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DE2718325C2 - Leucinreiches 3,1-S-α↓2↓-Glykoprotein sowie dessen Verwendung - Google Patents

Leucinreiches 3,1-S-α↓2↓-Glykoprotein sowie dessen Verwendung

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Publication number
DE2718325C2
DE2718325C2 DE2718325A DE2718325A DE2718325C2 DE 2718325 C2 DE2718325 C2 DE 2718325C2 DE 2718325 A DE2718325 A DE 2718325A DE 2718325 A DE2718325 A DE 2718325A DE 2718325 C2 DE2718325 C2 DE 2718325C2
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DE
Germany
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glycoprotein
leucine
solution
rich
protein
Prior art date
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Expired
Application number
DE2718325A
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DE2718325A1 (de
Inventor
Siegfried Dipl.-Chem. Dr. 3550 Marburg Baudner
Heinz Haupt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
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Publication date
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Description

2. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antiseren.
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Glykoprotein sowie dessen Verwendung für die Gewinnung von gegen das Glykoprotein gerichteten Antiseren, mit welchen der Gehalt des Glykoproteins in Körperflüssigkeiten nachgewiesen und bestimmt werden kann.
Das neue Glykoprotein unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Proteinen aus menschlichem Serum in seinen physikalischen und immunochemischen Eigenschaften.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Glykoprotein, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) Sedimemationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S±0,2;
b) Molekulargewicht von 49 600 ±4000;
c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der *2-Globulinedes Humanserums;
d) isoelektrischer Bereich pH 3,8—4,1;
e) Extinktionskoeffizient E 1cm, 230 mm = 1% 7,0 + 2,0;
f) Gehalt von 77 ±2% «-Aminosäuren mit einem Anteil von 17±2% Leucin und 23 + 2% an Kohlenhydraten;
g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.
Für die Bestimmung der Parameter wurden folgende analytischen Verfahren angewendet:
Die Ultrazentrifugationsanalysen wurden mit einer Ultrazentrifuge der Firma Beckman, Modell E, durchgeführt. Das Protein wurde 0,2%ig (g/v) in 0,9%iger Kochsalzlösung in die Ultrazentrifugenanalyse eingesetzt. Die Sedimentation erfolgte bei 60 000 U/min und 200C in einer Überschichtungszelle. Die Registrierung erfolgte unter Einsatz der UV-Scanner-Technik bei 280 mm. Eine daraus abzuleitende Molekulargewichtsbestimmung wurde nach der Gleichgewichtsmeihode nach Yphantis vorgenommen.
Die isoclektrische Fokussierung wurde mit Hilfe einer von der Firma LKB. Stockholm. Schweden, vertriebenen Apparatur und den von dort bezogenen Reagenzien durchgeführt Verwendet wurde eine 440 ml-Säulc mit speziellen Puffersubstanzen hierfür im Bereich der pH-Werte 3-6.
Die Kohlenhydratanalyse wurde durchgeführt nach Schultze, Schmidtberger, Haupt (1958), Biochem. Z„ 3and 329, Seiten 490-507.
Die Aminosäureanalyse erfolgte nach Spackman, Stein und Moore (1958), AnaL Chem. 30, Seite 1190. Es
ίο wurde verwendet ein Aminosäureanaiysator Multichrom B der Firma Beckman.
Für die immunologische Bestimmung des neuen Glykoproteins wurde ein Antiserum verwendet, welches durch Immunisierung von Kaninchen über einen Zeitraum von sechs Wochen mit dem isolierten Protein unter Verwendung von komplettem Freundschen Adjuvans erhalten worden war. Die quantitative Bestimmung des Proteins mit Hilfe dieses Antiserums ist durchführbar nach der Methode von Laurell (1966), Analyt Biochem, Band 15, Seiten 45—52.
Wegen der auffallendsten Parameter des neuen Proteins, nämlich der relativ niedrigen Sedimentationskonstante von 3,1 S ±0,2, dem auffallend hohen Gehalt an Leucin und der leichten Charakterisierbarkeit durch die Wanderung bis pH 8,6 im ^-Bereich der Proteine wird das neue Protein als das Leucin-reiche 3,1-S-<Z2-Glykoprotein bezeichnet.
Zur Herstellung kann das Leucin-reiche 3,1-S-*2-Glykoprotein, ausgehend von menschlichem Blutserum, durch mehrere Verfahrensschritte bis zur Reindarstcllung angereichert werden. Ziel der Anreicherungen ist es jeweils, entweder das Protein möglichst frei von weiteren Serumbestandteilen oder begleitende Serumbestandteile auszufällen und das Leucin-reiche 3,1-S-Λ-2-Glykoprotein in Lösung zu behalten.
