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DE2718326A1 - Neues protein und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Neues protein und verfahren zu dessen herstellung

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Publication number
DE2718326A1
DE2718326A1 DE19772718326 DE2718326A DE2718326A1 DE 2718326 A1 DE2718326 A1 DE 2718326A1 DE 19772718326 DE19772718326 DE 19772718326 DE 2718326 A DE2718326 A DE 2718326A DE 2718326 A1 DE2718326 A1 DE 2718326A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
solution
precipitated
new protein
until
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19772718326
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Dipl Chem Dr Bohn
Heinz Haupt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Priority to DE19772718326 priority Critical patent/DE2718326A1/de
Priority to ES468932A priority patent/ES468932A1/es
Priority to FR7811669A priority patent/FR2388825A1/fr
Priority to IT7822621A priority patent/IT7822621A0/it
Priority to AU35404/78A priority patent/AU516677B2/en
Priority to DK176178A priority patent/DK176178A/da
Priority to LU79511A priority patent/LU79511A1/de
Priority to ZA00782330A priority patent/ZA782330B/xx
Priority to CA301,838A priority patent/CA1108535A/en
Priority to NL7804365A priority patent/NL7804365A/xx
Priority to AT0292578A priority patent/AT366062B/de
Priority to JP4920678A priority patent/JPS53133618A/ja
Priority to IE802/78A priority patent/IE46738B1/en
Priority to SE7804713A priority patent/SE7804713L/xx
Priority to BE187093A priority patent/BE866355A/xx
Priority to GB16259/78A priority patent/GB1603153A/en
Publication of DE2718326A1 publication Critical patent/DE2718326A1/de
Priority to US06/128,253 priority patent/US4297274A/en
Priority to AT394080A priority patent/ATA394080A/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)
Aktenzeichen: Ma 288
HOE 7 7/B 008"
Datum: 22. April 1977 Dr.Li/Pa
Neues Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein neues Protein, das im Lysat menschlicher Erythrozyten immunologisch nachgewiesen und daraus isoliert werden kann, sowie ein Verfahrn zu dessen Herstellung.
Das Lysat menschlicher Erythrozyten enthält bekanntlich neben seinem Hauptbestandteil, dem Hämoglobin, eine Vielzahl von Enzymen, deren Enzymaktivität gut untersucht ist. Zu ihnen gehören: Carboanhydrase B, Carbonanhydrase C, Superoxiddismutase, Katalase, Laktatdehydrogenase, Glutathionreduktase, saure Phosphatase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, 6-Phosphoglukonatdehydrogenase, Glukose-6-Phosphatisomerase, Phosphoglukomutase, Phosphoglyzeratkinase, Adenylatkinase, sowie ein Protein, welches die drei Enzymaktivitäten 2,3-Di-Phosphoglyzeratmutase, 2,3-Di-Phosphoglyzeratphosphatase und Phosphoglyzeromutase in sich vereinigt. Einige davon wurden isoliert. Es wurde nun ein neues Protein gefunden, das sich von den bekannten Proteinen durch seine physikalischchemischen und immunologischen Eigenschaften sowie auch hinsichtlich seines mengenmäßigen Vorkommens im Hämolysat unterscheidet.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein, das gekennzeichnet ist durch:
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809843/0514
einen Proteinanteil von 99 % - 1 %, im wesentlichen bestehend aus ^-Aminosäuren,
einem Kohlenhydr.atanteil von 0,9% - 0,5%,
einen Sedimentationskoeffizienten S ~ von 6,88 - 0,50 S,
2Ow ein Molekulargewicht von 160.000 - 15.000,
einen isoelektrischen Punkt von 5,5 - 0,2,
eine elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich der B..-Globuline des Humanserums,
eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Protein gerichteten Antikörper.
Wegen der auffallendsten Eigenschaft des Proteins, seiner Molekülgröße und Beweglichkeit, kann es als 7 S-B1-GlObUHn bezeichnet werden.
