DD228266A5

DD228266A5 - Verfahren zur herstellung von wff-analoga

Info

Publication number: DD228266A5
Application number: DD84266649A
Authority: DD
Inventors: Peter Bohlen; Paul E Brazeau; Frederick St Esch; Ling Nicholas Chai-Kwan; William B Wehrenberg; Roger Ch L Guillemin
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1984-08-27
Publication date: 1985-10-09
Also published as: AU577542B2; KR900006560B1; IE842199L; AU3244984A; PT79094A; FI81589C; DK161835B; DE3461641D1; DK413084D0; NO167867C; FI843355A0; ES535455A0; KR850001536A; JPH0676437B2; EP0137689B1; YU45907B; DK161835C; ES8606401A1; DK413084A; FI843355L

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Diese Peptide enthalten die folgende Sequenz (I): Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R14-Val-Arg-Leu-Y. Das erfindungsgemaesse Verfahren besteht aus dem Bilden einer Verbindung mit mindestens einer schuetzenden Gruppe und der Formel (II) und dem Abspalten der schuetzenden Gruppe oder Gruppen von der Verbindung der Formel (II) zwecks Schaffung eines Peptids der Formel (I) oder eines davon abgeleiteten biologisch aktiven Fragments und wenn gewuenscht, dem Umwandeln des resultierenden Peptids in davon abgeleitetes nicht-toxisches Additionssalz. Das Peptid oder ein davon abgeleitetes biologisch aktives Fragment oder auch davon abgeleitete Analoga mit wohlbekannten Substitutionen und/oder Additionen wie auch nichttoxische Salze der vorgenannten Substanzen koennen an Saeuger verabreicht und diagnostisch angewendet werden. Speziell eignen sich die Peptide zur Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormonen wie auch zur Wachstumsbeschleunigung bei warmbluetigen nichthumanen Tieren der jeweiligen Spezies und/oder zur Leistungsverbesserung in der Aquakultur.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Einfluß auf die Hirnanhangdrüse bei Säugern. Speziell bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse beschleunigen und die speziell hinsichtlich besonderer Spezies von Nutzen sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Im Jahre 1982 wurde ein hypothalamischer Freisetzungsfaktor für Hirnanhangdrüsen-Wachstumshormon oder Somatotropin aus einem humanen Inselzelltumor isoliert, gereinigt, charakterisiert und synthetisiert. Im Rahmen der Prüfung zeigte sich, daß er die Freisetzung von Wachstumshormon (WM) durch die Hirnanhangdrüse fördert. Dieses Peptid hat die Sequenz: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂. Nunmehr hat sich gezeigt, daß humaner hypothalamisches Wachstumshormon freisetzender Faktor (hWFF) die gleiche Struktur aufweist, Bohlen et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 114,3, S.930-936 (1983).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitsteilung neuer WFF-Analoga mit höherer biologischer Potenz für veterinärmedizinische Zwecke, welche die gleiche Struktur wie natürliche Hormone aufweisen und keine unerwünschten Nebenwirkungen verursachen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue WFF-Analoga mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Nunmehr sind aus gereinigten Extrakten von procinem, bovinem, caprinem und ovinem Hypothalamus44-restige Polypeptide isoliert und c arakterisiert worden. Jedesmal zeigten sich Differenzen von nur wenigen Aminosäureresten gegenüber der im folgenden dargestellten Formel von hWFF.

In bezug auf die Zusammensetzung von hWFFkann porcinerWFF(pWFF) als das Analogen [Arg³⁴, GIn³⁸, Val⁴²]-hWFF(1-44)-NH₂ ausgedrückt werden, was bedeutet, daß er die Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-lvlet-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH₂ aufweist. Er wird im folgenden als pWFF oder porcines Somatocrinin bezeichnet. Dieses Peptid kann zur Beschleunigung des Wachstums von warmblütigen Tieren — speziell Schweinen —, von kaltblütigen Tieren sowie in der Aquakultur verwendet werden.

In bezug auf die Zusammensetzung von hWFF kann boviner WFF (bWFF) als das Analogon [Asn²⁸, Arg³⁴, GIn³⁸, Lys⁴¹, Val⁴²]-hWFF-(1-44)-NH₂ ausgedrückt werden, was bedeutet, daß er die Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg- LeU-NH₂ aufweist. Er wird im folgenden als bWFF oder bovines Somatocrinin bezeichnet. Capriner WFF hat die gleiche Formel und kann zur Beschleunigung des Wachstums von warmblütigen Tieren — speziell von Rindern —, von kaltblütigen Tieren

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sowie in der Aquakultur eingesetzt werden. Er kann desgleichen dazu verwendet werden, die Milchleistung bei Kühen sowie Ziegen zu steigern, um auf diese Weise Milch für die Herstellung von Käsespezialitäten zu gewinnen. In bezug auf die Zusammensetzung von hWFF kann oviner WFF (oWFF) als das Analogon [He¹³, Asn²⁸, Arg³⁴, GIn³⁸, Lys⁴¹, Val⁴²]-hWFF-(1-44)-NH₂ ausgedrückt werden, was bedeutet, daß er die Formel H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH₂ aufweist. Er wird im folgenden als oWFF oder ovines Somatocrinin bezeichnet. Dieses Peptid kann zur Beschleunigung des Wachstums von warmblütigen Tieren- speziell Schafen —, von kaltblütigen Tieren sowie in der Aquakultur eingesetzt werden. Es kann des weiteren zur Steigerung der Milchleistung bei Mutterschafen zwecks Gewinnung von Milch für Käsespezialitäten eingesetzt werden.

Erfindungsgemäße Veterinäre und pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten entweder pWFF, bWFF oder oWFF, ein davon abgeleitetes Analogon oder biologisch aktives Fragment oder ein daher rührendes nichttoxisches Salz, dispergiert in einer pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Flüssigkeit oder festen Trägersubstanz. Derartige Zusammensetzungen können in der klinischen Medizin — sowohl der Human- als auch der Veterinärmedizin — in akuter oder chronischer Verabreichung zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken verwendet werden. Darüber hinaus können sie zur Beschleunigung des Wachstums an Muskelmasse und/oder Milchleistung bei Schweinen, Rindern, Ziegen, Schafen oder anderen Tieren eingesetzt werden.