Zur Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-«2-Glykoproteins kann demnach ein Verfahren gebraucht werden, worin mindestens einer der folgenden Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung des Proteins Anwen- dung findet:
a) Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten Neutralsalzcs bis zur Ausfällung des Leucin-reichen 3,1-S-rt2-Glykoproteins, vorzugsweise von Ammoniumsulfat in einer Menge von 2,4 bis 2,8 M/l bei neutralem pH-Wert.
b) Durch Zugabe eines in der Proteinchcmie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten organisehen Lösungsmittels bis zu einer Konzentration, bei welcher das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein gerade noch in Lösung verbleibt und begleitende Proteine ausgefällt werden, vorzugsweise Zugabe von 40% (v/v) Äthanol zu einer in schwach saurem pH-Bereich gepufferten Lösung bei einer Temperatur von — 8 bis 0°C, vorzugsweise —5"C.
Dieses Fällungsverhalten des Glykoproteins bedeutet, daß es bei den bekannten Plasma-Fraktionierungsverfahren mit Hilfe von Äthanol nach der Methode VI von Cohn (E. J. Cohn et al., J. Am.
Chem. Soc. 68 [1946], Seite 459) in Lösung verbleibt. Der verbleibende alkoholische Überstand dieses Fäliungsverfahrens enthält nur noch 1 — 2% der gesamten Plasmaproteine. Dies besagt dem l'ach-
b5 mann weiter, daß das Fraktionierungsverfahren
nach Cohn besonders geeignet ist, um das neue Glykoprotein gegenüber anderen Plasiiiaproiciiien anzureichern.
c) Zugabc von wasserlöslichen Salzen der Akridinbascn, vorzugsweise das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlaclat bis zu einer Konzentration von 0,01 Mol/l in neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich. Dabei fällt das neue 3,l-S-a:2-Glykoprotein nicht aus, wohingegen die meisten Plasmaproteine mit Ausnahme der Gammaglobuline durch diese Maßnahme gefällt werden.
Demnach erweist sich eine fraktionierte Fällung einer Proteinlösung, welche neben Leucin-reichem 3.1 -S-«2-Glykoprotein noch andere Plasmaproteine enthält, mit Akridinbasen als vorteilhafter Reinigungsschritt für das neue Protein, da hierbei ein großer Teil der Begleitproteine ausgefällt wird.
d) Zugabe von in der Proteinchemie zur Fällung von Proteinen verwendeten organischen Säuren, vorzugsweise von Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/l, wobei das Leucin-reiche 3,l-S-<*2-Glykoprotein in Lösung verbleibt.
Von dieser Maßnahme ist bekannt, daß sie den GIobulintcil der Plasmaproteine auszufällen vermag. Demnach erweist sie sich ebenfalls als geeignet, um das neue Glykoprotein in Lösung anzureichern.
Statt Trichloressigsäure können auch andere Säuren zur Anreicherung des neuen Glykoproteins eingesetzt werden, wie z. B. Perchlorsäure oder Sulfosalizylsäure. Bei Perchlorsäure liegt die üblicherweise für die Fraktionierung verwendete Endkonzentration zwischen 0,4 und 0,6 Mol/l. Bei diesen Konzentrationen verbleibt das neue Glykoprotein in Lösung.
e) Erhitzung der das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein enthaltenden Proteinlösung kurzzeitig auf eine Temperatur nahe 100°C Dei neutralem bis schwach saurem pH-Wert. Vorzugsweise wird die sogenannte Hitzekoagulation von Proteinlösungen bei einem pH-Wert von etwa 5 während 5—15 Minuten bei 95—98°C vorgenommen. Dabei zeigt sich, daß nach einer Operation üas Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein in Lösung verbleibt. Nur wenige Proteine bleiben unter den gleichen Bedingungen in Lösung. Die meisten fallen unter Koagulation aus der Lösung aus.
Γ) Entfernung von Elektrolyten aus der das Leucinreiche 3,1-S-«2-Glykoprotein enthaltenden Lösung. Die Verringerung des Elektrolytengehaltes einer Proteinlösung führt zur Ausfällung der sogenannten Euglobuline. Dazu gehört ein Teil der Lipoproteine, die Makroglobuline, ein Teil der Immunglobuline und Ceruloplasmin, um einige als Beispiel zu nennen. Bei dieser als sogenannte Euglobulin-Fällung bezeichneten Maßnahme bleibt das Leucinreiche 3,1 -S-*2-Glykoprotein in Lösung.