Bemerkenswert an dem neuen Protein ist, daß es im Stroma-freien Lysat menschlicher Erythrozyten immunologisch nachgewiesen werden kann und darin etwa 1 % des Proteinanteils, bezogen auf den Zellinhalt von roten Blutkörperchen, ausmacht. In Relation zum Hämoglobin und der Carbonanhydrase B folgt das neue Protein mengenmäßig an dritter Stelle.
Zur Erläuterung der kennzeichenden Merkmale des Proteins sei folgendes ausgeführt:
Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten erfolgt in einer analytischen Ultrazentrifuge bei 56 0OO U/Min in Doppelsektorzellen in einer Uberschichtungszelle in Anlehnung an Vinograd, Proc. Acad. Sei USA ££, 902 (1963). Gemessen wird die bei 28O nm absorbierende, in der Überschichtungszelle wandernde Bande. Als Lösungsmittel wird destilliertes Wasser von pH 7,0 verwendet. Die Proteinkonzentration beträgt 10, 7,5 und 2,5 mg/100 ml Lösung.
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Das Molekulargewicht wurde einerseits in der Ultrazentrifuge über die Ermittlung des Sedimentationsgleichgewichtes nach Yphantis errechnet. Es ergab sich ein Wert von 160 000 15 000. Andererseits wurde bei der Untersuchung des Proteins in einem 1 %igen Natriumdodezylsulfat-haltigen Trägergel, bestehend aus Polyacrylamid mit Humanplazentalaktogen und Humanalbumin als Refenrenzsubstanzen ein Molekulargewicht von 45 000 - 5 000 ermittelt. Danach kann angenommen werden, daß das Molekül aus vier gleichen oder sehr ähnlichen Untereinheiten aufgebaut ist.
Das Molekulargewicht kann auch noch mit Hilfe der analytischen Säulenchromatogre.phie mit quervernetztem Dextran als Träger,
(R)
wie es als Sephadex ' G 150 der Firma Pharmacia im Handel ist, bestimmt werden. Mit O,O1 M PKosphatpuffer pH 7,0 und Humanserum als Referenzsubstanz eluiert das neue Protein gemeinsam mit dem Immunglobin A und der C3-Komponente des Komplementsystems. Dies entspricht einem Molekulargewicht von etwa 160 000 bis 180 000. Wird der Elutionspuffer mit 1M NaCl versetzt, wird eine Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 erhalten. Dies entspricht den elektrophoretisch bestimmten Untereinheiten des neuen Proteins.
Zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde das Verfahren der isoelektrischen Fokusierung angewandt unter Einsatz der hierfür von der Firma LKB Stockholm vertriebenen Geräte und Reagenzien.
Die elektrophoretische Beweglichkeit wurde unter Verwendung von Cellulose-Acetat als Trägerfolie in Barbital-Na-Puffer pH 8.6 ermittelt.
Kohlenhydrate wurden bestimmt nach Schultze, H.E., R. Schmidtberger, Haupt J.: Untersuchungen über die gebundenen Kohlenhydrate in isolierten Glykoproteinen, Biochem. Z. 329, 490 (1958).
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809843/051*
Die Aminosäureanalyse wurde nach Moore S., Spakman, D.H. Stein W.H.: Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins, Anal. Chem. 22' 1185 (1958) durchgeführt unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographen. Dabei zeigte sich, daß Asparaginsäure und Glutaminsäure, die in der Peptidkette am häufigsten vertetenen °C-Aminosäuren sind.
Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten nach einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchem Antigen, d.h. das neue Protein, und ein gegen das neue Protein gerichteter Antikörper, bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antiserum, gegeneinander in einem Trägermedium, z.B. Agar, diffundieren. Treffen die beiden Reaktionskomponenten in einem günstigen Verhältnis aufeinander, bildet sich ein sichtbares Präzipitat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den Fachmann einleuchtend, daß alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung sowohl des neuen Proteins als auch der gegen das neue Protein gerichteten Antikörper möglich sind. Das Antiserum hoher Spezifität gegen das neue Protein wird nach an sich bekannten Verfahren erhalten, z.B. durch Immunisierung von Kaninchen mit dem isolierten Protein über einen Zeitraum von mehreren Wochen unter Verwendung eines immunologischen, z.B. kompletten Freundschen Adjuvans. Danach wird das Blut der immunisierten Tiere gewonnen, das Serum davon abgetrennt und gewünschtenfalls die antikörperreiche GammaglobulinFraktion hergestellt. Mit Hilfe dieser Serum- bzw. Antikörperpräparation kann das neue Protein in wäßriger Lösung auch quantitativ beispielsweise nach dem Elektro-Immuno-Assay nach Laurell, C.B.: Analyt.Biochem. J_5, 45 (1966) bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Herstellung des oben charakterisierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß Lösungen, die dieses Protein enthalten, vorzugsweise Erythrozytenlysate, unter Zugrundelegung folgender erfindungs-
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gemäß gefundener Kriterien fraktioniert werden:
Das Protein ist mit Neutralsalzen fällbar.Mit dem üblicherweise für derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsulfat wird das Protein aus seiner 1%igen wässrigen Lösung bei einer Konzentration zwischen 1,5 bis 2 Mol/l in einem pH-Bereich in der Nähe des Neutralpunktes ausgefällt.
Das Protein ist weiter fällbar mit Hilfe von in der Proteinchemie verwendbaren organischen Lösungsmitteln, z.B. von Äthanol bei einer Volumenkonzentration von 10 % aus einer wässrigen Lösung von schwach saurem pH-Wert, z.B. in einem 0,04 molaren Acetatpuffer vom pH 5,5 bei 0 C.
Es hat sich gezeigt, daß das neue Protein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Akridin- und Chinolinreihe, die für Proteinfällungsverfahren üblicherweise Verwendung finden, präzipitiert wird. Es wird z.B. mit 2-Äthoxi-6,9-Diaminoakridinlaktat in einer Konzentration von 0,01 Mol/l bei pH 8,0 aus seiner wässrigen Lösung ausgefällt.
Das neue Protein ist weiter fällbar mit den in der Proteinchemie für Fällungen verwendeten organischen Säuren, beispielsweise mit Trichloressigsäure in einer Konzentration von 0,2 Mol/l und Perchlorsäure in einer Konzentration von 0,6 Mol/l.
Die Verringerung der elektrischen Leitfähigkeit der Proteinlösung, wie sie durch Entfernung von Ionen erreicht werden kann, fällt das Protein im schwach sauren pH-Bereich aus. So wird z.B. bei einer Dialyse gegen destilliertes Wasser vom pH-Wert 5,0 eine Präzipitation des Proteins erreicht.
Die elektrischen Eigenschaften des Proteins ermöglichen dessen Fraktionierung mit Hilfe eines Ionenaustauschers. Basische Anionenaustauscher, insbesondere solche mit Mono-,
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Di-, Triäthylaminoäthyl oder quaternären Basen sowie deren Derivaten als funktioneilen Gruppen, binden das Protein aus einer vergleichsweise wenig konzentrierten Pufferlösung. Durch Erhöhung der Salzkonzentration kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhaltens die Möglichkeit an, das Protein zu adsorbieren und unter Verwendung von höher konzentrierter Salzlösungen, bzw. von Pufferlösungen mit erhöhtem pH-Wert, wieder zu eluieren.
Aufgrund der Kenntnis der elektrophoretischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung bzw. Isolierung des Proteins die präparative Zonenelektrophorese mit Vorteil eingesetzt werden. Das Protein reichert sich während der Elektrophorese im ß-Bereich der Plasmaproteine an und kann daraus gewonnen werden.
Die immunologische Affinität des Proteins zu seinen Antikörpern kann dafür eingesetzt werden, das Protein mit Hilfe von sogenannten Immunadsorptionsverfahren anzureichern.Hierfür kann in an sich bekannter Weise ein Immunadsorbens, d.h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das Protein hergestellt werden, welcher dieses spezifisch zu binden vermag. Das Protein kann danach durch Änderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden.
Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Proteins, andererseits zu seiner Abtrennung von den übrigen begleitenden Proteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanz erfolgen.
Über die hier angebotenen Möglichkeiten hinaus, die dem Fachmann die Lehre geben, die verschiedenen Verfahren der präparativen Proteinchemie zur Isolierung des neuen Proteins einzusetzen, wurde nun überraschend ein sehr einfaches Verfahren
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gefunden, das im Rahmen der Erfindung bevorzugt angewandt wird.
