Mateo, California, erhältlich.

Zur Verknüpfung des C-endständigen Cysteins mit dem Harz überführt man das geschützte Cystein zuerst in sein Cäsiumsalz. Dieses Salz wird dann nach dem in HeIv. Chim. Acta 56, 1476 (1973) beschriebenen Verfahren mit dem Harz umgesetzt. Wahlweise läßt sich das Cystein auch an das Harz binden, indem man die Carboxylfunktion des Cysteinmoleküls in bekannter Weise acyliert. Hierzu kann man beispielsweise das Cystein mit dem Harz in Gegenwart einer carboxylgruppenaktivierenden Verbindung, wie N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), umsetzen.

Wenn das freie Carboxylcystein an das Trägerharz entsprechend gebunden ist, dann besteht der Rest der Peptidbildungssequenz in der stufenweisen Addition einer jeden Aminosäure an den N-endständigen Teil der Peptidkette. Die jeweilige bestimmte Folge besteht daher zwangsläufig in einer Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe von der Aminosäure, die den N-endständigen Teil des Peptidfragments bildet, und einer anschließenden Kupplung des nächstfolgenden Aminosäurerests an die nun freie und reaktionsfähige N-endständige Aminosäure. Die Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe läßt sich in Gegenwart einer Säure, wie Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Trifluoresäigsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Essigsäure, erreichen, wobei

709846/0869

das jeweilige Säureadditionssalz entsteht. Eine andere Methode zur Durchführung der Abspaltung der Aminoschutzgruppe besteht im Einsatz von Bortrifluorid. So führt beispielsweise die Verwendung von Bortrifluoriddiäthylätherat in Eisessig zu einer Umwandlung des aminogeschützten Peptidfragments in einen Bortrifluoridkomplex, der sich dann durch Behandeln mit einer Base, wie wässrigem Kaliumbicarbonat, in das deblockierte Peptidfragment überführen läßt. Jede dieser Methoden läßt sich anwenden, sofern man darauf achtet, daß es sich dabei jeweils um eine Methode handeln muß, die zu einer Abspaltung der N-endständigen alpha-Aminoschutzgruppe ohne Zerstörung anderer Schutzgruppen an der Peptidkette führt. Die Abspaltung der N-endständigen Schutzgruppe wird dabei vorzugsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure vorgenommen. Im allgemeinen wird diese Abspaltung bei Temperaturen von etwa 0 C bis etwa Raumtemperatur durchgeführt.

Das nach Abspalten der N-endständigen Gruppe erhaltene Produkt liegt normalerweise in Form eines Säureadditionssalzes derjenigen Säure vor, die zur Abspaltung der Schutzgruppe verwendet wird. Dieses Produkt läßt sich dann in die freie endständige Aminoverbindung überführen, indem man es mit einer milden Base, beispielsweise einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triäthylamin, behandelt.

Die auf diese Weise erhaltene Peptidkette läßt sich hierauf mit der nächstfolgenden Aminosäure umsetzen. Diese Umsetzung kann nach irgendeiner bekannten Technik erfolgen. Zur Ankupplung der nächstfolgenden Aminosäure an die N-endständige Peptidkette verwendet man eine Aminosäure mit freier Carboxygruppe, die jedoch an der alpha-Aminofunktion sowie an eventuellen anderen aktiven Stellen entsprechend geschützt ist. Hierzu unterwirft man die Aminosäure Bedingungen, die die Carboxylfunktion für die Kupplungsreaktion aktivieren. Eine für diese Synthese geeignete Aktivierungstechnik besteht in der überführung der Aminosäure in ein gemischtes Säureanhydrid. Hier-

709846/0869

durch wird die freie Carboxylfunktion der Aminosäure durch Reaktion mit einer anderen Säure, beispielsweise einer Carbonsäure in Form ihres Säurechlorids, aktiviert. Beispiele solcher Säurechloride, die sich zur Bildung der entsprechenden gemischten Anhydride verwenden lassen, sind Äthylchlorformiat, Phenylchlorformiat, sek.-Butylchlorformiat, Isobutylchlorformiat oder Pivaloylchlorid.

Eine andere Methode zur Aktivierung der Carboxylfunktion der Aminosäure für die Kupplungsreaktion besteht in einer Umwandlung der Aminosäure in ihr aktives Esterderivat. Beispiele solcher aktiver Ester sind 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylestsr, Ester mit 1-Hydroxybenzotriazol sowie Ester mit N-Hydroxysuccinimid. Eine andere Methode für die Kupplung der C-endständigen Aminosäure an das Peptidfragment besteht darin, daß man die Kupplungsreaktion in Gegenwart wenigstens einer äquimolaren Menge Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchführt. Diese Methode wird zur Herstellung des Tetradecapeptids der Formel II, bei dem X für den Rest

Harz

steht, bevorzugt.