Die Verringerung der Elektrolyte einer Proteinlösung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe der Dialyse gegen ein wäßriges Medium mit verringerter Leitfähigkeit, gegebenenfalls gegen destilliertes Wasser. Auch Elektrodialyseverfahren eder die Verringerung der Elektrolyten in Lösung durch Verwendung von Ionenaustauschern sind hierfür geeignet.
g) Molekularsiebfraktionierung der das neue Glykoprotein enthaltenden Lösung mit dem Ziel auf einer Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht /wischen 45 000 und 55 000 bzw. ein Ausschluß von Proteinen höheren oder niedrigeren Molekulargewichtes. Hierfür wird zweckmäßig eine Säulenfraktionierung durchgeführt unter Verwendung von Molekularsiebgelen, vorzugsweise von mit Epichlorhydrin quervernetztem Dextran. Auch andere Gelfiltrationsmedien mit vergleichbaren Ausschluß- bzw. Fraktionierungsgrenzen sind im Sinne der Erfindung geeignet.
h) Behandlung der Proteinlösung, die das Leucin-reiche 3,1-S-Ä2-Glykoprotein enthält, mit einem Anionenaustauscher, vorzugsweise einem solchen, der Aminoäthyl, Diäthylaminoäthyl oder Triäthylaminoäthyl als funktionell Gruppen und Cellulose als Matrix enthält. Das Leucin-reiche 3,l-S-«2-CJlykoprotein wird aus einer Lösung mit der Ionenstärke 0,05 an derartige Ionenaustauscher gebunden. Es kann danach mit dem Ionenaustauscher zusammen von den übrigen Proteinen, die in Lösung verbleiben, abgetrennt werden. Das neue Protein läßt sich durch Erhöhung der Leitfähigkeit von Pufferlösungen mit Hilfe von beispielsweise Neutralsalzen wie Kochsalz eluieren und somit gegenüber begleitenden Proteinen anreichern.
i) Elektrophorese in geeigneten Trägermedien und Gewinnung der Zone des «2-Bereiches der Plasmaproteine,
k) Behandlung der das Leucin-reiche 3,l-S-*2-Glykoprotein enthaltenden Lösung mit wasserunlöslichem Calciumphosphat-Hydrat, vorzugsweise mit Hydroxylapatit. Selbst bei niedriger Iononstärke der Proteiniösung, z. B. solche von Viooo Mol/l Ionen, wird das neue Glykoprotein an das unlösliche Phosphat nicht adsorbiert. Bei entsprechender Vorreinigung der das neue Protein enthaltenden Eiweißlösungen stellt der Adsorptionsüberstand bzw. im Säulenchromatographifcverfahren der Säulendurchfluß die Lösung eines gereinigten 3.1-S- «2-Glykoproteins dar.
Als letzter von mehreren der vorgenannten Schritte eingesetzt, liefert der Säulendurchfluß das reine Glykoprotein.
Durch eine beliebige Kombination von vorstehend dargestellten, in der Proteinchemie üblichen Verfahrensschritten läßt sich das neue Leucin-reiche 3.1-S-i*2-Glykoprotein aus menschlichem Serum oder einer Fraktion daraus beliebig anreichern und rein darstellen.
Die schließlich anfallenden, nurmehr das Leucin-reiche 3,l-S-*2-Glykoprotein. gegebenenfalls noch Salze enthaltende Lösung kann von Elektrolyten befreit und gefriergetrocknet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-*2-Glykoproteins geht von der bekannten Serumfraktionierung mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlaciat und Ammoniumsulfat aus, allgemein bekannt unter der Bezeichnung »Rivanol-Ammoniumsulfat-Verfahren«. dargestellt in Schultze, Hermanns; Molecular Biology of Human Proteins; Elsevier Publishing Company (1966), Seite 265. Bei diesen Verfahren ist das Leucin-reiche 3,1-S-A2-Glykoprotein zusammen mit einer Reihe anderer Glykoproteine in einem Abguß angereichert, der als Nebenfraktion bei der
bO Gewinnung von Albumin und Gammaglobulin aus Humanserum anfällt. Daraus werden in einem ersten Trennungsgang mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-diaminoakridinlactat in einer Konzentration von 0.03 bis 0.06 Mol/l eine Reihe begleitender Proteine ausfällt.
Das Fällungsmittel wild durch Zugabe von Chloridionen, vorzugsweise Natriumchlorid, präzipitiert. Zu der Proteinlösung wird ein Ionenaustauscher gegeben, welcher das Leucin-reiche 3.1 -S-rti-GIvkoprotein zu binden
vermag. Vorteilhaft wird hierfür ein Anionenaustauscher mit funktionellen Aminoäthyl-, Diäthylamino- oder Triäthylaminoäthyl-Gruppen verwendet.