Bei der zur Definierung der Peptide verwendeten Nomenklatur handelt es sich um die von Schroder & Lubke in „The Peptides", Academic Press (1965) beschriebene, wobei in Übereinstimmung mit der herkömmlichen Darstellungsweise die Amino-Gruppe am N-Terminal links und die Carboxyl-Gruppe am C-Terminal rechts erscheint. Wo der Aminosäurerest isomere Formen hat, so wird — sofern nicht anderweitig ausdrücklich angegeben — die L-Form der Aminosäure dargestellt. Die Erfindung vermittelt, synthetische WFF-Peptide mit der folgenden Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R₁3-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-R2₈-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R4₁-Val-Arg-Leu-Y, wobei R₁₃ für VaI oder He steht; R₂a ist Ser oder Asn; R₄₁ ist Arg oder Lys; und Y ist OH oder NH₂. Desgleichen einbezogen sind biologisch aktive Fragmente, die sich vom N-Terminus bis mindestens zumRest-28 (oder bis mindestens etwa Rest-34 für pWFF) erstrecken, wobei Y entweder OH oder NH₂ sein kann.

Die Peptide können vermittels jedweder geeigneter Methode synthetisiert werden, so etwa durch ausschließliche Festphasentechniken, durch teilweise Festphasentechniken, durch Fragmentkondensation, durch klassische Lösungsverknüpfungen oder auch durch Anwendung unlängst entwickelter rekombinanter DNA-Techniken. Die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese sind beispielsweise im Textbuch „Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, dargelegt und werden durch die Offenlegung des US-Patents Nr.4105603, herausgegeben am 8.August 1978, exemplifiziert. Die Fragmentkondensationsmethode der Synthese ist im US-PS Nr.3972859 (3. August 1976) exemplifiziert. Andere verfügbare Synthesen werden durch die US-PS Nr.3842067 (15. Oktober 1974) sowie Nr.3862925 (28. Januar 1975) exemplifiziert. Wahrscheinlich wird die Herstellung der synthetischen Peptide unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken erfolgen, um den Ansprüchen der großtechnischen Herstellung zur entsprechen. Die Synthese vermittels Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken sollte im Rahmen der vorliegenden Beschreibung so verstanden werden, daß sie auch die Einbeziehung der geeigneten Nutzung einer Struktur-Gen-Codierung für eine Form von WFF vorsieht. Der synthetische WFF kann durch Transformieren eines Mikroorganismus unter Verwendung eines Expressionsvektors einschließlich eines Promoters und Operators gemeinsam mit einem derartigen strukturellen Gen sowie durch Hervorrufung eines derartigen transformierten Mikroorganismus zwecks Darstellung des WFF gewonnen werden. Desgleichen kann ein nichthumanes Tier zur Herstellung von WFF vermittels Gen-farming verwendet werden, wobei ein derartiges strukturelles Gen sowie die im US-PS Nr.4276282 (30. Juni 1981) dargelegten allgemeinen Techniken angewendet werden können, oder wobei auch die Mikroinjektion von Embryos gemäß Beschreibung in W083/o1783 — veröffentlicht am 26. Mai 1983 — sowie in WO82/04443 — veröffentlicht am 23. Dezember 1982 — genutzt werden kann. Der synthetische WFF kann aber auch direkt in dem Tier, dessen Wachstum beschleunigt werden soll, vermittels der in den beiden WO-Publikationen beschriebenen Techniken produziert werden.

Wie bei den Synthesen des Kopplungstyps erfolgt das Schützen der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurekomponenten mit geeigneten schützenden Gruppen, wobei dies verhindert, daß es an jener Stelle zu einer chemischen Reaktion kommt, bevor die Gruppe endgültig entfernt ist. Ebenso üblich ist das Schützen einer Alpha-Aminosäure-Gruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment während des an der Carboxyl-Gruppe erfolgenden Reagierens jener Einheit, wobei anschließend die selektive Entfernung der Alpha-Amino-schützenden Gruppe vorgenommen wird, um so die darauffolgende Reaktion an jener Stelle stattfinden lassen zu können. Dementsprechend ist es üblich, als Schritt innerhalb der Synthese eine Intermediärverbindung zu produzieren, welche jeden der in der Peptidkette in ihrer gewünschten Sequenz lokalisierten Aminosäurereste mit an den jeweiligen Resten angeknüpften seitenkettenschützenden Gruppen beinhaltet. Als ebenfalls innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung befindlich gelten Intermedinärverbindungen der Formel: X^TyriX^-Ala-AspiX^-Ala-lle-Phe-ThriX^Asn-SerfX^-TyrtX^-ArgtX^-LysiX^-R^-Leu-Gly-Gln-Leu-SeriX^-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-lle-Met-R₂₈(X⁵)-Arg(X^e)-Gln-Gln-Gly-Glu(X³)-Arg(X⁶)-Asn-Gln-Glu(X³)-Gln-Gly-Ala-R₄₁(X⁶

oder X⁷)-Val-Arg(X^e)-Leu-X⁸

wobei gilt: X¹ ist entweder Wasserstoff oder eine a-Amino-schützende Gruppe. Bei den durch X¹ markierten a-Aminoschützenden Gruppen handelt es sich um jene, die dafür bekannt sind, daß sie sich im Rahmen der schrittweisen Synthese von Polypeptiden eignen. Unter den durch X¹ bezeichneten Klassen von α-Amino-schützenden Gruppen sind (1) schützende Gruppen des Acyl-Typs wie etwa Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluensulfonyl(Tos), Benzensulfonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chloracetyl, Acetyl und γ-Chlorbutyryl; (2) schützende Gruppen des aromatischen Urethan-Typs wie etwa Benzyloxycarbonyl (Z) sowie substituiertes Z wie etwa p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Bromobenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatische Urethan-schützende Gruppen wie etwa t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) schützende Gruppen des Cycloalkylurethan-Typs wie etwa Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) schützende Gruppen des Thiourethan-Typs wie etwa Phenylthiocarbonyl; (6) schützende Gruppen des Alkyl-Typs wie etwa Triphenylmethyl (trityl), Benzyl; (7) Trialkylsilan-Gruppen wie etwa Trimethylsilan. Die bevorzugte a-Amino-schützende Gruppe ist BOC.