Sobald die gewünschte Aminosäuresequenz hergestellt ist, kann man das erhaltene Peptid von dem Harzträger trennen. Dies erreicht man durch Behandeln des geschützen harzgetragenen Tetradecapeptids mit Fluorwasserstoff. Eine Behandlung mit Fluorwasserstoff führt zu einer Abspaltung des Peptids vom Harz und ergibt gleichzeitig auch noch eine Abspaltung aller restlichen Schutzgruppen an reaktionsfähigen Stellen der Peptid-

709846/0869

?718718

kette sowie der an der N-endständigen Aminosäure vorhandenen alpha-Aminoschutzgruppe. Verwendet man zur Abspaltung des Peptids von dem Harz sowie zur Entfernung der Schutzgruppen Fluorwasserstoff, dann führt man diese Reaktion vorzugsweise in Gegenwart von Anisol durch. Die Gegenwart von Anisol hemmt die mögliche Alkylierung bestimmter Aminosäurereste in der Peptidkette. Die obige Abspaltung wird vorzugsweise auch noch in Gegenwart von Äthylmercaptan durchgeführt. Dieses Äthylmercaptan dient zum Schutz des Indolrings des Tryptophanrests und erleichtert ferner auch eine Umwandlung der blockierten Cysteine in ihre Thiolformen. Steht der Rest R- für Formyl, dann erleichtert die Gegenwart von Äthylmercaptan gleichzeitig auch noch die Abspaltung der Formylgruppe durch Fluorwasserstoff.

Das nach erfolgter Spaltreaktion erhaltene Produkt ist ein geradkettiges Peptid mit 14 Aminosäureresten, nämlich ein Peptid der oben genannten Formel III. Zur Herstellung des Endprodukts der Formel I muß man dieses geradkettige Tetradecapeptid unter Bedingungen behandeln, die zu einer oxidativen Umwandlung der beiden im Molekül vorhandenen SuIfhydrylgruppen, nämlich jeweils einer Sulfhydrylgruppe an jedem Cysteinylrest, unter Bildung einer Disulfidbrücke führen. Dies läßt sich erreichen, indem man eine verdünnte Lösung des linearen Tetradecapeptids mit irgendeinem Oxidationsmittel behandelt, beispielsweise mit Jod oder Kaliumferricyanid. Als Oxidationsmittel läßt sich ferner auch Luft verwenden, und der pH-Wert des Gemisches soll im allgemeinen zwischen etwa 2,5 und 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 7,0 und 7,6, liegen. Arbeitet man mit Luft als Oxidationsmittel, dann soll die Konzentration der Peptidlösung im allgemeinen nicht über etwa 0,4 mg Peptid pro ml Lösung betragen und normalerweise etwa 50 /Ug Peptid pro ml Lösung ausmachen.

709846/0869

Die Verbindungen der Formel I können warmblütigen Säugetieren und Menschen nach mehreren Methoden verabreicht werden, beispielsweise oral, sublingual, subkutan, intramuskulär oder intravenös. Eine Verabreichung der Verbindungen der Formel I führt in vivo zu einer Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormonen. Dieser stimulierende Effekt wirkt sich in denjenigen Fällen günstig aus, in denen man eine therapeutische Behandlung wegen ungenügender Abscheidung von Somatotropin braucht, da sich eine zu geringe Abscheidung von Somatotropin nachteilig auswirkt und beispielsweise zu Primordialzwergwuchs führt. Der Dosierungsbereich für eine sublinguale oder orale Verabfolgung beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht und pro Tag. Der Dosierungsbereich für eine intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung liegt im allgemeinen zwischen etwa 10 /Ug und etwa 1 mg pro kg Körpergewicht und pro Tag, und er macht vorzugsweise etwa 5 .ug bis etwa 100 ,ug pro kg Körpergewicht und pro Tag aus. Der Dosierungsbereich kann selbstverständlich in einem breiten Bereich schwanken und ist abhängig von dem jeweiligen Zustand des zu behandelnden Subjekts sowie dem Ausmaß des Krankheitsbildes.

Die Verbindung der Formel I läßt sich ferner auch in Form von Tabletten verabreichen, die auch noch andere Bestandteile enthalten. Als solche Bestandteile lassen sich inerte Verdünnungsmittel oder Träger verwenden, wie Magnesiumcarbonat oder Lactose, zusammen mit üblichen Zersetzungshilfsmitteln, wie Maisstärke oder Alginsäure, sowie Schmiermitteln, wie Magnesiums tear at. Die Menge an Träger- oder Verdünnungsmittel macht beispielsweise etwa 5 bis 95 %, vorzugsweise etwa 50 bis 85 %, der fertigen Zubereitung aus. Bei der fertigen Zubereitung können ferner auch noch geeignete Aromastoffe verwendet werden, damit sich diese schmackhafter verabreichen läßt.