Das neue Protein wird bei einer niedrigen elektrischen Leitfähigkeit seiner wäßrigen Lösung zwischen 1 und 10 /uS/cm, vorzugsweise bei 2,5 bis 2,8^5/cm, an einen Anionenaustauscher, vorzugsweise einen Diäthylaminoäthyl-Ionenaustauscher, bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt (pH 6,5 - 7,5) adsorbiert. Danach wird das beladene Adsorbens, zweckmäßig in einer Chromatographiesäule, von der übrigbleibenden Lösung abgetrennt und mit einer Salzlösung steigender Konzentration (linearer Salzgradient) behandelt und das Eluat in Teilen aufgefangen. Die einzelnen Teile werden immuno-chemisch analysiert und diejenigen Fraktionen, welche mit dem gegen das neue Protein gerichteten Antikörper reagieren, werden gesammelt. Als Salzlösungen in diesem Sinne kommen Neutralsalz- und Pufferlösungen infrage. Der lineare Salzgradient für die Elution steigt von 10/jS/cm auf etwa 100 mS/cm an.
Die Kenntnis des Molekulargewichtes des neuen Proteins ermöglicht es, an dieser Stelle Maßnahmen anzuwenden, die zur Abtrennung, bzw. Anreicherung von Substanzen mit Molekulargewichten von 150 000 führen. Vorteilhaft werden hierfür die Methoden der Gel-Filtration oder der Ultra-Filtration eingesetzt. Besonders vorteilhaft kann demnach die durch Ionenaustauschchromatographie erhaltene Fraktion, die das neue Protein enthält, auf einem Molekularsieb aufgetrennt werden. Die einzelnen Fraktionen der Trennung werden ge wonnen und ebenfalls immuno-chemisch analysiert. Diejenigen Fraktionen, die weitgehend ausschließlich das neue Protein enthalten,werden gewonnen.
Das Verfahrensprodukt wird zweckmäßig bei Temperaturen unterhalb von O0C aufbewahrt.
Wie bereits ausgeführt, wandert das isolierte Protein ein-
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heitlich mit einer Beweglichkeit, die den Beta-1-Globulinen des Humanserums entspricht. Wird für die Charakterisierung des Produktes die Polyacrylamidgel-Elektrophorese verwendet, so läßt sich eine Heterogenität des Produktes nachweisen. Man findet im Gel zwei Banden. Wie die nähere Untersuchung gezeigt hat, ist diese Heterogenität auf eine Aufspaltung des Proteins während der Präparation zurückzuführen. Die Aufspaltung kann verhindert werden durch den Zusatz eines Proteinase-Inhibitors, beispielsweise des aus Lungen von
Tieren zu gewinnenden Trypsin-Kallikrein-Inhibitors. Mit anderen Worten ist damit ausgesagt, daß Proteinasen wie Plasmin oder Kallikrein eine Veränderung des nativen Proteins bewirken. Durch Zusatz von Proteinase-Inhibitoren wird eine derartige Veränderung unterbunden.
In elektrolytfreier Lösung neigt das isolierte Protein zur Bildung von Aggregaten. Sie zeigen in der Ultrazentrifuge einen Sedimentationskoeffizienten von etwa 11,0 S. Durch Erhöhung der Salzkonzentration, beispielsweise auf einen Wert von 0,25 M/l NaCl oder Phosphat bildet sich die native Komponente wieder zurück. Eine Weitere Erhöhung der Elektrolytkonzentration auf eine Ionenstärke von 0,5 - 1,0, beispielsweise durch Zugabe von Natriumchlorid, führt zu Dissoziationen des nativen Moleküls in Untereinheiten, deren Sedimentationskoeffizient etwa 3,0 S beträgt. Bei einer Ionenstärke von/u =0,15 bildet sich das native Molekül wieder zurück. Andererseits ist der Dissoziationsgrad auch noch abhängig von der Gesamtproteinkonzentration der Lösung. In einer niedrigen Proteinkonzentration, z.B.<1 % herrscht der 3S-Anteil vor.