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X² ist eine schützende Gruppe für die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr, ausgewählt unter Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorobenzyl. Die bevorzugte schützende Gruppe ist 2,6-Dichlorobenzyl. X² kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß sich auf der Hydroxyl-Gruppe keine schützende Gruppe befindet.

X³ ist Wasserstoff oder eine esterbildende schützende Gruppe für die Carboxyl-Gruppe von Asp oder GIu und wird unter BzI, 2,6-Dichlorobenzyl, Methyl und Ethyl ausgewählt.

X⁴ und X^s sind schützende Gruppen für die Hydroxyl-Gruppe von Thr und Ser und wird unter Acetyl, Benzoyl, tert-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorobenzyl und CBZ ausgewählt. Die bevorzugte schützende Gruppe ist BzI. X⁴ und/oder X⁵ können Wasserstoff sein, was bedeutet, daß sich keine schützende Gruppe auf der Hydroxyl-Gruppe befindet. X⁶ ist eine schützende Gruppe für die Guanidino-Gruppe von Arg, ausgewählt unter Nitro, Tos, CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOC, oder ist Wasserstoff;

X⁷ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für den Seitenketten-Aminosubstituenten von Lys. Illustrativ für geeignete seitenketten-aminoschützende Gruppen sind 2-Chlorobenzyloxycarbonyl (2-CI-Z), Tos, CBZ, t-Amyloxycarbonyl und BOC. Die Auswahl einer seitenketten-aminoschützenden Gruppe ist nicht kritisch, außer daß es sich um eine Gruppe handeln muß, die wärend der Entschützung der a-Amino-Gruppen im Verlaufe der Synthese nicht entfernt wird. Mithin können die a-Aminoschützende Gruppe und die seitenketten-aminoschützende Gruppe nicht die gleiche sein.

Wahlweise kann die Seitenketten-Amido-Gruppe von GIn und/oder Asn in geeigneter Weise — etwa mit Xanthyl (Xan) — geschützt werden.

X⁸ wird unter jener Klasse ausgewählt, die sich aus OH, OCH₃, Estern, Amiden, Hydraziden, -O-CH₂-Harzträger und -NH-Harzträger zusammensetzt, wobei die Gruppen — mit Ausnahme von OH und Amiden — im weiteren Sinne als schützende Gruppen angesehen werden.

In der Formel für das Intermediärprodukt ist mindestens eine der Komponenten X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ und X⁸ eine schützende Gruppe.

Bei der Auswahl einer speziellen, bei der Synthese der Peptide zu verwendenden seitenkettenschützenden Gruppe werden die folgenden Regeln befolgt: (a) die schützende Gruppe sollte bei jedem Syntheseschritt gegenüber dem Reagenten sowie unter den für das Entfernen der a-Amino schützenden Gruppe ausgewählten Reaktionsbedingungen stabil sein, (b) die schützende Gruppe sollte ihre schützenden Eigenschaften beibehalten und sollte unter Anknüpfungsbedingungen nicht abgespalten werden, und (c) die seitenkettenschützende Gruppe sollte nach der Vollendung der die gewünschte Aminosäuresequenz enthaltenden Synthese unter Reaktionsbedingungen entfernbar sein, welche die Peptidkette nicht verändern. Vorzugsweise werden die Peptide unter Anwendung von Festphasesyntheseverfahren hergestellt, wie sie etwa von Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,85, S. 2149 (1963) beschrieben wurden, wenngleich auch — wie bereits weiter oben erwähnt — noch andere gleichwertige und im Fachgebiet bekannte chemische Synthesen angewendet. Die Festphasensynthese wird vom C-terminalen Ende des Peptides durch Anknüpfen einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen. Ein derartiges Ausgangsmaterial kann durch Anlagern von α-Amino-geschütztem Leu an ein chlormethyliertes Harz oder an ein Hydroxymethyl-Harz vermittels einer Esterbindung, oder aber vermittels einer Amid-Bindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethyl-Harzes wird von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38,1597-98 (1966) beschrieben. Chlormethylierte Harze können käuflich bezogen werden. Die Herstellung eines derartigen Harzes wird von Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1-6, beschrieben. ByA- und MBHA-Harzträgerstoffe sind im Handel erhältlich und werden im allgemeinen nur dann verwendet, wenn das zu synthetisierende gewünschte Polypeptid am C-Terminal ein a-Carboxamid aufweist.

Durch BOC geschütztes Leu wird nach dem Verfahren von Monahan und Gilon, Biopolymer 12, S.2513-2519,1973, an das chlormethylierte Harz angeknüpft, wenn beispielsweise gewünscht wird, das 44-Aminosäure-Peptid mit freiem Carboxy-Terminal zu synthetisieren. Nach dem Koppeln von BOC-Leu wird die α-Amino-schützende Gruppe beseitigt, so etwa durch Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid, durch TFA allein oder durch HCI in Dioxan. Die Entschützung wird bei einer Temperatur zwischen etwa O⁰C und Raumtemperatur vorgenommen. Es können auch andere Standard-Spaltungsreagenzien und -bedingungen für die Entfernung spezifischer α-Amino-schützender Gruppen angewendet werden, wie dies bei Schroder & Lubke, „The Peptides", 1, S.72-75 (Academic Press 1965) beschrieben ist.