709846/0869

Möchte man die Verbindung der Formel 1 intravenös verabreichen, dann lassen sich geeignete Träger verwenden, wie beispielsweise isotonische Salzlösungen oder Phosphatpufferlösungen.

Die Herstellung der Verbindung der Formel I wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-cysteinyl(S-p-methoxybenzyl)-Methyliertes Polystyrolharz

Eine Suspension von 20,0 g chlormethyliertem Polystyrolharz (0,75 mMol/g) (Lab System, Inc.) in 150 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) versetzt man mit 3,7 g (7,8 mMol) Cäsiumsalz von N-tert.-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)cystein. Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird das Harz abfiltriert und dann der Reihe nach mit Dimethylformamid, einem Gemisch aus 90 % Dimethylformamid und 10 % Wasser sowie erneut mit Dimethylformamid gewaschen. Zu der Suspension von Harz und Dimethylformamid gibt man dann eine Lösung von 5,5 g Cäsiumacetat in heißem Dimethylformamid. Das so erhaltene Gemisch wird dann 16 Stunden bei Raumtemperatur, 8 Stunden bei 50 ⁰C, 16 Stunden bei Raumtemperatur, 8 Stunden bei 50 ⁰C und 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Harz abfiltriert und der Reihe nach mit Dimethylformamid, einem emisch aus 90 % Dimethylformamid und 10 % Wasser, Dimethylformamid, einem Gemisch aus 90 % Dimethylformamid und 10 % Wasser, Dimethylformamid sowie 95-prozentigem Äthanol gewaschen. Durch nachfolgendes Trocknen des Harzes unter Vakuum bei 50 ⁰C gelangt man zu dem im Titel genannten Produkt, das O,45 % Stickstoff (0,32 mMol/g) und 0,80 % Schwefel (0,25 mMol/g) enthält.

709846/0869

Beispiel 2

tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-alanyl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-D-(cyclopentyloxycarbonyl)lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-iN-cyclopentyloxycarbonyl)lysyl-L-(O-benzyl)threonyl-L-phenylananyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-(O-benzyl)seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)cysteinyl-Methyliertes Polystyrolharz

Ein auf einem Schüttler befindliches 3OO ml fassendes Reaktionsgefäß versetzt man mit 16,26 g des Produkts von Beispiel 1. Im Anschluß daran führt man entsprechende Folgen von Schutzgruppeabspaltung, Neutralisation, Kupplung und Rekupplung durch, um auf diese Weise eine jede Aminosäure an das Peptid zu addieren. Die gesamte Reaktionsfolge wird unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisiergerätes mit der Bezeichnung Beckman 990 durchgeführt. Es wird mit folgenden Aminosäuren in der angegebenen Sequenz gearbeitet: (1) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-serin; (2) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin; (3) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin; (4) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin; (5) N^{a p a}-tert.-Butyloxycarbony.l-NC -cyclopentyloxycarbonyl-L-lysin; (6) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophan; (7) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin; (8) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin; (9) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-p-nitrophenylester; (10) N " -tert.-Butyloxycarbonyl-N ^--cyclopentyloxycarbonyl-D-lysin; (11) N-tert.-Butyloxycarbonyl- (S-p-methoxybenzyl) -L-cystein; (12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-D-alanin und (13) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-alanin. Die Sequenz der Schutzgruppenabspaltung, Neutralisation, Kupplung und Rekupplung zur Einführung einer jeden Aminosäure in das Peptid läuft wie folgt ab: (1) Dreimaliges Waschen (10 ml/g Harz) über eine Zeitspanne von 3 Minuten mit jeweils Chloroform, (2) Entfernen der BOC-Gruppe durch jeweils zweimalige Behandlung über eine Zeit-

709846/0869

?71R718

spanne von 20 Minuten mit jeweils 10 ml eines Gemisches aus 30 % Trifluoressigsäure, 65 % Chloroform und 5 % Triäthylsilan pro g Harz, (3) zweimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Chloroform, (4) einmaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von 3 Minuten mit Methylenchlorid, (5) dreimaliges Waschen (1O ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (6) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (7) Neutralisation durch dreimalige Behandlung über jeweils eine Zeitspanne von 3 Minuten mit jeweils 10 ml einer 3 %-igen Lösung von Triethylamin in Methylenchlorid pro g Harz, (8) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (9) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 90 % tert.-Butylalkohol und 1O % tert.-Amylalkohol, (10) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (11) Zugabe von 0,8 mMol pro g Harz der geschützten Aminosäure und 0,8 mMol pro g Harz Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml pro g Harz Methylenchlorid und anschliessendes Vermischen über eine Zeitspanne von 120 Minuten, (12) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (13) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 9O % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (14) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (15) Neutralisation durch jeweils dreimalige Behandlung über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils 10 ml einer 3-prozentigen Lösung von Triäthylamin in Methylenchlorid pro g Harz,