Der Ionenaustauscher wird sodann mit einer Pufferlösung steigender Salzkonzentration behandelt. Durch diese Maßnahme wird das neue Protein vom Ionenaustauscher wieder abgelöst. Die Lösung wird einem Molekularsiebverfahren, bei welchem Proteine mit einem Molekulargewicht von 100 000—150 000 ausgeschlossen werden, unterworfen. In der niedrig-molekularen Fraktion befindet sich das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein neben anderen, niedrig-molekularen Glykoproteinen.
Es erweist sich zweckmäßig und nützlich, die Ionenaustausch-Chromatographie unter etwas variierenden Bedingungen zu wiederholen. Dies kann einerseits durch Änderung der Adsorptions- bzw. Elutionsverhältnisse oder auch durch die Auswahl von Ionenaustauschern unterschiedlicher Basizität erfolgen. Von restlichen Verunreinigungen wird das Gl> Icoprotein durch Behandlung mit einem mineralischen Adsorbens, z. B. Hydroxylapatit, abgetrennt Dabei bleiben die begleitenden Proteine an dem Adsorbens gebunden, wonach eine Lösung mit reinem Leuc.n-reichen 3,1-S-«2-Glykoprotein anfällt.
Das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein ist immunogen. Seine parenteral Applikation an Wirbeltiere, vorzugsweise an gebräuchliche Laboratoriumstiere wie Kaninchen, führt zur Ausbildung von Antikörpern im Blut dieser Tiere. Danach kann deren Blut gewonnen und das Serum abgetrennt und gegebenenfalls hinsichtlich vorhandener Antikörper angereichert werden. Hierzu stehen geläufige Methoden der Plasmaproteinfraktionierung dem Fachmann zur Verfügung. Durch Immunisierung der Versuchstiere mit dem isolierten 3,l-S-*2-Glykoprotein wurde ein Antiserum erhalten, das streng spezifisch mit dem Immunisierungsantigen reagiert. Kreuzreaktionen mit anderen bisher isolierten Serumproteinen wurden nicht beobachtet.
Das neue Leucin-reiche 3,1-S-«2-Glykoprotein erweist sich demnach als wertvolles immunisierendes Agens bei der Herstellung von Antiseren. Diese sind wertvolle diagnostische Reagenzien.
Gegenstand der Erfindung ist demnach auch die Verwendung des neuen Glykoproteins für die Herstellung von Antiseren.
Die quantitativen immunologischen Bestimmungen des Proteins mit Hilfe des Elektro-lmmunoassay nach Laurell in einer Serummischung von ca. 1000 Spendern ergab einen Durchschnittsgehalt an 3,l-S-«2-Glykoprotein von 2,1 mg/100 ml Serum.
Es wurde festgestellt, daß die Konzentration des Leucin-reichen 3,l-S-*2-Glykoproteins in Einzelseren von Erwachsenen zwischen 1,5 und 3.2 mg/100 ml Serum schwankt.
Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert.
Beispiel
Ausgangsmaterial für die Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-rt:-Glykoproteins ist eine Fraktion, ausgehend von 25 Litern Ht.nanplasma. Dieses wird mit 0,84% 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakiidinlactat bei pH 8,0 behandelt. Aus dem Überstand wird das Fällungsmittel als Chlorid ausgefällt und entfernt; sodann wird bei DH 7,0 mit 2,0 Mol Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird als gammaglobulinresche Fraktion abgetrennt und der Überstand folgendem Verfahren unterworfen.
Der Überstand wird durch Ultrafiltration auf 5 I eingeengt Der Eiweißgehalt der Lösung beträgt dann 3%. Die Lösung wird mit einer 0,85%igen Kochsalzlösung am Ultrafilter gewaschen und danach mit 7,5 g 2 Äthoxy-ö.g-diaminoacridon-lactat versetzt. Das dabei entstandene Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung wird Kochsalz bis ίο zu einer Endkonzentration von 5% (g/v) zugegeben. Dabei fällt die Akridinbase als Chiorid aus. Es wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird durch Waschen auf dem Ultrafilter vom Kochsalz befreit und mit 0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, äquilibriert Er stellt 3 Liter einer 2,5%igen Proteinlösung dar. Dazu werden 300 g Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Ionenaustauscher zugegeben, 1 Stunde gerührt, am Filter abgenutscht und der Filterrückstand mit 0,02 M/l Phosphat-Puffer, pH 0,7, gewaschen. Darauf wird der Ionenaustauscher mit einer IM NaCl-Lösung gewaschen. Der Durchfluß wird zum Teil entfernt Eine Fraktion, weiche das Leucin-reiche Giykoprotein enthält, wird weiter verarbeitet. Man führt mit dieser eine Gelfiltration an SEPHADEX G 150 durch; die Gelfiltration wird in einer Säule vom Durchmesser 20 cm und einer Höhe von 1 m, welche mit SEPHADEX9G 150 gefüllt ist, durchgeführt. Als Elutionsmittel dient Trishydroxymethylaminoethan-HCl-Puffer, O.lmolar, vom pH 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl. Dabei wird eine hochmolckulare Fraktion abgetrennt und eine niedermolekulare Fraktion, welche das Leucin-reiche 3,l-S-rt:2-Glykoprotein enthält, gewonnen.