Nach Entfernung der a-Amino-schützenden Gruppe von Leu werden die verbleibenden a-Amino- und seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Ordnung verknüpft, um die weiter oben definierte Intermediärverbindung zu gewinnen, wie auch andererseits als eine Alternative zum separaten Zusetzen einer jeden Aminosäure in der Synthese einige von ihnen vor dem Zusetzen zum Festphasenreaktor miteinander verknüpft werden können. Die Auswahl eines passenden Verknüpfungsreagenten bleibt dem erfahrenen Fachmann überlassen. Als Verknüpfungsreagens speziell geeignet ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).

Die bei der Festphasensynthese der Peptide verwendeten aktivierenden Reagenzien sind im Fach-Spezialgebiet wohlbekannt. Beispiele für geeignete aktivierende Reagenten sind: (1) Carbodiimide wie etwa Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid, N-N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI); (2) Cyanamide wie etwa N,N'-Dibenzylcyanamid; (3) Keteimine; (4) Isoxazolium-Salze wie etwa N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat; (5) monozyklische stickstoffhaltige heterozyklische Amide aromatischen Charakters, die ein bis vier Stickstoffanteile im Ring enthalten — wie etwa Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Brauchbare spezifische heterozyklische Amide beinhalten Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxyliertes Acetylen wie etwa Ethoxyacetylen; (7) Reagenten, die mit der Carboxyl-Komponente der Aminosäure ein gemischtes Anhydrid bilden, wie etwa Ethylchloroformiat und Isobutylchloroformiat und (8) Reagenten, die mit der Carboxyl-Komponente der Aminosäure einen aktiven Ester bilden, so etwa stickstoffhaltige heterozyklische Verbindungen mit einer Hydroxy-Gruppe auf einem Ringstickstoff, z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysukzinimid und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT). Andere aktivierende Reagenten sowie deren Verwendung bei der Peptidverknüpfung werden von Schroder & Lubke, siehe oben, im Kapitel III sowie von Kapoor, J. Phar. Sei., 59, S. 1-27 (1970) beschrieben.

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird mit etwa einem zweifachen oder größeren Überschuß in den Festphasenreaktor eingeführt, wobei die Verknüpfung in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF): CH₂CI₂ (1:1) oder in DMF oder CH₂CI₂ allein durchgeführt werden kann. In Fällen, bei denen eine unvollständige Verknüpfung auftrat, wird der Verknüpfungsvorgang vor der Beseitigung der a-Amino-schützenden Gruppe vor dem Anknüpfen der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Verknüpfungsreaktion wird in jedem Stadium der Synthese durch die Ninhydrin-Reaktion angezeigt, wie sie durch E.Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595(1970) beschrieben wurde.

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Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollendet worden ist, wird das intermediäre Peptid vom Harz-Trägerstoff durch Behandlung mit einem Reagens wie etwa flüssigem Wasserstofffluorid beseitigt, welches nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch alle übrigen Seiten kettenschützenden Gruppen X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ und X⁸ sowie die a-Aminoschützende Gruppe X¹ spaltet, um das Peptid zu gewinnen.

Als alternative Möglichkeit kann das intermediäre Peptid durch Alkoholyse vom Harz-Trägerstoff abgeschieden werden, worauf der dargestellte C-terminale Alkylester vermittels Hydrolyse in die Säure umgewandelt wird. Jedwede seitenkettenschützenden Gruppen können dann in der zuvor beschriebenen Weise oder auch vermittels anderer bekannter Vorgehensweisen wie etwa der katalytischen Reduktion (z. 8. Pd auf BaSO₄) gespalten werden. Bei Verwendung von Wasserstofffluorid für das Abspalten, werden zum Zwecke der Reinigung Anisol und Mehtylethylsulfid in das Reaktionsgefäß einbezogen.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Ausführungsbeispiele stellen bevorzugte Verfahren des Synthetisierens von WFF durch die Festphasentechnik dar. Es wird selbstverständlich davon ausgegangen, daß die Synthese eines entsprechend kürzeren Peptidfragmentes auf die gleiche Weise durchgeführt wird, durch die einfache Eliminierung einer erforderlichen Anzahl von Aminosäuren an einem beliebigen Endader Kette; man ist jedoch gegenwärtig der Meinung, daß die biologisch aktiven Fragmente die angezeigte Sequenz beim N-Terminus enthalten sollten.

Ausführungsbeispiel I

Die Synthese von pWFF (1-44) freier Säure mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-G Iy-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gin-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-OH erfolgt in einer schrittweise unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisators auf einem chloromethylierten Harz wie etwa jenem, das 0,9Mäq Cl/g enthält. Das Anknüpfen von BOC-Leu an das Harz erfolgt vermittels der von Monahan et al. in Biopolymers, Volume 12 (1973) S.2513-2519 dargelegten allgemeinen Verfahrensweise und resultiert in der Substitution von ewa 0,22mmol Leu pro Gramm Harz. Sämtliche verwendeten Lösungsmittel werden durch Hindurchleiten eines inerten Gases — vorzugsweise Helium — sorgfältig entgast, um auf diese Weise die Abwesenheit von Sauerstoff zu gewährleisten, welcher den Schwefel des Met-Restes in unerwünschter Weise oxydieren könnte.

Nach dem Entschützen und der Neutralisation wird die Peptidkette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Entschützung, Neutralisation und Addition einer jeden Aminosäure erfolgen in allgemeiner Übereinstimmung mit der im einzelnen im US-PS Nr. 3904594 nach Guillemin et al. dargelegten Verfahrensweise. Die Verknüpfungen werden speziell nach dem im folgenden dargestellten Schema A vorgenommen:

SCHEMA

SCHRITT REAGENTENUNDOPERATIONEN MISCHZEITEN

min

1 CH₂CL₂ Wäsche (zweimal) 0,5

2 50 %Trifluoressigsäure (TFA)

+5 %1,2-Ethandithiol in CH₂CI₂ (einmal) 0,5

3 " 50 %Trifluoressigsäure (TFA)