7098^6/0869

7718718

(16) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (17) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (18) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (19) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Dimethylformamid, (20) Zugabe von 0,8 mMol pro g Harz der geschützten Aminosäure und 0,8 mMol pro g Harz N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml pro g Harz eines 1:1-Gemisches aus Dimethylformamid und Methylenchlorid unter anschließendem Vermischen über eine Zeitspanne von 120 Minuten, (21) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Dimethylformamid, (22) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (23) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 90 % tert.-Butylalkohol und 1O % tert.-Amylalkohol, (24) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (25) Neutralisation durch dreimalige Behandlung über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils 10 ml einer dreiprozentigen Lösung von Triäthylamin in Methylenchlorid pro g Harz, (26) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid, (27) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils einem Gemisch aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol und (28) dreimaliges Waschen (10 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Methylenchlorid.

Die obige Behandlungsfolge verwendet man zur Addition einer jeden Aminosäure mit Ausnahme des Asparaginrests. Die Einführung des Asparaginrests erfolgt über seinen aktiven

709846/0869

p-Nitrophenylester. Hierzu modifiziert man die oben angeführte Verfahrensstufe (11) in folgendes Dreistufenverfahren:

(a) dreimaliges Waschen (7,5 bis 15 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Dimethylformamid,

(b) Zugabe von 1,0 mMol pro g Harz p-Nitrophenylester von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 7,5 bis 15 ml pro g Harz eines 1:1 Gemisches aus Dimethylformamid und Methylenchlorid unter anschließendem Vermischen über eine Zeitspanne von 720 Minuten und (c) dreimaliges Waschen (7,5 bis 15 ml pro g Harz) über eine Zeitspanne von jeweils 3 Minuten mit jeweils Dimethylformamid. Auch die oben angeführte Verfahrensstufe (20) wird so abgewandelt, daß sie der oben angeführten Verfahrensstufe (b) entspricht, mit der Ausnahme, daß man hierbei mit einem 3:1 Gemisch aus Dimethylformamid und Methylenchlorid arbeitet.

Das fertige Peptidharz wird abschließend unter Vakuum getrocknet. Eine Probe dieses Produkts hydrolysiert man durch 21 Stunden langes Rückflußkochen in einem Gemisch aus Chlorwasserstoff säure und Dioxan. Die AminosäureanaIyse des erhaltenen Produkts ergibt folgende Werte, wobei Lysin als Standard dient: Asn 1,03; 2Thr 1,96; Ser O,98; 2Ala 2,32; 3Phe 2,91; 2Lys 2,00; Trp 0,80. Das Cystein wird nicht bestimmt, da es durch die Analysenmethode zerstört wird.

Beispiel 3

L-Alanyl-D-alanyl-L-cysteinyl-D-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cy stein

Ein Gemisch aus 10 ml Anisol und 10 ml Äthylmercaptan versetzt man mit 4,04 g des geschützten Tetradecapeptidharzes von Beispiel 2. Das Gemisch wird in flüssigem Stickstoff gekühlt und

709846/0869

i ?7187Ί8

dann durch Destillation mit 43 ml flüssigem Fluorwasserstoff versetzt. Anschließend läßt man das erhaltene Gemisch auf O C kommen und rührt es 1,5 Stunden. Sodann destilliert man den Fluorwasserstoff ab und versetzt das restliche Gemisch mit Äther. Das dabei erhaltene feste Material wird durch Filtrieren gesammelt und mit Äther gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid extrahiert man von dem Harzgemisch unter Verwendung einer 1 molaren Essigsäure. Die Essigsäurelösung wird dann unmittelbar im Dunkeln zur Trockne lyophilisiert. Den dabei erhaltenen leicht gelben Feststoff suspendiert man in einem Gemisch aus 15 ml von Sauerstoff befreiter 1 molarer Essigsäure und 4 ml Eisessig. Die so gewonnene Suspension wird filtriert, und das Filtrat absorbiert man an eine Sephadex G-25 F-Säule. Für die Chromatographierung wird unter folgenden Bedingungen gearbeitet: Lösungsmittel: von Sauerstoff befreite 0,2 molare Essigsäure, Säulengröße: 7,5 χ 150 cm. Temperatur: 26 ⁰C, Strömungsgeschwindigkeit: 689 ml pro Stunde, Fraktionsvolumen: 24,1 ml.