Anschließend wird eine Säule (ca. 500 ml, 5 χ 45 cm) mit Diäthylaminoäthyl-SEPHADEX-Ionenaustauschcr gefüllt, die das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glvkoprotein enthaltende Fraktion auf die Säule aufgetragen und die Elution der Substanzen mit einem linearen Salzgradicnten von 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan-HCI-Puffer vom pH-Wert 8,6 ohne Salzzusat/. bis 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan· Puffer HCI vom pH-Wert 8,6, enthaltend 0,2 M NaCl/l, angelegt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Es werden diejenigen Fraktionen weiterverarbeitet, welche durch eine Kontroil-Elektrophorese eine elektrische Bcweglichkeit im «2-Bereich der Proteine aufweisen. Zur Anreicherung des Proteins werden die Fraktionen mil Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% versetzt. Der dabei entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der für die folgende QAE-Chromatographie verwendet wird.
Anschließend wird eine weitere Chromatographie an QAE-SEPHADEX in einer vergleichbaren Vcrsuchsanordnung durchgeführt. Zur Elution wird ein linearer Salzgradient von 0,08 Mol Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, bis 0,35 Mol Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, angelegt. Die durch Elektrophorese charakterisierten Fraktionen werden gewonnen und weiterverürbeitet.
Zunächst erfolgt eine Dialyse gegen 0,001 Mol Nntriumphosphat-Puffer vom pH 7,0. Das gegen diesen Puffer äquilibrierte Produkt wird schließlich auf eine mit Hydroxylpatit gefüllte Säule aufgetragen (Säulengröße 4x12 cm). Der Säuleninhalt wird eluiert mit 0,0Oi Mol Phosphatpuffer, pH 7,0. Der Durchfluß stellt reines Leucin-reiches 3,1 -S-Ä2-Glykoprotein dar.
Ausgehend von 25 Litern Humanplasma werden 100 mg des erfindungsgemäßen Proteins erhalten.
Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzungen:
7 N-Aeetylneuraminsäure 27 18 325
Mol% des Summe (Kohlenhydratanteil)
Aminosäuren Aminosäure- Variations
iinlcils koeffizient
3,87 %
Lysin 2,23 5,90 — ry
Histidin 4,65 11,28
Arginin 11,45 7,68
Asparaginsäure 3,87 1,49 1 ΓΪ
Threonin 6,43 6,26 IU
Serin 10,72 2,36
Glutaminsäure 7,04 2,51
Prolin 7,32 4,43
Glycin 6,65 2,31 I <Λ
Alanin 1,21 1,97 I D
1/2 Cystin 4,48 9,83
Valin 0,75 3,78
Methionin 1,29 5,81
Isoleucin 22,05 3,16 ■yn
Leucin 0,81 5,79
Tyrosin 3,23 19,53
Phenylalanin 1,60 1,39
Tryptophan 11,69
25
Kohlcnhydrat Gew.-o/o
Galaktose 4,1 ±0.3
Mannose 3,8 + 0,3
Glucose 0 30
Fucose 0,3 + 0,1
Xylose 0
N-Acetylhexosamin 8,1+0,5
6,6 + 0,4
22,9+1,6 35
Die Streubreiten sind methodisch bedingte Fehlergrenzen.
40
50

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Glykoprotein aus menschlichem Serum, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3.1 S ±0,2;
b) Molekulargewicht von 49 600 ±4000;
c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der Ä2-Globuline des Humanserums;
d) isoelektrischer Bereich pH 3,8—4,1;
e) Extinktionskoeffizient £L„2eomm = 7,O±2,O;
f) Gehalt von 77 ±2% α-Aminosäuren mit einem Anteil von 17%±2% Leucin und 23±2% an Kohlenhydraten;
g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.
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