+5 %1,2-Ethandithiol in CH₂CI₂ (einmal) 20,0

4 CH₂CI₂ Wäsche (dreimal) 0,5

5 CH₃OH Wäsche (zweimal) 0,5

6 10%Triethylamin (Et₃N) in CH₂CI₂

Neutralisation (zweimal) 0,5

7 CH₃OH Wäsche (zweimal) 0,5

8 10%Triethylamin (Et₃N) in CH₂CI₂

Neutralisation (zweimal) 0,5

9 CH₃OH Wäsche (zweimal) 0,5

10 CH₂Cl₂ Wäsche (zweimal) 0,5

11 *Boc-Aminosäure (1 mMol/g Harz) plus äquivalente Menge an Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)

InCH₂CI₂ 120

12 CH₂CI₂ Wäsche (einmal) 0,5

13 50% Dimethylformamid in CH₂CI₂

Wäsche (zweimal) 0,5

14 10%Triethylamin (Et₃N) in CH₂CI₂

Wäsche (einmal) 0,5

15 CH₃OH Wäsche (zweimal) 0,5

16 CH₂CI₂ Wäsche (zweimal) 0,5

17 25% Essigsäureanhydrid in CH₂CI (2 ml/g Harz) 20,0

18 CH₂CI₂ Wäsche (zweimal) . 0,5

19 CH₃OH Wäsche (zweimal) · 0,5

* Für die Verknüpfung von Asn und GIn wurde in diesem Schritt ein 1,136 molarer Überschuß an 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) einbezogen. Kurz gesagt, für die Verknüpfungsreaktion wird einemMol BOC-geschützte Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz eingesetzt, plus ein Äquivalent 0,5 molares DCCI in Methylenchlorid oder 30% DMF in Methylenchlorid, für zwei Stunden. Beim Verknüpfen von Arg wird ein Gemisch aus 10% DMF und Methylenchlorid verwendet. BzI wird als die Hydroxylseitenkettenschützende Gruppe für Ser und Thr verwendet. 2-Chlor-Benzyloxycarbonyl (2CI-Z) wird als die schützende Gruppe für die Lys-Seitenkette verwendet. Tos wird verwendet, um die Guanidin-Gruppe von Arg zu schützen, und die GIu- oder Asp-Carboxyl-Gruppe wird wie der Bzl-Ester geschützt. Die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr wird mit 2,6-Dichlorobenzyl geschützt. Am Ende der Synthese wird die folgende Zusammensetzung gewonnen: X¹-Tyr(X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-lle-Phe-Thr(X⁴)-

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Asn-Ser(X⁵)-Tyr(X²)-Arg(X^e)-Lys(X⁷)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X⁵)-Ala-Arg(X^e)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-lle-Met-Ser(X⁵)-Arg(X⁶)-Gln-Gln-Gly-Glu(X³)-Arg(X⁶)-Asn-Gln-Glu(X³)-Gln-Gly-Ala-Arg(X^e)-Val-Arg(X^e)-Leu-X⁸, wobei X¹ für BOC steht, X² ist 2,6-Dichlörobenzyl, X³ ist Benzylester, X⁴ ist BzI, X⁵ ist BzI, X^e ist Tos, X⁷ ist 2CI-Z und X⁸ ist -O-CHrBenzen-Polystyren-Harzträgerstoff.

Nachdem der finale Tyr-Rest an das Harz angeknüpft worden ist, wird die BOC-Gruppe mit 45% TFA in CH₂CI₂ entfernt. Um das verbleibende geschützte Peptid-Harz zu spalten und zu entschützen, wird es mit 1,5ml Anisol, 0,25ml Methylethylsulfid und 10ml Hydrogenfluorid (HF) pro Gramm Peptid-Harz bei -20°C für eine halbe Stunde sowie bei 0⁰C für eine weitere halbe Stunde behandelt. Nach Eliminierung des Hydrogenfluorids unter hohem Vakuum wird der Harz-Peptid-Rest abwechselnd mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen, worauf das Peptid dann mit entgaster 2N wäßriger Essigsäure extrahiert wird. Eine Lyophilisierung des Essigsäureextraktes liefert ein weißes flockiges Material.

Das gespaltene und entschützte Peptid wird dann in 30%iger Essigsäure aufgelöst und einer Sephadex-G-50 Feingelfiltration unterzogen.

Das Peptid wird dann weitervermitteis CM-32 Carboxymethyl-Zellulose (Whatman) Kationenaustauschchromatografie (1,8 χ 18cm, V_Bett = 50 ml) gereinigt, wobei ein konkaver Gradient angewendet wird, welcher durch Eintropfen von 11 0,4M NH₄OAc, pH 6,5 in einen Mischkolben hervorgerufen wird, welcher 400ml 0,01 M NH₄OAc, pH 4,5 enthält. Die abschließende Reinigung erfolgt unter Anwendung von Verteilungschromatografie auf Sephadex-G-50 Feinträger (Pharmacia) mit einem nBuOH:EtOH:Pyridin: 0,2% N HOAc (4:1:1 -J) Lösungsmittelsystem. Die Details der Reinigung sind zusammenfassend bei Ling et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 95,945 (1980) dargelegt. Die chromatografischen Fraktionen werden sorgfältig vermittels Dünnschichtchromatografie überwacht, wobei lediglich die beträchtliche Reinheit zeigenden Fraktionen zusammengefaßt werden.

Die Synthese wird unter Verwendung eines MBHA-Harzes wiederholt, um das gleiche Peptid mit einem amidierten C-Terminus zu produzieren, wobei generell der im US-PS Nr.4292313 beschriebenen Vorgehensweise gefolgt wird, um Leu an das MBHA-

Harz anzuknüpfen.