Eine Absorption bei 280 m,u für jede Fraktion, aufgetragen gegen die Fraktionszahl, ergibt zwei Hauptmaxima mit einigen kleinen Maxima. Es werden fünf Fraktionssätze gesammelt. Hierbei kombiniert man folgende Fraktionen, wobei die Volumina ebenfalls angegeben sind:

Fraktionen 111-195 (2651-4699 ml)

Fraktionen 196-215 (47OO-5181 ml)

Fraktionen 216-246 (5182-5928 ml)

Fraktionen 247-255 (5929-6145 ml)

Fraktionen 256-310 (6146-7471 ml).

Die obigen fünf Proben lyophilisiert man im Dunkeln zur Trockne und sammelt sie dann. Eine UV-spektroskopische Untersuchung zeigt, daß die zweite Probe (68,5 mg) das beste Produkt ist.

709846/0869

?718718

Beispiel 4

2 4
Oxidation zu D-AIa , D-Lys -Somatostatin

2 4
Das reduzierte D-AIa , D-Lys -Somatostatin von Beispiel 3 verdünnt man mit destilliertem Wasser bis auf eine Konzentration von 50 ,ug pro ml. Sodann versetzt man diese Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,9 mit konzentriertem Ammoniumhydroxid. Anschließend rührt man die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln über eine Zeitspanne von 68 Stunden. Eine nachfolgende Ellman-Titration ergibt die Beendigung der Oxidation.

Das Reaktionsgemisch wird sodann unter Vakuum auf ein Volumen von 10 ml konzentriert, worauf man 14 ml einer 50-prozentigen Essigsäure zugibt. Die so erhaltene Lösung gibt man dann auf eine Sephadex G-25 F-Säule. Die Chromatographie wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel: von Sauerstoff befreite 50-prozentige Essigsäure, Säulengröße: 5,0 χ 90 cm, Temperatur: 26 ⁰C, Strömungsgeschwindigkeit: 321 ml pro Stunde, Fraktionsvolumen: 18,75 ml.

Eine Absorption bei 280 m,u einer jeden Fraktion, aufgetragen gegen die Fraktionszahl, zeigt zwei große Maxima. Das erste Maximum entspricht aggregierten Formen des Produkts. Das zweite Maximum stellt ein gutes monomeres Produkt dar. Das dem zweiten Maximum entsprechende Produkt wird gesammelt, mit destilliertem Wasser verdünnt und zur Trockne lyophilisiert. Den dabei erhaltenen Feststoff löst man dann in 7 ml entgaster 0,2 molarer Essigsäure, worauf man die Lösung auf eine Sephadex G-25 F-Säule gibt. Es wird unter folgenden Bedingungen chromatographiert: Lösungsmittel: von Sauerstoff befreite

709846/0869

7718718

0,2 molare Essigsäure, Säulengröße: 5,0 χ 150 cm, Temperatur: 26 ⁰C, Strömungsg«
volumen: 16,5 ml.

26 ⁰C, Strömungsgeschwindigkeit: 495 ml pro Stunde, Fraktions-

Eine Absorption bei 280 m.u einer jeden Fraktion, aufgetragen gegen die Fraktionszahl, ergibt ein großes Maximum mit einer Schulter an jeder Seite. Eine UV-spektroskopische Untersuchung zeigt, daß es sich bei dem Material mit dem großen Maximum um ein gutes Produkt handelt. Die Fraktionen 156 bis 17O (Abstromvolumina 2558 - 2805 ml) werden vereinigt und im Dunkeln zur Trockne lyophilisiert, wodurch man 21,55 mg des gewünschten Produkts erhält.

Optische Drehung /alpha/_D = -43,0 (1-prozentige Essigsäure).

Aminosäureanalyse: AIa + D-AIa_{1 g8} 2CyS_{1 g} 2Lys_{2 o}Asn.. _

^3Phe2,88 ^TrP_O;89 ^Thr1,92^SerO,88·

2 4
Das D-AIa , D-Lys -Somatostatin wird hinsichtlich seiner in vitro Wirksamkeit zur Hemmung der Magensäuresektretion untersucht. Hierzu tötet man zunächst 12,7 bis 15,2 cm große Ochsenfrösche durch Durchschneiden des Rückenmarks. Im Anschluß daran befreit man die Magenschleimhaut jeweils von den Muskelschichten und zerschneidet sie der Länge nach in zwei Teile. Die beiden Hälften befestigt man dann in getrennten Kammern aus Acrylkunststoff. Die freigelegte Abscheidungsfläche be-