Es gehört zum Gegenstand der Erfindung während der Verfahren zur Herstellung des Proteins, den dabei verwendeten wässrigen Lösungen einen Proteinasen-Inhibitor, zweckmäßig einen polyvalenten Proteinasen-Inhibitor in einer für Proteinasen-Hemmung
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- ir- M
ausreichenden Menge zuzusetzen.
Das native Molekül ist am stabilsten in Salzlösungen mit Ionenstärken zwischen ja = 0,01-0,2.
Ausgangsmaterial für die Herstellung des neuen Proteins sind rote Blutzellen, Erythrozyten. Sie werden durch Einbringen in ein hypotones Milieu lysiert, zweckmäßig wird die Lyse durch destilliertes Wasser bewerkstelligt. Um den proteolytischen Angriff von in dem Lysat anwesenden Enzymen zurückzudrängen, empfiehlt es sich,
bereits dem lytischen Agens, z.B. dem destilliertem Wasser, einen polyvalenten Proteinasen-Inhibitor zuzusetzen. Vorteilhaft wird die Lyse bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt, z.B. bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 6,0.
Die partikulären Bestandteile der Erythrozyten werden nach etwa 10 bis 30 Stunden von dem sogenannten Hämolysat abgetrennt. Empfehlenswert ist hierfür eine hochtourige Zentrifugation, wobei der Stroma-freie Überstand für die Herstellung des neuen Proteins gewonnen wird. Diese Lösung kann wie beschrieben mit einem Ionenaustauscher und einem Molekularsieb behandelt werden, wonach jeweils das durch ein Nachweisverfahren in den einzelnen Fraktionen bestimmte Protein weiter verarbeitet bzw. schließlich gewonnen wird.
Auch Extrakte aus blutreichen Organen, z.B. aus der Plazenta, sind als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Proteins geeignet.
Das Protein läßt sich selbstverständlich nach dem Vorhergesagten in der gleichen Reinheit auch durch Kombination anderer Schritte unter Berücksichtigung seiner Fällungseigenschaften erhalten.
Das neue Protein stellt ein wertvolles diagnostisches Mittel dar. Es ist insbesondere zur Herstellung von Antiseren nach hierfür bekannten Methoden geeignet.
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Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert.
Beispiel
2 1 gepackte rote Blutzellen werden dreimal mit jeweils 2 1 physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Sodann wird zum Zwecke der Hämolyse das 4-fache Volumen an dest. Wasser zugefügt. Pro Liter Hämolysat werden 1O mg eines Proteinasen-
(R)
Inhibitors aus Rinderlunge (Antagosan der Behringwerke AG, Marburg,) zugesetzt. Der pH-Wert wird unter Rühren mit 1 η Essigsäure auf 5.8 eingestellt. Nach Stehen über Nacht bei 4 - 6°C erfolgt die Entfernung des ausgeflockten Stromas durch hochtouriges Zentrifugieren bei 19.ΟΟΟ upm. Anschließend wir der pH-Wert mit 1 η Natronlauge auf pH 6,8 eingestellt. Die elektrische Leitfähigkeit beträgt danach 2,7 mS/cm.
Zum Stroma-freien Lysat werden 1 OOO g (Feuchtgewicht) Diäthylaminoäthyl-Cellulose, granulä^ gegeben und 1 Stunde kräftig gerührt. Hiernach wird das mit Protein beladene Adsorbens auf einem Büchnerfilter gesammelt und mit 0,005 M Phosphat-Puffer, pH 6,8 der 1O mg des oben genannten Proteinasen-Inhibitors pro Liter enthält, von Hämoglobin freigewaschen. Nach Einschlämmen in eine Chromatographie-Säule erfolgt die Elution der Proteine mit Hilfe eines linearen Salzgradienten aus jeweils 5 Litern 0,005 M Na-Phosphat-Puffer, pH 6,8 und 0,4 M Na-Phosphat-Puffer, pH 6,8, enthaltend pro Liter
(R)
10 mg Antagosan .