Ausführungsbeispiet Il

Zur Bestimmung der Effektivität des Peptids, die Freisetzung von Wachstumshormon zu beschleunigen, werden in vitro Untersuchungen durchgeführt, wobei synthetischer hWFF(1-44)-NH₂ in Seite-an-Seite-Vergleichen mit pWFF(1-44)-NH₂ verwendet wird und wobei ein WFF-Bezugsstandard mit bekannter Wirksamkeit zur Beschleunigung der Freisetzung von Wachstumshormon aus Hirnanhangzellen verwendet wird. Der WFF.-Bezugsstandard ist bei Brazeau et al., Endocrinology, Bd. 110, A538(1982) beschrieben und definiert. Es handelt sich dabei um eine Menge einer Präparation von hypothalamischem Ratten-Ursprungsmaterial, welches in bezug auf die Wachstumshormonfreisetzung in einem Hirnanhangszellen-Monoschichtbioassay eine halbmaximale Reaktion erzeugt. Es werden Kulturen verwendet, welche Zellen von einigen vier bis fünf Tage zuvor entnommenen Ratten-Hirnanhangdrüsen beinhalten. Für die vergleichende Prüfung gemäß der allgemeinen Beschreibung bei Brazeau et al.. Regulatory Peptides, 1,255,1981 werden sowohl Kulturen eines definierten Standard-Mediums als auch Kulturen verwendet, von denen angenommen wird, daß sie hinsichtlich der Sekretion von Wachstumshormon optimal sind. Die Inkubation mit den zu prüfenden Substanzen wird über 3 bis 4 Stunden vorgenommen. Aliquote des Kulturmediums werden abgenommen und aufbereitet, um ihre Gehalte an immunoreaktivem Wachstumshormon (ir WH) vermittels einer gut gekennzeichneten Radioimmunountersuchung zu messen.

Die Resultate dieser vergleichenden Untersuchung zeigen, daß — in äquimolaren Verhältnissen — pWFF(1—44)-NH₂ die volle innere biologische Aktivität des synthetischen hWFF-Peptids sowie nahezu die gleiche Potenz aufweist.

Ausführungsbeispiel III

Die Synthese von bWFF(1—44)Amid mit der Formel:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH₂ erfolgt in einer schrittweisen Manier unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisators und eines MBHA-Harzes. Das Anknüpfen von BOC-Leu an das Harz erfolgt vermittels der im US-PS Nr.4292313 dargelegten allgemeinen Verfahrensweise und resultiert in der Substitution von ewa 0,2...0,6mMol Leu pro Gramm Harz je nach der Substitution des verwendeten MBHA-Harzes. Sämtliche verwendeten Lösungsmittel werden durch Hindurchleiten eines inerten Gases — vorzugsweise Helium — sorgfältig entgast, um auf diese Weise die Abwesenheit von Sauerstoff zu gewährleisten, welcher den Schwefel des Met-Restes in unerwünschter Weise oxydieren könnte.

Nach dem Entschützen und der Neutralisation wird die Peptidkette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Entschützung, Neutralisation und Addition einer jeden Aminosäure erfolgen in allgemeiner Übereinstimmung mit der im einzelnen im US-PS Nr.3904594nach Guillemin et al. dargelegten Verfahrensweise. Die Verknüpfungen werden speziell nach dem im Schema A von Ausführungsbeispiel I dargestellten Weg vorgenommen.

Die Verknüpfungsreaktionen werden gemäß der Beschreibung in Ausführungsbeispiel I vorgenommen, wobei am Ende der Synthese die nachstehende Zusammensetzung gewonnen wird:

X¹^r(X²I-AIa-ASp(X³I-AIa-IIe Phe-Thr(X⁴)-Asn-Ser(X⁵)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X⁵)-Ala-Arg(X^e)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-lle-Met-Asn-Arg(X⁶)-Gln-Gln-Gly-Glu(X³)-Arg(X⁶)-Asn-Gln-Glu(X³)-Gln-Gly-Ala-Lys(X⁷)-Val- Arg(X⁶)-Leu-X⁸

wobei X¹ für BOC steht, X² ist 2,6-Dichlorobenzyl, X³ ist Benzylester, X⁴ ist BzI, X⁵ ist BzI, X⁶ ist Tos, X⁷ ist 2CI-Z und X⁸ ist -NH-MBHA-Harzträgerstoff.

Nachdem der finale Tyr-Rest an das Harz angeknüpft worden ist, wird die BOC-Gruppe mit 45% TFA in CH₂CI₂ entfernt. Um das verbleibende geschützte Peptid-Harz zu spalten und zu entschützen, wird es mit 1,5 ml Anisol, 0,25 ml Methylethylsulfid und 10ml Hydrogenfluorid (HF) pro Gramm Peptid-Harz bei -2O⁰C für eine halbe Stunde sowie bei 0⁰C für eine weitere halbe Stunde behandelt. Nach Eliminierung des Hydrogenfluorids unter hohem Vakuum wird der Harz-Peptid-Rest abwechselnd mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen, worauf das Peptid dann mit entgaster 2N wäßriger Essigsäure extrahiert wird. Eine Lyophililierung des Essigsäureextraktes liefert ein weißes flockiges Material.

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Das Peptid wird dann weiter gereinigt, wobei zunächst Kationenaustauschchromatografie und daran anschließend gemäß Darstellung in Ausführungsbeispiel I Verteilungschromatografie angewendet wird.

Die Synthese wurde unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes wiederholt, um auf diese Weise das gleiche Peptid mit einem freien-Säure-C-Terminus zu produzieren, wobei generell der in Biopolymers, 12,2513-19 (1973) beschriebenen Verfahrensweise gefolgt wird, um Leu an das chlormethylierte Harz anzuknüpfen.

Die Synthese wird unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes zwecks Erzeugung des gleichen Peptids mit einem frei-Säure-C-Terminus wiederholt, wobei die Verfahrensweise von Ausführungsbeispiel I verfolgt wird.

Ausführungsbeispiel IV

Zur Bestimmung der Effektivität des Peptids, die Freisetzung von Wachstumshormon zu beschleunigen, werden in vitro Untersuchungen durchgeführt, wobei synthetischer hWFF(1-44)-NH₂ in Seite-an-Seite-Vergleichen mit äquimolaren Konzentrationen von bWFF(1-44)-NH₂ verwendet wird, wie dies weiter oben in Ausführungsbeispiel Il dargelegt wurde. Die Resultate dieser vergleichenden Untersuchung zeigen, daß — in äquimolaren Verhältnissen — bWFF(1-44)-NH₂ die volle innere biologische Aktivität des synthetischen Peptids sowie nahezu die gleiche Potenz aufweist. In faktoriellen Versuchsanordnungen mit Mehrfachdosierungen zeigte sich, daß bWFF die gleiche innere Aktivität wie hWFF(1-44)-NH₂ wie auch eine spezifische Aktivität aufweist, die etwa 70% der Aktivität von hWFF(1-44)-NH₂ in Konfidenzgrenzen von 54... 93% entspricht.