2
trägt 2,85 cm , und das Volumen einer jeden Hälfte der Kammer macht 5 ml aus. Die zum Baden der Mucosa verwendeten Lösungen entsprechen denjenigen, wie sie in Biochemica et Biophysics Acta, 321, 553-560 (1973) beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß die Serosalflüssigkeit zusätzlich noch Natriumdihydrogenphosphat in einer Konzentration von 1 mMol enthält. Beide Seiten der Kammer belüftet man mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Zur Ermittlung der Säureabschei-

709846/Ü869

Sfe 7718718

dungsgeschwindigkeit hält man die Abscheidlösung auf einen pH-Wert von 4,5.

Zur Stimulierung der Säureabscheidung arbeitet man auf der Serosalseite des Gewebes mit einer Pentagastrinkonzentration von 1 χ 10 Mol pro Liter. Die Serosalflüssigkeit wird alle 40 Minuten erneuert, um auf diese Weise einen Abfall der Pentagastrinkonzentration durch eine enzymatische Hydrolyse der Peptidbindungen zu verhindern. Zum Zusatz der zu untersuchenden Verbindung gibt man diese jeweils beim Wechseln der Badlösung in die Serosalflüssigkeit.

Spontane Säureausstöße einer durch Pentagastrin stimulierten Sekretion in einer Menge von weniger als 8 Mikroäquivalent Säure pro Stunde dienen als Kontrollen. Der Hemmeffekt einer Magensäuresekretion wird als prozentuale Hemmung gegenüber den Kontrollzeiten ausgedrückt, die der Zufuhr der zu untersuchenden Verbindung zum Serosalpuffer vorangehen. Es wird lediglich eine der Hälften der Magenmucosa mit der zu untersuchenden Verbindung behandelt, während die andere Hälfte als Kontrolle dient, um so zu überprüfen, ob das Gewebe noch lebt. Nach Einstellung einer Gleichgewichtssekretion gibt man die zu untersuchende Verbindung in solcher Menge zur Nährlösung, daß sich eine Inhibitorkonzentration von 1 χ Mol pro Liter ergibt. Die Säure wird kontinuierlich bis auf pH 4,5 titriert, wobei man das Volumen von 12,5 mMol Natriumhydroxidlösung alle 20 Minuten zur Bestimmung der Säureabscheidungsgeschwindigkeit verwendet. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in Mikroäquivalent Säure ausgedrückt, die pro Stunde abgeschieden werden.

Unter Anwendung dieser Bestimmungsmethode erhält man mit Somatostatin eine prozentuale Hemmung der Magensäureabscheidung von 54,64 plus minus 6,05, während das

709846/0869

7718718

2 4
D-AIa , D-Lys -Somatostatin eine prozentuale Hemmung der Magensäuresekretion von 39,31 plus minus 8,09 ergibt.

2 4
Das D-AIa , D-Lys -Somatostatin wird bezüglich seiner in vivo Hemmung der Magensäuresekretion auch an Hunden untersucht. Bei Hunden mit chronischer Magenfistula und Heidenhainbeutel induziert man eine Salzsaureabscheidung im Magen durch Infusion des C-endständigen Tetrapeptids von Gastrin in einer Menge von 0,5 ,ug pro kg und pro Stunde. Ein Hund dient als Kontrolle und erhält lediglich das Tetrapeptide Einem anderen Hund gibt man das Tetrapeptid und Somatostatin. Weiteren Hunden gibt man anstelle von Somatostatin die zu untersuchende Verbindung. Nach 1 Stunden langer Gleichgewichtsabscheidung von HCl infusiert man den Tieren Somatostatin oder die zu untersuchende Verbindung in einer Menge von 3 yug pro kg und Stunde über eine Zeitspanne von 1 Stunde. Es werden entsprechende Magensäureproben über eine Zeitspanne von insgesamt 1,5 Stunden in Intervallen von 15 Minuten gesammelt. Im Vergleich zur Kontrolle hemmt Somatostatin die Magensäuresekretion um 99,1 %, während man mit

2 4
D-AIa , D-Lys -Somatostatin eine Hemmung von 50,9 % erhält.

An einem weiteren Versuch wird gezeigt, daß das D-AIa ,

4
D-Lys -Somatostatin auch die Pancreatssekretion hemmt. Bei 3 Hunden mit sowohl Pancreatsfistula als auch gesamter Magenfistula induziert man eine Pancreatsektretion durch Infusion von Sekretin in einer Menge von 0,5 Einheiten pro kg und Stunde sowie eine ChlorwasserstoffSäureproduktion im Magen durch Infusion von Tetragastrin in einer Menge von 0,5,ug pro kg und Stunde. Nach Einstellung eines Gleichgewichtszustandes beginnt man mit der Verabfolgung der zu untersuchenden Verbindung. Einer der Hunde dient als Kontrolle.