Das Eluat wird in 500 ml-Portionen aufgefangen. Anschließend erfolgt die Charakterisierung der Fraktionen in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Diejenigen Fraktionen, welche die Hauptmenge des 7S-B..-Globulins enthalten, werden gemischt und durch Ultrafiltration konzentriert. Es werden durchschnittlich 40 ml Konzentrat mit einem Proteingehalt von 5,5 % erhalten.
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Ah
Das Konzentrat wird zur Gelfiltration auf eine mit
(R)
Sephadex G 150 (Pharmacia, Uppsala) gefüllte Säule gegeben, die mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, äquilibriert ist. Das Eluat wird in 4O ml Fraktionen gesammelt, die wie oben in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese charakterisiert werden. Im Hauptgipfel wird das 7S-B1-GlObUUn eluiert. Die rein erscheinenden Fraktionen werden gemischt und durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat des 7S-B1-GlObUHnS wird tiefgefroren aufbewahrt. Die Ausbeute des Proteins aus 2 Liter gepackten roten Blutkörperchen beträgt durchschnittlich 1,5 g.
/12
8098A3/05U
J2--
2718328
Das erhaltene Produkt zeigt folgende Aminosäuren- und Kohlenhydratzusammensetzungen, wobei methodisch bedingte Fehlergrenzen zu berücksichtigen sind:
Aminosäuren,
Mol % Variations-
koeffizient %
6,68 2,67
1,61 5,O8
5,05 3,97
11,39 1,21
5,05 2,23
4,98 4,12
8,44 4,35
5,66 6,95
9,13 2,22
7,35 1,68
1,65 2,04
8,96 1,36
0,32 28,87
4,84 1,17
8,79 3,83
3,34 4,24
5,92 3,81
1,Ol 10.30
Lysin Histidin Arginin Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin 1/2 Cystin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
Kohlenhydrate:
Hexosen v A ce thylhexosamin Acetylneuraminsäure Fucose
1:1) Gew. %
0,9 0,3 0 0
- 0,2 ±0,1
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Claims (6)

  1. HOE 77/B 008
    PATENTANSPRÜCHE
    ΓΠ Protein gekennzeichnet durch
    a) einen Proteinanteil von 99 % - 1 %,
    einen Gehalt an Kohlenhydraten von 0,9 - 0,5 %,
    C=O +
    b) einen Sedimentationskoeffizienten S von 6,88 - 0,5 S,
    2Ow
    c) ein Molekulargewicht von 160.000 - 15.000,
    d) einen isoelektrischen Punkt von 5,5 - 0,2,
    e) eine elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich der ß--Globuline des Humanserums,
    f) eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Protein gerichteten Antikörper.
  2. 2. Verfahren zur Anreicherung eines Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die dieses Protein enthält, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen wird und die bezüglich des Proteins angereicherte Fraktion gewonnen wird:
    a) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Proteins,
    b) Zugabe von organischen Lösungsmitteln bis zur Ausfällung des Proteins, ^.
    c) Zugabe von organischen Säuren bis zur Ausfällung des Proteins,
    d) Verringerung der elektrischen Leitfähigkeit der Proteinlösung bis zur Ausfällung des Proteins,
    e) Adsorption des Proteins an Ionenaustauscher und selektive Elution davon,
    f) präparative Zonenelektrophorese mit Gewinnung der Zone der im ß-Bereich wandernden Proteine,
    g) Molekularsiebfraktionierung zur Gewinnung von Fraktionen mit Molekulargewichten von etwa 150.000,
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    ORIGINAL INSPECTED
    HOE 77/B 008
  3. 3. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine das Protein enthaltende wäßrige Lösung bei einer Leitfähigkeit von 1 - 10/iS/cm an einen Anionenaustauscher bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 adsorbiert, von der überstehenden Lösung abgetrennt und mit einer Salzlösung steigender Konzentration behandelt, und dabei derjenige Anteil gewonnen wird, der das Protein gemäß Anspruch 1 enthält.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinlösung das Hämolysat von Erythrozyten verwendet wird.
  5. 5. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Antiseren.
  6. 6. Antiserum erhältlich durch Immunisierung von Wirbeltieren mit einem Protein gemäß Anspruch 1.
    809843/05U
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