Ausführungsbeispiel V ~

Die Synthese von oWFF{1—44)Amid mit der Formel:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg- · Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers und eines MBHA-Harzes, wie dies in Ausführungsbeispiel III dargelegt wurde. Am Ende der Synthese wird die folgende Zusammensetzung gewonnen:

X^TyrlX^-Ala-AspiX^-Ala-lle-Phe-ThrlX^-Asn-SerfX^-TyrfX^-ArgiX^-LysfX'i-lle-Leu-Gly-Gln-Leu-SerlX^-Ala-ArglX⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-lle-Met-Asn-Arg(X⁶)-Gln-Gln-Gly-G!u(X³)-Arg(X^s)-Asn-Gln-Glu(X³)-Gln-Gly-Ala-Lys(X⁷)-Val- Arg(X^e)-Leu-X⁸

wobei X¹ für BOC steht, X² ist 2,6-Dichlorobenzyl, X³ ist Benzylester, X⁴ ist BzI, X^s ist BzI, X⁶ ist Tos, X⁷ ist 2CI-Z und X⁸ ist -NH-M BH A-Harztfägerstoff.

Nachdem der finale Tyr-Rest an das Harz angeknüpft worden ist, wird die BOC-Gruppe mit 45%iger TFA in CH₂CI₂ entfernt. Die Aufspaltung und Entschützung des verbleibenden geschützten Peptid-Harzes erfolgt in der in Ausführungsbeispiel III vorgeschriebenen Weise. Das gespaltene und entschützte Peptid wird in 30%iger Essigsäure aufgelöst und einer Sephadex-G-50 Feingelfiltration, Kationenaustauschchromatografie und schließlich einer Verteilungschromatografie gemäß Darstellung in Ausführungsbeispiel I unterzogen.

Die Synthese wird unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes zwecks Erzeugung des gleichen Peptids mit einem freie-Säure-C-Terminus wiederholt, wobei die Verfahrensweise von Ausführungsbeispiel I verfolgt wird.

Ausführungsbeispiel Vl

Zur Bestimmung der Effektivität des Peptids, die Freisetzung von Wachstumshormon zu beschleunigen, werden in vitro Untersuchungen durchgeführt, wobei synthetischer hWFF(1—44)-NH₂ in Seite-an-Seite-Vergleichen mit äquimolaren Konzentrationen von synthetischem oWFF(1-44)-NH₂ von Ausführungsbeispiel V in der weiter vorn in Ausführungsbeispiel Il dargelegten Weise verwendet wurde.

Die Resultate dieser vergleichenden Untersuchung zeigen, daß — in äquimolaren Verhältnissen — der oWFF(1—44) die volle innere biologische Aktivität des synthetischen Peptids sowie nahezu die gleiche Potenz aufweist. In faktoriellen Versuchsanordnungen mit Mehrfachdosierungen zeigte sich, daß oWFF etwa die gleiche innere Aktivität wie hWFF(1-44)-NH₂ wie auch eine spezifische Aktivität aufweist, die etwa 70% der Aktivität von hWFF(1-44)-NH₂ entspricht. Von einer chronischen Verabreichung von synthetischen pWFF-, bWFF-und oWFF-Peptiden an Nutztiere — speziell Schweine, Rinder, Ziegen und Schafe — oder andere warmblütige Tiere wird erwartet, daß damit der Anabolismus gefördert und mithin die Körpermasse in bezug auf die Muskelmasse erhöht wird. Die veterinärmedizinische Anwendung von WFF bei den jeweiligen Tierarten, d. h. oWFF bei Schafen und bWFF bei Rindern und Ziegen, stellt insofern eine ideale Situation dar, als das injizierte oder anderweitig verabreichte Molekül nicht antigen wirkt, da es von der gleichen Spezies herrührt wie das behandelte Tier. Das Präparat sollte darüber hinaus dazu geeignet sein, die Milchleistung der jeweiligen weiblichen Tiere zu steigern. Ein Einsatz in der Aquakultur bei der Aufzucht von Fischen oder anderweitigen kaltblütigen Seetieren zwecks Wachstumsbeschleunigung kann darüber hinaus von Bedeutung sein. Eine Verabreichung an Tiere bei einer Reinheit von bis hinunter zu etwa 5% erscheint als akzeptabel und wird im allgemeinen in Gestalt des Einsatzes einer Kombination von Peptid und einem veterinärmedizinisch annehmbaren festen oder flüssigen Trägerstoff erfolgen, wobei ein Präparat entsteht, welches im Rahmen der vorliegenden Beschreibung allgemein als eine pharmazeutische Zusammensetzung bezeichnet werden soll. Synthetischer WFF oder davon abgeleitete nichttoxische Salze — kombiniert mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff zwecks Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung — können an Sauger einschließlich des Menschen entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, intranasal oder oral verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch einen Arzt vorgenommen werden, um die Freisetzung von Wachstumshormon dort zu stimulieren, wo der zu behandelnde Wirtsorganismus einer derartigen therapeutischen Behandlung bedarf. Die erforderliche Dosis wird je nach dem spezieil zu behandelnden Zustand, nach der Schwere der Erkrankung wie auch in Abhängigkeit von der Dauer der gewünschten Behandlung variieren. -

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Derartige Peptide werden häufig in Form von pharmazeutisch annehmbaren nicht toxischen Salzen wie etwa in Form von Säureadditionssalzen oder Metallkomplexen — z.B. mit Zink, Eisen oder dergleichen (letztere werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung als Salze angesehen) — verabreicht. Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Sukzinat, Malat, Askorbat, Tartrat und dergleichen. Soll der Wirkstoff in Tablettenform verabreicht werden, so kann die Tablette ein Bindemittel wie etwa Traganth, Maisstärke oder Gelatine; ein zerfallsbeschleunigendes Mittel wie etwa Alginsäure; und ein Schmälzmittel wie etwa Magnesiumstearat enthalten. Wird eine Verabreichung in flüssiger Form gewünscht, dann können Süßstoff- und/oder Geschmacksstoffzusätze beigegeben werden, eine intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösungen oder dergleichen erfolgen.