Von den anderen beiden Hunden gibt man einem Somatostatin,

2 4

während der zweite D-AIa , D-Lys -Somatostatin erhält, wobei man jeweils über eine Zeitspanne von 1 Stunde mit Mengen von 3 ,ug pro kg und Stunde arbeitet. Bei diesen Untersuchungen ergibt sich gegenüber der Kontrolle folgende prozentuale Veränderung der maximalen Hemmwirkung:

709846/0869

-3A-

a?

5718718

PancreasSekretion

Volumen ^HC03 Protein

Somatostatin

-72

-85,1

-69,4

D-AIa², D-Lys⁴-Somatostatin

-61

-68

-55,4

2 4
Das D-AIa , D-Lys -Somatostatin untersucht man ferner auch bezüglich seiner Wirksamkeit zur Freisetzung von Wachstumshormon. Für diese Untersuchungen verwendet man reife männliche Spraque-Dawley-Ratten (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). Die Untersuchungsmethode stellt eine Modifikation des in Endocrinology 94, 184 (1974) beschriebenen Verfahrens dar. Man arbeitet mit 5 Gruppen aus jeweils 8 Ratten. Allen Ratten eines bestimmten Versuchs verabreicht man zur Stimulierung der Abscheidung von Wachstumshormon zunächst Natriumpentobarbital. Eine Tiergruppe dient als Kontrollgruppe und erhält lediglich eine Kochsalzlösung. Zwei Tiergruppen gibt man Somatostatin, und zwar einmal in einer Menge von 2 .ug pro Ratte subkutan und zum anderen Mal in einer Menge von 50 ,ug pro Ratte ebenfalls subkutan. Die anderen beiden Tier-

2 4

gruppen erhalten D-AIa , D-Lys -Somatostatin, und zwar einmal in einer Menge von 2 ,ug pro Ratte subkutan und zum anderen Mal in einer Menge von 50 ,ug pro Ratte ebenfalls subkutan. Anschließend bestimmt man das Ausmaß der Hemmung der Serumwachstumshormonkonzentration in Abhängigkeit von der Kontrollgruppe und vergleicht die relativen Wirksamkei-

2 4
ten von D-AIa , D-Lys -Somatostatin und Somatostatin selbst

miteinander.

709846/0869

?718718

Bei einer Dosierungshöhe von 2,ug pro Ratte stimuliert das

2 4-D-AIa , D-Lys Somatostatin die Wachstumshormonabscheidung um 114 % gegenüber der Kontrolle, während Somatostatin überhaupt keinen Effekt auf die Wachstumshormonabscheidung hat. Bei einer Dosierungshöhe von 5O,ug pro Ratte ergibt D-AIa ,

4 '

D-Lys -Somatostatin eine Stimulierung der Wachstumshormonabscheidung von nahezu 2OO % gegenüber der Kontrolle, während Somatostatin selbst hier zu einer 33-prozentigen Hemmung führt.

2 4

D-AIa ,D-Lys -Somatostatin untersucht man ferner auch hinsichtlich seiner in-vivo-Wirksamkeit zur Hemmung einer Glucagon- und Insulinabscheidung nach Stimulierung mit L-Alanin. Normale Bastardhunde beiderlei Geschlechts läßt man über Nacht hungern. Man entnimmt den Tieren Kontrollblutproben und beginnt dann mit einer intravenösen Infusion von Salzlösung, Somatostatin

2 4
oder D-AIa ,D-Lys -Somatostatin. Nach 30 Minuten verabreicht man den Hunden über eine Zeitspanne von 15 Minuten zusätzlich L-Alanin. Die Infusion von Salzlösung, Somatostatin oder

2 4

D-AIa ,D-Lys -Somatostatin führt man noch 15 Minuten nach beendeter Infusion des L-Alanins fort. Die Gesamtdosis an infu-

2 4

siertem Somatostatin oder D-AIa ,D-Lys -Somatostatin beträgt 2OO bis 500 .ug/Hund (0,20 bis O,3O ,ug/kg/Minute), und die Gesamtdosis an infusiertem L-Alanin liegt bei 1 mMol/kg.

Eine Somatostatininfusion führt zu einer Erniedrigung der Grundseruminsulinkonzentration und einer Hemmung der Konzentrationserhöhung von sowohl Glucagon als auch Insulin während der Infusion von L-Alanin. Im Vergleich dazu ergibt das

2 4

D-AIa ,D-Lys -Somatostatin bei einer Infusion mit einer Geschwindigkeit von 0,253 ,ug/kg/Minute einen geringen Abfall der Grundsekretion von sowohl Iusulin als auch Glucagon und führt zu einer teilweisen Hemmung der Zunahme der Serumkonzentration von sowohl Insulin als auch Glucagon, zu der es normalerweise bei der Infusion von L-Alanin kommt.