Die Peptide sollten unter der Aufsicht eines Arztes verabreicht werden, wobei pharmazeutische Zusammensetzungen üblicherweise das Peptid in Verbindung mit einem konventionellen, pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten können. Die Dosis wird üblicherweise von etwa 20 bis etwa 2000 Nanogramm Peptid pro Kilogramm Körpermasse des Wirtes betragen.

Wenn auch die Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Verköperungen beschrieben worden ist — womit die den Erfindern gegenwärtig bekannte beste Art und Weise der Realisierung dargelegt wurde — so sollte doch davon auszugehen sein, daß verschiedene, dem speziell ausgebildeten Fachmann offenkundige Abänderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne daß damit vom Geltungsbereich der Erfindung, wie er in den nachfolgenden Patentansprüchen dargelegt ist, abgewichen wird. Beispielsweise können Modifikationen in der 44-gliedrigen Kette — speziell am Carboxyl-Terminal des Peptids beginnende Tilgungen — in Übereinstimmung mit bisher bei hWFF gewonnenen experimentellen Erfahrungen wie auch unter Anwendung heutiger Praktiken vorgenommen werden, um Fragmente mit einer Länge von 34 bis 43 Resten zu erzeugen, so z. B. pWFF(1-34), bWFF(1-35), oWFF(1-40) und oWFF(1-37) oder auch noch kürzere Fragmente, d. h. oWFF(1-32), bWFF(1-29) und OWFF(1-27), wobei diese Fragmente entweder NH₂ oder OH am C-Terminal aufweisen können, um damit die innere biologische Aktivität des Peptids zu erhalten. Derartige kürzere Peptide gelten als innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung liegend. Darüber hinaus können Additionen zu jedem einzelnen der Endstücke wie auch zu beiden Endstücken vorgenommen werden, und/oder es können generell äquivalente Reste substituiert werden, wie dies im Gesamtbereich der Peptid-Chemie weithin bekannt ist, um so Analoga mit mindestens einem wesentlichen Anteil der Potenz des nativen Polypeptids zu produzieren, ohne dabei vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

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Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, die durch die Formel I definiert sind:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Ärg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-R₂₈-Ärg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R^-Val-Arg-Leu-Y

wobei R₁₃ für VaI oder He steht; R₂₈ ist Ser oder Asn; R₄₁ ist Arg oder Lys; und Y ist OH oder NH₂, gekennzeichnet dadurch, daß sich das Verfahren zusammensetzt aus (a) dem Bilden einer Verbindung mit mindestens einer schützenden Gruppe und der Formel (II):

X^TyrfX^-Ala-AspfX^-Ala-lle-Phe-ThrlX^-Asn-SerlX^-TyrlX^-ArgfX^-LyslX^-Rn-Leu-Gly-Gln-Leu-SerlX^-Ala-ArglX⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-lle-Met-R₂₈(X5)-Arg(X⁶)-Gln-G!n-Gly-Glu(X³)-Arg(X⁶)-Asn-Gin-Glu(X³)-Gln-Gly-Ala-R₄₁(X⁶oderX⁷ Val-Arg(X⁶)-Leu-X⁸, wobei irgendeiner oder auch sämtliche Reste von R₂₈ bis zum C-Terminus weggelassen werden können, wobei (X¹), (X²), (X³), (X⁴), (X^s), (X⁸) und (X⁷) jeweils entweder für Wasserstoff oder eine schützende Gruppe stehen und wobei (X⁸) entweder Amid oder Hydroxyl oder eine schützende Gruppe ist, und

(b) dem Abspalten der schützenden Gruppe oder Gruppen von der genannten Verbindung der Formel (II) zwecks Schaffung eines Peptids mit der Formel (I) oder eines davon abgeleiteten biologisch aktiven Fragmentes und, wenn gewünscht, (c) dem Umwandeln des resultierenden Peptids in ein davon abgeleitetes nicht-toxisches Additionssalz. __
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R₂₈ Asn ist und R₄₁ Lys ist.
3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₃ für He steht.
4. Verfahrennach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₃ für VaI steht.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₃ für VaI steht, R₂₈ ist Ser und R₄₁ ist Arg.
6. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Y für NH₂ steht.
7. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Y für OH steht.
8. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß X¹ Wasserstoff oder einer a-aminoschützenden Gruppe entspricht; X² ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr; X³ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Carboxyi-Gruppe Asp oder GIu; X⁴ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die alkoholische Hydroxyl-Gruppe von Thr; X^s ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die alkoholische Hydroxyl-Gruppe von Ser; X⁶ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Guanidin-Gruppe von Arg; X⁷ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Seitenketten-Aminogruppe von Lys; und X⁸ wird aus jener Klasse ausgewählt, die sich aus OH, OCH₃, Estern, Amiden, Hydraziden, -O-CH₂-Harzträgerstoff und -NH-Harzträgerstoff zusammensetzt.
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß X¹ für BOC steht, X² ist 2,6-Dichlorobenzyl, X³ ist BzI, X⁴ ist BzI, X⁵ ist BzI, X⁶ ist Tos, X⁷ ist 2-Chlorobenzyloxycarbonyl und X⁸ ist-O-CH₂-Harzträgerstoff.
10. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß X¹ für BOC steht, X² ist 2,6-Dichlorobenzyl, X³ ist BzI, X⁴ ist BzI, X^s ist BzI, X⁶ ist Tos, X⁷ ist 2-Chlorobenzyloxycarbonyl und X⁸ ist -NH-Harzträgerstoff.