709846/0869

30 ?718718

2 4

Das D-AIa ,D-Lys -Somatostatin wird ferner auch bezüglich seiner in-vivc—Aktivität zur Hemmung einer Glucagonabscheidung nach Stimulierung mit Insulin untersucht. Hierzu läßt man normale Bastardhunde beiderlei Geschlechts über Nacht hungern. Sodann entnimmt man den Tieren Vergleichsblutproben und beginnt mit einer intravenösen Infusion von Salzlösung,

2 4 ■ ·

Somatostatin oder D-AIa ,D-Lys -Somatostatin. Nach 15 Minuten spritzt man den Tieren intravenös Insulin in einer Menge von 0,3 Einheiten pro Kilogramm. Die Infusion von Salzlösung, Somatostatin oder der zu untersuchenden Verbindung wird 2 Stunden fortgeführt, wobei man den Tieren zu verschiedenen Zeitspannen während der gesamten Untersuchung Blutproben entnimmt. Die Gesamtdosis an Somatostatin oder der zu untersuchenden Verbindung beträgt 120 bis 260 ,ug/Hund (0,07 bis 0,13 ,ug/kg/Minute). Eine Verabreichung von Isulin ergibt eine Erniedrigung der Blutglucosekonzentration und eine Erhöhung der Serumglucagonkonzentration. Eine Infusion von Somatostatin blockiert die Zunahme der Serumglucagonkonzentration, hat jedoch keinen Einfluß auf eine Erniedrigung der Blutglucosekonzentration.

Infusiert man anstelle von Somatostatin den Versuchstieren

2 4
dagegen D-AIa ,D-Lys -Somatostatin in einer Menge von 0,114 yug/kg/Minute, dann ergibt sich hier keine Hemmung der durch die Verabreichung von Insulin hervorgerufenen Zunahme der Serumglucagonkonzentration.

709846/0869

Claims (10)

1. Patentansprüche

   ' 1./ Verbindung der Formel I, nämlich H-L-Ala-D-Ala-L-^V£ys-D-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L- Thr-L-Ser-L-Cys-OH, und ihre pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der in Anspruch 1 genannten Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man das entsprechende geradkettige Tetradecapeptid der Formel III, H-L-Ala-D-Ala-L-Cys-D-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, mit einem Oxidationsmittel umsetzt.
3. 3. Zwischenprodukt der Tormel II, nämlich

   R-L-Ala-D-Ala-L-Cys(R₁)-D-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R₅) L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-Cys(R₁)-X,

   R Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe bedeutet,

   R₁ für Wasserstoff oder eine Thioschutzgruppe steht, R_ Wasserstoff oder eine £-Aminoschutzgruppe ist,

   R₃ und R₄ jeweils Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe sind,

   R₅ Wasserstoff oder Formyl darstellt und X für Hydroxy oder einen Rest der Formel

   709846/0869

   ORIGINAL INSPECTED

   * 27Τ8718

   β=· iiarz

   steht, bei dem das Harz Polystyrol darstellt,

   mit der Maßgabe, daß die Substituenten R, R₁, R„, R_, R. und R₅ jeweils Wasserstoff sind, falls der Substituent X für Hydroxy steht, und daß ferner die Substituenten R, H₁, R₂, R₃ und R₄ etwas anderes als Wasserstoff bedeuten, falls der Rest X für

   steht.
4. 4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß X für Hydroxy steht.
5. 5. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch ge

   kennzeichnet , daß X für

   ·=· j Harz

   —O-CH 2—·

   steht.

   709846/0869
6. 6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß R für tert.-Butyloxycarbonyl steht.
7. 7. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ für p-Methoxybenzyl steht.
8. 8. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß R₂ Cyclopentyloxycarbonyl bedeutet.
9. 9. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch g e -

   kennzeichi Benzyl darstellen.

   kennzeichnet , daß die Substituenten R₀ und R-

   3 4
10. 10. Verbindung nach Anspruch 5 mit der Formel

    N-(BOC)-L-Ala-D-Ala-L-(PMB)Cys-D-(CPOC)Lys-L-Asn-L-Phe-

    L-Phe-L-Trp-L-(CPOC)Lys-L-(BzI)Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-

    _β „ Harz

    / I

    L- (BzI) Ser-L- (PMB) CyS-O-CH₂- «k

    7fjytU6/0869